LT4001B - Process for preparing transformed prokaryotic host cell, stable gene amplification in the chromosome dna of prokaryotic microorganisms - Google Patents

Process for preparing transformed prokaryotic host cell, stable gene amplification in the chromosome dna of prokaryotic microorganisms Download PDF

Info

Publication number
LT4001B
LT4001B LTIP1826A LTIP1826A LT4001B LT 4001 B LT4001 B LT 4001B LT IP1826 A LTIP1826 A LT IP1826A LT IP1826 A LTIP1826 A LT IP1826A LT 4001 B LT4001 B LT 4001B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
dna
bacillus
strain
recipient
chromosome
Prior art date
Application number
LTIP1826A
Other languages
English (en)
Inventor
Christiaan Albertus Vaneekelen
Johannes Cornelis Vanderlaan
Leonardus Johannes S Mulleners
Original Assignee
Gist Brocades Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8197582&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=LT4001(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Gist Brocades Nv filed Critical Gist Brocades Nv
Publication of LTIP1826A publication Critical patent/LTIP1826A/xx
Publication of LT4001B publication Critical patent/LT4001B/lt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Šio išradimo sritis priskiriama prokariotinėms ląstelėms, kuriose gauta stabili geno amplifikaciją panaudojant ne mažiau dviejų tam tikros sekos DNR kopijų išsklaidytą netandeminį įterpimą į aukščiau paminėtos prokanotinės ląstelės chromosomą.
Bacilos plačiai naudojamos pramoninių fermentų, tokių kaip alfa-amilazė, neutrali proteazė ir šarminė ar serino proteazės, gamybai (žr. Debado Bacilų panaudojimas pramonėje knygoje Bacilų molekulinė biologija, Acad. Press, New York, 1982) .
Bacillus fermentų gamybos tobulinimas galimas tiek panaudojant klasikinius genetinius būdus, tokius kaip mutacijos ir po jų sekanti selekcija, tiek ir šiuolaikinius molekulinius-biologinius būdus. Paskelbta keletas homologinių ir heterologinių genų aukšto lygio ekspresijos tam tikruose prokariotiniuose ir eukariotinūuose organizmuose pasiekimo būdų, tam tikslui panaudojant genetinę inžineriją.
Vienas iš geno aukšto lygio ekspresijos pasiekimo būdų yra geno papildymas efektyviomis reguliacinėmis sekomis. Kitas būdas, dažnai naudojamas derinyje su pirmuoju, yra reikiamo geno kopijų pagausinimas. Pirmiausia amplifikacij a gaunama įterpiant daugiakopijinę nechromosominę DNR molekulę tokią kaip plazmidė. Tačiau norint panaudoti plazmides kaip vektorius genetinės informacijos ekspresijai ir amplifikacijai žymia kliūtimi yra jų nestabilumas. Amplifikuoto geno stabilumas yra būtina sąlyga norint išlaikyti ekspresijos produkto, kurį koduoja amplifikuotas genas, aukštą produkcijos lygį, kadangi ląstelės turi daugelį kartų pasidalinti, kol susidarys pakankama biomasė, reikalinga norimo produkto didelei gamybai.
Yra dvi nestabilumo formos: segregacinis nestabilumas, kuomet plazmidė prarandama kultivavimo metu, ir struktūrinis nestabilumas, kuomet įvyksta kai kurių plazmidės rajonų delecija. Segregacinis nestabilumas gali pasireikšti, pavyzdžiui, tada, kuomet ląstelė-recipientė turi vektorių, nešantį geną, pasižymintį stipria ekspresija. Apskritai, nokiu atveju pasireikš selekcinis spaudimas ląstelėms, prarandančiom, sugebėjimą superekspresuoti geną, kadangi superekspresija yra nepageidautina transformuotos ląstelės-recepientės savybė. Geno superekspresuotam produktui išeikvojama daug metabolinės energijos, o tai neigiamai veikia ląstelės konkurentinį sugebėjimą (augimo greitis) palyginus su ląstelėmis-recipientėmis, kurioms tokia superekspresija nebūdinga.
Būdas, kurį panaudoja segregacinio nestabilumo išvengimui, grindžiamas atranka ląstelių, turinčių daugiakopijines plazmidės, nešančias genus, suteikiančius plazmidę turinčiai ląstelei pirmenybę, pavyzdžiui, atsparumą antibiotikui. Tuomet į fermentinę terpę pridėjus atitinkamo antibiotiko, galima atrinkti šias atsparias ląsteles. Tačiau stambiamastės pramoninės gamybos procesuose antibiotikai paprastai nėra naudingos atrankos priemonės, kadangi jie gali neigiamai veikti fermentinį procesą ar patį produktą.
Kitas būdas, naudojamas plazmidės praradimo, kurį sąlygoja segregacinis nestabilumas, sumažinimui, grindžiamas svarbaus ląstelei-recipientei funkciniu požiūriu geno įterpimui į vektorinę molekulę (Ferrari ir kt., Biotechnology, 3 (1985) 1003-1007). Tačiau šis metodas nelaiduoja vektoriaus struktūrinio stabilumo.
Būdai, naudojami struktūrinio plazmidės nestabilumo problemai išspręsti, grindžiami geno ekspresijos eksponentinėje augimo fazėje išvengimui. Pavyzdžiui, tam tikslui panaudojamos reguliacinės sekos, tokios kaip temperatūrai jautrios reguliacinės sekos, o taip pat galima Įterpti egzogeninę DNR į ląstelės-recipientės chromosomą. Kiti naudojami būdai grindžiami tuo, kad vengiama panaudoti autonomiškai besireplikuojančias vektorines molekules, o vietoje to naudojami būdai, palengvinantys įvestos DNR įsiterpimą į ląstelės-recipientės chromosomą.
Svetimos DNR įterpimo į ląstelės-recipientės chromosomą būdai grindžiami homologinė rekombinacija ir netaisyklinga rekombinacija. Yra du DNR sekų įterpimo ą atitinkamą vietą chromosomoje būdai, panaudojant homologinę rekombinaciją: Campbell tipo ir dviguba reciprokinė rekombinacija. Šie būdai parodyti atitinkamai Fig. IA ir Fig. IB. Trečias DNR sekų įterpimo į chromosomą būdas - tai būdas, naudojantis dviejų stadijų pakeitimo mechanizmą. Jis parodytas Fig. IC. Iš esmės čia panaudojama Campbell tipo rekombinacija, tačiau jos galutiniu rezultatu yra chromosoma, neturinti duplikuotų sekų. Tuo pačiu metu chromosomos rekombinuotoj e dalyje nėra amplifikuoto vieneto. Tokiu būdu šis procesas panašus į dvigubą reciprokinę rekombinaciją .
Svetimos DNR įterpimui į chromosomą be homologinės rekombinacijos galima naudoti netaisyklingą rekombinaciją. Integruotos vektorinės molekulės gali būti atrinktos parenkant tokias sąlygas, kurios slopintų ne30 integruotų vektorinių molekulių replikaciją. Netaisyklingos replikacijos panaudojimas įterpimui pavaizduotas Fig. ID. Tai, kad gautuose chromosominiuose dariniuose nėra tandeminių duplikacijų, būdams, parodytiems Fig. IB, C ir D, suteikia privalumą naudojant juos stabiliam DNR sekų įterpimui į genomą. Genai, įterpti į chromosomą, gali būti tiek homologiniai, tiek ir heterogeniniai genai. įterptos į chromosomą DNR amplifiLT 4001 B kacija vykdoma tandemine tvarka. Skelbiama, kad šie chromosomoje amplifikuoti genai yra nestabilūs, nors kartais pasitaiko darbų, rodančių šių genų stabilumą. Tokiu būdu, pageidautina surasti metodus, kurių pagalba DNR, įterpta į chromosomą, liktų stabili.
Literatūros apžvalga
Egzogeninės DNR įterpimas į Bacillus subtilis chromosomą homologinės rekombinacijos būdu aprašytas Duncan ir kt. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7 5 (1978) 3664-3668, o į Anacystis hidulans - Williams ir Szalay, Gene, 24, (1983) 37-51 ir Tarptautinėje patento paraiškoje W0084/00381. Paraiškoje EP-A-0127328 aprašytas heterologinio geno, negalinčio stabiliai išsilaikyti plazmidinio vektoriaus sąstate, įterpimas į mikroorganizmo chromosomą panaudojant homologinę rekombinaciją.
Paskelbti duomenys apie tiek homologinių, tiek heterologinių genų, įterptų į chromosomą, amplifikaciją. Žr., pavyzdžiui: Saito ir kt. Ketvirto tarptautinio simpoziumo pramoninių mikroorganizmų klausimais medžiaga, Kioto, Japonija, 1982, p.125-130; Youny, J. Gen. Microbiol., 130 (1984) 1613-1621; Jeanniere ir kt. Gene 40, (1985) 47-56; Surgent ir Benett, J. Bacteriol. 161, (1985) 589-595; Gutterson ir Koshland, Proc. Natl. Acad, Sci, USA, 80, (1983), 4894-4898; Hashiguchi ir kt. , Agric. Biol. Chem. 4 9, (1985) 545-550; Wilson ir Morgan, J. Bacteriol. 163, (1985), 445-453; prancūzų patentinė paraiška Nr. 84.06701; ir EP-A-0134048.
Taip pat aprašyta spontaninė amplifikacija prokanotinėse ląstelėse. Žr., pavyzdžiui, apžvalgą Anderson ir Roth, Ann. Rev. Microbiol. 31, (1977) 473-505.
Visais aukščiau aprašytais atvejais į chromosomą įterptos DNR amplifikacija vykdyta tandemine seka. SkelLT 4001 B biama, kad šio tipo chromosominė sekos amplifikacija yra nestabili, nors kai kuriais atvejais -stebėtas žymiai didesnis stabilumas negu aprašyta Janniere ir kt. , Gene, 4 0, (1985), 47-55.
Yra duomenų apie gamtinių amplifikuotų prokariotinių genų stabilizaciją, kuri atsiranda dėl svarbių genų, esančių tarp šių amplifikuotų sekų. Pavyzdžiui, B. subtilis esantys du tandemiškai išsidėstę ribosominės RNR geno 9-10 kopijų rinkiniai yra atskirti tRNR genų klasteriu (Waumausen ir Hansen, J. Biol. Chem. 258, (1983), 291-298. Kitais atvejais tiek E. coli, tiek B. subtilis sutinkami gamtiniai tandemiškai pasikartojantys ribosominės RNR operonai buvo deletuoti, ir tai turėjo nedidelę įtaką organizmo fenotipiniams ypatumams: atitinkamai Elwood ir Momura, J. Bacterioi. 143, (1980), 1077-1080 ir Houghney ir kt. J. Bacterioi.
j__5_4, (1983) 525-532.
Hofemeister ir., Mol. Gen. Genet. 189 (1983) 58-63 ir
Prozorov ir kt. Gene 34, (1985), 39-46 aprašė plazmidės įterpimą į B. subtilis chromosomą tam tikslui panaudojant netaisyklingą rekombinaciją.
Sėkmingai klonuoti keletas bacilų ekstraląstelinių fermentų genų, tokių kaip alfa-amilazės genai, išskirti iš B. amyloliguefaciens (Pulva ir kt. Gene, 15, (1981),
43-51), iš B. licheniformis (Ortlepp, Gene 23 (1983),
267), iš B. stearothermophiius (Mielenz ir kt. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, (1983), 5975-5979; EP-A0057976) ir iš B. subtilis (Yang ir kt. Nucleic Acids REs. 11, (1983), 237); levansukrazės genas, išskirtas iš B. subtilis (Gay ir kt., J. Bacterioi. 153, (1983),
1424); genai, koduojantys neutralią proteazę, išskirti iš B. stearothermophiius (Fuji ir kt. J. Bacterioi.,
156, (1983), 831), iš B. amyloliguefaciens (Honjo ir kt. , J. Biotech., 1, (1984), 165) ir iš B. subtilis (Yang ir kt., J. Bacteriol., 160, (1984), 115); genai, koduojantys serininę ar šarminę proteazę, išs.kirti iš B. subtilis (Wong ir kt., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, (1984), 1184), iš B. licheniformis (Jacobs ir kt.
Nucleic Acids Res., 13, (1985), 8913) ir iš B.
amyloliguefaciens (Wells ir kt., Nucleic Acids Res. 11, (1983), 7911) .
Paskelbti duomenys apie kai kurių gramteigiamų mikro10 organizmų protoplastų transformaciją. Chang ir Cohen (Mol. Gen. Genet. 168, (1979), 111-115) aprašė B, subtilis protoplasto transformaciją, kuri šiuo metu plačiai naudojama. Aprašytas panašus sėkmingas B. megaterium protoplasto transformacijos būdas (Vorobjovą ir kt. , FEMS Microbiol. Letters, Ί_, (1980), 261-263),
B. amylcliguefaciensis (Fisher ir kt., Arch. Microbiol. 139, (1981), 213-217), B. sphaericus (McDonald, J. Gen.
Microbiol., 130, (1984), 203), ir B. larvae (Bachiet ir kt. , Appl. and Env. Microbiol. 4 9, (1985), 577). Toje pačioje publikacijoje pranešta apie neigiamus rezultatus, gautus dirbant su B. papillae. Šis būdas buvo sėkmingas taikant ji B. polymyxa, B. licheniformis, B. macerans, B. laterosporus, tačiau nedavė teigiamų rezultatų B, coagulans, B. cereus ir B. pumilus atvejais, nors ir buvo stebimas geras protoplastų susidarymas (Mann ir kt. , Current Microbiol. 13, (1986), 131-135).
Kiti DNR įterpimo į protoplastus būdai grindžiami suliejimu su liposomomis, turinčiomis DNR (Holubova, Folia
Microbiol. 30, (1985), 97), arba protoplasto suliejimu su lengvai transformuojamu organizmu kaip tarpine ląstele-recipiente (EP-A-0134048).
Trumpas išradimo turinys
Siūlomos prokariotinės ląstelės-recipientės ir jų paruošimo būdai, kurių pagrindą sudaro DNR sekos, koduo7 jančios norimą peptidą, ne mažiau dviejų kopijų stabilus įterpimas į ląstelės-recipientės chromosęmą. Svetimos DNR sekos stabilus išlaikymas pasiekiamas įterpiant į ląstelės-recipientės chromosomą dvi ir daugiau sekos kopijas, kurios tarpusavyje atskiriamos endogeninės chromosominės DNR sekomis.
Trumpas figūrų iliustracijų aprašymas
Fig. 1A-D schematiškai pavaizduoti keturi nechromosominės DNR sekų įterpimo į prokariotinių organizmų chromosomą būdai.
T - seka-taikinys, tai yra chromosomoje ir plazmidėje esančios DNR sekos, tarp kurių gali vykti homologinė rekombinacij a.
S - DNR seka, kurią reikia įterpti į chromosomą.
M - rekombinantinio kamieno atrankai naudojamo markerinio geno seka.
Fig. 2A ir 2B schematiškai pavaizduoti du geno stabilios amplifikacijos prokariotinėj e chromosomoje gavimo būdai.
Fig. 3 parodyti histidin/MOPS gel-elektroforezės rezultatai, gauti tiriant B. subtilis DB104, turinčios pnBUO arba pM58, kultūros supernatantą ir lyginant su kai kuriais subtilizinais:
takelis: Carlsberg subtilizinas takelis: Bacillus PB92 proteazė takelis: Bacillus subtilis subtilizinas takelis: Bacillus subtilis DB104 (pM58) takelis: Bacillus subtilis DB104 (pnBUO)
Fig. 4 pavaizduota plazmidės pM58 restrikcinė kartograma. Be to, paveikslėlio viršutinėje dalyje parodyta sekvenavimo strategija. Ištisinės linijos su strėlėmis - tai fragmentai, klonuoti fago M13 vektoriuose mp 10, mp 11 ir mp 18. Apatinėje paveikslėlio dalyje pavaizduota sekvenavimo strategija, panaudojant dešimt oligonukleotidų, išdėstytų proteazės gene vienodais tarpais.
Fig. 5 pavaizduota koduojančios grandinės nukleotidinė seka, atitinkanti Bacillus PB92 šerininės proteazės aminorūgščių seką. Taip pat parodyti promotoriai (Pi, P2), ribosomų surišimo saitas (rbs) ir DNR sekos terminacijos rajonai (term). Sunumeruotos ištisinės linijos nurodo sekvenavimui naudotų dešimties oligonukleotidų išsidėstymo vietą.
Fig. 6A pavaizduotas plazmidės pE194-neo konstravimas.
Fig. 6B pavaizduotas plazmidės pMAX-4 konstravimas.
Fig. 7A pavaizduotas radioautografas, gautas atlikus sekantį tyrimą:
kamienų PB92, PBT109 ir PBT108 chromosominės DNR skaldomos Hind 111, po elektroforezės 0,5 % agarozės gelyje produktai pernešami ant nitroceliuliozės ir hibridinami pagal Southern su nik-transliacija 32P pažymėta pM58 DNR.
Fig. 7B ir 7C parodoma integracija, gauta panaudojant homologinę (B) rekombinaciją ir netaisyklingą (C) rekombinaciją tarp pMAX-4 ir Bacillus PB92 chromosomos.
Fig. 8 parodytas integracinio vektoriaus pElatB konstravimas .
Fig. 9A iliustruoja plazmidės pElatB įterpimą į B. licheniformis kamieno T9 chromosomą, tuo būdu gaunant B. licheniformis kamieną TB13.
Fig. 9B iliustruoja B. licheniformis kamienų TB13 ir T5B rekombinaci]ą, suliejant šių kamienų protoplastus ir po to gaunant B. licheniformis kamieną T13F.
Fig. 10 parodoma devynių skirtingų kolonijų, gautų po kamieno T13 poveikio fermentais, aprašyto 11 pavyzdyje, chromosominė analizė. Išskirta chromosominė DNR veikiama Eco Rl, elektroforetiškai frakcionuojama 0,8 i agarozės gelyje ir pernešama ant nitroceliuliozės. Po to hibridinama su nik-transliacij a 32P pažymėta pElatB DNR. Piešinyje - radioautografas. Viršutinė strėlė rodo poziciją, į kurią migruoja 15000 bazių porų ilgio Eco Rl DNR fragmentas, turintis pilną pElatB seką, kuri buvo įterpta į chromosomą dalyje, nesančioje šalia pradinio alfa-amilazės geno, priešingai tam, kaip tai buvo padaryta kamieno TB13 atveju, kuris pavaizduotas Fig. 9A. Apatinė strėlė rodo poziciją, į kurią migruoja 33000 bazių porų ilgio Eco Rl DNR fragmentas, turintis visą alfa-amilazės geną, iš pradžių buvusį B. liche-
niformis sekantys T5 kamiene (žr. taip pat DNR pavyzdžiai: Fig . 9B). Analizuoti
1 takelis : Bacillus licheniformis T 5 DNR
2 takelis : Bacillus licheniformis TB13 DNR
3 takelis : Bacillus licheniformis T390 DNR
takelis: DNR, išskirta iš neomicinui jautraus Bacillus licheniformis kamieno T390, paveikto fermentais, kaip tai aprašyta 12 pavyzdyje.
takelis: Bacillus licheniformis T13F DNR
6-14 takeliai: 9 skirtingų kolonijų, išskirtų iš kamieno T13F paveikus fermentais, kaip tai aprašyta 12 pavyzdyje, DNR.
Pavyzdžiai
Šis išradimas siūlo prokariotines ląsteles, jų paruošimo būdus, pagal kuriuos dvi ar daugiau DNR sekų kopijų stabiliai įterpiamos į chromosomą. Ląstelė-recipientė, į kurią įterpiama DNR seka, koduojanti norimą polipeptidą, yra transformuojama panaudojant DNR konstrukciją, turinčią aukščiau paminėtą DNR seką. Po to atrenkamos transformuotos ląstelės, kuriose įterptos DNR sekos atskirtos endogeninėmis chromosominėmis sekomis.
Paprastai endogeninės tarpinės sekos yra svarbios ląstelei-recipientei. Amplifikuotų sekų praradimas dėl homologinės rekombinacijos bus letališkas ląstelei-recipientei. Tokiu būdu pasireikš selekcinis spaudimas ląstelėms, turinčioms amplifikuotas sekas, ir nereikės naudoti antibiotikų ar kitų panašių atrankos priemonių, įterpti galima panaudojant homologinę rekombinaciją arba netaisyklingą rekombinaciją. Fig. 2A ir 2B pavaizduoti būdai, kuriuos galima panaudoti norimų ląstelių gavimui.
Naudojant homologinę rekombinaciją, vektorinėse molekulėse gali būti tarpai, homologiški ląstelės-recipientės chromosomai, ypač jeigu viena ar daugiau amplifikuoto geno kopijų jau Įterpta į ląstelę-recipientę.
Tokiu būdu, vektorinė molekulė gali turėti savo su11 detyje norimą DNR seką, seką-DNR taikini, ir marketinę DNR seką.
Reikia atkreipti dėmesį į tai, kad atrenkamos tik norimos rekombinantinės chromosominės struktūros. Tai pasiekiama naudojant rekombinacijai linijines DNR molekules. Žiedinė vektorinė molekulė, kurią reikia įterpti, skaidoma restr ikcimais fermentais homologijos su seka-taikiniu srityje, tokiu būdu rekombinacija ir įterpimas vyks pasirinktinai šioje specifinėje vietoje. Be to, kai norima DNR seka yra vektorinėje molekulėje, ji taip pat gali būti ir ląstelės-recipientės chromosomoje. DNR seka gali būti ląstelei-recipientei endogeninė arba gali būti įterpta į recipientės chromosomą pradinėje transformacijos stadijoje.
Sekas-taikinius netandeminei genų amplifikacijai geriau parinkti iš nereikšmingų genų tarpo. Pavyzdžiui, kai recipientiniai organizmai yra Bacilli, tuo atveju sekomis-taikiniais galima panaudoti genus, koduojančius ekstra ląstelinius fermentus arba sporuliacijos genus. Kaip taisyklė, DNR sekų įterpimas į šiuos genus iššauks pastarųjų inaktyvaciją. Geno ekspresijos netekimas gali būti patikrintas ir panaudotas norimų rekombinantiniu kamienų atrankai.
Chromosominio geno amplifikacij ai naudojant netaisyklingą rekombinaciją, kaip tai parodyta Fig. ID ir 2A, geriau parinkti tokias įterpimo ir atrankos sąlygas, kuriose homologinė rekombinacija neviršija netaisyklingos rekombinacijos. Homologinės rekombinacijos galima išvengti transformuojant pirmą ir antrą ląstelesrecipientes, neturinčias norimo struktūrinio geno. Tam tikslui panaudojamas vektorius, turintis DNR seką, koduojančią norimą polipeptidą ir markerinį geną. Po to pirmoji ir antroji ląstelės-recipientės, kuriose DNR seka yra skirtingose chromosomos vietose, gali būti atLT 4001 B rinktos ir sujungtos suliejant. Tokiu būdu gaunama transformuota ląstelė, turinti ne mažiau dviejų DNR sekų, koduojančių norimą struktūrini, geną, išdėstytą skirtingose antrosios ląstelės recipientės genomo vietose. Norint palengvinti atranką, pirmoji ląstelė-recipientė prieš suliejimą turi būti užmušta.
Interesuojantis genomas (kuriame yra norimi genai) gali būti iš prokariotines arba eukariotinės ląstelės. Šie genai gali būti: bakteriniai genai, vienaląsčių mikroorganizmų genai, žinduolių genai ir pan. Struktūrinius genus galima paruošti ^vairiais būdais, panaudojant tame tarpe sintezę, genominės DNR išskyrimą, cDNR paruošimą arba jų rekombinaciją. Įvairūs manipuliacijų su genais būdai gerai žinomi. Tai: restrikcija, iškirpimas, ligavimas, mutagenezė in vitro, pirminė reparacija, linkerių ir adapterių panaudojimas ir pan. Tokiu būdu gautos DNR sekos gali būti apdorotos įvairiais būdais, parinktais pagal DNR konstrukciją (Maniatis ir kt., Molekulinis klonavimas, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982).
Struktūriniai genai gali ekspresuoti daugelį polipeptidų ir baltymų, tokių kaip fermentai, hormonai, limfokinai, paviršiaus baltymai, kraujo baltymai, statybiniai baltymai, imuncglobuiinai ir pan., priklausančių žinduoliams, vienaląsčiams mikroorganizmams, pvz., grybų bakterijoms tokioms kaip mielės, hifiniai grybai, jūrų dumbliai, pirmuonys ir t.t., o taip pat jie gali būti augalinės bei kitokios kilmės. Ypatingo dėmesio susilaukia fermentai, tame tarpe proteazės ir amilazės. Tokių fermentų pavyzdžiu gali būti serininės ir neserininės proteazės. Pastarųjų tarpe - labai šarmingos serininės proteazės, alfa- ir beta-amilazės ir pan. Serininių proteazių geras šaltinis yra Bacillus novo species PB92, o alfa-amilazės- T5 B. licheniformis, bei šių kamienų variantai ir mutantai.
Geną kaip sudėtinę atitinkamo vektoriaus dalį galima gauti įvairiais žinomais šiuolaikiniais būdais. Paprastai, iš organizmo, ekspresuojančio labai šarmingą proteazę, paruošiama genominė biblioteka. Pastarąją pa5 togu paruošti iiguojant donorinio kamieno DNR fragmentus prie tinkamo vektoriaus.
Terminu Tinkamas vektorius įvardinamas DNR darinys (konstrukcija), savo sudėtyje turintis struktūrinį gę10 ną, koduojantį norimą baltymą arba polipeptidą. Struktūrinis genas sujungiamas teisingai orientuojant su kontroliniais rajonais, tokiais kaip promotorinė seka, seka, formuojanti ribosomų surišimo sritį ir sekos, kontroliuojančios struktūrinio geno transliacijos ir transkripcijos terminaciją, t.y. su tokiais kontroliuojančiais rajonais, kurie funkcionuoja recipientinėje ląstelėje.
Kuomet ląstelė-recipientė pasižymi per žemu transfor20 macijos ir integracijos dažniu, kaip tai būna, pvz., pramoninių Bacillus kamienų atveju, tam, kad būtų išspręstas tiesioginės įterpimo atrankos klausimas, nenaudojant tarpinio ląstelių, turinčių plazmidės, išskyrimo, reikia į vektorių papildomai įjungti replikacijos pradmens vienetą, sąlygojantį autonominę replikaciją ląstelėj e-recipientej e.
Tuo atveju, kai genas gaunamas iš donorinės ląstelės, turinčios transkripcijos ir transliacijos, iniciacijos ir terminacijos reguliacinius signalus, kuriuos atpažįsta recipientiniai prokariotinių ląstelių kamienai, patogu išsaugoti struktūrinio geno pradines reguliacines sekas. Be to, transkripcijos reguliacijos gali sąlygoti konstitucinę arba indukuojamą ekspresiją ir todėl, esant atitinkamai situacijai, recipientą galima kultivuoti iki didelio tankio, kol bus pasiektas tikslinių struktūrinių genų aukštas ekspresijos lygis.
Tuo atveju, kai struktūriniai genai gauti iš šaltinio, kurio reguliacinių signalų ląstelė-recipientė. neatpažįsta, reikia turėti reguliacinius signalus, kuriuos atpažįsta recipientinė ląstelė. Struktūrinis genas turi būti įterptas tarp iniciacijos ir terminacijos reguliacinių signalų. Kartais egzogeninį struktūrinį geną, turintį nuosavą stopkodoną (kodonus), galima įterpti skaitymo rėmelyje po išsaugojusio savo reguliacinius signalus endogeninio struktūrinio geno N-galinių kodonų .
Pageidautina, kad ekspresijos produktas būtų sekretuojamas. Tai nesudėtinga realizuoti tuo atveju, kai ekspresijos produktas išsiskiria natūralia eiga ir recipientinė ląstelė atpažįsta lyderinius ir procesingo (brendimo) signalus. Tačiau tuo atveju, kai produktas neišskiriamas todėl, kad ląstelė-recipientė neatpažįsta sekrecijos lyderinių signalų ir/arba procesingo signalo (signalų), arba šie signalai nepakankamai veiklūs recipientėje, tuomet reikia išskirti arba susintetinti DNR sekas, koduojančias ląstelės-recipientės sekrecijos lyderinius ir polipeptido procesingo signalus ir prijungti jas taisyklingame skaitymo rėmelyje prie struktūrinio geno 5' galo.
Papildomai į vektorių galima įjungti markerinį geną, suteikiantį atsparumą antibiotikui, kuriam ląstelė recipiente yra jautri. Naudojant vektorių chromosominei integracijai, markerinis genas privalo atitikti išgyvenamumo atrankos galimybės reikalavimus, nežiūrint to, kad recipientėje bus tik viena ar keletas markerinio geno kopijų. Markeriniu genu laikomas struktūrinis genas, galintis ekspresuotis lastelėje-recipientėje ir sąlygojantis pastarosios išgyvenamumą selekcijos sąlygomis. Tai gali būti fototrofiškumo suteikimas auksotrofinei recipientei, atspariai biocidams arba virusams. Fototrofiškumo suteikimui gali būti panaudoti įvairūs genai, tokie kaip lui, his, trp ir pan. Markeriais gali tarnauti atsparumas sunkiesiems metalams, imunitetas ir pan. Įvairias DNR sekas galima gauti iš įvairių DNR šaltinių, sujungti jas kartu į vektorių, turintį vieną ar daugiau patogų, pageidautina, unikalų restrikcijos saitą. Tai leidžia į šiuos saitus įterpti arba pakeisti struktūrinius genus, arba juos įterpti į paprastų fragmentų vietą, tuo būdu konstruojant plazmidinį darinį.
u
Plazmidę su replikacijos pradmens vienetu, turinčiu mutaciją, sąlygojančią šio geno veiklos recipientinėj e ląstelėje priklausomybę nuo temperatūros, galima panaudoti chromosominio įterpimo atrankai (Ehrlich, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 75 (1978) 1433).
Sukonstruotą plazmidinį darinį galima klonuoti tam tikslui panaudojant tinkamą klonavimo šeimininką. Galima panaudoti bet kokį šeimininką, kuris patogus, lengvai transformuojasi, leidžia plazmidiniui dariniui repiikuotis. Po to pastarąjį darinį galima pernešti į ląstelę-recipientę. Yra daug kamienų, pasižyminčių aukštu transformacijos efektyvumu, auksotrofiškurnu ir/arba jautrumu antibiotikui. Kuomet ląstele-recipien25 te parenkamas Bacillus pramoninis kamienas, jis turi daug privalumų, tame tarpe ir klonuojant plazmidini darinį. Jis leidžia panaudoti vieną replikacinę sistemą, o taip pat vieną ir tą patį markerį išgyvenamumo atrankai tiek klonavimo šeimininke, tiek ir recipien30 tiniame kamiene (Europos patentas EP-A-134048).
Plazmidinį darinį galima įterpti į klonavimo šeimininką, panaudojant patogius būdus, tokius kaip: transformacija, DNR kalcio precipitacij a, konjugacija ir pan.
Po to klonavimo šeimininką galima išauginti tinkamoje maitinimo terpėje selekcijos sąlygomis, leidžiančiomis atrinkti šeimininką, turinti plazmidini darinį.
Auksotrofiniams šeimininkams naudojama maitinimo terpė, stokojanti būtinos maitinimo medžiagos. Tuo tąrpu biocidimam atsparumui, pvz., atsparumui antibiotikams, patikrinti į maitinimo terpę pridedami biocido (biocidų) citotoksiniai kiekiai.
Galima naudoti įvairias ląsteles-recipientes, tokias kaip E. coli, Bacillus, ypač Bacillus subtilis, Pseudomonas ir Streptomyces kamienus. Pasirenkant ląstelę-recipientę atsižvelgiama į įvairius faktorius, tame tarpe ir į tokius, kurie gali turėti įtakos ampiifikuoto geno ekspresijai ir norimo produkto gamybai. Geriausia panaudoti ląstelę-recipientę, kurioje galimas reguliacinių signalų atpažinimas, sekrecijos palengvinimas, norimo produkto degradacijos sumažinimas ir t.t. Tinkamiausia recipientinė ląstelė, kuri jau produkuoja norimą polipeptidą ir gali būti arba laukinio tipo, arba mutantinio tipo organizmas. Recipiente taip pat gali būti organizmo, produkuojančio norimą polipeptidą, mutantas, kuris liovėsi produkavęs. Kada norimu polipeptidų yra proteazė ar amilazė, tinkamiausi kamienai yra atitinkamai Bacillus novo species PB92 ir T5 Bacillus licheniformis, o taip pat šių kamienų mutantai ir variantai.
Be to, dar galima panaudoti ir pramoninius kamienus, pasižyminčius norimais privalumais. Kamienų, kuriuos galima panaudoti pavyzdžiais yra kamienai, naudojami pramoninei fermentų gamybai, tokie kaip B. licheniformis, B. amyloliguefaciens ir bazofilinės bacilos. Pramoniniai kamienai atrenkami iš organizmų, kuriuos galima išskirti iš dirvos arba gauti iš bankų ar kitų šaltinių, arba gaunami modifikuojant turimus kamienus. Pramoniniai kamienai labai našūs ir stabilūs. Dar daugiau, šie kamienai atsparūs faginei infekcijai ir genetiniams mainams, kuriems priklauso ir DNR įterpimas, panaudojant transformacijos būdus. Tinkami pramoniniai kamienai yra taip pat fototrofiški tam, kad nereiktų į maitinimo terpę papildomas brangias aminorūgštis.
Kiti pramoninių kamienų ypatumai yra jų aukštas produktyvumas, išsilaikantis iki fermentacijos, kuri gali tęstis net savaitę, pabaigos; stabili ląstelių koncentracija rkr bulijono išsekimo ir specifinio sekretuojamo baltymo aukštas produkcijos lygis (įprastas ne mažiau 5 g/1 - 0.5 % (masė/tūris).
Galima gauti transformantus, turinčius arba tandemiškai išdėstytus genus, arba išsklaidytus išilgai chromosomos. Paprastai galima atrinkti transformantus, turinčius išsklaidytus genus tam tikslui išskiriant iš abiejų tipų transformantų mišinio chromosominę DNR iš kiekvieno transformanto, po to analizuojant šią DNR ir nustatant genų lokalizaciją, pvz., Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517, metodu ar kokiu kitu būdu.
Vengiant tandeminio įterpimo, transformantus su išsklaidytais genais galima gauti panaudojant DNR linijines konstrukcijas, turinčias DNR seką, kurią reikia amplifikuoti, markerinį geną ir seką-taikinį rekombinacijai dvigubos reciprokinės rekombinacijos būdu kaip tai parodyta Fig. IB ir 2B.
Dar daugiau, transformantus su išsklaidytais genais galima gauti panaudojant netaisyklingą rekombinaciją, pavaizduotą Fig. 2A. Jos metu galima išvengti tandeminių transformantų, panaudojant atranką ir markerinio geno (pvz., koduojančio atsparumą antibiotikui) diferencinę ekspresiją, kuomet kamienų su netandeminiu ir tandeminiu geno įterpimu jautrumas antibiotikui skirtingas. Dažniausiai įterptų endogeninių DNR sekų ilgis mažiau 10.000 bazių porų.
Be to, vengiant tandeminės duplikacijos transformantus su išsklaidytais genais galima gauti protoplastus, gautus iš homologinio donorinio kamieno, turinčio DNR konstrukciją, sudarytą iš struktūrinio geno ir markerinio geno, kurioje, palyginus su akceptoriniu kamienu, struktūrinis genas yra kitoje chromosomos vietoje.
Recipientinių ląstelių transformacijai geriausiai panaudoti protoplastus, paruoštus iš recipientinio kamieno. Protoplastai ruošiami iš ląstelių įprastiniais būdais, pvz., paveikiant lizocimu arba zimoliaze. Po to protoplastai atsargiai suspenduojami terpėje, kurios osmotiškumas tinkamas protoplastų išsilaikymui. Protoplastų iš Bacillus pramoninių kamienų paruošimo būdai aprašyti EP-A-0134048, kuris čia pateikiamas kaip literatūros šaltinis. Kuomet recipientinių kamienu parenkamas bazofilinis Bacillus kamienas, protoplastai gali būti paruošti esant šarminiam pH, geriau 8.0. Šis būdas aprašytas Europos patente Nr. EP-A-87200358.7.
Ląstelė recipiente transformuojama suliejant plazmidinį darinį arba klonavimo šeimininko protoplastą su ląstetam tikslui panaudojant Galima naudoti bet kurį Paprastai, polietilenglilės-recepientės protoplastų tinkamą suliejimo reagentą, pakankamai aktyvų reagentą, kolis sąlygoja pakankamai efektyvų suliejimą: Po trumpo laikotarpio reakcijos mišinys pakeičiamas tinkama maitinimo terpe. Ląstelės regeneruoja selektyvioje terpėje išsėjus į lėkšteles su agaru.
Transformantai, gauti suliejus ląstelę-recipientę su tinkama DNR konstrukcija, gali turėti šią visą konstrukciją arba jos dalį kaip sritį, įterptą į chromosomą. Jei DNR konstrukcija turi replikacijos pradmens vienetą, funkcionuojantį recipienteje, tuomet DNR konstrukcija ląstelėje bus laisvos vektorinės molekulės pavidalu .
Transformantų, turinčių DNR konstrukciją, įterptą į chromosomą, selekcijos būdas grindžiamas plazmidės, turinčios temperatūrai jautrų replikacijos pradmens vienetą, panaudojimu. Transformantai auginami selektyvioje terpėje optimalioje temperatūroje, po to temperatūra pakeičiama į neoptimalią. Kolonijos, ekspresuojančios markerinį geną neoptimalioje temperatūroje išskiriamos ir auginamos selektyvioje terpėje optimalioje temperatūroje. Plazmidės nebuvimas gali būti patikrintas, pvz., suminės DNR išskyrimu iš kolonijų ir jos elektroforeze agaro gelyje arba transformantų nesugebėjimu transformuoti kompetentines ląsteles. Įsiterpimo į chromosomą tipas gali būti nustatytas chromosominės DNR analize, aprašyta Southern, J. Mol. Biol. 98, (1975) 503-517 arba kitais žinomais būdais.
Kuomet transformantai, turintys papildomas tandemiškai išdėstytas markerinio geno kopijas, palyginus su transformantais, turinčiais išsklaidytą recipientės genome markerinį geną, pasižymi diferenciniu jautrumu selektyviam agentui, tada transformantus galima auginti terpėje su selektyviniu agentu, tam kad būtų atrinkti transformantai su netandeminiais intarpais.
Transformantus su išsklaidytai įterptomis norimomis DNR sekomis galima gauti ir kitu būdu, panaudojant protoplastus, paruoštus iš homologinių donorinių ląstelių, turinčių nors vieną norimos DNR sekos kopiją, esančią kitoje negu recipientinės ląstelės chromosomos vietoje.
Homologinė donorinė ląstelė gali būti paruošta, transformuojant ląstelę, neturinčią norimo struktūrinio geno. Tam tikslui panaudojamas vektorius turintis norimą struktūrini geną. DNR seka į donorinės ląstelės chromosomą gali būti įterpta lengvesniu būdu - panaudojant plazmidę, turinčią temperatūrai jautrų replikacijos pradmens vienetą ir po to auginant transformantą selekcijos sąlygomis iš pradžių optimalioje temperatūroje, o vėliau neoptimalioje temperatūroje kaip tai .aprašyta aukščiau. Kolonijos, ekspresuojančios markerini geną, išskiriamos.
b
Po to, kai įsitikinama, kad nėra plazmidinės DNR, galim išskirti chromosominę DNR ir ištirti ją Southern metodu (žr. aukščiau) hibridizuoj ant su zondu, pažymėtu, pvz., 32P arba biotinilintu nukleotidų. Zondu gali būti cDNR, koduojanti norimą polipeptidą, arba jos fragmentai, o taip pat ir DNR konstrukcija arba jos fragmentai, turintys savo sudėtyje norimą DNR seką, pvz., vektorius. Transformantai, turintys norimą geną kitoje vietoje, palyginus su genu, esančiu donoriniame kamiene, gali būti po to panaudoti kaip homologinė donorinė ląstelė. Recipientiniu kamienu geriau parinkti tą kamieną, kuris naudojamas kaip norimos DNR sekos šaltinis, arba tą kamieną, kuriame norima DNR seka yra kitoje chromosomos vietoje, negu transformuotos donorinės ląstelės.
Siekiant palengvinti atranką, donorinė ląstelė užmušama citotoksiniu agentu prieš ar protoplasto susidarymo metu. Donorinės ląstelės užmušimui galima naudoti įvairius agentus, tame tarpe ir antibiotikus. Pastebėta, kad patogiu efektyviu agentu, neveikiančiu būsimo suliejimo, yra jodoacetamidas. Naudojant klonavimo šeimininko užmuštus protoplastus, santykis užmuštų protoplastų su akceptoriniu recipiento kamienu turi būti ne mažiau 1:1 arba galima naudoti užmuštų protoplastų per30 teklių.
Suliejus užmuštos donorinės ląstelės protoplastą su recipientinės ląstelės protoplastų, transformantai gali būti atrinkti panaudojant markerinį geną. Po to DNR ga35 Įima išskirti ir ištirti kaip tai aprašyta aukščiau. Identifikuojami transformantai, kurių genome yra įsiterpusios daugiau kaip viena norimo geno kopijos, atLT 4001 B skirtos tarpusavyje endogeninėmis chromosominėmis sekomis .
Transformantai su išsklaidytais genais skrininguojami ieškant variantų, pažyminčių norimo polipeptido padidinta ekspresija. Tam tikslui naudojami įvairūs būdai, pvz., naudojami fermentai. Tais atvejeis, kai nėra fermentų ar nėra tinkamos ieškojimo sistemos, klonų skriningui galima naudoti bioanalizę, antikūnus, DNR ar RNR hibridizaciją, siekiant identifikuoti plazmidinę konstrukciją ir norimo struktūrinio geno ekspresiją.
Be to, recipientinė ląstelė, turinti i chromosomą Įterptą plazmidinę konstrukciją arba jos fragmentus, auginama maitinimo terpėje tinkamose fermentacijai sąlygose. Fermentacija tęsiasi, kol išsenka bulijonas. Jeigu produktas sekretuoj amas, tai jis išskiriamas iš bulijono, panaudojant atitinkamą būdą, pvz., ekstrahavimą, chromatografiją, elektroforezę ir pan. Jeigu produktas lieka citoplazmoje, tuomet ląsteles galima surinkti centrifuguojant ar filtruojant ir t.t., jas lizuoti mechaniškai arba detergentu, lizocimu ar kitokiu būdu ir išskirti produktą kaip tai aprašyta aukščiau. Naudojant šiame išradime aprašytą būdą, galima stabiliai įterpti ne mažiau dviejų DNR sekų kopijų, pasiekiant geno amplifikaciją.
Sekantys pavyzdžiai pateikiami kaip iliustracija, kuri neišsemia visų galimybių.
EKSPERIMENTINĖ DALIS pavyzdys
Genominės DNR bibliotekos iš bazofilinio Bacillus novo species PB92 kamieno paruošimas ir serininės proteazės geno išskyrimas
Chromosominė DNR, išskirta iš Bacillus novo sp. PB92 10 (saugoma Olandijoje, Delfte, Technikos Universiteto mikrobiologijos laboratorijoje, Nr. OP-60. žr. patentą
JAV Nr. Pi 30.602) pagal būdą, aprašytą Saito-Miuva, Biochim. Biophys. Actą, 72 (1963) 619-632, po to paveikta restrikciniais fermentais Sau 3A ir liguota Bam iii saite į plazmidę puBllu (Gryczan ir kt., J. Bacteriol. 134 (1978) 318-329) . puBUO plazmidinė DNR paruošta kaip aprašyta Birnboim ir Boly, Nucl. Acids Res., 7_, (1973) 1513-1523.
2C Liguotas mišinys transformuojamas į B. subtilis 1A40 (Bacilų saugojimo Genetinis Centras) pagal metodą, aprašytą Spizizen ir kt., J. Bacteriol., 81 (1961) 741746, panaudojant 0,6-1 ųg DNR/lml kompetentinių ląstelių.
Ląstelės iš transformuojančio mišinio išsėmimas į minimalias lėkšteles su 2,8 % KH2PO4; 1,2 % KH2PO4; 0,4 % (NH4)2SO4; 0,2 % tris-Na-citrato-2H20; 0,04 % MgSO4*7H2O; 0,00005 % MnSO4*4H2O; 0,4 % L-gliutaminines rūgšties;
0, 5 % gliukozės; 0,02 % kazamininių rūgščių; 50 μ/ml metionino; 20 ųg/ml lizino; 20 ųg/ml neomicino; 0,4 % kazeino ir 1,5 % agaro. Po lėkštelių ir inkubacijos per naktį 37°C temperatūroje viena iš 50.000 kolonijų, atsparių neomicinui, pasižymėjo padidinta proteazės pro35 dukcija. Tai buvo nustatyta pagal padidėjusį precipitacijos lauką, atsiradusį aplink koloniją ant agaro ir kazeino skaldymo produktų. Plazmidinė DNR išskirta iš šios kolonijos pagal metodą, aprašytą Birnboim ir Doly (Nucleic Acids Res. J_ (1979) 1513-1523) ir. pažymėtą pM58.
pavyzdys
Serininės proteazės geno PB92 ekspresija
Bacillus subtilis 1A40, turinti pM58, išauginta minimalioje terpėje (Spizizen ir kt. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 44 (1958) 1072-1078), į kurią pridėta 0,02 % kazanininių rūgščių; 50 ųg/ml lizino ir 20 ųg/ml neomicino. Po 24 vai. kultūra nucentrifuguojama ir patikrinamas supernatanto proteazinis aktyvumas panaudojant kaip substratą dimetilkazeiną (Lin ir kt. , J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793). Kultūra B. subtilis 1A40, turinti plazmidę puBUO, panaudota kaip kontrolė, kurios proteazinis aktyvumas sudarė mažiau kaip 1/60 kultūros, transformuotos pM58, proteazinio aktyvumo. Proteazinį aktyvumą slopino 1 mM fenilsulfonilfluorido (PMSF), bet ne 20 mM EDTA.
Aukščiau paminėti supernatantai išanalizuoti baltyminiame gelyje pagal būdą, aprašytą Laemmli, Nature 227 (1970) 680. Mėginiai šiai analizei paruošiami supernatantą paveikiant 5 % trichloracto rūgštimi (TChA). Po to centrifuguojama, precipituoto baltymo nuosėdos 2 kartus plaunamos acetonu, po to ištirpinamos 40 μΐ buferio (0,5 M Tris*HCl, pH 7,5; 10 % (tūrio) 2-merkaptoetanolio; 50 % (tūrio) glicerino ir 0,05 % bromfenolio mėlynojo) virinant 10 min. Kultūrų supernatanto mėginiai tiriami elektroforetiškai. Ištirti trys skirtingi B. subtilis 1A40 kamienai: kamienai, turintys puBUO arba pM58, kamienas be plazmidės ir Bacillus PB92 proteazė kaip kontrolė. Po elektroforezės geliai dažomi Kumasi briliantiniu mėliu ir atplaunami. B. subtilis kamieno 1A40, turinčio pM58, mėginys turėjo 31 kDa baltymą, kuris migravo kartu su Bacillus PB92 proteaze. Šis baltymas neaptiktas kontroliniame - kamieno B, subtilis 1A40, turinčio puBUO, takelyje.
Visos serininės proteazės turi vienodą molekulinę masę. Todėl klonuota Bacillus PB92 serininė proteazė diferencijuojama nuo visų kitų žinomų serininių proteazių (B. subtilis subtilizino, Carlsberg subtilizino) transformuojant pM58 ir puBUO į beproteazinį B. subtilis kamieną DB104 (R. Doi, J. Bacteriol. 160 (1984) 442444) . Po to analizuojama produkuojama ekstraląstelinė proteazė. Gauti transformantai auginami minimalioje terpėje (Spizizen ir kt. , žr. aukščiau), turinčioje 0,02 % kazamininių rūgščių, 50 ųg/ml histidino ir 20 ųg/ml neomicino. Po 24 vai. paimami mėginiai, centrifuguojami ir be papildomo paruošimo analizuojami tam tikslui panaudojant histidino IMOPS gelius, turinčius 75 mM KOH; 40 mM histidino; 100 mM MOPS)3-)N-morfolino)-propansulforūgštis) , pH 7,5 ir 5% poliakrilamido. Elektroforezės buferis turėjo 40 mM histidino, 100 mM MOPS, pH 6,6. Mėginiai judėjo katodo kryptimi. Proteazės juostos aptinkamos profesionalių juostelių AgFa Pan 100 pagalba (Zuidweg ir kt. , Biotechnol. and Bioengin. 14 (1972) 685-714). Šie rezultatai parodyti Fig. 3. Iš jų matyti kad PM58 turi geną, koduojantį Bacillus PB92 proteazę.
pavyzdys
Bacillus PB92 serininės proteazės geno nukleotidinių sekų nustatymas pM58 Bal I - Hpa I fragmento seka nustatyta panaudojant būdą, aprašytą Sanger, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 77 (1977) 6463. pM58 restrikciniai fragmentai (žr. 4 pav.) klonuoti fago M13 vektoriuose mplO, mpll ir mpl8 (Meshing ir kt., Nucleic Acids Res., 9 (1981) 309-321).
Fragmentų pM558 Įsiterpimas skrininguoj amas pagal hibridizacijos rezultatus. Sekvenavus paruoštą dešimt nukleotidų, lokalizuotų gelyje lygiais tarpais, ir pakartotas sekvenavimas, patvirtinęs seką, parodytą Fig. 5.
pavyzdys
Plazmidės pMAX-4, turinčios serininės proteazės geną, kons travimas (1982) 259-268) kaip aprašyta
Konstruojant plazmidę puCN (Fig. 6A) plazmidė puBUO paveikiama fermentais Tag 1 ir Pvu 11. Fragmentas, turintis atsparumo neomicinui geną, išvalytas panaudojant žemos lydymosi temperatūros agarozę ir po to jo galai paveikti Klenovo polimerazės fragmentu (Maniatis, Molekulinis klonavimas: A laboratory Manual Cold Spring Harbor, 1982) . Plazmidė puC7 (Vilira ir kt. Gene 19 iinearizuota Sal 1 ir galai apdoroti aukščiau. Abu fragmentai liguoti Tu ligaze (Maniatis) ir transformuoti 1 E. coli IML 03. Atranka atlikta 2xTY lėkštelėse (1,6 % svoris/tūris
Bakto triptono; 1 % svoris/tūris mielių ekstrakto; 0,5 % NaCI, 50 pg/ml ampicilino ir 10 ųg/ml neomicino). Gauta plazmidė, pavadinta puCN710, paveikta restriktaze Bam H1. Plazmidė pE194 (Iordanescu, Plasmio (1978) 468-479) Fragmentai liguoti T4 ligaze ir subtilis 1A40. Atranka atlikta mi20 ųg/ml suskaldyta Bei 1 transformuoti 1 B nimaliose lėkštelėse, turinčiose 20 ųg/ml neomicino (žr. Fig. 1). Gauta plazmidė pEl94-neo (Fig. 6A) turėjo neomicino geną ir temperatūrai jautrų replikacijos pradmens vienetą.
Proteazės genas subklonuotas 1 Įterpimo vektorių pE194neo sekančiu būdu: pM58 (žr. Fig. 7) paveikiama fermentais Hpasl ir Bali ir Bgl 11. Plazmidė pE194-neo paveikiama Hpa 1. Šie fragmentai liguojami T4 ligaze ir transformuojami 1 B. subtilis 1A40. Transformantai atLT 4001 B renkami pagal atsparumo neomicinui ir proteazės produkcijos padidėjimo požymius. Apie tai sprendžiama iš precipitacijos arealo, kurį sudaro kazeino skaidymo produktai (žr. Fig. 1), dydžio. Gauta plazmidė puAX-4, kurios struktūra nustatyta restrikcine fermentų analize (žr. Fig.6B!.
pavyzdys
Bacillus PB92 pMAX-4 protoplasto transformacija
Bacillus PB92 augintas per naktį 100 ml NBSG-X tirpale (Thorne etcel., J. Bacteriol. 91 (1966) 1012-1020).
Kultūra buvo centrifuguojama 10 min esant 4.500 aps/min rotoriuje Sorvcell modelis CSA. protoplastai buvo paruošti inkubuojant bacilas 1 vai. 37°C temperatūroje 10 ml šarminio tirpalo (ANM), turinčio 0,5 M sacharozes; 0,02 M MgCl2 ir 0,02 M Tris-maleat, pH 8,0; steriliame vandenyje, į kurį buvo pridėta 0,4 mg/ml lizocimo. Protoplastai buvo nusodinti per 10 min esant 4.500 aps/min, resuspenduoti 5 ml ANM+ buferinio mišinio (ANM buferis, į kurį pridėta 3,5 % svoris/tūris
Bakto Penassay bulijono ir 0,04 % svoris/tūris Merieux albumino), kurio pH 8,0, sumaišyti ir vėl· nusodinti kaip aprašyta aukščiau. Po resuspendavimo 5,0 ml ANM, 0,5 ml šios protoplastų suspensijos buvo sumaišyta su 55 ųg demineralizuoto vandens, turinčio 1 ųg plazmidinės DNR ir inkubuota 2 min. su 30 % svoris/tūris polietilenglikolio 8.000, pH 8,0. Tris kartus praskiedus tirpalu ANM+ pH 8,0 ir centrifugavus, nuosėdos resuspenduotos mažame tūryje 1 ml ANM+ ir inkubuotos 23 vai. Alikvotos po 100 ml buvo išsėtos naujai paruoštose regeneracinėse lėkštelėse su 0,55 M sukcinatoHC1 pH 8,0; 1,55 % svoris/tūris agaro; 0,5 % svoris/tūris kazamininių rūgščių; 0,55 % svoris/tūris mielių ekstrakto; 0,031 M fosfatinio buferio pH 8,0; 0,5 % svoris/tūris gliukozės; 0,02 mg MgCl2 ir 0,02 % svoLT 4001 B ris/tūris Merieux albumino. Šiose lėkštelėse taip pat buvo 1000 ųg/ml neomicino selekcijai. Po inkubacijos prie 37°C ne mažiau 72 vai. kolonijos perneštos į lėkšteles su agaru, turinčiu širdies raumens ekstraktą ir 20 ųg/ml neomicino.
pavyzdys pMAX-4 įterpimas į Bacillus kamieno pB92 chromosomą
Transformantas Bacillus pB92, turintis plazmidę pMAX-ė, inkubuojamas Triptono sojos bulijone (TSB) , turinčiame arba 1 ųg/ml, arba 20 ųg/ml neomicino, 24 vai prie 37°C .
Po to po 2 ml ląstelių suspensijos atskiedžiama 100 ml TSB, turinčio atitinkamai 1 ųg/ml arba 20 ųg/ml neomicino, ir inkubuojama 24 vai prie 50°C. Po 24 vai. abiejų kultūrų mėginiai po į ml vėl atskiedžiami, kaip nurodyta aukščiau ir inkubuojami 24 vai. prie 50°C vėl pridėjus atitinkamai 1 ųg/ml arba 20 ųg/ml neomicino. Pastaroji procedūra pakartojama dar vieną kartą. Tada ląstelių suspensijos atskiedžiamos 100 kartų ir išsėjamos į lėkšteles su agaru, turinčiu širdies raumens ekstraktą (Hl-agaras) ir atitinkamai 1 ųg/ml neomicino (kultūrų, augintų terpėje su 20 ųg/ml neomicino mėginiams. Lėkštelės inkubuojamos 16 vai prie 50°C. Rezistentiškos neomicinui kolonijos išskiriamos ir auginamos 10 ml TBS terpės, turinčios 1 ųg/ml neomicino, 16 vai prie 37°C. Iš šių kolonijų išskiriama suminė DNR (Holmes ir kt., Anai Biochem 114 (1981) 193-197) . Plazmidės nebuvimas tikrinamas DNR elektroforeze agarozės gelyje. Plazmidinės DNR nebuvimas mėginiuose patvirtinamas transformuojant suminę DNR į B. subtilis 1A40. Nuspręsta, kad mėginiai, negalintys transformuoti B. subtilis, neturi plazmidės.
Tam, kad būtų nustatyta, kur ir kokiu būdu pMAX-4 įsiterpusi τ chromosomą, išskiriama chromosominė DNR paveikiama Hind III ir analizuojama 0,5 % agarozės gelyje pernešant ant nitroceliuliozės (Southern, J. Md. Biol., 98 (1975) 503-517) ir hibridizuojant su 32P pažymėta po niktransliacijos pM58 (Maniatis, 1982). Šios analizės duomenys parodyti Fig. 7A.
Po selekcijos 1 ųg/ml neomicinu proteazės genai buvo tandemiškai išsidėstę chromosomoje, o po Campbell-tipo homologinės rekombinacijos šie genai buvo atskirti kamieno PBT109 plazmidinėmis sekomis. Išskyrus 30 nepriklausomų integrantų, vėl buvo atlikta atranka terpėje su 1 ųg/ml neomicino. Išskirtas vienas integrantas po netaisyklingos rekombinacijos (kamienas PBT122), turintis plazmidę pMAX-4, įsiterpusią atsitiktinėje chromosomos vietoje. Šis kamienas pažymėtas PBT108. Kamienų PBT109 ir 108 genetinė organizacija parodyta atitinkamai Fig. 7B ir 7C. Chromosominė analizė patvirtina, kad PBT122 ir PBT108 intarpai yra skirtingose chromosomos vietose.
pavyzdys
Kamienuose PBT108 ir PBT109 esančių dvigubų proteazės genų stabilumas
500 ml talpos kolbos su 100 ml gamybinės terpės be neomicino (turinčios: 1 % krakmolo, 4 % laktozės, 0,8 % K2HPO4; 0,5 % mielių ekstrakto; 2H2O; 0,55 % MgSO4*7H2P; 0,07 % CaCl2; 0,068 % FeO4*7H2O ir 1 ml/1 skysčio prieš putojimą) pasėjama po 0,2 ml ląstelių suspensijos iš kamieno PBT108 arba PTB109 kultūrų, augintų per naktį 37°C temperatūroje. Inkubuojama 44 vai. 37°C temperatūroje pastoviai aeruojant. Po to klonuojant patikrinamas kultūros atsparumas neomicinui ir jos proteazinis aktyvumas.
Kamienai PBT108 ir PBT109 patikrinti Eschweiler fermentatoriuose, užpildytuose aukščiau paminėta .gamybine terpe, norint išsiaiškinti tūrio padidėjimo iki 11 efektą. Fermentacijos bandymų duomenys suvesti 1 lentelėje.
lentelė
Kamienas Santykinė proteazes gamyba* Atsparių neomicinui ląstelių % po fermentacij os
Kontrolė (PB92 100 % -
PBT108 120 % 100 %
PBT109 115-120 % 75-97 %
* Proteazes aktyvumas patikrintas naudojant dimetilkazeiną kaip substratą (Lyn ir kt., J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793.
Patikrinus kolonijas, gautas iš kamieno PBT109 po jo auginimo 2 dienas Eschweiler fermentatoriuj e, rasta, kad 3-25 % šių kolonijų proteazes aktyvumas buvo kaip kamieno, turinčio tik vieną proteazes geną. Nustatyta, kad aukščiau paminėtos kolonijos yra neomicinui jautrios, kadangi homologinės rekombinacijos metu pMAX-4 yra iškerpama. Tuo tarpu patikrinus kolonijas, gautas iš kamieno PBT108 po jo auginimo fermentatoriuje, rasta, kad visos šios ląstelės yra neomicinui atsparios. Parinkta šimtas neomicinui atsparių kolonijų atsitiktiniam ir individualiam proteazinio aktyvumo testavimui, siekiant nustatyti, kiek proteazes genų - vieną ar du jos turės. Visos 100 individualiai testuotų kolonijų produkavo kamieno, turinčio du genus, lygyje. Tai rodo, kad du, atsitiktiniai įterpti į kamieną PBT108 proteazės genai stabiliai laikėsi naudotose fermentacijos sąlygose.
pavyzdys
Integracinio vektoriaus pElaTB konstravimas
Plazmide pB34, aprašyta EPĄ 0134048 paveikta restrikciniais fermentais bcll, Bgll ir BglII. Gautų restrikcijos fragmentų galai paveikiami klenovo polimerazę ir po to liguojami i pE194-neo Hpal saitą (žr. fig. 6) . Plazmidės pE194-neo DNR išskirta kaip aprašyta birnboim ir Doly (Nucl. Acids. Res. 7 (1979) 15513-1523.
Gautas mišinys transformuojamas i B. subtilis 1A40 pagal būdą, kuri aprašė Spizizen ir kt. (J. Bacteriol.
(1961) 741-746), panaudojant 0,55-1 ųg DNR/1 ml kom15 petentinių ląstelių.
Po to ląstelės išsėjamos i minimalias lėkšteles, turinčias 2,8 % K2HPO4; 1,2 % KH2PO4; 0,4 % (NH4)2SO4; 0,2 % tris-Na-citrato* 2H2O; 0,04 % MgSO4*7H2O; 0,00005 %
MnSO4*H2O; 0,4 % gliutamininės rūgšties; 0,555 % gliukozės; 0.02 % kazamininių rūgščių; 50 ųg/ml lizino;
ųg/ml neomicino; 0,4 % kazeino, 0,5 % krakmolo ir
1,5 % agaro.
Birnboim ir Doly aprašytu būdu iš kolonijų, produkuojančių alfa-amilazę, išskirta DNR, paveikta restrikciniais fermentais ir analizuota iš vieno transformanto išskirta plazmidė pElaTB (žr. Fig. 8).
9 pavyzdys pElaTB panaudojimas alfa-amilazę neprodukuojančio kamieno Bacillus licheniformis T9 transformacijai
Kamienas Bacillus licheniformis T9 transformuotas būdu, aprašytu EP-A-02553455, su nedidele pataisa - procedūra atlikta (30°C, o ne 37°C temperatūroje) . Transformantų atranka atlikta minimaliose lėkštelėse, turinčiose 20 ųg/ml neomicino. Visi transformantai produkavo amilazę. Birnboim ir Doly aprašytu būdu išskirta DNR, atlikta restrikcinė analizė, kuri parodė, kad visi transformantai turi pElaTB.
pavyzdys pElaTB įterpimas į B. licheniformis T9 chromosomą
Bacillus licheniformis kamienas T9, turintis plazmidę pElaTB, išsėjamas į Triptono sojos bulijoną (TSB), su 20 ųg/ml neomicino ir inkubuojama 16 vai. 30°C temperatūroje. 5 ml ląstelių suspensijos atskiedžiama 100 ml aukščiau paminėtos terpės ir inkubuojama 50°C temperatūroje 24 vai.
Ši procedūra pakartojama. Po to ląstelių suspensija atskiedžiama 100 kartų ir išsėjama į lėkšteles su agaru, į kurį įdėtas širdies raumens ekstraktas ir 10 ųg/ml neomicino. Inkubuojama 40 vai. 50°C temperatūroje, po to išskiriamos kolonijos, atsparios neomicinui, ir kultivuojamos 10 ml TSB terpės su 10 ųg/ml neomicino 16 vai. 30°C temperatūroje. Tada iš kultūrų išskirta šeiminė DNR (Holmes ir kt., Anai. Biochem. 114 (1981) 192-197). DNR elektroforezės agarozės gelyje būdu nustatyta, kad ląstelės neturi plazmidžių. Tai patvirtino ir papildomi tyrimai bandant transformuoti B. Subtilis 1A40 į neomicinui atsparų kamieną.
Tam, kad būtų patikrinta, ar pElaTB yra įsiterpusi į genomą ir kokiu būdu iš transformantų išskiriama chromosominė DNR (Saito-Miuva, Biochem. Biophys., Actą, 72 (1963) 619-632), paveikiama EcoRI, frakcionuojama 0,55 % agarozės gelyje, pernešama ant nitroceliuliozės (Southern, J. Mol. Biol. 98 (197555) 503-517) ir hibridizuojama su 32P pažymėta nik-transliuota p-B33 (žr. EP-A-0134048). Šių tyrimų duomenys parodyti Fig. 9A. Duomenys rodo, kad yra įvykusi pElaTB netaisyklinga rekombinacija ir dėl to kamienas turi atskirą amiiazes geną kitoje genomo vietoje, palyginus su pradiniu amilaziniu kamienu Bacillus licheniformis T5555. Gautas kamienas, turintis pElaTB, pažymėtas TB13 .
pavyzdys
Kamieno T13F, turinčio du amilazės genus, atskirtus endogeninėmis chromosominėmis sekomis, konstravimas
Tam, kad būtų sukonstruotas kamienas, turintis du amilazės genus atskirtus endogeninėmis chromosominėmis sekomis, atliktas bandymas suliejant Bacillus licheniformis kamieną T5 (amilazinis kamienas, turintis pradinę amilazės geną, žr. EP-A-0134048. Prieš padarant protoplastus, kamienas TB13 užmušamas tam tikslui panaudojant jodacetamidą. Kamienas T5 (jautrus neomicinui) nebuvo užmuštas. Sulietų ląstelių atranka atliekama regeneracinėse lėkštelėse, turinčiose 10 ųg/ml neomicino.
Tam, kad būtų patikrintos ir identifikuotos potencialios sulietos ląstelės, buvo išskirta chromosominė DNR, paveikta EcoRI, frakcionuota 0,5 agarozės gelyje, pernešta ant nitroceliuliozės filtrų (Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517) ir hibridizuota su 32P pažymėta nik-transliuota pB33 (žr. EP-A-0134048) . Šio tyrimo rezultatai parodyti Fig. 9B. Vienas iš gautų sulietų ląstelių klonų, T3F, turėjo 2 amilazės genus, atskirtus endogeninėmis sekomis.
pavyzdys
Kamienuose T390 ir T1F esančių dvigubų amilazės genų stabilumas
Kamieno T1F, turinčio du chromosominius amilazės genus, atskirtus esminėmis chromosominėmis sekomis, stabilumas palygintas su kamieno T390 stabilumu. Pastarasis kamienas turi du chromosominius amilazės genus, lokalizuotus tandemine seka. Kamieno T390 gavimas aprašytas EP-A-134048 (17 psl. 1 lentelė), kur jis priskirtas B.
licheniformis T5 (pGB33) . Kamienai T13F ir T390 patikrinti fermentacijos sąlygomis. Tam tikslui 0,2 ml TSB kultūros, išaugintos per naktį 37°C temperatūroje, pasėta į 500 ml talpos kolbas, turinčias 100 ml gamybinės terpės (žr. Fig. 7) . Po sterilinimo pridedant NaOH pasiekiamas pH 6,9 (neomicinas nepridedamas) . Po inkubacijos 6 dienas 40°C temperatūroje pastoviai aeruojant, testuojamas kultūros atsparumas neomicinui ir amilazės aktyvumas. Bandymų duomenys suvesti 2 lentelėje .
lentelė
Kamienas Santykinis amilazės aktyvumas Atsparių neomicinui ląstelių % po fermentacijos*
T5 100 % -
TB13 20 % 100 %
T390 200 % 88 %
* testuota virš 1000 kiekvieno kamieno kolonijų
Tam, kad būtų nustatyta, ar kamiene T13F prarastas vienas amilazės genas, išlaikant neomicino geną, išanalizuota 20 kolonijų, gautų po T13F auginimo fermentatoriuje. Išskirta chromosominė DNR iš 20 atsitiktinai atrinktų kolonijų ir išanalizuota hibridizuoj ant kaip tai aprašyta aukščiau. Fig. 10 parodyti 9 tokių tyrimų duomenys. Visi ištirti kamienai turėjo du alfa amilazės genus jų chromosominėje DNR.
Priešingai genetiškai stabiliam T13F kamienui, kamienas T390 pasirodė besąs fermentacijos metu nestabilus - 12 % kolonijų buvo jautrios neomicinui . Patikrinus vieną koloniją aptiktas tik vienas alfa-amilazės genas (Fig. 10, 4 takelis) . Tai rodo, kad išsklaidytai įsiterpę genai yra stabilesni fermentacijos sąlygomis negu tandemiškai įsiterpę genai .
Iš aukščiau pateiktų duomenų akivaizdu, kad galima gauti prokariotines ląsteles, kuriose stabili geno amplifikacij a pasiekta atrenkant transformuotas ląsteles, kuriose įterpta ne mažiau dviejų struktūrinio geno kopijų. Geno įterpimas gali įvykti homologinės rekombinacijos arba netaisyklingos rekombinacijos būdu.
Šiame išradimo aprašyme paminėtos publikacijos prilygsta specialiai ir individualiai paminėtoms kaip nuoroda .
Kadangi dabar išradimas pilnai aprašytas, tai įvairių pakeitimų ir modifikacijų galimybė, nenukrypstant nuo išradimo apibrėžties, apimties ir esmės, tėra tik techninis reikalas.

Claims (27)

1. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė, turinti savo chromosomoje ne mažiau dviejų koduojančios norimą polipeptidą DNR sekos kopijų, besiskirianti tuo, kad kopijos atskirtos endogeninemis DNR sekomis.
2. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė, turinti savo chromosomoje ne mažiau dviejų koduojančios norimą polipeptidą DNR sekos kopijų, besiskirianti tuo, kad minėtos kopijos atskirtos endogeninėmis DNR sekomis ląstelės-recepientės genome, o pati ląstelė-recepientė formuojama tokiu būdu:
ląstelės-recepientės, turinčios ne mažiau vienos aukščiau paminėtos sekos kopijos, Įterptos 1 chromosomą kombinavimo transformacijos sąlygomis su a) DNR konstrukcija, turinčia ne mažiau vienos aukščiau paminėtos DNR sekos kopijos ir ne mažiau vieno markerinio geno bei temperatūrai jautrų replikacijos pradmens vienetą arba su b) donorine ląstele, turinčia aukščiau paminėtą DNR konstrukciją;
transformanto, kuriame minėta DNR konstrukcija Įterpta 1 jo chromosomą, atrankos;
transformuotų prokariotinių recepientinių ląstelių, turinčių ne mažiau dviejų aukščiau paminėtos DNR sekos kopijų, atskirtų endogeninėmis DNR sekomis, išskyrimo iš didelio aukščiau paminėto transformantų skaičiaus.
3. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal 1 ir 2 punktą, besiskirianti tuo, kad minėta prokariotinė ląstelė yra Bacillus kamienas.
4 . Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal 1 ir 2 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtos Bacillus kamienas yra bazofilinis Bacillus kamienas arba Bacillus licheniformis kamienas.
U
5. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal 4 punktą b e s i s k i r i a n t i tuo, kad minėtas bazofilinis Bacillus kamienas yra Bacillus novo species PB92 arba 30 mutantas, ar variantas.
6. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal 4 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas recepientinis Bacillus licheniformis kamienas yra Bacillus licheniformis T5 kamienas arba jo mutantas, ar
15 variantas.
7. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal 1 ir 2 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas norimas polipeptidas yra fermentas.
8. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal
7 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas fermentas yra proteolitinis fermentas arba amilolitinis fermentas.
9. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal
8 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas proteolitinis fermentas yra serino proteazė.
30
10. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal
9 punktą, besiskirianti tuo, kad minėta serino proteazė turi tokią seką:
I I2N-A-Q-S-V-I’-W-CM-S-R-V-Q-A-I’-A-I1-N-R-G.-I,-T-G.-S-G-V-K-V-A-V-I,-I)-T-C’.-I-S-T
U-l’-D-b-N-I-R-G-G-A-S-P-G-b-I’-S-T-Ų-D-C-N-G-ū-G-T-H-V-A-G-Td-A-A-I.-N-N-S-l(TV-I ,-G.-\r-A-|’-N-A-I(-I-Y-A-V-K-V-I,-G,-A-S-(GS-CGS-CG5-V-5-S-i-A-Q-G-I,-|ęW-A-G5 N-N-G-I {-[ Į-V-A-N-I ,-S-l,-G-5-I’-S-I’-S-A-T-I.-I'’-G)-A-V-N-S-A-T-S-I<-G-V-J,-V-V-A-A-SG-N-G-A-G-S-I-S-Y-l’-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G,-A-T-l )-Q-N-N-N-I<-A-S-P-S-Q-Y-G-A-GP-l GI-V-A-I’-G-V-N-V-CJ-S-T-Y-l’-G-S-T-Y-A-S-I.-N-G-T-S-A-T-I’-H-V-A-C-A-A-A-l.-VK-Q-R-N-l’-5-W-S-N-V-Q-l-R-N-I I-I,-K-N-T-A-T-5-l,-G.-5-T-N-l -Y-G-S-G-L-V-N-A-R-A10 A-T-R-CGG! (.
11. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal 8 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas amilolitinis fermentas yra alfa-amilazė.
15 12. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal
1 arba 2 punktą, besiskirianti tuo, kad Bacillus novo species PB92 arba jo mutanto, arba varianto genomas turi minėtą DNR seką.
20 13. Transformuota prokariotinė ląstelė-recepientė pagal
1 ar 2 punktą, besiskirianti tuo, kad Bacillus licheniformis T5 arba jo mutanto arba varianto genomas turi minėtą DNR seką.
25 14. Transformuotos prokariotines ląstelės-recepientės, turinčios ne mažiau dviejų koduojančios norimą polipeptidą DNR sekos kopijų, atskirtų endogeninėmis chromosominėmis sekomis minėtos recepientės genome paruošimo būdas, besiskiriantis tuo, kad recepientinę ląstelę, turinčią ne mažiau vienos minėtos DNR sekos kopiją, įterptą į jos chromosomą kombinuoja transformacijos sąlygomis su a) DNR konstrukcija, turinčia ne mažiau vienos minėtos DNR sekos kopiją ir ne
35 mažiau vieno markerinio geno bei temperatūrai jautraus replikacijos pradmens vieneto, arba su b) donorine ląstele, turinčia minėtą DNR konstrukciją;
atrenka transformantą, kuriame minėta DNR konstrukcija Įterpta ą chromosomą, ir išskiria transformuotas prokariotines recepientines ląsteles, turinčias ne mažiau dviejų minėtos DNR sekos kopijų, atskirtų endogeninėmis sekomis, iš didelio minėtų transfomantų skaičiaus.
15. Būdas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad atranka susideda iš:
minėto transformanto, turinčio DNR konstrukciją su markeriniu genu, auginimo terpėje su biocidu, atsparumą kuriam sąlygoja minėtas markerinis genas, ir transformantų, neturinčių plazmidės, identifikacijos ir išskyrimo iš minėtų transformantų.
16. Būdas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad atranka susideda iš:
minėto transf ormanto, turinčio markerini, geną ir temperatūrai jautrų replikacijos pradmens vienetą, auginimo terpėje su biocidu, permisyvinėj e temperatūroje; ir transformantų, neturinčių plazmidės, atrankos iš minėtų transformantų.
17. Būdas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas išskyrimas susideda iš:
chromosominės DNR iš minėtų transformantų išskyrimo; ir minėtos chromosominės DNR hibridizacijos su žymėtu zondu, turinčiu DNR konstrukciją arba jos fragmentą, ko pasėkoje pagal aptiktą žyme atrenkamos minėtos transformuotos prokariotines ląstelės.
18. Būdas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta recepientinė ląstelė gaunama būdu, susidedančiu iš:
prokariotinės ląstelės, neturinčios DNR sekos, koduojančios norimą minėtą polipeptidą, kombinavimo suliejimo sąlygomis su DNR konstrukcija;
transformuotų ląstelių išskyrimo;
minėtų ląstelių auginimo nepermisyvioj e temperatūroje; ir transformuotų ląstelių, kuriose minėta DNR konstrukcija įterpta kitoje chromosomos vietoje negu minėtos recepientinės ląstelės, identifikavimo ir išskyrimo.
19. Būdas pagal bet kurį iš 14-18 punktų, besiskiriantis tuo, kad minėta prokariotinė ląstelė yra Bacillus.
20. Būdas pagal 19 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas Bacillus yra bakteriologinis Bacillus kamienas arba Bacillus licheniformis kamienas.
21. Būdas pagal 20 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas bazofilinis Bacillus novo species PB92 ir minėtas Bacillus licheniformis kamienas yra Bacillus licheniformis T5 kamienas.
22. Būdas pagal bet kurį iš 14-21 punktų, besiskiriantis tuo, kad minėtas norimas polipeptidas yra fermentas.
23. Būdas pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas fermentas yra serino proteazė arba amilazė.
24. Būdas pagal 23 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta serino proteazė, turi ne mažiau 70 % nukleotidinės sekos homologijos su proteolitinį fermentą koduojančiu genu iš Bacillus novo species PB92.
25. Būdas pagal 23 ar 24 punktą, besiskirian-t i s tuo, kad minėta serino proteazė turi sekančią aminorūgščių seką:
I i2N-AAJ-S-\'-l’A\'A AI-S-R-VAJ-A-J’-A-H-N-K-G-f.-TA’.-SA AV-K-\'-A-V-I.-l J-TAAI-S-Ti mm na-s-ι’-c,-ι·:-ι’-s-tavi ran-g-i i a :-t-i i-v-a a ;-t-i-a-a-i.-n-n-s-ic-v-i a;-v-a-i>-n-a-I'-i.-y-a-v-k-v-la;-a-sa’.-sa':-sa'.-s-v-s-s-i-aaja’.-i-ι·-νν-ΛΑ'.n-ΝΑ A[ I-U-V-A-N-I -S-I,a',-S-I’-S-1’-S-A-T-L-R-Q-A-V-N-S-A-T-S-RaA-V-I.-V-V-A-A-SA-NaAAAAS-I-S-Y-I’-A-K-Y-A-N-A-M-A-VaAA-T-DA J-N-N-N-K-A-S-I’-SAJ-YAAAAA i -i )-i-v-a-i’a;-\--n-\'aas-t-y-pa:-s-t-y-a-s-i.-na'.-t-s-a-t-i,-ii-\'-aa;-a-a-a-i,-vKAJ-K-N-P-SAV-S-NA’A Yl-R-N-H-I -K-N-T-A-T-S-LA',-8-Τ-Ν-Ι -YA ASAM ,-V-N-A-H-AA-T-R-COOII.
26. Būdas pagal bet kurį iš 14-25 punktų, besiskiriantis tuo, kad minėta DNR konstrukcija yra pMAX-4 arba pElaTB.
27. Būdas pagal bet kurį iš 14-26 punktų, besiskiriantis tuo, kad minėta DNR seka įterpta netaisyklingos rekombinacijos būdu.
28. Būdas pagal bet kurį iš 14-26 punktų, besiskiriantis tuo, kad minėta DNR seka įterpta homologinės rekombinacijos būdu.
29. Būdas pagal bet kurį iš 14-16 punktų, besiskiriantis tuo, kad minėta DNR konstrukcija turi dar ir temperatūrai jautrų replikacijos pradmens vienetą .
30. Būdas pagal 29 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta temperatūrai jautri plazmide yra plazmidės pE194 darinys.
LTIP1826A 1987-02-27 1994-01-28 Process for preparing transformed prokaryotic host cell, stable gene amplification in the chromosome dna of prokaryotic microorganisms LT4001B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP87200356 1987-02-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LTIP1826A LTIP1826A (en) 1995-08-25
LT4001B true LT4001B (en) 1996-06-25

Family

ID=8197582

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LTIP1826A LT4001B (en) 1987-02-27 1994-01-28 Process for preparing transformed prokaryotic host cell, stable gene amplification in the chromosome dna of prokaryotic microorganisms

Country Status (20)

Country Link
US (2) US5733723A (lt)
EP (1) EP0284126B1 (lt)
JP (1) JP2637532B2 (lt)
KR (1) KR970000188B1 (lt)
CN (1) CN1049247C (lt)
AU (1) AU620326B2 (lt)
BG (1) BG60920B2 (lt)
BR (1) BR8805646A (lt)
CA (1) CA1327175C (lt)
DE (1) DE3883041T2 (lt)
ES (1) ES2045081T3 (lt)
FI (1) FI104326B1 (lt)
HU (1) HUT50877A (lt)
IE (1) IE61743B1 (lt)
LT (1) LT4001B (lt)
LV (1) LV10791B (lt)
NO (1) NO300382B1 (lt)
PT (1) PT86863B (lt)
RU (1) RU2091487C1 (lt)
WO (1) WO1988006623A1 (lt)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2134186T3 (es) * 1987-02-27 1999-10-01 Genencor Int Clonaje molecular y expresion de genes que codifican enzimas proteoliticas.
JP2637532B2 (ja) * 1987-02-27 1997-08-06 ギスト ブロカデス ナームローゼ フェンノートチャップ 原核微生物の染色体ｄｎａにおける安定した遺伝子増幅
US4914031A (en) * 1987-04-10 1990-04-03 Amgen, Inc. Subtilisin analogs
US6287841B1 (en) 1988-02-11 2001-09-11 Genencor International, Inc. High alkaline serine protease
ES2095233T3 (es) * 1989-08-11 1997-02-16 Gist Brocades Nv Produccion eficaz de proteasa mutante.
US5695976A (en) * 1989-12-18 1997-12-09 Novo Nordisk A/S Stable integration of DNA in bacterial genomes
JP3046344B2 (ja) * 1990-10-24 2000-05-29 塩野義製薬株式会社 新規プロテアーゼ
WO1993010248A1 (en) * 1991-11-14 1993-05-27 Novo Nordisk A/S A PROCESS FOR EXPRESSING GENES IN $i(BACILLUS LICHENIFORMIS)
DE4216246A1 (de) * 1992-05-16 1993-11-18 Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg Einfaches Verfahren zur stabilen chromosomalen Genamplifikation
US5395763A (en) * 1992-06-24 1995-03-07 Monsanto Company Chromosomal expression vector
DK153992D0 (da) * 1992-12-22 1992-12-22 Novo Nordisk As Metode
US5861273A (en) * 1993-12-21 1999-01-19 Celtrix Phamraceuticals, Inc. Chromosomal expression of heterologous genes in bacterial cells
US6723550B1 (en) 1997-07-15 2004-04-20 Genencor International, Inc. Proteases from gram-positive organisms
GB9724627D0 (en) 1997-11-20 1998-01-21 Genencor Int Bv Gram positive microorganism formate pathway
US6465186B1 (en) 1997-12-30 2002-10-15 Genecor International, Inc. Proteases from gram positive organisms
US6599731B1 (en) 1997-12-30 2003-07-29 Genencor International, Inc. Proteases from gram positive organisms
GB9727470D0 (en) 1997-12-30 1998-02-25 Genencor Int Bv Proteases from gram positive organisms
US6528255B1 (en) 1997-12-30 2003-03-04 Genencor International, Inc. Proteases from gram positive organisms
EP1062318B1 (en) * 1998-02-12 2004-04-28 Novozymes A/S A prokaryotic cell comprising two copies of a gene transcribed in different directions
US6100063A (en) * 1998-02-12 2000-08-08 Novo Nordisk A/S Procaryotic cell comprising at least two copies of a gene
US6156514A (en) * 1998-12-03 2000-12-05 Sunol Molecular Corporation Methods for making recombinant cells
US6544792B1 (en) 1999-12-21 2003-04-08 Genencor International, Inc. Production of secreted polypeptides
JP2004501651A (ja) * 2000-06-23 2004-01-22 ノボザイムス　アクティーゼルスカブ 遺伝子の安定した染色体多コピー組み込みのための方法
BRPI0416797A (pt) 2003-11-19 2007-04-17 Genencor Int serina proteases, ácidos nucléicos codificando enzimas de serina e vetores e células hospedeiras incorporando as mesmas
US7985569B2 (en) 2003-11-19 2011-07-26 Danisco Us Inc. Cellulomonas 69B4 serine protease variants
US20050227356A1 (en) * 2004-04-07 2005-10-13 Lessard Philip A Novel compositions and methods for genetic manipulation of Rhodococcus bacteria
WO2006065272A2 (en) * 2004-05-21 2006-06-22 Idaho Research Foundation, Inc. Methods for altering acetic acid production and enhancing cell death in bacteria
EP1766002B1 (en) * 2004-06-21 2015-11-18 Novozymes A/S Stably maintained multiple copies of at least two orf in the same orientation
US20080085535A1 (en) 2004-10-22 2008-04-10 Novozymes A/S Stable Genomic Integration of Multiple Polynucleotide Copies
DE102007021001A1 (de) 2007-05-04 2008-11-06 Ab Enzymes Gmbh Expressionssystem zur antibiotikafreien Produktion von Polypeptiden
CN103290048B (zh) * 2013-06-27 2015-07-15 天津科技大学 一种适用于芽孢杆菌属同源重组的质粒及工程菌
US11046732B2 (en) 2015-12-11 2021-06-29 Wacker Chemie Ag Microorganism strain and method for antibiotic-free, fermentative preparation of low molecular weight substances and proteins
CN114032189B (zh) * 2021-05-10 2024-02-06 盐城师范学院 一种降解木质素的融合子菌株r3及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0134048A1 (en) 1983-07-06 1985-03-13 Gist-Brocades N.V. Molecular cloning and expression in industrial microorganism species

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US30602A (en) * 1860-11-06 Improvement in revolver fire-arms
GB1519148A (en) * 1974-11-19 1978-07-26 Gist Brocades Nv Compositions of matter
NO159863C (no) * 1980-01-07 1989-02-15 Univ Rochester Fremgangsm te for fremstilling og seleksjon av en rant bakteriofag som inneholder et genetisk fragment og koder for alfa-amylase, egnet for bruk i heterolog transformering av en bacillus-verts-mikroorganisme.
IL61982A (en) * 1980-02-15 1984-01-31 Cpc International Inc Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes
EP0074553A3 (en) * 1981-09-11 1985-01-09 The University Of Rochester Method of increasing the yield of a product by altering a microorganism
JPS59205983A (ja) * 1983-04-28 1984-11-21 ジエネツクス・コ−ポレイシヨン 異種遺伝子を原核微生物で発現させる方法
US4617266A (en) * 1983-04-28 1986-10-14 Genex Corporation Production of Protein A
NZ208612A (en) * 1983-06-24 1991-09-25 Genentech Inc Method of producing "procaryotic carbonyl hydrolases" containing predetermined, site specific mutations
FR2563533B1 (fr) * 1984-04-27 1986-08-22 Centre Nat Rech Scient Procede d'amplification de l'expression d'un gene determine chez bacillus subtilis et souches obtenues
US4828994A (en) * 1984-09-21 1989-05-09 Genex Corporation Bacillus strains with reduced extracellular protease levels
FR2582316B1 (fr) * 1985-05-22 1988-12-02 Centre Nat Rech Scient Vecteurs d'expression de l'a-amylase dans bacillus subtilis, souches obtenues et procede de preparation d'a-amylase
EP0254735B2 (en) * 1986-01-15 1998-06-17 Amgen Inc. METHOD FOR PRODUCTION OF THERMALLY STABLE AND pH STABLE SUBTILISIN ANALOGS
JP2637532B2 (ja) * 1987-02-27 1997-08-06 ギスト ブロカデス ナームローゼ フェンノートチャップ 原核微生物の染色体ｄｎａにおける安定した遺伝子増幅

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0134048A1 (en) 1983-07-06 1985-03-13 Gist-Brocades N.V. Molecular cloning and expression in industrial microorganism species

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDERSON RP, ROTH JR.: "Tandem genetic duplications in phage and bacteria.", ANNU REV MICROBIOL., 1977, pages 473 - 505
DEBADO: "Bacilų molekulinė biologija"
DUNCAN CH, WILSON GA, YOUNG FE.: "Mechanism of integrating foreign DNA during transformation of Bacillus subtilis", PROC NATL ACAD SCI U S A., 1978, pages 3664 - 3668, XP001313760
ERIC F. WAWROUSEK ET AL.: "Structure and organization of a cluster of sic tRNA genes in the space between tandem ribosomal RNA gene sets in Bacillus subtilis", J. BIOL. CHEM., 1983, pages 291 - 298
FERRARI E. ET AL.: "Isolation of an Alanine Racemase Gene from Bacillus subtilis and its Use for Plasmid Maintenance in B. subtilis", NATURE BIOTECHNOLOGY, 1985, pages 1003 - 1007
GAY P ET AL.: "Cloning structural gene sacB, which codes for exoenzyme levansucrase of Bacillus subtilis: expression of the gene in Escherichia coli.", J. BACTERIOL., 1983, pages 1424 - 1431, XP001297951
JANNIÈRE L ET AL.: "Stable gene amplification in the chromosome of Bacillus subtilis.", GENE, 1985, pages 47 - 55, XP023539816, DOI: doi:10.1016/0378-1119(85)90023-X
PALVA I. ET AL.: "Nucleotide sequence of the promoter and NH2-terminal signal peptide region of the alpha-amylase gene from Bacillus amyloliquefaciens.", GENE, 1981, pages 43 - 51, XP023542084, DOI: doi:10.1016/0378-1119(81)90103-7
YOUNG M.: "Gene amplification in Bacillus subtilis", J GEN MICROBIOL., 1984, pages 1613 - 1621, XP001206294

Also Published As

Publication number Publication date
EP0284126B1 (en) 1993-08-11
JP2637532B2 (ja) 1997-08-06
KR970000188B1 (en) 1997-01-06
JPH01502398A (ja) 1989-08-24
WO1988006623A1 (en) 1988-09-07
DE3883041T2 (de) 1994-01-20
EP0284126A1 (en) 1988-09-28
KR890700664A (ko) 1989-04-26
ES2045081T3 (es) 1994-01-16
CA1327175C (en) 1994-02-22
RU2091487C1 (ru) 1997-09-27
IE61743B1 (en) 1994-11-30
NO884422D0 (no) 1988-10-05
DE3883041D1 (de) 1993-09-16
LV10791B (en) 1995-12-20
US6124097A (en) 2000-09-26
PT86863B (pt) 1992-05-29
FI884903A (fi) 1988-10-24
AU620326B2 (en) 1992-02-20
BR8805646A (pt) 1989-10-17
IE880558L (en) 1988-08-27
FI104326B (fi) 1999-12-31
PT86863A (pt) 1988-03-01
HUT50877A (en) 1990-03-28
CN1030787A (zh) 1989-02-01
FI884903A0 (fi) 1988-10-24
US5733723A (en) 1998-03-31
NO300382B1 (no) 1997-05-20
AU1398188A (en) 1988-09-26
BG60920B2 (bg) 1996-06-28
NO884422L (no) 1988-10-05
FI104326B1 (fi) 1999-12-31
LV10791A (lv) 1995-08-20
LTIP1826A (en) 1995-08-25
CN1049247C (zh) 2000-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
LT4001B (en) Process for preparing transformed prokaryotic host cell, stable gene amplification in the chromosome dna of prokaryotic microorganisms
FI106726B (fi) Korkea-alkalisia proteaaseja koodaavien geenien transformointi Bacillus-bakteereihin, ja menetelmässä käytettävät vektorit, DNA-sekvenssit ja koettimet
EP0283075B1 (en) Molecular cloning and expression of genes encoding proteolytic enzymes
JPS61139392A (ja) 形質転換された細菌による所望産物の製造方法
JPH08504585A (ja) Ｄｎａ増幅
US6100063A (en) Procaryotic cell comprising at least two copies of a gene
EP1062318B1 (en) A prokaryotic cell comprising two copies of a gene transcribed in different directions
Cheung et al. Two control systems modulate the level of glutaminyl-tRNA synthetase in Escherichia coli
EP0900271B1 (en) Bacterial donor cell useful in conjugation
US5763187A (en) Bacterial donor cell useful in conjugation
Nishise et al. Glycerol dehydrogenase of a protoplast fusant of Cellulomonas sp. NT3060
EP0303668A1 (en) Stable expression vectors

Legal Events

Date Code Title Description
MM9A Lapsed patents

Effective date: 19980128