CN103290048B - 一种适用于芽孢杆菌属同源重组的质粒及工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种适用于芽孢杆菌属同源重组的质粒及工程菌，包括序列8的线性片段。所述质粒以16SrDNA的序列作为同源臂，同源臂之间为卡那抗性筛选标记基因、P43启动子、多克隆位点、终止序列。本发明的质粒可以将各种目的基因整合在芽孢杆菌属各种菌上，并可以获得含有不同拷贝数目的基因的转化子，实现目的基因在芽孢杆菌属的稳定高效表达。此外，我们利用此质粒构建了pKD314-apr4M重组质粒，并且通过同源重组方法获得了含有不同拷贝数稳定高产的工程菌。

Description

一种适用于芽孢杆菌属同源重组的质粒及工程菌

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种适用于芽孢杆菌属同源重组的质粒及工程菌。

技术背景

芽孢杆菌是分泌型基因工程宿主菌。研究表明，很多外源蛋白也在枯草芽孢杆菌中实现了分泌表达（表1），因此，用枯草芽孢杆菌生产外源蛋白越来越为人们所关注。

表1在枯草芽孢杆菌中表达的重组蛋白

芽孢杆菌作为外源基因的表达***有以下几个优点：枯草芽孢杆菌拥有一套高效的分泌信号肽及分子伴侣***，从而能够高效的分泌目的蛋白，也简化了目的蛋白的分离纯化步骤，而且在多数情况下，芽孢杆菌分泌的重组异源蛋白具有天然构象和生物活性；芽孢杆菌严格好氧、生长迅速、培养条件简单、大规模发酵技术成熟；多数芽孢杆菌使用安全，无致病性；密码子无偏爱性，转录翻译机制、遗传背景较清楚。

目前对枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌属的基因改造主要集中在通过遗传导入表达质粒实现游离表达，但是通过此种方法构建的工程菌遗传特性不稳定。在生产过程中需加入抗生素防止质粒丢失，很难普及到工业生产上。另外，采用同源重组方法将表达基因整合到染色体上，但是只能整合上一个拷贝数，且同源重组效率较低，效果不明显。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种适用于芽孢杆菌属同源重组的质粒及工程菌，本发明的质粒可以将各种目的基因整合在芽孢杆菌属各种菌上，并可以获得含有不同拷贝数目的基因的转化子，实现目的基因在芽孢杆菌属的稳定高效表达

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种适用于芽孢杆菌属同源重组的质粒，包括序列8的线性片段。

而且，所述质粒以16SrDNA的序列作为同源臂，同源臂之间为卡那抗性筛选标记基因、P43启动子、多克隆位点、终止序列。

而且，所述序列8的线性片段连接在质粒pMD18Tsimple-16SrDNA的pstI酶切位点。

一种芽孢杆菌工程菌，利用适用于芽孢杆菌属同源重组的质粒构建得到。

一株嗜碱芽孢杆菌工程菌，利用适用于芽孢杆菌属同源重组的质粒，将多拷贝目的基因apr4M整合到染色体16SrDNA上的工程菌。

本发明的优点和积极效果如下：

1、本发明在分析16SrDNA序列高度保守，拷贝数高且具有反馈调节作用（***致死一个或几个拷贝的16SrDNA，16SrRNA的总量保持不变，不会影响菌体正常的生长代谢活动）的特性的基础上，设计并构建了本发明提供的适用于芽孢杆菌属同源重组质粒，解决了通过游离表达改良菌种遗传特性不稳定以及很难通过同源重组方法将表达基因以多拷贝的形式整合到染色体上的问题，利用本质粒成功的构建了含有不同拷贝数的嗜碱芽孢杆菌工程菌，所构建工程菌的单位细胞产酶量较野生型提高了278%左右。

2、本发明的质粒可以将各种目的基因整合在芽孢杆菌属各种菌上，并可以获得含有不同拷贝数目的基因的转化子，实现目的基因在芽孢杆菌属的稳定高效表达。此外，利用此质粒构建了pKD314-apr4M重组质粒，并且通过同源重组方法获得了含有不同拷贝数稳定高产的工程菌。

附图说明

图1为本发明中同源重组载体pKD314结构图；

图2为本发明所构建不同拷贝数目的基因初筛结果；

图3为本发明所构建重组质粒pKD314-apr4PCR验证图；

图4为本发明所构建菌株中PCR验证的核酸电泳图其中M:DNAMarker1、2：同源重组成功，3：未被重组；

图5为本发明所测酶活测定的标准曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

一种适用于芽孢杆菌属同源重组的质粒：以16SrDNA的序列作为同源臂，同源臂之间为卡那抗性筛选标记基因、P43启动子、多克隆位点、终止序列。

一株嗜碱芽孢杆菌工程菌，利用由pKD314构建的质粒pKD314-apr4M将多拷贝目的基因整合到染色体16SrDNA上的工程菌。

上述同源重组质粒以及嗜碱芽孢杆菌工程菌的构建及检测步骤是：

一、构建pMD18Tsimple-16SrDNA质粒。

二、kan抗性基因连在全序列合成表达调控原件psg（P43启动子、多克隆位点、终止序列）上，构建kan-psg。表达调控原件psg具体序列见序列7。

三、将kan-psg线性片段连在被pMD18Tsimple-16SrDNA质粒上，构建成同源重组质粒pKD314，pKD314具体结构见图1。

四、将嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶成熟肽编码基因apr4连在pKD314多克隆位点上构建成pKD314-apr4质粒。

五、用ECORV限制性内切酶酶切重组质粒pKD314-apr4M得到线性片段，将线性片段电转入嗜碱芽孢杆菌。

六、比较工程菌和原始菌单位细胞产酶能力。

本发明菌株的构建的详细步骤如下：

一、同源重组载体的构建

二、1.各基因的扩增

⑴芽孢杆菌16SrDNA的基因扩增

以嗜碱芽孢杆菌（经序列比对整个芽孢杆菌属16SrDNA的同源性在95%以上，故选其中的一种菌的基因组作为模板）为模板进行PCR，再通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到目的基因片段。所需要的引物如下：

P15′-CGGATATCGAGAGTTTGATCCTGGCTGGCTCAG-3′(ECORV)

P25′-CGGATATCAAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′(ECORV)

反应体系为50μL，配比如下：

PCR程序如下:

95℃预变性5min；94℃变性45s；57℃退火45s；72℃延伸1min30s；30个循环后72℃延伸10min；4℃保存。

⑵卡纳抗性基因（kan）的扩增

以质粒pBE2为模板进行PCR，再通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到目的基因片段。所需要的引物如下：

P35′-CGGACTAGTGCCGATGAAGATGGATTTTCTATTA-3′(SpeI)

P45′-GGGACTAGTGCGCCCCGGGTTCGAAGGGCA-3′(SpeI)

反应体系为50μL，配比如下：

PCR程序如下:

95℃预变性5min；94℃变性45s；58℃退火45s；72℃延伸1min30s；30个循环后72℃延伸10min；4℃保存。

⑶成熟肽基因（apr4）的扩增

首先，以嗜碱芽孢杆菌基因组为模板进行PCR，再通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到目的基因片段。所需要的引物如下：

P55′-CGCGGATCCCAATCAGTGCCATGGGGAAT-3′(BamHI)

P65′-CCCAAGCTTTTAGCGTGTTGCCGCTTC-3′(HindIII)

反应体系为50μL，配比如下：

PCR程序如下:

95℃预变性5min；94℃变性45s；58℃退火45s；72℃延伸1min30s；30个循环后72℃延伸10min；4℃保存。

2.通用重组载体pKD314的构建，构建过程如下

⑴将质粒pMD18Tsimple与16SrDNA基因相连后得到质粒pMD18Tsimple-16SrDNA。

⑵根据NCBI(GenBankaccessionNo.K02174.1)查找P43启动子序列以及(GenBankaccessionNo.AAA22212)查找终止序列，根据报道的序列设计合成的序列，在启动子和终止子之间引入多克隆位点。具体序列psg见序列7。序列合成委托invitrogen公司。合成的质粒命名为pUC57-psg。

⑶将卡那抗性基因kan用限制性内切酶SpeI酶切后连到pUC57-psg的SpeI酶切位点上得到质粒pUC57-kan-psg。

⑷质粒pUC57-kan-psg用限制性内切酶pstI酶切得到线性片段(线性片段见序列8)，将此线性片段连接在质粒pMD18Tsimple-16SrDNA上得到质粒pKD314，其中质粒pMD18Tsimple-16SrDNA也需经过pstI酶切，然后再连接。

以上载体构建过程所用的连接酶均为T4DNA连接酶，连接体系为20μL，连接体系如下：目的基因：载体（摩尔浓度之比）=3:1-9:1，加入适量0.2ul连接酶混匀，在16°C下，过夜反应。

酶切体系为50μL，具体配比为。

37℃酶切3h，酶切产物中加入限制性内切酶附带的10×LoadingBuffer5μL终止反应。1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

3.高产碱性蛋白酶嗜碱芽孢杆菌的构建

⑴重组质粒pKD314-apr4M的构建

将pKD314经BamHI和HindIII双酶切后与碱性蛋白酶成熟肽基因apr4相连，得到重组质粒pKD314-apr4。

载体构建过程所用的连接酶均为T4DNA连接酶，连接体系为20μL，连接体系如下：目的基因：载体（摩尔浓度之比）=3:1-9:1，加入适量0.2ul连接酶混匀，在16°C下，过夜反应。

ECORV双酶切重组质粒得到同源重组线性片段。酶切体系为50μL。

37℃酶切3h，酶切产物中加入限制性内切酶附带的10×LoadingBuffer5μL终止反应。1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，对切胶回收4.3kb的线性片段。质粒PCR验证图见图2。

⑵重组片段的电转

将冻存的嗜碱芽孢杆菌感受态细胞（TCCC11263）在冰上溶化后，取50μL加入重组线性片段混合均匀，然后转移到冰预冷的电击杯中。使用高压脉冲电击转化电击该细胞混合物电脉冲结束后，迅速将细胞悬液转移到室温复苏培养基的EP管中，振荡培养一段时间，复苏后培养基连续稀释后取150μL转化液涂布1%脱脂乳平板（含有30μg/mL的卡那霉素）筛选阳性克隆。结果见图3。

⑶重组转化子的验证

挑选抗性平板上的单菌落，接种于含40μg/mL卡那霉素LB培养基中，32℃摇床培养24小时，提取基因组。

PCR验证，验证引物为P1、P2。

反应体系为20μL，配比如下：

PCR程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性45s；61℃退火45s；58℃延伸1min30s；30个循环后72℃延伸10min；4℃保存。

验证结果见图4。

（四）、单细胞重组菌产酶能力测定

取新鲜平板上的细菌单菌落接入25mL种子培养基中，34℃、180r/min恒温摇床培养12h；按1%的接种量接入50mL发酵培养基中，相同的培养条件培养48h。发酵液于4℃、8000r/min离心，上清液即为粗酶液。离心所获得的菌体用无菌水悬浮，测OD₆₀₀。

以轻工业部颁标准QB/T1803-93（Folin试剂显色法）：1mL酶液在40℃，pH10.5，每分钟反应产生1μg酪氨酸所需要的酶量为1个酶活力单位（U/mL）。

1.标准曲线的绘制

配制不同浓度的酪氨酸标准溶液（0、10、20、30、40、50、60μg/mL）。取酪氨酸标准溶液1.00mL，加0.4mol/L的碳酸钠溶液5.00mL、福林试剂溶液1.00mL，置于40±0.2℃水浴中显色20min。取出，用分光光度计分别测定其吸光度A680（以不含酪氨酸的管为空白）。以吸光度A680为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）。

2.粗酶液用硼砂－NaOH（pH10.5）缓冲溶液稀释至适当浓度，作为待测酶液。

硼砂/NaOH（pH10.5）缓冲液配制1%的酪素溶液作为底物并将粗酶液稀释适当的倍数。取1mL稀释的酶液，40℃保温2min，加入同样温度的底物1mL，于40℃反应10min，加入2mL10%三氯乙酸终止反应。静置离心，取1mL上清液，加入5mL0.4mol/LNa₂CO₃溶液、1mL福林酚试剂，混匀，40℃保温20min，测定吸光度A680。以灭活酶液为对照。

酶活计算方法

X=A×K×4/10×n＝0.4×A×K×n

式中：X—样品的酶活力（U/g或U/mL）

A—样品平行试验的平均吸光度

K—吸光常数

4—反应试剂的总体积（mL）

10—反应时间

n—稀释倍数

不同浓度的酪氨酸标准溶液的吸光值与酪氨酸浓度的数值关系如图5所示。

以酪氨酸浓度为横坐标，680nm处的吸光值为纵坐标作图，见图5。取直线斜率的倒数为K值。通常K值应在95-100范围内。经计算，K=98，符合标准曲线的要求。所测酶活/OD₆₀₀即为单位细胞产酶能力，结果单位细胞产酶能力重组菌较野生菌提高了278%左右。

（五）重组菌遗传稳定性验证

将基因工程菌在不含抗性的1/3LB平板上连续划线传代100次，分别取10、20、30、40、50、60、70、80、90、100代的菌种进行发酵，发酵条件同上。实验结果是单位细胞产酶量保持稳定，重组菌遗传特性稳定。

Claims (1)

1.一种芽孢杆菌工程菌，包括序列8的线性片段，所述质粒以16Sr DNA的序列作为同源臂，同源臂之间为卡那抗性筛选标记基因、P43启动子、多克隆位点、终止序列，所述序列8的线性片段连接在质粒pMD18Tsimple-16SrDNA的pstI酶切位点，具体构建过程如下：

同源重组载体的构建

[1].各基因的扩增

⑴芽孢杆菌16S rDNA的基因扩增

以嗜碱芽孢杆菌为模板进行PCR，所述嗜碱芽孢杆菌经序列比对整个芽孢杆菌属16SrDNA的同源性在95％以上，故选其中的一种菌的基因组作为模板，再通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到目的基因片段，所需要的引物如下：

P1 5′-CGGATATC GAGAGTTTGATCCTGGCTGGCTCAG-3′

P2 5′-CGGATATC AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′

反应体系为50μL，配比如下：

PCR程序如下:

95℃预变性5min；94℃变性45s；57℃退火45s；72℃延伸1min30s；30个循环后72℃延伸10min；4℃保存，

⑵卡那抗性基因(kan)的扩增

以质粒pBE2为模板进行PCR，再通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到目的基因片段，所需要的引物如下：

P3 5′-CGGACTAGTGCCGATGAAGATGGATTTTCTATTA-3′

P4 5′-GGGACTAGTGCGCCCCGGGTTCGAAGGGCA-3′

反应体系为50μL，配比如下：

PCR程序如下:

95℃预变性5min；94℃变性45s；58℃退火45s；72℃延伸1min30s；30个循环后72℃延伸10min；4℃保存，

⑶成熟肽基因apr4的扩增

首先，以嗜碱芽孢杆菌基因组为模板进行PCR，再通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到目的基因片段，所需要的引物如下：

P5 5′-CGCGGATCCCAATCAGTGCCATGGGGAAT-3′

P6 5′-CCCAAGCTTTTAGCGTGTTGCCGCTTC-3′

反应体系为50μL，配比如下：

PCR程序如下:

95℃预变性5min；94℃变性45s；58℃退火45s；72℃延伸1min30s；30个循环后72℃延伸10min；4℃保存，

[2].通用重组载体pKD314的构建，构建过程如下

⑴将质粒pMD18Tsimple与16SrDNA基因相连后得到质粒pMD18Tsimple-16SrDNA，

⑵根据NCBI GenBank accession No.K02174.1查找P43启动子序列以及GenBank accession No.AAA22212查找终止序列，根据报道的序列设计合成的序列，在启动子和终止子之间引入多克隆位点，具体序列psg见序列7，序列合成委托invitrogen公司，合成的质粒命名为pUC57-psg，

⑶将卡那抗性基因kan用限制性内切酶SpeI酶切后连到pUC57-psg的SpeI酶切位点上得到质粒pUC57-kan-psg，

⑷质粒pUC57-kan-psg用限制性内切酶pstI酶切得到线性片段，所述线性片段见序列8，将此线性片段连接在质粒pMD18Tsimple-16SrDNA上得到质粒pKD314，其中质粒pMD18Tsimple-16SrDNA也需经过pstI酶切，然后再连接，

以上载体构建过程所用的连接酶均为T4DNA连接酶，连接体系为20μL，连接体系如下：目的基因：载体的摩尔浓度之比＝3:1-9:1，加入适量0.2ul连接酶混匀，在16℃下，过夜反应，

酶切体系为50μL，具体配比为，

37℃酶切3h，酶切产物中加入限制性内切酶附带的10×Loading Buffer 5μL终止反应，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，

[3]高产碱性蛋白酶嗜碱芽孢杆菌的构建

⑴重组质粒pKD314-apr4M的构建

将pKD314经BamHI和HindIII双酶切后与碱性蛋白酶成熟肽基因apr4相连，得到重组质粒pKD314-apr4，

载体构建过程所用的连接酶均为T4DNA连接酶，连接体系为20μL，连接体系如下：目的基因：载体的摩尔浓度之比＝3:1-9:1，加入适量0.2ul连接酶混匀，在16℃下，过夜反应，

ECORV双酶切重组质粒得到同源重组线性片段，酶切体系为50μL，

37℃酶切3h，酶切产物中加入限制性内切酶附带的10×Loading Buffer 5μL终止反应，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，对切胶回收4.3kb的线性片段，质粒PCR验证；

⑵重组片段的电转

将冻存的嗜碱芽孢杆菌感受态细胞TCCC11263在冰上溶化后，取50μL加入重组线性片段混合均匀，然后转移到冰预冷的电击杯中，使用高压脉冲电击转化电击该细胞混合物电脉冲结束后，迅速将细胞悬液转移到室温复苏培养基的EP管中，振荡培养一段时间，复苏后培养基连续稀释后取150μL转化液涂布1％脱脂乳平板，含有30μg/mL的卡那霉素，筛选阳性克隆；

⑶重组转化子的验证

挑选抗性平板上的单菌落，接种于含40μg/mL卡那霉素LB培养基中，32℃摇床培养24小时，提取基因组，

PCR验证，验证引物为P1、P2，

反应体系为20μL，配比如下：

PCR程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性45s；61℃退火45s；58℃延伸1min30s；30个循环后72℃延伸10min；4℃保存。