PT86863B - Processo para amplificacao de genes estaveis em adn cromossomico de microorganismos procarioticos - Google Patents

Description

O âmbito da presente invenção refere-se a células procariõticas nas quais se obtêm a amplificação estável de genes por integração não encadeada dispersa de# pelo menos, duas cópias de uma sequência definida de ADN dentro do cromossoma da referida célula procariótica.

Antecedentes

Têm-se utilizado amplamente bacilos na produção de enzimas industrialmente importantes tais como a

alfa-amilase, a protease neutra e alcalina ou proteases de serina (cf. Debabov, The Industrial Use of Bacilli, em: The Molecu lar Biology of Bacilli, Acad. Press, New York, 1982). Pode conse guir-se uma melhoria na produção de enzimas de Bacillus por técnicas genéticas clássicas, tais como por mutação e por selecção subsequente, e por técnicas biológicas moleculares modernas. No ultimo caso, encontram-se bem documentados diversos procedimentos para a obtenção de níveis elevados de expressão de genes homólogos e heterólogos em determinados microorganismos procarióti cos e eucariôtas através da engenharia genética.

Uma das vias para se atingirem níveis elevados de expressão de um gene consiste em prover o gene com sequências reguladoras eficazes. Outra via, muitas vezes uti lizada em combinação com a primeira, consiste em aumentar o nume ro de cópias do gene em questão. Consegue-se a amplificação, principalmente, inserindo o gene numa molécula de ADN extracromossómico que exista em multicõpia, tal como um plasmídeo. Contu do, um inconveniente significativo na utilização dos plasmideos como vectores para expressão e amplificação da informação genéti ca ê a sua instabilidade. Para utilização em larga escala, a estabilidade do gene amplificado é um requisito prévio para que se mantenha um nível de produção elevado do produto de expressão co difiçado pelo que amplificado, assim como se deverão efectuar nu merosas divisões celulares antes que se forme biomassa suficiente para se obter substancial formação do produto.

A instabilidade surge sob duas formas: instabilidade segregacional, em que a perda do plasmídeo ocorre durante a cultura; e instabilidade estrutural, em que se suprime uma parte do plasmídeo. Pode surgir instabilidade segregacional por exemplo, quando uma célula hospedeira alberga um vector portador de um gene que se sobreexpressa. Haverá, geralmente, uma pressão selectiva em direcção a células que perderam a capacidade de sobreexpressa o gene; deste modo, a sobreexpressão ê uma propriedade desfavorável para a célula hospedeira transformada. Dispende-se uma grande quantidade de energia metabólica neste produto genético sobreexpresso, o que influencia ne gativamente a competitividade celular (proporção de crescimento)

com as células hospedeiras que não sobreexpressam de modo semelhante.

Um método que se utiliza para contrariar a instabilidade segregacional consiste em seleccionar cê lulas que contêm plasmídeos multicõpias portadores de genes que conferem uma vantagem ã célula que contém o plasmídeo, por exemplo, conferindo resistência a um antibiótico e, depois, adicionar o antibiótico relevante ao caldo de fermentação. Contudo, os antibióticos não são, geralmente, meios de selecção úteis em pro cessos de produção comercial em larga escala devido aos regulamentos que dizem respeito à aprovação do processo de fermentação ou do próprio produto.

Um outro método que se utiliza para minimizar a perda de plasmídeo devido à instabilidade segregado nal consiste em inserir um gene que é funcionalmente essencial para a célula hospedeira dentro da molécula vector (Ferrari e ou tros, Biotechonology 3_ (1985) 1003-1007). Este método não assegu ra, contudo, a estabilidade estrutural do vector.

As técnicas que se utilizam para so lucionar o problema da instabilidade plasmídica estrutural inclu em a anulação da expressão do gene durante a fase de crescimento exponencial, por exemplo, utilizando sequências reguladoras tais como sequências reguladoras sensíveis à temperatura e a integração de ADN exógeno dentro do cromossoma da célula hospedeira. Ou tros métodos utilizados incluem a acção de evitar a utilização de moléculas vector que se repliquem autonomamente e, em vez dis_ so utilizar técnicas que favoreçam a integração do ADN introduzi do dentro do cromossoma da célula hospedeira.

Os métodos para se atingir a integração de ADN estranho dentro do cromossoma da célula hospedeira incluem recombinação homóloga e recombinação ilegítima. Existem dois modos de inserção de sequências de ADN dentro de locais específicos de um cromossoma por recombinação homologa: recombinação homóloga tipo Campbell e recombinação dupla recíproca, que se apresentam nas Figuras IA e 1B, respectivamente. Na Figura 1C apresenta-se uma terceira via para se introduzirem sequências de • ADN dentro do cromossoma, utilizando este método um mecanismo de _ q _ substituição em duas fases. Em princípio, utiliza-se uma recombi nação tipo Campbell, mas o resultado final ê um arranjo cromossó mico que não contêm sequências duplicadas, e, como tal, não contêm unidades amplificáveis, na parte recombinada do cromossoma. Assemelha-se, por consequência a uma recombinação reciproca dupla.

à parte a utilização de recombinação homóloga para a integração de ADN estranho dentro do cromossoma, também é possível integrar ADN por recombinação ilegítima. Podem seleccionar-se as moléculas vector sob condições que inibam a replicação autónoma das moléculas vector não integradas. Apresenta-se na Figura 1D a utilização da recombinação ilegítima para integração. A ausência de duplicações encadeadas nos arranjos da sequência cromossõmica obtida torna preferenciais as vias apresentadas nas Figuras 1B, C e D para introdução estável de se quências de ADN no genoma. Os genes que se integraram no cromossoma incluem genes homólogos e heterõlogos em que a amplificação do ADN integrado cromossomicamente é de forma encadeada. Refiram -se estas sequências cromossomicamente amplificadas como sendo instáveis, apesar de nalguns casos se ter referido alguma estabi lidade. Por conseguinte, ê desejável que se desenvolvam métodos pelos quais o ADN integrado no cromossoma se mantenha de forma estável.

Literatura Relevante

A integração de ADN exógeno por recombinação homóloga dentro do cromossoma do Bacillus subtilis foi descrita por Duncan e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978) 3664-3668 e para o Anacystis nidulans por Williams e Szalay, Gene 24 (1983) 37-51 e no Pedido de Patente Internacional WO 84/00381. A integração por recombinação homóloga de um gene heterõlogo, que não se pode manter de forma estável quando trans portado num vector plasmídico, dentro do cromossoma de um microorganismo está descrita em EPA-0127328.

Encontra-se bem documentada a ampli ficação dos genes cromossomicamente integrados, quer homólogos quer heterõlogos. Ver por Exemplo, Saito e outras, Proceedings of the Fouth International Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms, Kyoto, Japan, 1982, pp. 125130; Young, J. Gen. Microbiol. 130 (1984) 1613-1621; Janniêre e outros, Gene 40 (1985) 47-55; Sargent e Bennett, J. Bacteriol. 161 (1985) 589-595; Gutterson e Koshland, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 (1983) 4894-4898; Hashiguchi e outros, Agric. Biol. Chem. 49 (1985) 545 -550; Wilson e Morgan, J. Bacteriol. 163 (1985) 445-453; Pedido de Patente Francês N9. 84.06701; e EP-A-0134048. Tem sido referi da e pode seleccionar-se a amplificação espontânea nas células procariótas. Ver, por exemplo, a revista de Anderson e Roth, Ann Rev. Microbiol. 31 (1977) 473-505.

Em todos os casos anteriormente referidos, a amplificação do ADN integrado cromossomicamente era de uma forma encadeada. Referiu-se este tipo de sequência de amplificação cromossomica como instável, apesar de nalguns casos se ter verificado uma estabilidade bastante boa, conforme debati do por Janniêre e outros, Gene £0, (1985) 47-55.

Descreveu-se a estabilização dos ge nes procarioticos que surgem naturalmente, devido â presença de outros genes essenciais entre estas sequências amplificadas. Por exemplo, das 9 a 10 cópias dos grupos de genes de ARN ribóssomico que ocorrem no cromossoma do B. subtills, dois grupos dispostos de forma encadeada encontram-se separados por um aglomerado de genes de tARN (Wawrousek e Hansen, J. Biol. Chem. 258 (1983) 291-298). Noutros casos, eliminaram-se os operões de ARN ribossó mico que se repetiam de forma encadeada e que surgem naturalmente, tanto em E. coli como em B. subtilis, com efeito reduzido nas propriedades fenotípicas do organismo: Ellwood e Momura, J. Bacteriol. 143 (1980) 1077-1080 e Loughney e outros, J. Bacteriol. 154 (1983) 529-523, respectivamente.

Hofemeister e outros, Mol. Gen. Genet. 189 (1983) 58-68 e Prorozov e outros, Gene 34 (1985) 39-46, creveram a integração de plasmídeos no cromossoma do B. subtilis por recombinação ilegítima utilizando o vector pE194.

Efectuou-se, com êxito, a clonagem de diversos genes para as enzimas extracelulares de bacilos, tais como os genes da alfa-amilase B. amyloliquefaciens (Paiva e ou-

tros, Gene 15 (1981) 43-51), do B. licheniformis (Ortlepp, Gene 23 (1983) 267) , do B. stearothermophilus (Mielenz e outros, Proc. Acad. Sei. USA 80 (1983) 5975-5979; EP-A-0057976) e do B. subtilis (Yang e outros, Nucleic Acids Res. 11 (1983) 237); o gene da levansucrase do B. subtilis (Gay e outros, J. Bacteriol. 153 (1983) 1424); os genes que codificam para a protease neutra do B. stearothermophilus (Fuji e outros, J. Bacteriol. 156 (1983) 831), do B. amyloliquefaciens (Honjo e outros, J. Biotech. 1 (1984) 165) e do B. subtilis (Yang e outros, J. Bacteriol. 160 (1984) 115; os genes que codificam para a protease serina ou para a protease alcalina do B. subtilis (Wong e outros, Proc. Natl, Acad. Sei. USA 81 (1984), 1184), B. licheniformis (Jacobs e outros, Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8913) e do B. amyloliquefaciens (Wells e outros, Nucleic Acids Res. 11 (1983) 7911).

Tem sido referida a transformação de protoplastos para diversas espécies de microorganismos gram positivos. Para o B. subtilis, Chang e Cohen (Mol. Gen. Genet. 168 (1979) 111-115), elaboraram um protocolo para a transformação de protoplastos o qual tem sido utilizado amplamente. Elaboraram-se, com êxito, idênticos protocolos para a transformação dos protoplasto do B. megaterium (Vorobjeva e outros, FEMS Micro biol. Letters 7_ (1980) 261-263) , dos protoplastos do B. amyloliguefaciens (Smith e outros, Appl. e Env. Microbiol. 51 (1986) ι 634), dos protoplastos do B. thuringiensis (Fisher e outros, Arch. Microbiol. 139 (1981) 213-217), dos protoplastos do B. sphaericus (McDonald, J. Gen. Microbiol. 130 (1984) 203) e proto plastos do B. larvae (Bakhiet e outros, Appl. e Env. Microbiol. 49 (1985) 577); na mesma publicação faz-se referência a resultados mal sucedidos no caso do B. popillae. O protocolo foi bem su cedido para o B. polymyxa, o B. licheniformis, B. macerans e B. laterosporus mas tal não aconteceu para o B. coágulans, B. cereus e B. pumilus, apesar de se ter observado uma boa formação de protoplastos (Mann e outros, Current Microbiol. 13 (1986) 131-135) .

Outros métodos para a introdução de ADN dentro de protoplastos incluem a fusão com lipossomas que . contêm ADN ((Holubova, Folia Microbiol. 30 (1985) 97), ou a fu-

são de protoplastos utilizando como uma célula hospedeira intermediária um organismo facilmente transformãvel (EP-A-0134048).

RESUMO DA INVENÇÃO

Proporcionam-se células hospedeiras procarióticas, bem como métodos para a sua preparação, os quais compreendem, pelo menos duas copias de uma sequência de ADN que codifica para um polipeptídeo de interesse integrado de forma ess tãvel dentro do cromossoma da célula hospedeira. A manutenção de forma estável da sequência de ADN exógeno obtêm-se pela integração de duas ou mais cópias da sequência dentro do cromossoma da célula hospedeira, encontrando-se as cópias separadas por sequên cias de ADN cromossómico endógeno.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As Figuras 1A-D são representações esquemáticas de quatro vias para integração das sequências de ADN extracromossõmico dentro de cromossomas de microorganismos procarióticos.

T ê a sequência alvo, isto ê, as sequências de ADN pre sentes no cromossoma e no plasmídeo, entre as quais pode ter lugar a recombinação homóloga.

S representa a sequência de ADN a ser integrada no cro mossoma.

M representa a sequência do gene de marcação usado para a selecção da estirpe recombinante.

As Figuras 2A e 2B são representações esquemáticas de duas vias para obtenção de amplificação genética estável num cromossoma procariõtico.

A Figura 3 apresenta os resultados da electroforese em gel de histidina/MOPS, efectuada em sobrenadantes a partir de culturas do B. subtilis DB104 gue contêm pUB 110 e pM58, respectivamente, em comparação com diversos subtilisinas:

pista 1: subtilisina de Carlsberg pista 2: protease de Bacillus PB92 pista 3: subtilisina de B. subtilis

pista 4: Bacillus subtilis DB104 (pM58) pista 5: Bacillus subtilis DB104 (pUBUO)

A Figura 4 apresenta o mapa de restrição do plasmídeo pM58. Para além disso, na parte superior da Figura apresenta-se a estratégia de sequenciação. As linhas a cheio com setas representam os fragmentos que se clonaram nos vectores mplO, mpll e mpl8 do bacteriõfago M13. Na parte inferior da Figura apresenta-se a estratégia de sequenciação utilizando dez oligonucleotidos localizados no gene de protease a distân cias regulares.

A Figura 5 apresenta a sequência nu cleotídica da cadeia de codificação relacionado com a sequência de ácidos aminados da protease de serina do Bacillus PB92. Também se apresentam os promotores (P.^, P₂) , os locais de ligação ribossémica (rbs) e as regiões de terminação terem da sequência de ADN. As linhas a cheio numeradas representam a localização dos dez oligonucleotidos que se utilizaram para sequenciação.

A Figura 6A apresenta a construção do plasmídeo pE194-neo.

A Figura 6B apresenta a construção do plasmídeo pMAX-4.

Figura 7A: submeteram-se a electroforese em gel de agarose a 0,5%, misturas de digestão, preparadas com HindIII, de ADN cromossõmico das estirpes PB92, PBT109 e PBT108, transferiram-se para nitrocelulose, conforme descrito por Southern e hibridaram-se com ADN do pM58 com translacção de encaixe e marcado com 32 . A Figura apresenta uma auto-radiograIr fia.

As Figuras 7B e 7C ilustram as consequências de integração que ocorrem nos casos de recombinação homóloga (B) e recombinação ilegítima (C) entre o pMAX-4 e o cro mossoma do Bacillus PB92.

A Figura 8 apresenta a construção do vector de integração pElatB.

A Figura 9A ilustra a integração do plasmídeo pElatB dentro do cromossoma da estirpe T9 do Bacillus licheniformis, dai resultando a estirpe TB13 do Bacillus licheni

formís.

A Figura 9B ilustra a recombinação cromossõmica das estirpes TB13 e T5 do Bacillus licheniformis em consequência da fusão de protoplastos destas estirpes, daí resul tando a estirpe T13F. do Bacillus Licheniformis.

A figura 10 apresenta uma analise cromossõmica de nove colónias diferentes isoladas a partir de uma fermentação da estirpe T13F, conforme descrito no Exemplo 11. Efectuou-se a digestão, do ADN cromossõmico isolado, com EcoRI, separou-se sobre geis de agarose a 0,8% e depositou-se formando uma mancha em nitrocelulose. Efectuou-se a hibridização da mancha com ADN do pElatB com translacção de encaixe e marcado com 32p. A Figura apresenta um autodiagrama. A seta superior indica a posição para onde migra um fragmento de ADN EcoRI de cerca de 15kb, o qual contêm a sequência completa do pElatB que se integrou dentro do cromossoma num local não adjacente ao gene da alfa-amilase original, conforme se representa na Figura 9A para a estirpe TB13. A seta inferior indica a posição para onde migrou um fragmento de ADN EcoRI de cerca de 33kb e que contem o gene completo da alfa-amilase originalmente presente na estirpe T5 do Bacillus licheniformis (ver também a Figura 9B). Analisaram-se as seguintes amostras de ADN:

pista 1: ADN de Bacillus licheniformis T5 pista 2: ADN de Bacillus licheniformis TB13 pista 3: ADN de Bacillus licheniformis T390 pista 4: ADN de um derivado de Bacillus licheniformis sensível à neomicina isolado apôs fermentação, conforme descrito no Exemplo 12 pista 5: ADN de Bacillus licheniformis T13F pistas 6-14: ADN de 9 colõnias diferentes que se isola ram a partir da fermentação da estirpe T13F, conforme descrito no Exemplo 12.

DESCRIÇÃO DOS MODOS DE CONCRETIZAÇÃO ESPECÍFICOS

De acordo com a presente invenção proporcionam-se células procariõticas, bem como métodos para a

sua preparação, nas quais se integram, de forma estãvel, duas ou mais copias de uma sequência de ADN, dentro do cromossoma. Trans forma-se uma célula hospedeira que contêm uma sequência de ADN que codifica para um polipeptídeo de interesse, com uma construção de ADN que compreende a referida sequência de ADN. Seleccionam-se as células transformadas nas quais as sequências de ADN integradas se encontram separadas por sequências cromossõmicas endógenas do gene que se pretende amplificar. As sequências endõ genas intervenientes são, geralmente, vitais para a célula hospe deira. A perda de sequências amplificadas por recombinação homóloga será vital para a célula hospedeira. Assim, haverã pressão de selecção para as células portadoras de sequências amplificadas sem necessidade de se utilizarem antibióticos ou meios de se lecção semelhantes. Pode conseguir-se a integração quer por recombinação homóloga quer por recombinação ilegítima. Nas Figuras 2A e 2B, respectivamente, apresentam-se as técnicas que se podem utilizar para se obterem as células-designadas.

Quando se utiliza a recombinação ho mõloga podem estar presentes nas moléculas vector diversas exten soes de sequências de ADN que são homólogas do cromossoma da cêlula hospedeira, especialmente quando jã se introduziu dentro da célula hospedeira uma ou mais cópias do gene a ser amplificado. Deste modo, a molécula vector pode incluir uma sequência de ADN de interesse; uma sequência de ADN alvo; e uma sequência de ADN de marcação.

Deve ter-se cuidado para que apenas se seleccionem os arranjos cromossómicos desejados. Pode conseguir-se isto utilizando para recombinação moléculas de ADN linea res. A moléculas vector circular a ser integrada, ê cortada com uma enzima de restricção na região homóloga da sequência alvo. Deste modo, a recombinação e a integração podem dar-se, preferen cialmente, neste local específico. Para além de estar presente na molécula vector, a sequência de ADN de interesse também pode estar presente no cromossoma da célula hospedeira. A sequência de ADN pode ser uma sequência de ADN que codifica para qualquer gene estrutural que se pretenda amplificar. A sequência de ADN pode ser endógena ao organismo hospedeiro, ou pode ter sido inse rida dentro do cromossoma numa fase de transformação previa.

As sequências alvo para a amplifica ção genética de forma não encadeada escolher-se-ão, de preferência, entre os genes não essenciais, por exemplo, no caso dos bacilos como organismos hospedeiros, podem utilizar-se como sequên cias alvo os genes que codificam para enzimas extracelulares ou genes envolvidos na esporulação. A integração de sequências de ADN nestes genes inactivam, geralmente, o gene. Assim, pode observar-se a perda de expressão do gene e utilizã-la para a selec ção das estirpes recombinantes desejadas.

Quando se utiliza a recombinação ilegítima para amplificação genética cromossómica, conforme apre sentado nas Figuras 1D e 2A, dã-se preferência ãs condições de integração e selecção nas quais a recombinação homóloga não predomine sobre a recombinação ilegítima. Um procedimento preferido para se evitar a recombinação homologa consiste na transformação das células hospedeiras primeira e segunda que não possuem o gene estrutural de interesse, com um vector que compreende uma sequência de ADN que codifica para um polipeptídeo de interesse, e um gene de marcação. Pode então seleccionar-se e combina-se as células hospedeiras primeira e segunda nas quais estã presente a sequência de ADN em diferentes locais, sob condições de fusão, para se obter uma célula transformada com pelo menos duas copias da sequência de ADN que codifica para o gene estrutural de interesse em locais dispersos no genoma do segundo hospedeiro. Para facilitar a selecção pode sacrificar-se o primeiro hospedeiro an tes da fusão.

0(s) gene(s) de interesse podem ser quaisquer genes procarióticos ou eucarióticos. Estes genes podem incluir genes bacterianos, genes de microorganismos unicelulares, genes de mamíferos, ou semelhantes. Podem preparar-se os genes estruturais de diversos modos, incluindo síntese, isolamento a partir de ADN genõmico, preparação a partir de cADN, ou combinações dos mesmos. São bem conhecidas as diversas técnicas de mani pulação dos genes incluindo restricção, digestão, resecção, liga ção, mutagenêse in vitro, reparação de iniciadores, emprego de ligantes e de adaptadores, e, similares. Assim, podem manipular

-se segundo diversos métodos, as sequências de ADN obtidas a par tir de um hospedeiro, dependendo das necessidades da construção de ADN. Ver Maniatis e outros, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982.

Os genes estruturais podem expressar uma diversidade de polipeptídeos ou proteínas, tais como enzimas, hormonas, linfoquinas, proteínas de superfície, proteínas sanguí^ neas, proteínas estruturais, imunoglobulinas ou similares, a par tir de mamíferos, microorganismos unicelulares, por exemplo, bac terias, fungos, tais como levedura, ou fungos filamentosos, algas, protozoários, etc., plantas ou outras fontes de ADN. De par ticular interesse são os enzimas, mais particularmente as protea ses e amilases. São exemplos de tais enzimas as proteases de serina e de não-serina, incluindo as proteases de serina de alcali nidade elevada, as alfa e beta amilases e similares. Uma fonte preferencial de protease de serina ê o Bacillus novo species PB92, e para a alfa-amilase ê a estirpe T5 do B. licheniformis, bem como os mutantes e variantes destas estirpes.

Pode obter-se o gene que faz parte do vector adequado segundo métodos que são, geralmente, conhecidos na especialidade. 0 método compreende, geralmente, a prepara ção de uma biblioteca genômica a partir do organismo que expressa um protease de alcalinidade elevada. Prepara-se convenientemente uma biblioteca genômica, por exemplo, ligando fragmentos de ADN da estirpe dadora num vector adequado.

Com os termos vector adequado pre tende-se referir uma construção de ADN que compreende um gene es_ trutural que codifica para uma proteína ou um polipeptídeo de in teresse. 0 gene estrutural é ligado segundo orientação adequada às regiões de regulação tais como uma sequência promotora, uma sequência que forma o local de ligação ribossômica e sequências que regulam a terminação da transcripção e da translação do gene estrutural, sendo as referidas regiões de regulação funcionais na célula hospedeira. Quando a célula hospedeira possui frequências de transformação e de integração que são demasiadamente bai xas para permitir a selecção directa no que respeita à integração sem o isolamento intermédio das células que contêm o plasmí-

deo, tais como estirpes industriais do Bacillus, o vector pode compreender, adicionalmente, uma origem de replicação que ê capaz de se replicar de forma autónoma na célula hospedeira.

Quando se obtêm o gene a partir de uma célula dadora que possui sinais reguladores de início de transcrição e de tradução e de terminação que são reconhecidos pelas estirpes de células procariõticas hospedeiras, serã geralmente conveniente manter as sequências reguladoras originais do gene estrutural. Para além disso, a região de início da transcri ção pode proporcionar expressão constitutiva ou inductível pelo que, em situações apropriadas, o hospedeiro se pode desenvolver até uma densidade elevada antes se obterem níveis de expressão elevados dos genes estruturais com interesse.

Quando se obtêm o gene estrutural a partir de uma fonte cujos sinais reguladores não são recolheci dos pela célula hospedeira, serã necessário obter regiões regula doras reconhecidas pela célula hospedeira e inserir o gene estru tural entre os sinais reguladores de início e de terminação. NaJL guns casos pode inserir-se o gene estrutural exógeno com o seu(s) codão (codões) de paragem próprio(s), numa estrutura de leitura depois dos codões N-terminais de um gene estrutural endógeno que conserva os seus sinais reguladores naturais.

Ê desejável que o produto de express são seja segregado. Quando o produto de expressão é segregado na turalmente e os sinais guia e o sinal (ou os sinais) de processa mento são reconhecidos pela célula hospedeira não surgem dificuJL dades. Contudo quando o produto não ê segregado devido ao facto da célula hospedeira não reconhecer os sinais guia de selecção e/ou o sinal (os sinais) de processamento, ou os sinais não funcionam a um nível satisfatório na célula hospedeira, então, serã necessário isolar ou sintetizar sequências de ADN que codificam para os sinais guia de secreção e sinal (sinais) de processamento de um polipeptídeo de uma célula hospedeira e ligá-los num quadro de leitura adequado ã extremidade 5’ do gene estrutural. Para além disso, o vector pode incluir um gene de marcação que confere resistência para um antibiótico ao qual a célula hospedeira é sensível. 0 gene de marcação, quando utilizado na inte-

gração cromossõmica do vector, tem de obdecer ã condição de que seja possível a selecção de sobreviventes ainda que apenas estejam presentes na estirpe hospedeira uma ou poucas cópias do gene indicador. Por gene de marcação entende-se um gene estrutural capaz de se expressar num hospedeiro e que proporciona selecção de sobreviventes. Por selecção de sobreviventes entende-se a transmissão de prototrofia a um hospedeiro auxotrõfico, ou resis tência a biocidas ou virai. Podem empregar-se diversos genes para prototrofia, tais como, leu, his, trp, ou semelhantes. Para resistência a biocidas, pode incluir-se resistência aos antibióticos, por exemplo, neo, cam, tet, tun, kan, ou similares. Outros genes de marcação incluem resistência aos metais pesados, imunidade e similares. As diversas sequências de ADN podem ser derivadas de diversas fontes e ligadas para proporcionar um vector que inclua um ou mais locais d.e restricção, de preferência singulares, convenientes para permitir a inserção ou substituição dos genes estruturais em locais ou em lugar dos fragmentos perdidos de modo a que possibilitem a construção do plasmídeo.

Pode auxiliar-se a selecção para in tegração cromossõmica utilizando um plasmídeo com uma origem de replicação que possua uma mutação que torna o seu funcionamento sensível à temperatura na célula hospedeira. Ver, por exemplo, Ehrlich, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978) 1433.

Uma vez preparada a construção do plasmídeo, pode efectuar-se, então, a clonagem num hospedeiro de clonagem adequado. Pode utilizar-se qualquer hospedeiro que seja apropriado, facilmente transformãvel e permita a replicação da construção do plasmídeo e a transferência para a célula hospedei ra. Encontram-se disponíveis um grande numero de estirpes que possuem elevadas eficiência de transformação e que são habitualmente auxotrópicas e/ou sensíveis aos antibióticos. Quando a cêlula hospedeira ê uma estirpe industrial de Bacillus, a utilização do mesmo organismo da célula hospedeira para clonagem da construção plasmídica possui muitas vantagens pelo facto de permitir a utilização de um único sistema de replicação bem como o mesmo marcador para a selecção de sobreviventes quer no hospedei ro de clonagem quer na estirpe hosped.eira. Ver, por exemplo, Patente Europeia EP-A-134048, cuja descrição aqui se indica como referência.

Pode introduzir-se a construção pias mídica dentro do hospedeiro de clonagem de acordo com técnicas convencionais, tais como transformação, empregando ADN precipita do por cálcio, conjugação, ou outras técnicas convenientes. 0 hospedeiro de clonagem pode, então, ser cultivado num meio nutri ente apropriado, sob condições selectivas para seleccionar um hospedeiro que contenha a construção plasmídica. Para hospedeiros auxotrõficos, o meio ambiente é deficiente no nutriente necessário, enquanto para resistência a biocidas, por exemplo, resistência a antibióticos, emprega-se no meio nutriente uma quantidade cititóxica de biocida(s).

Podem empregar-se diversas células hospedeiras, incluindo E. coli, estirpes de Bacillus, especialmente Bacillus subtilis, Pseudomonas e Streptomyces. Na escolha duma célula hospedeira levam-se em conta diversos factores, incluindo factores que podem afectar a expressão do gene a ser amplificado e a produção do produto pretendido. Assim, ê desejável utilizar-se uma célula hospedeira na qual há reconhecimento dos sinais reguladores; facilidade de secreção, degradação reduzida do produto desejado, etc. Uma célula hospedeira preferida produz já o polipeptídeo de interesse e pode ser quer um organismo de tipo selvagem quer um organismo mutante. A célula hospedeira tam bêm pode ser um mutante de um organismo que produz o polipeptídeo de interesse, o qual contudo não é, ele próprio, um produtor. Quando o polipeptídeo com interesse ê uma protease ou uma amilase, as estirpes preferidas englobam o Bacillus novo species PB92 e a estirpe T5 do Bacillus licheniformis, respectivamente, bem como mutantes e variantes destas estirpes.

Para além disto, podem empregar-se estirpes industriais que possuam as características desejadas de uma estirpe industrial. Exemplos de estirpes que se podem utilizar incluem as estirpes que se utilizam na produção industrial de enzimas tais como: o B. licheniformis, o B. amyloliquefaciens e bacilos alcalofílicos. As estirpes industriais são escolhidas a partir de organismos que possam isolar-se no solo ou a partir de organismos disponíveis a partir de depósitos ou de outras par tes ou obtidos pela modificação de tais estirpes. As estirpes in

dustrlais são altamente robustas e estáveis. Para alem disso estas estirpes são resistentes ã infecção por bacteriófagos e ã permuta genética, isto ê, ã introdução de ADN pelos procedimentos de transformação convencionais. As estirpes industriais convencionais também são prototróficas, tendo em vista evitar a adi ção de ácidos aminados dispendiosos ao meio nutriente. Outras ca racterísticas das estirpes industriais são a sua elevada produti vidade até ao fim da fermentação, que pode ter a duração de uma semana, concentração estável de células até exaustão do caldo, e, elevada produtividade de, geralmente, pelo menos 5 g/1 (0,5% p/v) de uma proteína específica segregada.

Podem obter-se os transformantes possuindo genes quer em arranjo encadeado quer dispersor no cromossoma. Geralmente, é possível seleccionarem-se transformantes que contêm genes dispersos a partir de misturas dos dois tipos de transformantes mencionados, isolando o ADN cromossõmico que cada transformante individual, analisando subsequentemente o referido ADN no que respeita ãs localizações relativas dos referidos genes, segundo, por exemplo, o método de Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517 ou por outros procedimentos que são do conhecimento do especialista, identificando assim a integração dispersa dos referidos genes.

Os procedimentos para se obterem transformantes de genes dispersos evitando a integração de forma encadeada incluem, a utilização da recombinação recíproca dupla conforme ilustrado nas Figuras 1B e 2B, a utilização de construção linearizadas de ADN que compreendem a sequência de ADN a ser amplificada, um gene de marcação e sequências alvo para recombinação.

Para além disto, procedimentos espe cíficos para se obterem transformantes de genes dispersos incluem a utilização de recombinação ilegítima, conforme ilustrado na Figura 2A, na qual o isolamento de transformantes encadeados pode ser evitado mediante selecção, utilizando a expressão diferen ciai de um gene de marcação, por exemplo de um gene que codifica para a resistência a antibióticos, sendo a sensibilidade ao anti • biõtico diferente em estirpes com integração encadeada do que em

oposição ã integração não encadeada. Geralmente, a extensão das sequências de ADN endógenos intervenientes serã inferior a 10 kpk. Além disso, os meios para obtenção de transformantes de genes dispersos que evitam a duplicação em forma encadeada incluem a utilização de protoplastos mortos de uma estirpe dadora homóloga portadora de uma construção de ADN que compreende o gene estrutural e o gene de marcação, sendo o gene estrutural integrado no cromossoma em locais diferentes no que respeita ã estirpe receptora.

A transformação das células hospedeiras envolvem preferencialmente a utilização de protoplastos preparados a partir da estirpe hospedeira. Os protoplastos, preparam-se, geralmente, a partir de células de acordo com procedimentos habituais, por exemplo, por tratamento por lisozima ou z_i moliase e suspensão cuidadosa dos protoplastos num meio apropria do que possua osmolaridade adequada para a manutenção da integri dade dos protoplastos. Na ΕΡ-Α-0134048, descrição que aqui se in dica como referência, descrevem-se métodos para a preparação de protoplastos para as estirpes industriais de Bacillus. Quando a estirpe hospedeira ê uma estirpe de Bacillus alcalofílica, podem preparar-se convenientemente protoplastos a pH alcalino, de preferência a pH 8,0, aproximadamente. Este procedimento encontra-se descrito no Pedido de Patente Europeia N9. EP-A-87200358.7, descrição que aqui se indica como referência.

A célula hospedeira pode ser transformada por combinação da construção plasmídica, ou um protoplas^ to hospedeiro que se clonou, com um protoplasto da célula hospedeira na presença de um agente de fusão adequado. Pode empregar-se qualquer agente de fusão que proporcione o nível de eficácia desejado; para a maioria dos casos, descobriu-se que o polietile no-glicol proporcionava elevada eficácia de fusão com grande van tagem.

Após curto período, substitui-se a mistura de fusão por um meio nutritivo adequado e regeneram-se as células num meio de selecção colocando-as, convenientemente, numa placa de agar.

Os transformantes que se obtêm pela

combinação da célula hospedeira com uma construção de ADN adequa da podem conter a referida construção de ADN ou parte dela quer directamente como uma parte integral dos seus cromossomas quer como moléculas vector livres quando as construções de ADN contêm uma origem de replicação funcional na referida célula hospedeira.

Um procedimento de selecção dos tran formantes em que a construção do ADN estã integrada dentro do cromossoma consiste em utilizar-se um plasmídeo contendo uma ori gem de replicação sensível ã temperatura. Os transformantes são cultivados num meio de selecção ã temperatura tolerável, sendo em seguida transferidos para uma temperatura não tolerável. São então isoladas as colónias que expressam o gene de marcação ã temperatura não tolerada e são cultivadas em meio selectivo à temperatura tolerada. Pode verificar-se a ausência de plasmídeo, por exemplo, isolando o ADN total a partir das colónias e efectu ando a electroforese em gel de agarose ou demonstrando a perda de capacidade dos transformantes para transformar células competentes. A determinação do processo pelo qual teve lugar a integração no cromossoma pode efectuar-se pela análise do ADN cromoss sõmico, por exemplo, segundo o método de Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517 ou segundo outros métodos que são do conhecimento dos especialistas.

Quando existe sensibilidade diferen ciai para o agente selectivo entre os transformantes que contêm cópias adicionais do gene de marcação dispostos de forma encadea da, em comparação com aqueles em que o gene indicador está incor porado em localizações dispersas no genona hospedeiro, os transformantes podem ser cultivados, convenientemente, num meio contendo a concentração adequada do agente selectivo para seleccionar transformantes com integração não encadeada.

Outro método para se obterem transformantes com integração difusa de cópias de sequência de ADN com interesse consiste na utilização de um protoplasto preparado a partir de uma célula dadora homóloga contendo, pelo menos, uma cópia da sequência de ADN com interesse num local do seu cromossoma diferente do da célula hospedeira receptora. Pode preparar-se a célula dadora homóloga, por exemplo, pela transformação da

célula que não contêm o gene estrutural com interesse com um vec tor que compreende o gene estrutural. Pode facilitar-se a integração da sequência de ADN dentro do cromossoma da célula dadora utilizando um plasmídeo que contêm uma origem de replicação sensível ã temperatura e cultivando os transformantes sob condições de selecção, em primeiro lugar à temperatura tolerada e depois à temperatura nao tolerada, conforme descrito antes, e, isolando depois, as colónias que expressam o gene de marcação.

A seguir ã verificação da ausência de ADN plasmídico, pode isolar-se e analisar-se o ADN cromossómi co de acordo com o método de Southern, supra, por hibridação com uma sonda marcada com por exemplo, 32p ou com nucleõtidos bio-es^ tanhados. A sonda pode ser cADN que codifica para o polipeptídeo com interesse ou fragmentos deste, bem como construções de ADN ou fragmentos destas compreendendo a sequência de ADN com interesse, por exemplo, um vector. Os transformantes que contêm o ge ne com interesse numa localização alternativa em comparação com a da estirpe dadora do gene podem, então, ser utilizados como uma célula dadora homóloga. A estirpe hospedeira receptora ê, de preferência, idêntica ã estirpe que se utilizou como fonte da se quência de ADN com interesse, ou uma estirpe na qual a sequência de ADN com interesse se localiza numa região do cromossoma diferente daquela da célula hospedeira transformada.

Para auxiliar a selecção, aniquila-se, de preferência, a célula dadora com um agente citotõxico an tes ou durante a formação do protoplasto. Podem empregar-se diversos agentes para aniquilar a célula dadora, incluindo antibio ticos, mas verifica-se que a iodoacetamida e conveniente, eficiente e que não interfere com a fusão subsequente. Quando se utilizam protoplastos hospedeiros de clonagem aniquilados, a propor ção dos protoplastos aniquilados para a estirpe hospedeira receg tora será, de preferência de pelo menos 1:1 e pode empregar-se um excesso de protoplastos aniquilados.

A seguir à fusão do protoplasto mor to da célula dadora e do protoplasto da célula hospedeira receptora, podem seleccionar-se os transformantes por meio do gene de marcação. Pode então isolar-se e analisar-se o ADN conforme des-

crito antes para identificar os transformantes nos quais se incorporam dentro do genoma mais do que uma cópia do gene com inte resse que estejam separadas por sequências cromossómicas endógenas.

Efectua-se então o rastreio de transi formantes com dois genes dispersos, mediante procedimentos adequados para detectar o acréscimo de expressão do polipeptídeo de interesse. Podem empregar-se diversas técnicas, particularmente quando hã intervenção de enzimas que possuem métodos de detecção bem determinados. Em alternativa, quando não hã intervenção de enzimas ou não existem sistemas de detecção disponíveis, podem empregar-se bio-anãlises, anticorpos ou hibridação de ARN ou de ADN para efectuar o rastreio dos clones a fim de determinar a presença da construção plasmídica e para determinar a expressão do gene estrutural com interesse. Cultiva-se em seguida a célula hospedeira contendo a construção plasmídica integrada cromossomi camente ou fragmentos desta num meio nutriente sob condição de fermentação normais. A fermentação pode prosseguir até ã exaustão do caldo de cultura. Quando o produto for segregado, pode isolar-se o produto do caldo segundo técnicas normais, por exemplo, por extracção, por cromatografia, por electroforese ou simi lares. Quando o produto estiver retido no citoplasma, as células podem ser separadas por centrifugação, por filtração, etc., podem ser alisadas por acção mecânica por detergente, por lisozima ou por outras técnicas e o produto pode ser isolado conforme pré viamente descrito. Empregando o método exposto, pode conseguir-se a integração de forma estável de pelo menos duas cópias de uma sequência de ADN como um meio de amplificação genética.

Os exemplos seguintes fornecem-se a título de ilustração e não a título de limitação.

PARTE EXPERIMENTAL

EXEMPLO 1

Preparação de uma Biblioteca de ADN Genómico a Partir de Bacillus novo sp. PB92 Alcalofílico e Isolamento do Gene da Protease de Serina

Efectuou-se a digestão parcial do ADN cromossõmico isolado a partir de Bacillus novo sp. PB92, (depositado sob ο N9. OR-60 no Laboratorium voor Microbiologie, Technical University of Delft, Países Baixos, ver Patente dos E_s tados Unidos N9. Re. 30,602) de acordo com o procedimento descri to por Saito-Miuva, Biochim. Biophys. Acta 72 (1963) (619-632, com a enzima de restricção Sau3A e ligou-se dentro do local Bam Hl do plasmídeo pUBllO (Gryczan e outros, J. Bacteriol. 134 (1978) 318-329). Preparou-se o ADN plasmídico de pUBllO conforme descrito por Birnboim e Doly (Nucl. Acids Res. 7_ d⁹⁷⁹) 1513-1523).

A mistura de ligação foi transforma da em B. subtilis 1A40 (Bacillus Genetic Stock Centre) de acordo com o método de Spizizen e outros, J. Bacteriol. 81 (1961) 741-746, utilizando 0,6-1 pg de ADN por ml de células competentes. Inocularam-se células da mistura de transformação em placas mini mas contendo: Κ,,ΗΡΟ^ a 2,8%, KH₂PO^ a 1,2%, (NH^)₂SO^ a 0,4%, citrato trissõdico.2H₂O a 0,2%, MgSO^.7H₂O a 0,04%, MnSO^.4H₂O a 0,00005%, ácido L-glutâmico a 0,4%, glucose a 0,5%, ácidos casamínicos a 0,02%, 50 pg/ml de triptofano, 20 /ug/ml de metionina, 20 ]ug/ml de lisina, 20 jug/ml de neomicina, caseína a 0,4% e agar a 1,5%. Após incubação das placas a 379 C durante a noite, uma de entre 50,000 colónias resistentes ã neomicina apresentou um acréscimo na produção de protease, conforme se determinou pelo acréscimo de precipitação de um halo de produtos de cisão de caseína em redor da colónia na placa de agar. A partir desta colónia isolou-se o ADN plasmídico de acordo com o método descrito por Birnboim e Doly, Nucleic Acids Res. 7_ (1979) 1513-1523, o qual se designou por pM58.

EXEMPLO 2

Expressão do Gene da Protease de Serina e PB92

Cultivou-se Bacillus subtilis 1A40 contendo pM58 em meio mínimo (Spizizen e outros, Proc. Natl. Acac Sei. USA 44 (1958) 1072-1078) ao qual se tinham adicionado ãcidos casamínicos a 0,02%, 50 pg/ml de triptofano, 20 jug/ml de metionina, 20 jug/ml de lisina e 20 jug/ml de neomicina. Após 24 horas, centrifugou-se a cultura e analisou-se a actividade de protease do sobrenadante utilizando dimetil-caseína como substrato (Lin e outros, J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793. Uma cultura de B. subtilis 1A40 contendo o plasmídeo pUBUO, utilizada como com paração, apresentou menos dó que 1/60 da actividade da protease apresentada pela cultura transformada por pM58. A actividade de protease foi completamente inibida por tratamento com fluoreto de fenilsulfonilo (PMSF) 1 mM, mas não por tratamento com EDTA 20 mM.

Analisaram-se sobre gel de proteína alíquotas dos sobrenadantes referidos antes, de acordo com o método de Laemmli, Nature 227 (1970) 680. Prepararam-se as amostras para análise, sobre estes geis por tratamento dos sobrenadantes com ãcido tricloro-acêtico a 5% (TCA). Após centrifugação da amostra, lavou-se duas vezes o agregado de proteína precipitada com acetona e em seguida dissolveu-se em 40 jul de tampão de amo£ tra (Tris/HCl pH 7,5, 2-mercapto-etanol a 10% v/v, glicol a 50% v/v e Azul de Bromo-fenol a 0,05%) por ebulição durante 10 minutos. Após electroforese, coraram-se os geis utilizando Azul Brilhante de Coomassie. Analisaram-se, então, por electroforese as amostras dos sobrenadantes da cultura. Utilizaram-se três estirpes diferentes de B. subtilis 1A40: uma estirpe contendo pUBUO; ou pM58; ou sem plasmídeo; e protease do Bacillus PB92 para comparação. Após electroforese coraram-se os geis com Azil Brilhante de Coomassie e descolaram-se. A amostra da estirpe 1A40 do B. subtilis que continha pM58 continha uma proteína de 31 kD, que migrou conjuntamente com a protease de Bacillus PB92. Não se detectou esta proteína na pista de comparação da estirpe de B. subtilis 1A40 que continha pUBUO.

Todas as proteases de serina possuem

pesos moleculares semelhantes. Por conseguinte, a protease de se rina de clonagem do Bacillus PB92 diferenciou-se das proteases de serina conhecidas (subtilisina de B. subtilis, subtilisina Carlsberg) , por transformação do pH58 e pUBUO na estirpe DB104 de B. subtilis negativa em relação a protease (R. Doi, J. Bacteriol. 160 (1984) 442-444) e análise das proteases extracelulares produzidas. Cultivaram-se os transformantes obtidos em meio mini mo (Spizizen e outros, supra) contendo ácidos casamínicos a 0,02 %, 50 pg/ml de histidina e 20 jug/ml de neomícina Decorridas 24 horas, tomaram-se amostras, centrifugaram-se e analisaram-se sem tratamento prévio sobre geis de histidina/MOPS contendo KOH 75 mM, histidina 40 mM, MOPS (ácido 3-(N-morfolino)-propano-sulfõni co) 100 mM a pH 7,5 e poliacrilamida a 5%. O tampão de electrofo rese continha histidina 40 mM e MOPS 100 mM, a pH 6,6. As amostras deslocaram-se em direcção ao cátodo. Detectaram-se as bandas de protease com película profissional Agfa Pan 100 (Zuidweg e outros, Biotechnol. e Bioengin. 14 (1972) 685-714). Apresentam -se estes resultados na Figura 1. Conforme apresentado, o plasmi deo pM58 contêm o gene que codifica para a protease de Bacillus PB92.

EXEMPLO 3

Sequênciação do Gene da Protease de Serina de Bacillus PB92

Determinou-se segundo o método de

F. Sanger, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 6463, a sequência completa do fragmento Ball-Hpal de pM58. Efectuou-se a clona gem de fragmentos de restricção de pM58 (ver Figura 2) nos vecto res nuplO, nupll e nupl8 do bacteriõfago M13 (Messing e outros,

Nucleic Acids Res. 9. (1981) 309-321. Efectuou-se o rastreio das inserções dos fragmentos de pM58 por hibridação em placa. Apôs sequênciação, obtiveram-se dez nucleotidos localizados no gene a distâncias regulares e repetiu-se a sequênciação, o que confirmou a sequência apresentada na Figura 5.

EXEMPLO 4

Construção do Plasmídeo pMAX-4 que contém Protease de Serina

Para se construir o plasmídeo pUCN 710 (Figura 6A) efectuou-se a digestão de pUBllO com TagI e PvuU Purificou-se em agarose de baixo ponto de fusão o fragmento que contêm o gene que confere resistência à neomicina e alinharam-se as extremidades com polimerase de Klenow e NTP’s (Maniatis, Mole cular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor 1982). Li nearizou-se o plasmídeo pUC7 (Vieira e outros, Gene 19 (1982) 259-268) com Sall e alinharam-se as extremidades, conforme descrito antes. Ligaram-se ambos os fragmentos com ligase T4 (Mania tis) e transformaram-se em E. coli JM103. A selecção foi efectua da em placas de 2xTY (Bacto-trypton a 1,6% v/v, extracto de leve dura a 1% p/v, NaCl) a 0,5%), contendo 50 pg/ml de ampicilina e 10 pg/ml de neomicina. Efectuou-se a digestão do plasmídeo resul tante, que se designou por pUCN710, com BamHI. Efectuou-se a digestão do plasmídeo pE194 (Jordanescu, Plasmid 1 (1978) 468-479) com BclI. Ligaram-se os fragmentos de ambas as digestões com ligase T4 e transformou-se em B. subtilis 1A40. Efectuou-se a selec ção em placas mínimas contendo 20 jug/ml de neomicina (ver Exempk 1). O plasmídeo obtido, pE194-neo (Figura 6A) contém o gene da neomicina e uma origem de replicação sensível à temperatura.

Efectuou-se a subclonagem do gene da protease no vector de integração pE194-neo, conforme se segue: efectuou-se a digestão de pM58 (ver Exemplo 1) com Hpal e Bali e BglII. Efectuou-se a digestão do plasmídeo pE194-neo com Hpal. Ligaram-se estes fragmentos com ligase T4 e transformaram-se em B. subtilis 1A40. Seleccionaram-se os transformantes com base na resistência à neomicina e num acréscimo de produção de protease, conforme determinada pela precipitação dos produtos de cisão da caseína (formação de um halo, ver Exemplo 1). Obteve-se o plasmí deo pMAX-4 cuja estrutura foi confirmada por analise com enzimas de restricção (ver Figura 6B).

EXEMPLO 5

EXEMPLO 5

Transformação de Protoplastos da Estirpe PB92 de Bacillus pelo pMAX-4

Cultivou-se durante a noite a estir pe PB92 de Bacillus em 100 ml de meio NBSG-X (Thorne e outros,

J. Bacteriol. 91 (1966) 1012-1020). Centrifugou-se a cultura durante 10 minutos a 4500 rpm num rotor Sorvall modelo GSA. Prepararam-se os protoplastos por incubação dos bacilos durante uma hora a 379 C em 10 ml de Meio de Fixação Alcalino (AHM)(Alkalic Holding Médium) contendo sucrose 0,5 M, MgC^ 0,02 M e Tris/maleato 0,02 M, a pH 8,0, em água esterilizada ã qual se adicionou 0,4 mg/ml de lisozima. Centrifugaram-se os protoplastos (10 minu tos a 4500 rpm), tornou-se a efectuar uma suspensão em 5 ml de tampão de AHM⁺ a pH 8,0 Lampão de AHM ao qual se adicionou'Bacto Penassay Broth a 3,5% p/v e Albumina Merieux a 0,04% p/v) mistu rou-se e, depois tornou a centrifugar-se conforme descrito antes. Após nova suspensão em 5,0 ml de meio de fixação alcalino, mistu raram-se 0,5 ml desta suspensão de protoplastos com 5 pg de água desmineralizada contendo 1 pg de ADN plasmídeo e incubou-se durante 2 minutos na presença de polietileno-glicol 8000 a 30% p/v a pH 8,0. Após diluição de 1:3 com meio AHM⁺ a pH 8,0 e centrifu gação, voltou a suspender-se o agregado num pequeno volume (1 ml + 1* de AHM e incubou-se durante 2 a 3 horas. Depositaram-se aliquotas de 100 microlitros em placas de regeneração recentemente pre paradas, contendo succinato de N.a/HCl 0,5 M a pH 8,0, agar a 1,5 % p/v, ácidos casamínicos a 0,05% p/v, extracto de levedura a 0,5% p/v, tampão de fosfato a 0,031 M, pH 8,0, glucose a 0,5% p/v, MgC12 0,02 M e Albumina Merieux a 0,02% p/v. Estas placas continham ainda 1000 jug/ml de neomícina para selecção. Após incu bação a 379 C durante, pelo menos, 72 horas, as colónias foram transferidas, por replicação, sobre as placas de agar com infusão de coração contendo 20 pg/ml de heomicina.

EXEMPLO 6

Integração de pMAX-4 no Cromossoma da Estirpe PB92 de Bacillus

Incubou-se um transformante do Ba-

cillus PB92 contendo o plasmídeo pMAX-4 em Caldo de Soja e Triptona contendo 1 pg/ml ou 20 pg/ml de neomícina, durante 24 horas a 379 C. Diluiram-se então porções de 2 ml das suspensões de cêlulas em 100 ml de TSB contendo 1 jug/ml ou 20 jug/ml de neomícina, respectivamente, e incubou-se durante 24 horas a 509 C. Decorridas 24 horas, diluiram-se novamente amostras de 5 ml de ambas as culturas, conforme descrito antes, e incubaram-se durante 24 horas a 509 C, novamente na presença de 1 jug/ml ou de 20 pg/ml de neomícina, respectivamente. Repetiu-se o último procedimento mais uma vez. Diluiram-se então 100 vezes as suspensões celulares e inocularam-se em placas de agar com Infusão de coração (Hl) contendo 1 pg/ml de neomícina para as amostras dos balões que continham 1 pg/ml de neomícina e 20 pg/ml de neomícina para as amostras dos balões que continham 20 pg/ml de neomícina. Incubaram-se as placas durante 16. horas a 509 C. Isolaram-se as colónias resistentes ã neomícina e cultivaram-se em 10 ml de meio TBS contendo 1 pg/ml de neomícina durante 16 horas a 379 C. A partir destas colónias isolou-se o ADN total (Holmes e outros, Anal. Biochem. 114 (1981) 193-197. Verificou-se a ausência de plasmídeo por electroforese do ADN em gel de agarose. A ausência do ADN plasmídico a partir das amostras nas quais não se detectou ADN plasmídico foi confirmada por transformação do ADN total em B. subtilis 1A40. As amostras que não tinham a capacidade para transformar o B. subtilis 1A40 foram consideradas isentas de plasmídeo.

Para verificar se a integração do pMAX-4 no cromossoma tinha tido lugar e de que forma, isolou-se o ADN cromossõmico total, digeriu-se com HindlII, fez-se migrar sobre geis de agarose de ADN a 0,5% e depositou-se em mancha em nitrocelulose (Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517) e hibridou-se com pM58 submetido a translacção de encaixe e marcado com 32p (Maniatis, 1982). Na Figura 7A apresenta-se o resultado desta análise.

Da selecção a 1 pg/ml de neomícina resultaram genes de protease localizados de forma encadeada no cromossoma e separados por sequências plasmídicas (estirpe PBT 109) como numa consequência de recombinação homóloga (mecanismo

tipo Campbell). Numa acumulação de 30 integrantes isolados independentemente, efectuou-se a selecção a 1 pg/ml de neomícina.

Isolou-se um integrante que continha o plasmídeo pMAX-4 localiza do aleatoriamente no cromossoma como resultado de recombinação ilegítima (estirpe PBT122). Da selecção a 20 pg de neomícina resultou uma cópia do plasmídeo pMAX-4 numa localização aleatória no cromossoma como consequência de um tipo ilegítimo de recombinação. Designou-se esta última estirpe por PBT108. As organizações genéticas das estirpes PBT109 e 108 são apresentadas nas Fi guras 7B e 7C, respectivamente. A análise cromossõmica demonstrou que a integração em PBT122 e em PBT108 ocorreu em locais di ferentes do cromossoma.

EXEMPLO 7

Estabilidade dos Genes Duplos de Protease nas Estirpes PBT108 e PBT109

Inocularam-se 100 ml de meio de pro dução (contendo: amido a 1%, lactose a 4%, K₂HPO₄ a 0,87%, extracto de levedura a 0,5%, (NH₄)₂HPO₄ a 0,5%, citrato trissõdico 2H₂O a 0,2%, MgSO₄.7H₂O a 0,05%, CaCl₂ a 0,07%, FeSO₄.7H₂O a 0,068% e 1 ml/1 de anti-espuma) sem neomícina com 0,2 ml de uma cultura em TBS preparada de um dia para o outro (379 C) da estir pe PBT108 ou PBT109 em balões de Erlenmeyer de 500 ml. Após incu bação durante 44 horas a 379 C sob constante arejamento ensaiou-se a cultura quanto a colónias resistentes ã neomícina e quanto ã actividade de protease.

Também se ensaiaram ambas as estirpes PBT108 e PBT109 em fermentadores Eschweiler contendo idêntico meio de produção para verificar o efeito do aumento de escala atê 10 1. Na Tabela 1 que se segue, resumem-se os resultados das experiências de fermentação.

TABELA 1

Estirpe	Produção Relativa de Protease *	Percentagem de células Resistentes à Neomícina Apôs Fermentação
Controlo Comparação (PB92)	100 %
PBT108	120 %	100 %
PBT	115-120 %	75-97 %

* Analisou-se a actividade da protease utilizando dimetil-caseina como substrato, conforme descrito por Lin e outros, J. Biol. Chem. 244 (1969) 789 - 793.

A análise das colónias derivadas a partir da fermentação em Eschweiler de PBT109 decorridos dois dias de cultura, demonstrou que 3 a 25% destas colónias produziam ao nível de uma estirpe que continha apenas um único gene de protease. Descobriu-se que estas mesmas colónias eram sensíveis à neomícina devido à excisão da sequência pMAX-4 por recombinação homóloga. Contudo, a análise das colónias derivadas a partir da experiência de fermentação da estirpe PBT108 demonstrou que estas células eram todas resistentes à neomícina. Tomaram-se aleatoriamente 100 destas colónias resistentes à neomícina e verificaram-se individualmente quanto ao potencial de produ ção de protease, para determinar se continham um ou dois genes produtores de protease. Todas as 100 colónias verificadas apresai taram uma produção ao nível de uma estirpe contendo dois genes, demonstrando que dois genes de protease integrados de modo aleatório no PBT108 se mantinham de forma estável sob as condições de fermentação utilizadas.

EXEMPLO 8

Construção do Vector de Integração pElatB

Efectuou-se a digestão do plasmídeo • pGB34, descrito em EPA 0134048, com as enzimas de restricção

Bcll,

Bgll e BglII. As extremidades dos

alinhadas com polimerase de Klenow e os fragmentos obtidos foram fragmentos resultantes foram no local Hpal de pE194-neo (ver Exemplo 6). Isolou-se o ADN plasmídico de pE194-neo conforme descrito por Birnboim e Doly (Nucl. Acids. Res. 7 (1979) 1513-1523).

Transformou-se a mistura de ligação em B. subtilis 1-A40, de acordo com o método de Spizizen e outros (J. Bacteriol. 81 (1961) 741-746) utilizando 0,5 a 1 ug de ADN por ml de células competentes. Colocaram-se as células da mistura de transformação em placas mínimas contendo K₂HPO₄ a 2,8%, KH₂PO₄ a 1,2%, (NH^^SO^ a 0,4%, citrato trissõdico.2H2O a 0,2%, MgSO₄.7H₂O a 0,04%, MnSO₄.4H₂O a 0,00005%, ácido glutáni. co a 0,04%, glucose a 0,5%, ácidos casamínicos a 0,02%, 50 pg/ml de triptofano, 20 pg/ml de metionina, 20 pg/ml de lisina, 20 pg/ /ml de neomícina, caseína a 0,4%, amido a 0,5% e agar a 1,5%.

Isolou-se o ADN das colónias que produzem alfa-amilase conforme descrito por Birnboim e Doly e ve rificou-se com enzimas de restricção. A partir de um destes transformantes isolou-se o plasmídeo pElatB, (ver Figura 8).

EXEMPLO 9

Transformação da Estirpe T9 de Bacillus licheniformis alfa-amilase negativa com pElatB

Efectuou-se a transformação da estirpe T9 do Bacillus licheniformis, conforme descrito em EPA 0253455, com a excepção de todo o procedimento se ter efectuado a 309 C em lugar de 379 C. Efectuou-se a selecção dos transformantes em placas mínimas contendo 20 μg/ml de neomícina. Todos os transformantes produziram amilase. A análise de enzima de res tricção efectuada em ADN preparado conforme descrito por Birnboim e Doly demonstrou que todos os transformantes continham pElatB.

EXEMPLO 10

Integração de pElatB dentro do cromossoma de B. licheniformis T9

Inoculou-se a estirpe T9 de Bacillus

licheniformis contendo o plasmídeo pElatB, em caldo de soja e Triptona (TBS) contendo 20 pg/ml de neomícina e incubou-se duran te 16 horas a 309 C. Diluiu-se uma porção de 5 ml da suspensão de células em 100 ml do mesmo meio e incubou-se a 509 C durante 24 horas.

Repetiu-se este procedimento mais uma vez. Então, diluiu-se 100 vezes a suspensão celular e colocou-se em placas de agar com Infusão de Coração contendo 10 jig/ml de neomícina. Decorridas 40 horas de incubação a 509 C, isolaram -se as colónias resistentes ã neomícina e cultivaram-se em 10 ml de meio TBS que continha 10 pg/ml de neomícina, durante 16 horas

I a 309 C. A partir destas culturas isolou-se o ADN (Holmes e outros, Anal. Biochem. 114 (1981) 193-197). Verificou-se a ausência de plasmídeos nestas células por electroforese do ADN sobre geis de agarose. As amostras nas quais o ADN de baixo peso molecular estava virtualmente ausente foram novamente verificadas na presença de ADN plasmídeo por transformação do ADN em B. subtilis 1-A40 (Spizizen e outros, 1961). Consideraram-se negativas em re lação a plasmídeos as amostras que nao possuíam capacidade para transformar o B. subtilis 1-A40 tornando-o resistente à neomícina.

Para se verificar se se tinha efectuado a integração do pElatB e de que modo, isolou-se o ADN cro) mossómico (Saito-Minwa, Biochem. Biophys. Acta 72 (1963) 619-632) , digeriu-se com EcoRI fraccionou-se sobre geis de agarose a 0,5%, depositou-se em mancha em nitrocelulose (Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517) e hibridou-se com pGB33 submetido a translacção de encaixe e marcado com 32p (ver EPA-0134048). Os resultados desta análise são apresentados na Figura 9A. Os dados indicam que teve lugar a recombinação ilegítima do pElatB daí re sultando uma estirpe que contêm um único gene de análise num local diferente do genoma em comparação com a estirpe original T5 de amilase do Bacillus licheniformis. A estirpe obtida contendo o pElatB foi designada por TB13.

EXEMPLO 11

Construção da estirpe T13F contendo Dois Genes de Amilase Separados por Sequências Cromossõmicas Endógenas

Tendo em vista desenvolver uma estirpe que contivesse dois genes de amilase separados por sequências de ADN Cromossómico endógeno, efectuou-se uma experiência de fusão entre a estirpe T5 de Bacillus 1icheniformis (a estirpe de amilase que contêm o gene original da amilase, ver EP-A-0134048) e a estirpe TB13 (a estirpe que contêm o gene da amila se integrado aleatoriamente). Efectuou-se a fusão dos protoplastos conforme descrito na EP-A-0134048, descrição que aqui se indica como referência. Antes da fusão dos protoplastos aniquilou-se a estirpe TB13 com iodoacetamida. Não se aniquilou a estirpe T5 (sensível à neomícina). Efectuou-se a selecção dos materiais de fusão em placas de regeneração contendo 10 jig/ml de neomícina

Para verificar e identificar potenciais estirpes de fusão, isolou-se o ADN cromossómico, efectuou-se a sua digestão com EcoRT, fraccionou-se sobre geis de agarose a 0,5%, depositou-se em mancha em filtros de nitrocelulose (Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517) e hibridou-se com pGB33 submetido a translacção de encaixe e marcado com 32p (ver EP-A-0134048). Apresenta-se na Figura 9B o resultado desta anãli se. Uma das estirpes de fusão obtidas, T13F, continha dois genes de amilase separados por sequências cromossõmicas endógenas.

EXEMPLO 12

Estabilidade dos Genes Duplicados da Amilase nas Estirpes T390 e T13F

Comparou-se a estabilidade da estir pe T13F, uma estirpe que contêm dois genes cromossõmicos de amilase separados por sequências cromossõmicas essenciais, com a da estirpe T390, uma estirpe com dois genes cromossõmicos de amilase dispostos de forma encadeada. A preparação da estirpe T390 en . contra-se descrita na EP-A-134048 (página 17, Tabela I) onde se L designa por B. licheniformis T5 (pGB33). Ensaiaram-se as estirO 1

pes T13F e T390 sob condições de fermentação; nomeadamente, inocularam-se 0,2 ml de uma cultura TBS(379 C) efectuada de um dia para o outro em balões de Erlenmeyer de 500 ml, contendo 100 ml de meio de produção (ver Exemplo 7; apôs esterilização ajustou-se o pH para 6,9 com NaOH) sem neomícina. Após incubação durante 6 dias a 409 C sob arejamento constante, ensaiou-se a cultura quanto às colonónias resistentes ã neomícina e à actividade de amilase. Os resultados das experiências de fermentação encontram -se resumidos no Quadro 2, seguinte.

TABELA 2

Estirpe	Actividade Relativa da Amilase	Percentagem de Células Resisten tes ã Neomícina Após Fermentação *
T5	100 %	-
TB13	20 %	100 %
T13F	120 %	100 %
T390	200 %	88 %

* Ensaiaram-se mais de mil colónias por estirpe.

Para excluir a possibilidade de excisão de um gene de amilase sem perda concomitante do gene da neomícina na estirpe T13F, analisaram-se 20 colónias derivadas da fermentação de T13F. Isolou-se e caracterizou-se por hibridação, conforme descrito antes, o ADN cromossómico de 20 colónias tomadas de forma aleatória. Apresentam-se na Figura 10 os resultados de 9 destas analises. Todas as estirpes ensaiadas continham doi genes de amilase, conforme se demonstrou pela presença de fragmentos EcoRI contendo doi genes de alfa-amilase nos seu ADN cromossómico.

Em contraste com a estabilidade genética da estirpe T13F, verificou-se que a estirpe T390 apresentava instabilidade na fermentação, originando 12% de colónias sensíveis ã neomícina. Analisou-se uma destas colónias e descobriu-se que continha apenas um gene de alfa-amilase (Figura 10, pista 4). Isto demonstra que os genes de amilase integrados alea o

toriamente são mais estáveis do que os genes integrados de modo encadeado, sob condições de fermentação.

A partir dos resultados anteriores, ê evidente que se pode obter uma célula procariõtica na qual se consegue a amplificação estável do gene por selecção das células transformadas nas quais ocorrem a integração de modo não encadea do de, pelo menos, duas cópias do gene estrutural a ser amplificado. A integração pode ocorrer por recombinação homóloga ou por recombinação ilegítima.

Todas as publicações e Pedidos de Patente mencionados na presente especificação revelam o grau de especialização dos especialistas a quem pertence a presente invenção.

Indicam-se aqui como referência todas as publicações e pedidos de Patente com o mesmo alcance que teriam se se indicasse cada publicação ou pedido de patente indi_ vidual e especificamente como referência.

Uma vez que a presente invenção se encontra completamente descrita, será evidente para o especiali£ ta que nela se poderão efectuar numerosas alterações e modificações sem alterar o espírito ou o âmbito das reivindicações em anexo.

Claims (1)

1. Processo para a preparação de uma célula hospedeira procariõtica transformada contendo pelo menos duas copias de uma sequência de ADN que codifica para um polipejD tídeo de interesse, estando as referidas copias separadas por se quências de ADN cromossômico endógenas no genoma da referida célula hospedeira, caracterizado por compreender:

   a combinação de uma célula hospedeira receptora conten do pelo menos uma cópia da referida sequência de ADN integrada no respectivo cromossoma com (a) uma construção de ADN contendo pelo menos uma cópia da referida sequência de ADN e pelo menos um gene de marcação ou uma origem de replicação sensível à tempe ratura, ou então (b) uma célula hospedeira dadora contendo a referida construção de ADN, sob condições de transformação;

   a selecção de um transformante em que a referida construção de ADN esteja integrada no respectivo cromossoma; e o isolamento de entre os referidos transformantes de células hospedeiras procariõticas transformadas contendo pelo me nos duas cópias da referida sequência de ADN separadas por sequências de ADN endógenas.

   Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por a referida selecção compreender;

   o crescimento do referido transformante contendo uma construção de ADN que contêm um gene de marcação na presença de um biocida ao qual o referido gene de marcação confere resistência; e a identificação e o isolamento a partir dos referidos transformantes de transformantes isentos de plasmídeos.

   Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por a referida selecção compreender:

   o crescimento do referido transformante contendo uma construção de ADN que contêm um gene de marcação e uma origem de replicação sensível ã temperatura na presença de um biocida a uma temperatura não permissiva; e a selecção a partir dos referidos transformantes de transformantes isentos de plasmídeos.

   Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por o referido isolamento compreender: o isolamento de ADN cromossõmico a partir dos referidos transformantes; e a hibridação do referido ADN cromossõmico com uma sonda marcada contendo a referida construção de ADN ou um seu fragmento, sendo as referidas células hospedeiras procariõticas traní formadas seleccionadas por detecção da referida marcação.

   Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por compreender:

   a combinação de uma célula hospedeira procariõtica que não tem uma sequência de ADN que codifica para o referido polipeptídeo de interesse com a referida construção de ADN sob condi ções de fusão;

   o isolamento das células transformadas;

   o crescimento das referidas células a uma temperatura não permissiva; e a identificação e o isolamento a partir das referidas células transformadas nas quais a referida construção estã integrada numa localização no cromossoma diferente da localização na referida célula hospedeira receptora.

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a referida célula procariética pertencer ao gênero Bacillus.

   ção 6, caracterizado por Bacillus alcalofilica ou

   Processo de acordo com a reivindica o referido Bacillus ser uma estirpe de uma estirpe de Bacillus licheniformis.

   Processo de acordo com a reivindica ção 7, caracterizado por a referida estirpe de Bacillus alcalofí lica ser Bacillus novo species PB92 e a referida estirpe de B. licheniformis ser a estirpe T5 de Bacillus licheniformis.

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado por o referido polipeptídeo de interesse ser uma enzima.

   Processo de acordo com a reivindica ção 9, caracterizado por a referida enzima ser uma enzima proteo lítica ou uma enzima amilolítica.

   - 11- Processo de acordo com a reivindica ção 9, caracterizado por a referida enzima ser uma protease de serina ou uma amilase.

   Processo de acordo com a reivindica ção 11, caracterizado por a referida protease de serina ter pelo menos 70% de homologia na sequência nucleotídica com um gene que codifica para uma enzima proteolítica de Bacillus novo species PB92.

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 12, caracterizado por a referida protease de serina ter substancialmente a seguinte sequência de ácidos amina dos:

   H₂N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-VL-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G-HG-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V-K-V-LG-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L-S-L-G-SP-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-SI-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-LD-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-AG-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-TN-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.

   - 14- -

   Processo de reivindicações 1 a 13, caracterizado por de ADN ser pMAX-4 ou pElatB. acordo com qualquer das a referida construção - 15- -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 14, caracterizado por a referida sequência de ADN ser integrada por recombinação ilegítima.

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 14, caracterizado por a referida sequência de ADN ser integrada por recombinação homóloga.

   η n

   Μί,

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 14, caracterizado por a referida construção de ADN conter adicionalmente uma origem de replicação sensível à temperatura.

   - 18- Processo de acordo com a reivindica ção 17, caracterizado por o referido plasmídeo sensível à temperatura ser derivado do plasmídeo pE194.

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 18, caracterizado por a estirpe transformada obtida ser a estirpe Bacillus PBT108, PBT122 ou T13F.