NO300382B1 - Transformert prokaryot vertscelle og anvendelse derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører transformert prokaryot vertscelle som omfatter minst to kopier av en DNÅ-sekvens i dets kromosom, i det nevnte DNÅ-sekvens koder for et polypeptid av interesse, hvori nevnte kopierv er separert av endogent kromosomalt DNA som er vitalt for vertscellen og nevnte kopier "blir stabilt opprettholdt, og anvendelse derav.

Bacilli er ofte blitt anvendt for produksjon av industrielt viktige enzymer så som alfa-amylase, nøytralt protease og alkaliske eller serine proteaser (jfr. Debabov, "The Industrial Use of Bacilli", i: The Molecular Biology of Bacilli, Acad. Press, New York, 1982). Forbedring av produksjonen av Bacillus-enzymer kan bli oppnådd både ved klassiske genetiske teknikker, så som mutasjon og påfølgende seleksjon, og ved anvendelse av moderne molekylærbiologiske teknikker. I sistnevnte tilfelle er flere forskjellige måter for tilveiebringing av høyekspresjonsnivåer av homologe og heterologe gener i visse prokaryotiske og eukaryotiske mikroorganismer ved genetisk konstruering blitt dokumentert.

Et av forsøkene for å oppnå høyt ekspresjonsnivå av et gen, er å tilsette effektive regulatoriske sekvenser til genet. En annen måte som ofte blir anvendt sammen med den første måten, er å øke kopiantallet til genet. Amplifikasjon blir hovedsakelig oppnådd ved innsetting av genet inn i et multikopi ekstrakromosomalt DNA-molekyl, så som et plasmid. En betydelig ulempe ved anvendelse av plasmider som vektorer for uttrykking og amplifisering av genetisk informasjon har derimot vært deres ustabilhet. For anvendelse i stor skala, er stabiliteten til det amplifiserte genet en forutsetning for å opprettholde produksjon av det ekspresjonsproduktet som blir kodet av det amplifiserte genet i høyt nivå, da mange celledelinger må foregå før tilstrekkelig biomasse er blitt dannet for å oppnå vesentlig produktdannelse.

Ustabilitet inntreffer i to former: segregasjonsustabilitet, hvor tapet av plasmidet oppstår i løpet av kultiveringen; og strukturell ustabilitet, hvor en del av plasmidet er deletert. Segregasjonsustabilitet kan for eksempel oppstå når en vertscelle inneholder en vektor som bærer et gen som blir over-uttrykt. Det vil generelt være et selektivt trykk mot celler som har tapt kapasiteten til å over-uttrykke genet, siden overekspresjon er en uønsket egenskap for den transformerte vertcellen. En stor mengde metabolsk energi blir brukt på det over-uttrykte genproduktet, som negativt influerer på cellens konkurransedyktighet (veksthastighet) med vertsceller som ikke på samme måte over-uttrykker.

En fremgangsmåte som blir anvendt for å unngå segregasjonsustabilitet er å selektere for celler inneholdende multi-kopiplasmider som bærer gener som medfører en fordel for den plasmidinnholdende cellen, for eksempel, utøver resistens mot et antibiotika og deretter tilsette det relevante antibiotika til fermentasjonskraften. Antibiotika er derimot generelt ikke en nyttig seleksjonsmåte ved kommersielle produksjons-prosesser i stor skala forårsaket av bestemmelser når det gjelder godkjenning av fermentasjonsprosessen eller selve produktet.

En annen metode som ble anvendt for å minimalisere plasmidtap forårsaket av segregasjonsustabilitet, er å sette inn et gen som er funksjonelt essensielt for vertscellen inn i vektormolekylet (Ferrari et al., Biotechnology 3 (1985) 1003-1007). Denne metoden forsikrer derimot ikke strukturell stabilitet av vektor.

Teknikker anvendt for å løse problemet når det gjelder strukturell plasmid-ustabilitet, har innbefattet unngåing av ekspresjon av genet i løpet av den eksponentielle vekstfasen, for eksempel ved anvendelse av regulatoriske sekvenser så som temperaturfølsomme regulatoriske sekvenser, og integrering av eksogent DNA inn i vertscellekromosomet. En annen metode som er blitt anvendt har innbefattet unngåing av anvendelse av autonomt replikerende vektormolekyler og i steden for anvender teknikker som foretrekker integrasjon av det innførte DNA'et inn i vertscellekromosomet.

Metoder for å oppnå integrasjon av fremmed DNA inn i vertscellekromosomet har innbefattet homolog rekombinasjon og illegitim rekombinasjon. Det er to måter å innføre DNA-sekvenser inn i spesifikke beliggenheter på et kromosom ved homolog rekombinasjon: Campbell-type homolog rekombinasjon og dobbel resiprok rekombinasjon, som er vist i figurene IA og IB, respektivt. En tredje måte å innføre DNA-sekvenser inn i kromosomet på, denne metoden anvender en to-trinns utskift-ningsmekanisme, er vist i figur 1C. I prinsippet blir en Campbell-type rekombinasjon anvendt, men det endelige resultatet er et kromosomalt arrangement som ikke inneholder noen duplikerte sekvenser, og dermed ikke noen amplifiserbar enhet, i den rekombinerte delen av kromosomet. Den ligner derfor på en dobbel resiprok rekombinasjon.

Bortsett fra anvendelse av homolog rekombinasjon for integrasjon av fremmed DNA inn i kromosomet, er det også mulig å integrere DNA ved illegitim rekombinasjon. Integrerte vektormolekyler kan bli selektert for under betingelser som inhiberer autonom replikasjon av ikke-integrerte vektormolekyler. Anvendelse av illegitim rekombinasjon for integrasjon er vist i figur ID. Fravær av tandemduplikasjoner i de tilveiebragte kromosomale sekvensarrangementene gjør at veiene vist i figurene IB, C og D er foretrukket for stabil innføring av DNA-sekvenser inn i genomet. Kromosomalt integrerte gener har innbefattet både homologe og heterologe gener hvor amplifikasjonen av det kromosomalt integrerte DNA har vært i en tandem oppstilling. Disse kromosomalt amplifiserte sekvensene er blitt rapportert å være ustabile selv om stabilitet har blitt rapportert i noen tilfeller. Det er derfor ønskelig å utvikle metoder hvorved DNA integrert inn i kromosomet blir opprettholdt på en stabil måte. Integrasjon av eksogent DNA ved homolog rekombinasjon inn i kromosomet til Bacillus subtilis er blitt beskrevet av Duncan et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75 (1978) 3664-3668 og for Anacystis nidulans ved Williams og Szalay, Gene 24 (1983) 37-51 og i Internasjonal patentsøknad WO 84/00381. Integrasjon ved homolog rekombinasjon av et heterologt gen, som ikke blir stabilt opprettholdt når den blir båret på en plasmidvektor, inn i kromosomet til en mikroorganisme beskrevet i EP-A-0127328.

Amplifikasjon av kromosomalt integrerte gener, både homologe og heterologe, er blitt dokumentert. Se for eksempel Saito et al., Proceedings of the Fourth International Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms, Kyoto, Japan, 1982, s. 125130; Young, J. Gen. Microbiol. 130 (1984) 1613-1621; Janniére et al., Gene 40 (1985) 47-55; Sargent og Bennett, J. Bacteriol. 161 (1985) 589-595; Gutterson og Kohsland, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80 (1983) 4894-4898; Hashiguchi et al., Agric. Biol. Chem. 49 (1985) 545-550; 'Wilson og Morgan, J. Bacteriol. 163 (1985) 445-453; Fransk patentsøknad nr. 84.06701; og EP-A-0134048. Spontan amplifikasjon i prokaryotiske celler er blitt rapportert og kan bli selektert for. Se for eksempel oversikten til Anderson og Roth, Ann. Rev. Microbiol. 31 (1977) 473-505.

I alle tilfellene som er referert til ovenfor, var amplifikasjon av kromosomalt integrert DNA i en tandem oppstilling. Denne typen av kromosomal amplifikasjonssekvens er blitt rapportert å være ustabil, selv om ganske god stabilitet ble funnet i noen av tilfellene, slik som det er blitt diskutert av Janniére et al., Gene 40 (1985) 47-55.

Stabilisering av naturlig forekommende amplifiserte prokaryotiske gener på grunn av nærvær av andre essensielle gener mellom disse amplifiserte sekvensene, er blitt rapportert. Ut i fra de 9 til 10 kopiene av de ribosomale RNA gensetene som oppstår i B. subtilis-kromosomet, var to tandem beliggende sett separert av en sammenhoping av tRNA-gener (Wawrousek og Hansen, J. Biol. Chem. 258 (1983) 291-298). I andre tilfeller var naturlig forekommende tandem repeterte ribosomale RNA operoner deletert, både i E. coli og i B. subtilis, med liten effekt på de fenotypiske egenskapene til organismen: Ellwood og Momura, J. Bacteriol. 143 (1980) 1077-1080 og Loughney et al., J. Bacteriol. 154 (1983) 529-532, respektivt.

Integrasjon av plasmider inn i kromosomet til B. subtilis ved illegitim rekombinasjon ved anvendelse av pE194 vektoren er blitt beskrevet av Hofemeister et al., Mol. Gen. Genet. 189

(1983) 58-68 og Prorozov et al., Gene 34 (1985) 39-46.

Flere gener for ekstracellulære enzymer til bacilli er med hell blitt klonet, så som alfa-amylasegenene til B. amyloliquefaciens (Palva et al., Gene 15 (1981) 43-51), B. licheniformis (Ortlepp, Gene 23 (1983) 267), B. stearothermophilus (Mielenz et al., Proe. Acad. Sei. USA 80 (1983) 5975-5979; EP-A-0057976) og B. subtilis (Yang et al., Nucleic Acids Res. 11 (1983) 237); levansukrasegenet til B. subtilis (Gay et al., J. Bacteriol. 153 (1983) 1424); de nøytrale proteasekodende genene til B. stearothermophilus (Fuji et al., J. Bacteriol. 156 (1983) 831), B. amyloliquefaciens (Honjo et al., J. Biotech. 1 (1984) 165) og av B. subtilis (Yang et al., J. Bacteriol. 160 (1984) 115; det serine eller alkalin-proteasekodende gener av B. subtilis (Wong et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81 (1984) 1184), B. licheniformis (Jacobs et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8913) og B. amyloliquefaciens (Wells et al., Nucleic Acids Res. 11 (1983) 7911).

Protoplasttransformasjon for forskjellige species av gram positive mikroorganismer er blitt rapportert. For B. subtilis er en protokoll for protoplasttransformasjon blitt beskrevet av Chang og Cohen (Mol.Gen. Genet. 168 (1979) 111-115), som er blitt mye anvendt. Lignende vellykkede protokoller er blitt beskrevet for transformasjon av B. megaterium protoplaster (Vorobjeva et al., F EMS Microbiol, Letters 7 (1980) 261-263), B. amyloliquefaciens protoplaster (Smith et al., Appl. og Env. Microbiol. 51 (1986) 634), B. thuringiensis protoplasts (Fisher et al., Arch. Microbiol. 139 (1981) 213-217), B. sphaericus protoplaster (McDonald, J. Gen. Microbiol. 130 (1984) 203), og B. larvae protoplasts (Bakhiet et al., Appl. og Env. Microbiol. 49 (1985) 577); i den samme publikasjonen er ikke vellykkede resultater blitt rapportert for B. popillae. Protokollen var vellykket for B. polymyxa, B. licheniformis, B. macerans og B. laterosporus men ikke for B. coagulans, B. cereus og B. pumilus, selv om god protoplastdannelse ble observert (Mann et al., Current Microbiol. 13 (1986) 131-135).

Andre metoder for innføring av DNA inn i protoplaster innbefatter fusjon med DNA-inneholdende liposomer (Holubova, Folia Microbiol. 30 (1985) 97) eller protoplastfusjon ved anvendelse av en lett transformerbar organisme som en mellomstående vertscelle (EP-A-0134048).

Prokaryotiske vertsceller er tilveiebragt innbefattende minst to kopier av en DNA-sekvens som koder for et polypeptid av interesse stabilt integrert inn i vertscellekromosomet. Stabil opprettholdelse av den eksogene DNA-sekvensen blir tilveiebragt ved integrering av to eller flere kopier av sekvensen i vertscellekromosomet hvori kopiene er separert av endogene kromosomale DNA-sekvenser.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figurene 1A-D er skjematiske fremstillinger av fire måter for integrering av ekstra kromosomale DNA-sekvenser inn i kromosomet til prokaryotiske mikroorganismer.

T er målsekvensen, dvs. DNA-sekvenser som er tilstede på kromosom og plasmid, og mellom disse kan homolog rekombinasjon oppstå.

S står for DNA-sekvensen som skal bli integrert i kromosomet. M står for en markørgensekvens som ble anvendt for seleksjon av rekombinant stamme. Figurene 2A og 2B er skjematiske fremstillinger av to måter for oppnåelse av stabil genamplifikasjon i et prokaryotisk kromosom. Figur 3 viser resultatene fra histidin/MOPS gel elektroforese utført på supernatanten fra kulturene til B. sublitis DB104 inneholdende pUBllO og pM58, respektivt, sammenlignet med flere subtilisiner:

fil 1: Carlsberg subtilisin

fil 2: Bacillus PB92 protease

fil 3: Bacillus subtilis subtilisin fil 4: Bacillus subtilis DB104 (pM58)

fil 5: Bacillus subtilis DB104 (pUBllO)

Figur 4 viser restriksjonskartet til plasmid pM58. Sekvenseringsstrategien er vist i den øvre delen av figuren. De heltrukne linjene med pilene står for fragmenter klonet inn i fag M13 vektorene mplO, mpll og mpl8. Den nedre delen av figuren viser sekvenseringsstrategien med anvendelse av ti

oligonukleotider beliggende med jevne avstander på proteasegenet. Figur 5 viser nukleotidsekvensen til den kodende tråden korrelert med aminosyresekvensen til Bacillus PB92 serin protease. Promoterne (Pj, P2) > ribosombindingssete (rbs) og termineringsregionene (term) til DNA-sekvensen er også vist. De nummererte heltrukne linjene representerer beliggenhetene til de ti oligonukleotider som blir anvendt for sekvensering.

Figur 6A viser konstruksjonen av plasmid pE194-neo.

Figur 6B viser konstruksjonen av plasmid pMAX-4.

Figur 7A: Spaltinger utført med Hindlll på kromosomalt DNA til stammene PB92, PBT109 og PBT108 ble utsatt for elektroforese på en 0,5$ agarosegel, overført til nitrocellulose som beskrevet av Southern og hybridisert med <32>p<->merket nick-translatert pM58 DNA. Figuren viser en autoradiograf. Figurene 7B og 7C illusterer integrasjonen som oppstår når det gjelder homolog (B) rekombinasjon og illegitim (C) rekombinasjon mellom pMAX-4 og Bacillus PB92 kromosomet. Figur 8 viser konstruksjonen av integrasjonsvektor pElatB. Figur 9A illustrerer integrasjonen av plasmid pElatB inne i kromosomet B. licheniformis stamme T9 som resulterer i B. licheniformis-stamme TB13. Figur 9B illustrerer kromosomal rekombinasjon av B. licheni-f ormis-stammene TB13 og T5 ved protoplastfusjon av disse stammene, resulterende i B. licheniformis-stamme T13F. Figur 10 viser en kromosomal analyse av ni forskjellige kolonier isolert fra en fermentasjon av stamme T13F som beskrevet i eksempel 11. Isolert kromosomalt DNA ble spaltet med EcoRI og separert på 0,8& agarosegeler og blottet på nitrocellulose. Hybridisasjon av blottet ble utført med <32p_ >merket nick-translatert pElatB DNA. Figuren viser et auto-diagram. Den øvre pilen indikerer posisjonen hvor et EcoRI DNA-fragment på omtrent 15 kb migrerer, som inneholder hele pElatB-sekvensen som var integrert inn i kromosomet i en beliggenhet som ikke er ved siden av det opprinnelige alfa-amylasegenet som beskrevet for stamme TB13 i fiugr 9A. Den nedre pilen indikerer posisjonen hvor et EcoRI DNA-fragment på omtrent 33kb migrerer, som inneholder hele alfa-amylase-genet opprinnelig er tilstede i B. licheniformis-stamme T5 (se også figur 9B). Følgende DNA-prøve ble analysert:

fil 1: Bacillus licheniformis T5 DNA

fil 2: Bacillus licheniformis TB13 DNA

fil 3: Bacillus licheniformis T390 DNA

fil 4: DNA fra et neomycin-følsomt derivat til Bacillus licheniformis T390, isolert etter fermentas;)on, som beskrevet i eksempel 12. fil 5: Bacillus licheniformis T13F DNA.

fil 6-14: DNA fra 9 forskjellige kolonier isolert fra en fermentasjon av stamme T13F som beskrevet i eksempel 12.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig transformert prokaryot vertscelle kjennetegnet ved at :

de ekstra kopiene av den nevnte DNA sekvensen oppnås fra

(a) en DNA-konstruksjon, omfattende minst en kopi av nevnte DNA-sekvens og minst et markørgen og et temperatur-følsomt replikasjonsorigo eller (b) en donorvertscelle som omfatter nevnte DNA-konstruksjon, under transformerende betingelser;

ved integrering av minst en kopi av nevnte DNA-sekvens inn i kromosomet til en mottager vertscelle med nevnte DNA-konstruksjon;

selektering for en transformant hvori nevnte DNA-konstruksjon er integrert inn i kromosomet til nevnte transformant; og

isolering fra blant nevnte transformanter, transformerte prokaryote vertsceller omfattende minst to kopier av nevnte DNA-sekvens separert av endogene DNA sekvenser som er vitale for vertscellen.

Når videre beskrevet anvendelse av en transformert prokaryot vertscelle for produksjon av et polypeptid av interesse.

De endogene mellomliggende sekvensene er generelt vitale for vertscellen. Tap av amplifiserte sekvenser ved homolog rekombinasjon ville være letal for vertscellen. Det vil derfor være seleksjonstrykk for cellene som inneholder de amplifiserte sekvensene uten nødvendigheten av anvendelse av antibiotika eller lignende seleksjonsmåte. Integrasjon kan bli oppnådd enten ved homolog rekombinasjon eller ved illegitim rekombinasjon. Teknikker som kan bli anvendt for å tilveiebringe de ønskede cellene er vist i figurene 2A og 2B.

Når homolog rekombinasjon blir anvendt, kan flere DNA-sekvenslengder være tilstede i vektormolekylene som er homologe til vertscellekromosomet, spesielt når en eller flere kopier av genet som skal bli amplifisert allerede er blitt ført inn i vertscellen. Vektormolekylet kan dermed innbefatte en DNA-sekvens som er av interesse; en mål-DNA-sekvens; og en markør DNA-sekvens.

En bør være oppmerksom på at bare de ønskede rekombinerte kromosomale arrangementene blir selektert for. Dette kan oppnås ved anvendelse av lineære DNA-molekyler for rekombinasjon. Det sirkulære vektormolekylet som skal bli integrert blir kuttet med et restriksjonsenzym i den regionen som er homolog med målsekvensen. Dermed kan rekombinasjon og integrasjon ved dette spesifikke sete fortrinnsvis oppstå. I tillegg til å være tilstede i vektormolekylet, kan DNA-sekvensen som er av interesse også være tilstede i vertscellekromosomet. DNA-sekvensen kan være en DNA-sekvens som koder for et hvilket som helst strukturelt gen som det er ønskelig å amplifisere. DNA-sekvensen kan være endogent for vertsor-ganismen, eller kan ha blitt satt inn i vertskromosomet i et tidligere transformeringstrinn.

Målsekvenser for ikke-tandem genamplifikasjon vil fortrinnsvis bli valgt fra ikke-essensielle gener, for eksempel når det gjelder basiller som vertsorganismer, kan genene som koder for ekstracellulære enzymer eller gener innbefattet i sporulering bli anvendt som målsekvenser. Integrasjon av DNA-sekvenser i disse genene vil generelt inaktivere genet. Tap av ekspresjon av genet kan deretter bli undersøkt og anvendt for seleksjon av de ønskede rekombinante stammene.

Når illegitim rekombinasjon blir anvendt for kromosomal genamplifikasjon som beskrevet i figurene ID og 2A, er foretrukne betingelser for integrasjon og seleksjon når homolog rekombinasjon ikke dominerer over illegitim rekombinasjon. En foretrukket måte for å forhindre homolog rekombinasjon er å transformere første og andre vertsceller som mangler det strukturelle gen av interesse med en vektor innbefattende en DNA-sekvens som koder for en polypeptid av interesse og et markørgen. Første og andre vertsceller hvori DNA-sekvensen er tilstede i forskjellige beliggenheter kan deretter bli selektert og kombinert under fusjonsbetingelser for å tilveiebringe en transformert celle med minst to kopier av DNA-sekvensen som koder for det strukturelle gen av interesse ved spredte beliggenheter i det andre vertsgenomet. For å lette seleksjonen kan den første verten bli drept før fusjon.

Genet(ene) som er av interesse, kan være et hvilket som helst prokaryot eller eukaryotisk gen. Disse genene kan innbefatte bakterielle gener, encellede mikroorganismegener, pattedyr-gener eller lignende. De strukturelle genene kan bli preparert på forskjellige måter, innbefattende syntese, isolasjon fra genom til DNA, preparering fra cDNA, eller kombinasjon derav. De forskjellige teknikkene som innbefatter manipulering av genene er velkjente, og innbefatter restrik-sjon, spalting, omorganisering, ligering, in vitro-mutagen-ese, primer reparering, anvendelse av linkere og adaptere o.l. DNA-sekvenser tilveiebragt fra en vert kan dermed bli manipulert på mange måter, avhengig av kravene til DNA-konstruksjon. Se Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982.

De strukturelle genene kan uttrykke forskjellige polypeptider eller proteiner så som enzymer, hormoner, lymfokiner, overflateproteiner, blodproteiner, strukturelle proteiner, immunoglobuliner el.l., fra pattedyr, encellede mikroorganismer, f.eks. bakterie, sopp, så som gjær eller filamentøse sopp, alge, protozoa, osv., planter eller andre DNA-kilder. Av spesiell interesse er enzymer, spesielt proteaser og amylaser. Eksempler på slike enzymer er serin og ikke-serinprotease, innbefattende høyalkalisk serin proteaser, alfa- og beta-amylase o.l. En foretrukket syre for en serin protease er Bacillus novo species PB92, og for en alfa-amylase er B. licheniformis-stamme T5, og likeledes mutanter og varianter av disse stammene.

Genet som danner en del av den egnede vektoren kan bli tilveiebragt ved måter som er generelt kjente innenfor fagområdet. Metoden innbefatter generelt fremstilling av et genomt bibliotek fra organismen som uttrykker en høyalkalisk protease. Det genome biblioteket blir for eksempel hensiktsmessig fremstilt ved legering av DNA-fragmenter fra donorstammen inn i en egnet vektor.

Med betegnelsen "egnet vektor" menes en DNA-konstruksjon innbefattende et strukturelt gen som koder for et protein eller polypeptid av interesse. Det strukturelle genet blir festet i rett riktig orientering til kontrollregioner så som en promotersekvens, en sekvens som danner ribosombindingssete og sekvenser som kontrollerer terminering av transkripsjonen og translasjonen av det strukturelle genet, og disse kontrollregionene fungerer i vertscellen. I de tilfeller hvor vertscellen har transformasjonsfrekvenser og integra-sjonsfrekvenser som er for lave for å tillate direkte seleksjon for integrasjon uten først isolasjon av plasmid-inneholdende celler, og som industrielle Bacillus-stammer, kan vektoren i tillegg innbefatte et replikasjonsorigo som har evnen til autonom replikering i vertscellen.

Når genet er tilveiebragt fra en donorcelle som har transkripsjonen og translasjonen initiering og termineringsre-gulatoriske signaler som blir gjenkjent av den vertsprokaryo-tiske cellestammen, vil det vanligvis være hensiktsmessig å opprettholde de opprinnelige regulatoriske sekvensene til det strukturelle genet. I tillegg kan den transkripsjonene initieringsregionen tilveiebringe konstitutiv eller induser-bar ekspresjon, slik at verten, i hensiktsmessige situa-sjoner, kan bli dyrket til høy tetthet før høye ekspre-sjonsnivåer av de strukturelle gener av interesse blir tilveiebragt.

Når det strukturelle genet kommer fra en kilde hvor de regulatoriske signalene ikke blir gjenkjent av vertscellen, vil det være nødvendig å tilveiebringe regulatoriske regioner som blir gjenkjent av vertscellen, og å innføre det strukturelle genet mellom initierings- og termineringsregulator-iske signaler. I noen tilfeller kan det eksogene strukturelle genet med dets egne kodon(er) bli satt inn i leseramme bak N-terminuskodonene til det endogene strukturelle genet, som opprettholder dets naturlige regulatoriske signaler.

Det er ønskelig at ekspresjonsproduktet blir utskilt. Når ekspresjonsproduktet blir naturlig utskilt og ledersignalene og prosesseringssignalet(ene) er gjenkjent av vertscellen, vil dette ikke medføre noen vanskeligheter. Når produktet derimot ikke blir utskilt fordi vertscellen ikke gjenkjenner utskillelsesledersignalene og/eller prosesseringssignalet-(ene), eller signalene ikke fungerer i tilstrekkelig grad i vertscellen, kan det da være nødvendig å isolere eller syntetisere DNA-sekvenser som koder for utskillelsesledersignalene og prosesseringssignal(er) til et vertscellepoly-peptid og å feste disse i riktig leseramme til 5'-enden av det strukturelle genet.

Vektoren kan i tillegg innbefatte et markørgen som utviser resistens mot et antibiotika som vertsstammen er følsomme ovenfor. Markørgenet, når det blir anvendt i kromosomal integrasjon av vektoren, må oppfylle kravet om at overlevelsesseleksjon er mulig selv når bare ett eller bare noen få kopier av markørgenet er tilstede i vertsstammen. Med markører menes et strukturelt gen som har evnen til ekspresjon i en vert, som tilveiebringer overlevelsesseleksjon. Med "overlevelsesseleksjon" menes tilveiebringing av prototropi til en auxotrop vert, biocid eller viral resistens. For prototropi, kan forskjellige gener bli anvendt, så som leu, his, trp eller lignende. For biocidresistens kan dette innbefatte resistens til antibiotika, f.eks. neo, cam, tet, tun, kan el.l. Andre markører innbefatter resistens mot tungmetaller, immunitet o.l. De forskjellige DNA-sekvensene kan være avledet fra forskjellige kilder og festet sammen for å tilveiebringe en vektor som innbefatter et eller flere hensiktsmessige, fortrinnsvis unike, restriksjonsseter, som tillater innsetting eller substitusjon av de strukturelle genene ved slike seter eller i steden for tapte fragmenter for å tilveiebringe plasmidkonstruksjonen.

Seleksjon for kromosomal integrasjon kan gjøres lettere ved anvendelse av et plasmid med et replikasjonsorigo som har en mutasjon som gjør at den er temperatur-følsom i vertscellen. Se f.eks. Ehrlich, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75

(1978) 1433.

Når plasmidkonstruksjonen er blitt preparert, kan den deretter bli klonet inn i en hensiktsmessig kloningsvert. En hvilken som helst vert som er hensiktsmessig, som lett kan transformeres og som tillater replikasjon av plasmidkonstruksjonen og overføring til vertscellen kan bli anvendt. Et stort antall stammer er tilgjengelige som har høy transfor-masjonseffektivitet og som vanligvis er auxotrop og/eller antibiotika-følsomme. Når vertscellen er en industriell Bacillus-stamme, har anvendelse av samme organisme som vertscelle for kloning av plasmidkonstruksjonen mange fordeler som innbefatter at det tillater anvendelse av et enkelt replikasjonssystem og likeledes den samme markøren for overlevelsesseleksjon i både kloningsverten og vertsstammen. Se f.eks. Europa-søknad EP-A-134048, og beskrivelsen er inkorporert heri ved referanse.

Plasmidkonstruksjonen kan bli innført i kloningsverten i henhold til konvensjonelle teknikker, så som transformasjon, med anvendelse av kalsiumutfelt DNA, konjugasjon eller annen hensiktsmessig teknikk. Kloningsverten kan deretter dyrkes i et hensiktsmessig næringsmedium, under selektive betingelser for å selektere for en vert inneholdende plasmidkonstruksjonen. For auxotrope verter inneholder næringsmediumet ikke de nødvendige næringsstoffene, mens for biocidresistens, f.eks. antibiotikaresistens, blir en cytotoksisk mengde av biocidet(ene) anvendt i næringsmediumet.

Forskjellige vertsceller kan bli anvendt. Disse innbefatter E. coli, Bacillus-stammene, spesielt Bacillus subtilis, Pseudomonas og Streptomyces. Ved valg av vertscelle, blir forskjellige faktorer tatt i betraktning, innbefattende faktorer som kan tilveiebringe ekspresjon av genet som skal bli amplifisert og produksjon av det ønskede produkt. Det er dermed ønskelig å anvende en vertscelle hvori det er en gjenkjenning av regulatoriske signaler; lett utskilling; redusert degradering av det ønskede produkt osv. En foretrukket vertscelle produserer allerede polypeptider av interesse, og kan enten være en vill-type organisme eller en mutant organisme. Vertscellen kan også være en mutant av en organisme som produserer polypeptid av interesse som i seg selv, derimot, er en ikke-produsent. Når polypeptid av interesse er en protease eller en amylase, innbefatter foretrukne stammer Bacillus novo species PB92, og Bacillus licheniformis-stamme T5, respektivt, og likeledes mutanter og varianter av disse stammene.

I tillegg kan industrielle stammer bli anvendt som har de ønskede egenskapene til en industriell stamme. Eksempler på stammer som kan bli anvendt innbefatter stammer som ble anvendt for industriell produksjon av enzymer så som: B. licheniformis, B. amyloliquefaciens og alkalofile Bacilli. De industrielle stammene blir valgt fra organismer som kan bli isolert fra jord eller som er tilgjengelige fra deponerings-stasjoner eller andre kilder eller tilveiebragt ved modifika-sjon av slike stammer. De industrielle stammene er veldig robuste og stabile. Slike stammer er videre motstandsdyktige for faginfeksjon og for genetisk utbytting, dvs. introduksjon av DNA ved konvensjonelle transformasjonsprosedyrer. De konvensjonelle industrielle stammene er også prototrofe, for å unngå tilsetting av dyre aminosyrer til næringsmediet. Andre karaktertrekk til industrielle stammer er deres høye produktivitet helt til slutten av fermenteringen, som kan pågå så lenge som en uke, stabil cellekonsentrasjon ved utpining av mediet og høy produktivitet, vanligvis minst 5 g/l (0,5$ w/v) av et spesifikt utskilt protein.

Transformanter kan bli tilveiebragt med gener enten i et tandem arrangement eller spredt i kromosomet. Det er vanligvis mulig å selektere transformanter inneholdende spredte gener fra blandinger av de to typene av transformantene som er nevnt ved isolering av kromosomalt DNA fra hver individuelle transformant, og deretter analysering av nevnte DNA med hensyn på de relative beliggenhetene til nevnte gener ved f.eks. metoden til Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517 eller andre måter som er kjent for fagmannen og som dermed identifiserer spredt integrasjon av nevnte gener.

Måter å oppnå spredte gentransformanter på som unngår tandem integrasjon innbefatter anvendelse av dobbel resiprok rekombinasjon som illustrert i figur IB og 2B, anvendelse av lineærisert DNA-konstruksjoner innbefattende DNA-sekvensen som skal bli amplifisert, et markørgen og målsekvenser for rekomb inasj on.

En spesifikk måte for å oppnå spredte gentransformanter innbefatter anvendelse av illegitim rekombinasjon som illustrert i figur 2A, hvori isolasjon av tandem transformanter kan unngås ved seleksjon, ved anvendelse av differen-siell ekspresjon av et markørgen, f.eks. et gen som koder for antibiotikaresistens, hvor følsomhet overfor antibiotika er forskjellig i stammer med tandem integrasjon av genet i forhold til ikke-tandem integrasjon. Vanligvis vil lengden av den mellomliggende endogene DNA-sekvensen være mindre enn 10 kbp.

Måter å oppnå rette gentransformanter som unngår tandem duplikering, innbefatter i tillegg anvendelse av drepte protoplaster fra en homolog donorstamme som bærer en DNA-konstruksjon innbefattende det strukturelle genet og et markørgen, hvor det strukturelle genet er integrert i kromosomet et annet sted med hensyn på mottagerstammen.

Tranformering av vertscellene innbefatter fortrinnsvis anvendelse av protoplaster preparert fra verts-stammen. Protoplaster blir generelt preparert fra cellene i henhold til konvensjonell måte, f.eks. lysozym eller zymolasebehand-ling, og protoplastene blir forsiktig suspendert i et hensiktsmessig medium som har riktig osmolaliteter for opprettholdelse av integriteten til protoplasten. For industrielle Bacillus-stammer, er metoder for preparering av protoplaster beskrevet i EP-A-0134048, og beskrivelsen er inkorporert heri ved referanse. Når vertsstammen er en alkalofil Bacillus-stamme, kan protoplastene hensiktsmessig bli preparert ved alkalisk pH, fortrinnsvis omtrent pH 8,0. Denne fremgangmsåten er beskrevet i EP-A-87200358.7, og beskrivelsen er inkorporert heri ved referanse.

Vertscellen kan bli transformert ved kombinering av plasmidkonstruksjonen eller en protoplast av kloningsverten med vertscelleprotoplasten i nærvær av et hensiktsmessig fusogen. Et hvilket som helst fusogen kan bli anvendt og som tilveiebringer den ønskede grad av effektivitet, og i de fleste tilfeller har polyetylenglykol vist å tilveiebringe høy fusjonseffektivitet. Etter kort tid blir fusogenblandingen erstattet med et hensiktsmessig næringsmedium, og cellene blir regenerert i et selektivt medium, hensiktsmessig ved utsåing på en agarskål.

Transformanter som er tilveiebragt ved kombinering av en vertscelle med en egnet DNA-konstruksjon kan nevnte DNA-konstruksjon eller del derav, enten direkte som en integrert del av deres kromosom eller som frie vektormolekyler når DNA-konstruksjonene inneholder et replikasjonsorigo som fungerer i nevnte vertscelle.

Måter for selektering for transformanter hvori DNA-konstruksjonen er integrert i kromosomet er å anvende et plasmid inneholdende et temperatur-sensitivt replikasjonsorigo. Transformantene blir dyrket i et selektivt medium ved den permissive temperatur, deretter blir temperaturen skiftet til en ikke-permissiv temperatur. Koloniene som uttrykker markørgenet ved den ikke-permissive temperaturen, blir deretter isolert og dyrket i et selektivt medium ved den permissive temperaturen. Fravær av plasmid kan bli verifisert for eksempel ved isoleringen av totalt DNA fra koloniene og kjøre elektroforese på en agarosegel eller ved å demon-strere den manglende evnen som transformantene har til å transformere komponente celler. Bestemmelse av måten hvori integrasjon inn i kromosomet har foregått på, kan være analyse av kromosomalt DNA, for eksempel metoden til Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517, eller ved anvendelse av andre måter kjent for fagmannen.

Når det er en forskjell i følsomheten for det selektive midlet mellom transformantene inneholdende flere kopier av markørgenet i en tandem oppstilling sammenlignet med de hvori markørgenet er inkorporert ved spredte beliggenheter i vertsgenomet, kan transformanter hensiktsmessig bli dyrket i medium som inneholder den hensiktsmessige konsentrasjonen av det selektive midlet for å selektere for transformanter med ikke-tandem integrasjon.

En annen måte å oppnå transformanter med spredt integrasjon av kopiene av DNA-sekvensen som er av interesse, er å anvende en protoplast preparert fra en homolog donorcelle som minst inneholder ett kopi av DNA-sekvensen av interesse ved en beliggenhet på dets kromosom som er forskjellig fra beliggen-heten til mottagervertscellen. Den homologe donorcellen kan for eksempel bli fremstilt ved transformering av en celle som ikke inneholder det strukturelle gen av interesse med en vektor innbefattende det strukturelle genet. Integrering av DNA-sekvensen inn i donorcellekromosomet, kan gjøres lettere ved å anvende et plasmid som inneholder et temperatur-følsomt replikasjonsorigo og dyrking av transformantene under selektive betingelser ved først den permissive temperaturen og deretter ved den ikke-permissive temperaturen som beskrevet ovenfor, og deretter isolering av koloniene som utgjør markørgenet.

Etter verifisering av fravær av plasmid-DNA, kan kromosomalt DNA bli isolert og analysert i henhold til metoden til Southern ovenfor, ved hybridisering med en probe for eksempel merket med for eksempel <32>P eller biotinylerte nukleotider. Proben kan være et cDNA som koder for polypeptidet av interesse eller fragmenter derav, og DNA-konstruksjoner eller fragmenter derav som innbefatter DNA-sekvensen av interesse, for eksempel en vektor. Transformanter som inneholder gen av interesse ved en annen beliggenhet sammenlignet med beliggen-heten til gendonorstammen kan deretter bli anvendt som en homolog donorcelle. Mottaker-vertsstammen er fortrinnsvis den samme som stammen som blir anvendt som kilden for DNA-sekvensen av interesse, eller en stamme hvori DNA-sekvensen av interesse er beliggende i en annen region av kromosomet enn i den transformerte donor-cellen.

For å medvirke til seleksjon, blir donorcellen fortrinnsvis drept med et cytotoksisk middel før eller i løpet av protoplastdannelsen. Forskjellige midler kan bli anvendt for å drepe donorcellen, innbefattende antibiotika, men iodoacet-amider funnet å være hensiktsmessig, effektivt og inter-fererer ikke med påfølgende fusjon. Når døde kloningsvertpro-toplaster blir anvendt, vil forholdet mellom døde protoplast og akseptorstammeverten, fortrinnsvis være minst omtrent 1:1 og et overskudd av den døde protoplasten kan bli anvendt.

Etter fusjon av den døde donor-celleprotoplasten og mottager-vertscelleprotoplasten, kan transformanter bli selektert ved hjelp av markørgenet. DNA'et kan bli isolert og analysert som beskrevet ovenfor for å identifisere transformanter hvori mer enn ett kopi av genet som er av interesse er blitt inkorporert inn i genomet og er separert av endogene, kromosomale sekvenser.

Spredte to-gen-transformanter blir deretter screenet på hensiktsmessige måter for deteksjon av øket ekspresjon av polypeptid av interesse. Forskjellige teknikker kan bli anvendt, spesielt når det gjelder enzymer som har godt etablerte metoder for detektering. Alternativt, når det ikke gjelder enzymer, og det ikke er noe tilgjengelig deteksjons-system, bioanalyse, antistoffer eller DNA eller RNA-hybridisasjon blir anvendt for screening av klonene for å bestemme tilstedeværelse av plasmidkonstruksjonen og ekspresjon av det strukturelle gen av interesse.

Vertscellen som inneholder den kromosomalt integrerte plasmidkonstruksjonen eller fragmentene derav, blir deretter dyrket i et næringsmedium under konvensjonelle fermenter-ingsbetingelser. Fermenteringen kan fortsettes helt til mediet er oppbrukt. I de tilfellene hvor produktet blir utskilt, kan produktet bli isolert fra mediet ved konvensjonelle teknikker, f.eks. ekstraksjon, kromatografi, elektroforese el.l. Når produktet blir opprettholdt i cytoplasma, kan cellene bli høstet ved sentrifugering, filtrering osv., lysert ved mekanisk tjæreoverflateaktivt middel, lysozym eller andre teknikker og produktet blir isolert som beskrevet ovenfor. Ved anvendelse av foreliggende metode, kan stabil integrasjon av minst to kopier av en DNA-sekvens bli oppnådd som en måte for genamplifikasjon.

Følgende eksempler er tilveiebragt for å illustrere oppfinnelsen .

EKSEMPEL 1

Preparering av et genom DNA- bibliotek fra alkalofil Bacillus novo sp. PB92 og

isolering av serin protease gen.

Kromosomalt DNA isolert fra Bacillus novo sp. PB92 (deponert under nr. OR-60 til Laboratorium voor Microbiologie, Technical University of Delft, the Netherlands, se US-patent nr. Re. 30.602) i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Saito-Miuva, Biochim. Biophys. Acta 72 (1963) 619-632, ble delvis spaltet med restriksjonsenzymet Sau3A og legert inn i BamHY-setet til plasmid pUBllO (Gryczan et al., J. Bacteriol. 134 (1978) 318-329). pUBllO plasmid DNA ble preparert som beskrevet av Birnboim og Doly (Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1513-1523).

Legeringsblandingen ble transformert inn i B. subtilis 1A40

(Bacillus Genetic Stock Centre) i henhold til metoden til Spizizen et al., J. Bacteriol. 81 (1961) 741-746, ved anvendelse av 0,6-ljjg DNA pr. ml kompetente celler. Cellene fra transformasjonsblandingen ble sådd ut på minimalskåler inneholdende: 2,8% K2HP04, 1,2% KH2PC>4, 0,4% (NH4)2S04, 0,2% tri-Na-citrat.2H20, 0,04% MgS04.7H20, 0,00005% MnS04.4H20, 0,4% L-glutamsyre, 0,5% glukose, 0,02% kasaminosyrer, 50 jjg/ml tryptofan, 20 pg/ml metionin, 20 jig/ml lysin, 20 pg/ml neomycin, 0,4% kasein og 1,5% agar. Etter inkubasjon over natt av platene ved 37°C viste en ut av 50.000 neomycinresi-stente kolonier øket proteaseproduksjon, bestemt ved øket innfelling av en ring av kaseinspalteprodukter rundt kolonien i agarskålen. Plasmid-DNA ble isolert fra denne kolonien i

henhold til metoden beskrevet av Birnboim og Doly, Nucleic Acids Res. 7 (1979) 1513-1523 og kalt pM58.

EKSEMPEL 2

Ekspresjon av PB92 serin proteasegen

Bacillus subtilis 1A40 inneholdende pM58 ble dyrket i minimalmedium (Spizizen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 44

(1958) 1072-1078) hvor 0,02% kasaminosyrer 50 jig/ml tryptofan, 20 jjg/ml metionin, 20 jig/ml lysin og 20 ug/ml neomycin var blitt tilsatt. Etter 24 timer, ble kulturen sentrifugert og supernatanten ble analysert for proteaseaktivitet ved anvendelse av dimetylkasein som substrat (Lin et al., J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793. En B. subtilis lA40-kultur inneholdende plasmid pUBllO som ble anvendt som en kontroll, viste mindre enn 1/60 av proteaseaktiviteten som den pM58 transformerte kulturen viste. Proteaseaktiviteten var fullstendig inhibert ved behandling med 1 mM fenylsul-fonylfluorid (PMSF), men ikke ved behandling med 20 mM EDTA.

Aliquoter av de ovenfor beskrevne supernatantene ble analysert på proteingel i henhold til metoden til Laemmli, nature 227 (1970) 680. Prøvene for analyse på disse gelene ble preparert ved behandling av supernatantene med 5% trikloreddiksyre (TCA). Etter sentrifugering av prøven , ble pelleten av utfelt protein vasket to ganger med aceton, deretter løst opp i 40 jjI prøvebuffer (0,5 M Tris/ECl pH 7,5, 10% v/v 2-merkaptoetanol, 50% v/v glyserol og 0,05% Bromophe-nol Blue) ved koking i 10 minutter. Etter elektroforese, ble gelene farvet ved anvendelse av Coomassie Brilliant Blue. Kultursupernatantprøver ble deretter analysert ved elektroforese. Tre forskjellige B. subtilis 1A40 stammer, ble anvendt: en stamme inneholdende pUBllO; eller pM58; eller ikke noe plasmid; og Bacillus PB92 protease som en kontroll. Etter elektroforesen, ble gelene farvet ved anvendelse av Coomassie Brilliant Blue og avfarvet. Prøven fra B. subtilis-stamme 1A40 inneholdende pM58 inneholdt et 31 kD protein, som migrerer sammen med Bacillus PB92 protease. Dette proteinet ble ikke detektert på kontrollfilen til stamme B. subtilis 1A40 inneholdende pUBllO.

Alle serinproteaser har lignende molekylvekter. Den klonede serin proteasen til Bacillus PB92 ble dermed differensiert fra kjente serin proteaser (B. subtilis subtilisin, Carlsberg subtilisin), ved transformasjon av pM58 og pUBllO til den proteasenegative B. subtilis-stammen DB104 (R. Doi, J. Bacteriol. 160 (1984) 442-444) og analyse av de ekstracellulære proteasene som ble produsert. De tilveiebragte transformantene ble dyrket i minimalmedium (Spizizen et al., ovenfor) inneholdende 0,02% kasaminosyrer, 50 pg/ml histidin og 20 ug/ml neomycin. Etter 24 timer ble prøver tatt ut, sentrifugert og uten forbehandling analysert på histidin/- MOPS-geler inneholdende 75 mM KOE, 40 mM histidin, 100 jjM MOPS (3-(N-morfolino)-propansulfonsyre) pH 7,5 og 5% polyakrylamid. Elektroforese-buffer inneholdende 40 mM histidin 100 mM MOPS, pH 6,6. Prøvene ble kjørt i katoderet-ningen. Proteasebåndene ble detektert med Agfa Pan 100 Professional filmer (Zuidweg et al., Biotechnol. and Bioengin. 14 (1972) 685-714). Disse resultatene er vist i figur 3. Som vist i figur 4, inneholder pM58 genet som koder for Bacillus PB92 protease.

EKSEMPEL 3

Sekvensering av Bacillus PB92

serin proteasegen

Hele sekvensen til BalI-Hpal-fragmentet til pM58, ble bestemt ved metoden til Sanger, Proe. nati. Acad. Sei. USA 74 (1977) 6463. Restriksjonsf ragmentene til pM58 (se figur 4) ble klonet i fag M13 vektorene mplO, mpll og mpl8 (Messing et al., Nucleic Acids Res. 9 (1981) 309-321. Innskuddene av pM58 fragmentene ble screenet ved plaque-hybridisasjon. Etter sekvensering, ble ti oligonukleotider beliggende ved jevne avstander på genet laget og sekvensering ble gjentatt, som bekrefter sekvensen vist i figur 5.

EKSEMPEL 4

Konstruksjon av serin protease

innholdende plasmide pMAX- 4

For å konstruere plasmid pUCN710 (figur 6A) pUBllO spaltet med Taql og PvuII. Fragmentet inneholdende genet som utviser neomycinresistens ble renset på lavtsmeltende agarose og butte ender, ble laget med Klenow polymerase og NTP's (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor 1982). Plasmid pTJC7 (Vieira et al., Gene 19

(1982) 259-268) ble lineærisert med Sali og butte ender ble laget som beskrevet ovenfor. Begge fragmentene ble ligert med T4 ligase (Maniatis) og transformert til E. coli JM103. Seleksjon foregikk på 2xTY-skåler (1,6% w/v Bacto-trypton, 1% w/v gjaerekstrakt, 0,5% NaCl) inneholdende 50 jjg/ml ampicillin og 10 pg/ml neomycin. Det resulterende plasmid, betegnet pUCN710, ble spaltet med BamHI. Plasmidet pE194 (Jordanescu, Plasmid 1 (1978) 468-479) ble spaltet med Bell. Fragmentene fra begge spaltingene ble ligert med T4-ligase og transformert i B. subtilis 1A40. Seleksjonen foregikk på minimal-skåler inneholdende 20 pg/ml neomycin (se eksempel 1). Det tilveiebragte plasmidet, pE194-neo (figur 6A) inneholder neomycingenet og et temperatur-følsomt replikasjonsorigo.

Subkloning av proteasegenet i integrasjonvektor pE194-neo ble utført som følger: pM58 (se eksempel 1) ble spaltet med Hpal og Ball og Bglll. Plasmid pE194-neo ble spaltet med Hpal. Disse fragmentene ble ligert med T4 ligase og transformert til B. subtilis 1A40. Transformantene ble selektert basert på neomycinresistens og en økning i proteaseproduksjon, slik det ble vurdert ved kaseinspaltingproduktutfelling (ringdannelse, se eksempel 1). Plasmid pMAX-4 ble tilveiebragt, og struk-turen ble berkeftet ved restriksjonsenzymanalyse (se figur 6B).

EKSEMPEL 5

Protoplasttransformas. lon av

Bae i Huss tamme PB92 ved pMAX- 4 Bacillus-stamme PB92 ble dyrket overnatt 1 100 ml NBSG-X-medium (Thorne et al., J. Bacteriol. 91 (1966) 1012-1020). Kulturen ble sentrifugert i 10 minutter og 4.500 rpm i en Sorvall modell GSA rotor. Protoplaster ble preparert ved inkubering av bacilli i en time ved 37°C i 10 ml alkalisk Holding-medium (AHM) inneholdende 0,5 M sukrose, 0,02 M MgCl2 og 0,02 M Tris/maleat, pH 8,0, i sterilt vann hvor 0,4 mg/ml lysozym ble tilsatt. Protoplastene ble pelletert (10 minutter ved 4.500 rpm), resuspendert i 5 ml AHM<+> pH 8,0 buffer (AHM buffer hvor det ble tilsatt 3,5% w/v Bacto Penassay Broth og 0,04% w/v Albumine Merieux) blandet, deretter pelletert som ovenfor. Etter å ha blitt resuspendert i 5,0 ml alkalisk holding-medium, ble 0,5 ml av denne protoplastsuspensjonen blandet med 5 >jg demineralisert vann inneholdende 1 jjg plasmid DNA og inkubert i 2 minutter i nærvær av 30% w/v polyetylenglykol 8.000, pH 8,0. Etter 1:3 fortynning med AHM<+ >pH 8,0

Etter 1:3 fortynning med AHM<+>pH 8,0 medium og sentrifugering, ble pelleten resuspendert i et lite volum (1 ml) AHM<+> og

inkubert i 2-3 timer. 100 jil aliquoter ble sådd ut på nylagede regenereringsskåler inneholdende 0,5 M Na suk-sinat/HCl pH 8,0, 1,5% w/v agar, 0,5% w/v kasaminosyrer, 0,5% w/v gjærekstrakt, 0,031 M fosfatbuffer pH 8,0, 0,5% w/v glukose, 0,02 M MgCl2 og 0,02% w/v Albumin Merieux. Disse skålene inneholdt også 1000 pg/ml neomycin for seleksjon. Etter inkubasjon ved 37° C i minst 72 timer, ble koloniene replika-platet på hjerteinfusjon (heart infusion) inneholdende 20 jjg/ml neomycin.

EKSEMPEL 6

Integrasjon av pMAX- 4 i

Bacillus- stammen PB92- kromosomen

En transformant av Bacillus PB92, inneholdende plasmid pMAX-4, ble inkubert i Trypton Soya Broth (TSB) inneholdende enten 1 jjg/ml eller 20 jjg/ml neomycin i 24 t ved 37"C. To ml porsjoner av cellesuspensjonene ble deretter fortynnet i 100 ml TSB inneholdende 1 jjg/ml eller 20 jjg/ml neomycin, respektivt, og inkubert i 24 t ved 50°C. Etter 24 t ble 5 ml prøver av begge kulturene igjen fortynnet, som beskrevet ovenfor, og inkubert i 24 t ved 50° C, igjen i nærvær av 1 mg/ml eller 20 jjg/ml neomycin, respektivt. Den siste fremgangsmåten ble gjentatt en gang til. Cellesuspensjonene ble deretter fortynnet 100-ganger og sådd ut på hjerteinfusjon (HI) agar-skåler inneholdende 1 jjg/ml neomycin for prøvene fra flaskene inneholdende 1 jjg/ml neomycin, og 20 yg/ml neomycin for prøvene fra flaskene inneholdende 20 pg/ml neomycin. Skålene ble inkubert i 16 t ved 50°C. Neomycin-resistente kolonier ble isolert og dyrket i 10 ml TSB-medium inneholdende 1 jig/ml neomycin i 16 t ved 37° C. Fra disse kulturene ble totalt DNA isolert (Holmes et al., Anal. Biochem. 114 (1981) 193-197. Plasmidfråvær ble verifisert ved DNA-elektroforese på agarosegel. Fravær av plasmid-DNA fra prøvene hvori plasmid DNA ikke var detekterbart ble bekreftet ved transformasjon av totalt DNA til B. subtilis 1A40. Prøvene som manglet evnen til å transformere B. subtilis 1A40 ble ansett å være plasmid-frie.

For å undersøke om og på hvilken måte, integrasjon av pMAX-4 i kromosomet foregikk på, ble kromosomalt DNA isolert, spaltet med Hindlll, kjørt på 0,5% DNA agarosegeler og blottet på nitrocellulose (Southern, J. Mol. Niol. 98 (1975) 503-517), og hybridisert med<32p->merket nick-translatert pM58 (Maniatis, 1982). Resultatet av denne analysen er vist i figur 7A.

Seleksjon ved 1 jig/ml neomycin resulterte i proteasegener tandem beliggende i kromosomet og separert av plasmid-sekvenser (stamme PBT109) som et resultat av homolog rekombinasjon (Campbell-type mechanism). I en akkumulering av 30 uavhengig isolerte innsettinger, ble seleksjon utført ved en 1 jjg/ml neomycin. En innsetting ble isolert som inneholdt plasmid pMAX-4 i det tilfeldig beliggende kromosomet som et resultat av illegitim rekombinasjon (stamme PBT122). Seleksjon ved 20 jig/ml neomycin resulterte i en kopi av plasmid pMAX-4 ved en tilfeldig beliggenhet i kromosomet som et resultat av en illegitim rekombinasjonstype. Den siste stammen ble kalt PBT108. Den genetiske organiseringen av stammene PBT109 og 108 er beskrevet i figurene 7B og 7C, respektivt. Kromosomal analyse viste at integrasjon i PBT122 og PBT108 oppstod ved forskjellige beliggenheter i kromosomet .

EKSEMPEL 7

Stabiliteten av de duplikerte proteasegenene i stammene PBT108 og PBT 109

100 ml av produksjonsmedium (inneholdende: 1% stivelse, 4% laktose, 0,87% K2HP04, 0,5% gjærekstrakt, 0,5% (NH4)2HP04, 0,2% Tri Na sitrat.2H20, 0,05% MgS04.7H20, 0,07% CaCl2, 0,068% FeS04.7H20 og 1 ml/l antiskum) uten neomycin, ble inokulert med 0,2 ml av en overnatt TSB-kultur (37°C) av stamme PBT108 eller PBT109 i 500 ml rysteflaske. Etter inkubasjon i 44 timer ved 37°C under konstant lufting, ble kulturen testet for neomycin-resistente kolonier og for proteaseaktivitet.

Begge stammene PBT%108 og PBT109 ble også analysert i Eschweiler fermentatorer inneholdende det samme produksjonsmedium for å undersøke effekten av oppskallering til 10 1. Resultatene av fermentasjonseksperimentene er oppsummert ifølge tabell 1.

Analyse av koloniene avledet fra Eschweiler-fermentasjon av PBT109 etter dyrking i 2 dager, viste at 3-25% av disse koloniene produserte i nivået i en stamme bare et enkelt proteasegen. Disse samme koloniene var funnet å være neomycin-følsomme, forårsaket av fjerning av pMAX-4-sekvensen ved homolog rekombinasjon. Analyse av koloniene avledet fra PBT108-stammefermentasjonseksperimenter viste at disse cellene var alle neomycin-resistente. Hundre av disse neomycin-resistente koloniene ble tilfeldig tatt ut og individuelt testet for proteaseproduksjonspotensial, for å bestemme om de inneholdt ett eller to produktive proteasegener. Alle hundre individuelt testede kolonier produserte i nivået av en stamme to gener som viser at de to tilfeldig integrerte proteasegenene i PBT108 blir stabilt opprettholdt under fermentasjonsbetingelsene anvendt.

EKSEMPEL 8

Konstruksjon av integrasjonsvektor pElatB

Plasmid pGB34, beskrevet i EPA 0134048, ble spaltet med restriksjonsenzymene Bell, Bgll og Bgill. De tilveiebragte restriksjonsfragmentene ble tilført butte ender med Klenow-polymerase, deretter ligert inn i Hpal-setet til pE194-neo (se eksempel 6). Plasmid pE194-neo-DNA ble isolert som beskrevet av Birnboim og Doly (Nucl. Acids. Res. 7 (1979) 1513-1523).

Legeringsblandingen ble transformert inn i B. subtilis 1-A40, i henhold til metoden til Spizizen et al (J. Bacteriol. 81

(1961) 741-746) ved anvendelse av 0,5-1 jjg DNA pr. ml kompetente celler. Cellene fra transformasjonsblandingen ble sådd ut på minimalskåler inneholdende 2,8% K2HP04, 1,2% KH2P04, 0,4% (NH4)2S04, 0,2% Tri Na sitrat.2H20, 0,04% MgS04.7H20, 0,00005% MnS04.4H20, 0,4% glutamsyre, 0,5% glukose, 0,02% kasaminosyrer, 50 jig/ml tryptofan, 20 jjg/ml metionin, 20 pg/ml lysin, 20 pg/ml neomycin, 0,4% kasein, 0,5% stivelse og 1,5% agar.

DNA fra alfa-amylaseproduserende kolonier ble isolert som beskrevet av Birnboim og Doly og undersøkt med restriksjons-ensymet. Fra en av disse transformantene ble plasmid pElatB, se fig.8, isolert.

EKSEMPEL 9

Transformering av den alfa- amylasenegative stamne Bacillus licheniformis T9 med pElatB Transformering av Bacillus licheniformis-stamme T9 ble utført som beskrevet i EP-A-0253455 med unntagelse av at hele prosedyren ble utført ved 30°C i stedet for 37°C. Seleksjon for transformanter ble utført på minimal-skåler inneholdende 20 jjg/ml neomycin. Alle transformantene produserte amylase. Restriksjonsenzymanalyse utført på DNA preparert som beskrevet av Birnboim og Doly viste at alle transformantene inneholdt pElatB.

EKSEMPEL 10

Integrasjon av pElatB inn i

B. lichteniformis T9 kromosom

Bacillus licheniformis-stamme T9 inneholdende plasmid pElatB, ble inokulert i Trypton Soya Broth (TSB) inneholdende 20 jjg/ml neomycin og inkubert i 16 timer ved 30° C. 5 ml av cellesuspensjonen ble ført inn i 100 ml av det samme mediet og inkubert ved 50"C i 24 timer.

Denne prosedyren ble gjentatt én gang. Cellesuspensjonen ble deretter fortynnet 100-ganger og sådd ut på hjerteinfusjons-agarskåler inneholdende 10 ug/ml neomycin. Etter 40 timers inkubasjon ved 50°C, ble neomycin-resistente kolonier isolert og dyrket i 10 ml TSB-medium, inneholdende 10 jig/ml neomycin, i 16 timer ved 30°C. Totalt DNA fra disse kulturene ble isolert (Holmes et al., Anal. Biochem. 114 (1981) 193-197). Fravær av plasmider i disse cellene ble bekreftet ved DNA elektroforese på agarosegeler. Prøver hvori DNA med lav molekylvekt var i vesentlig grad fraværende, ble pånytt undersøkt for nærvær av plasmid DNA ved DNA-transformasjon til B. subtilis 1-A40 (Spizizen et al., 1961). Prøvene som manglet evnen til å transformere B. subtilis 1-A40 til neomycinresistens ble ansett å være plasmid minus.

For å undersøke om integrasjon av pElatB foregikk og hvordan det foregikk, ble kromosomalt DNA isolert fra transformantene (Saito-Minwa, Biochem. Biophys. Acta 72 (1963) 619-632), spaltet med EcoRI fraksjonert på 0,5% agarosegeler, blottet på nitro-cellulose (Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517) og hybridisert med <32>P-merket nick-translatert pGB33 (se EP-A-O134048). Resultatene fra denne analysen er vist i figur 9A. Dataene viser at illegitim rekombinasjon av pElatB foregikk, resulterende i en stamme inneholdende et enkelt amylasegen på et annet locus av genomet sammenlignet med den opprinnelige Bacillus licheniformis T5 amylasestamme. Den tilveiebragte stammen inneholdende pElatB ble betegnet TB13.

EKSEMPEL 11

Konstruksjon av stamme T13F inneholdende to amylasegener separert av endogene kromosomale sekvenser

For å utvikle en stamme inneholdende to amylasegener separert av endogene kromosomale DNA-sekvenser, ble et fusjonseksperi-ment utført mellom Bacillus licheniformis-stamme T5 (den opprinnelige amylasegeninneholdende amylasestammen, se EP-A-O134048) og stamme TB13 (den tilfeldig integrerte, amylasegeninneholdende stammen). Protoplastfusjonen ble utført som beskrevet i EP-A-0134048, og beskrivelsen er inkorporert heri ved referanse. Stamme TB13 ble drept med iodacetamid før protoplastdannelse. Stamme T5 (neomycin-følsom) ble ikke drept. Seleksjon for fusanter (positive kloner) foregikk på regenerasjonsskåler inneholdende 10 >ig/ml neomycin.

For å undersøke og identifisere potensielle fusanter (positive kloner), ble kromosomalt DNA isolert, spaltet med EcoRI, fraksjonert på 0,5% agarosegeler, blottet på nitrocel-lulosefiltere (Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517) og hybridisert med <32>P-merket nick-translatert pGB33 (se EP-A-0134048). Resultatet av denne analysen er vist i figur 9B. En av de tilveiebragte fusantene, T13F, inneholdt to amylasegener separert av endogene kromosomale sekvenser.

EKSEMPEL 12

Stabiliteten til de duplikerte amylasegenene

i stammene T390 og T13F

Stabiliteten til stamme T13F, en stamme inneholdende to kromosomale amylasegener separert av essensielle kromosomale sekvenser, ble sammenlignet med stamme T390, en stamme med to kromosomal amylasegener beliggende i en tandem oppstilling. Preparering av stamme T390 er beskrevet i EP-A-134048 (side 17, tabell I), hvor den ble referert til som B. licheniformis T5 (pGB33). Stammene T13F og T390 ble testet under fer-menterasjonsbetingelser, dvs. 0,2 ml av en overnatt TSB-kultur (37°C) ble inokulert i 500 ml rysteflasker inneholdende 100 ml produksjonsmedium (se eksempel 7; etter sterili-sering ble pH-en justert til 6,9 med NaOH) uten neomycin. Etter inkubasjon i 6 dager ved 40°C under konstant utlufting, ble kulturen testet for neomycin-resistente kolonier og amylaseaktiviteter. Resultatene til fermentasjonseksperimentene er oppsummert i følgende tabell 2.

For å utelukke muligheten av fjerning av et amylasegen uten samtidig tap av neomycingenet i stamme T13F, ble 20 kolonier avledet fra T13F-fermentasjon analysert. Kromosomalt DNA fra 20 tilfeldig valgte kolonier ble isolert og karakterisert ved hybridisasjonseksperimentet som beskrevet ovenfor. Resultatene til 9 av disse analysene er vist i figur 10. Alle testede stammer inneholdt to amylasegener, som blir demon-strert ved nærvær av to alfa-amylasegener inneholdende EcoRI-fragmenter i deres kromosomale DNA.

I kontrast til den genetiske stabiliteten til stamme T13F, var stamme T390 ustabil ved fermentasjon som resulterte i 12% neomycin-følsomme kolonier. En av disse koloniene ble anlysert og funnet å inneholde bare ett alfa-amylasegen (figur 10, fil 4). Dette viser at tilfeldig integrert amylasegener er mere stabile enn integrerte gener i tandem, ved fermentasjonsbetingelsene.

Det er innlysende fra resultatene ovenfor at en prokaryotisk celle kan bli tilveiebragt, hvori stabil genamplifikasjon blir oppnådd ved selektering for transformerte celler hvori ikke-tandem integrasjon av minst to kopier av det strukturelle genet som skal bli amplifisert har forekommet. Integrasjon kan oppstå ved homolog rekombinasjon eller illegitim rekombinasjon.

Alle publikasjonene og patentsøknadene som er nevnt i denne beskrivelsen, indikerer kunnskapsnivået til fagmennene som denne oppfinnelsen vedrører. Alle publikasjonene og patent-søknadene er inkorporert heri ved referanse i samme grad som om hver individuelle publikasjon eller patentsøknad var spesifikt og individuelt indikert å være inkorporert ved referanse.

Claims (13)

1. Transformert prokaryot vertscelle som omfatter minst to kopier av en DNÅ-sekvens i dets kromosom, i det nevnte DNA-sekvens koder for et polypeptid av interesse, hvori nevnte kopier er separert av endogent kromosomalt DNA som er vitalt for vertscellen og nevnte kopier "blir stabilt opprettholdt, karakterisert ved at: de ekstra kopiene av den nevnte DNA sekvensen oppnås fra (a) en DNA-konstruksjon, omfattende minst en kopi av nevnte DNA-sekvens og minst et markørgen og et temperatur-følsomt replikasjonsorigo eller (b) en donorvertscelle som omfatter nevnte DNA-konstruksjon, under transformerende betingelser; ved integrering av minst en kopi av nevnte DNA-sekvens inn i kromosomet til en mottager vertscelle med nevnte DNA-konstruksjon; selektering for en transformant hvori nevnte DNA-konstruksjon er integrert inn i kromosomet til nevnte transformant; og isolering fra blant nevnte transformanter, transformerte prokaryote vertsceller omfattende minst to kopier av nevnte DNA-sekvens separert av endogene DNA sekvenser som er vitale for vertscellen.

2. Transformert prokaryot vertscelle ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte prokaryote celle er en Bacillus-stamme.

3. Transformert prokaryot vertscelle ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte Bacillus-stamme er en alkalofil Bacillus-stamme eller en Bacillus licheniformis-vertsstamme.

4. Transformert prokaryot vertscelle ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte alkaliofile Bacillus-stamme er Bacillus novo species PB92 eller en mutant eller en variant derav.

5. Transformert prokaryot vertscelle ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte Bacillus licheniformis vertstamme er Bacillus licheniformis T5 eller en mutant eller variant derav.

6. Transformert prokaryot vertscelle ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte polypeptid av interesse er et enzym.

7. Transformert prokaryot vertscelle ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte enzym er et proteolytisk enzym eller et amylolyttisk enzym.

8. Transformert prokaryot vertscelle ifølge 7, karakterisert ved at nevnte proteolytiske enzym er en serin protease.

9. Transformert prokaryot vertscelle ifølge krav 8, karakterisert ved at nevnte serin protease omfatter vesentlig følgende aminosyresekvens:

10. Transformert prokaryot vertscelle ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte amylolytiske enzym er alfa-amylase.

11. Transformert prokaryot vertscelle ifølge krav 1, karakterisert ved at genomet til Bacillus novo species PB92 eller en mutant eller variant derav omfatter nevnte DNA sekvens.

12. Transformert prokaryot vertscelle ifølge krav 1, karakterisert ved at genomet til Bacillus licheniformis stamme T5 eller en mutant eller en variant derav omfatter nevnte DNA sekvens.

13. Anvendelse av en transformert prokaryot vertscelle som definert i et hvilket som helst av kravene 1 til 12, for produksjon av et polypeptid av interesse.