JP2004501651A - 遺伝子の安定した染色体多コピー組み込みのための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
発明の分野:
本発明は、細菌株の染色体中に遺伝子を挿入するための方法、及びその得られる菌株に関する。バイオテク産業においては、菌株に耐抗生物質性マーカー遺伝子を残さないで、安定して染色体に組み込まれる注目の遺伝子のいくつかのコピーを有するポリペプチド生成株を構成することが所望される。
【0002】
発明の背景:
ポリペプチドの産業的生成においては、生成物収率をできるだけ高く達成することが注目の対象である。収率を高めるための1つの手段は、注目のポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を高めることである。これは、高いコピー数プラスミド上に遺伝子を配置することによって行われ得るが、しかしながらプラスミドは不安定性であり、そしてしばしば、宿主細胞の培養の間、選択的アッセイが存在しない場合、宿主細胞から失われる。注目の遺伝子のコピー数を高めるためのもう1つの手段は、それを宿主細胞染色体中に複数コピーで組み込むことである。抗生物質マーカーを用いないで、二重相同組換えにより染色体中に遺伝子をいかにして組み込むかはこれまで記載されており(Honeなど., Microbial Pathogenesis 1988, 5: 407−418);2種の遺伝子の組み込みもまた記載されている(Novo Nordisk: WO91/09129号及びWO94/14968号)。
【0003】
宿主細胞の染色体への遺伝子のいくつかのコピーの組み込みに関する問題は、不安定性である。選択マーカー又は他の必須DNAがコピー間に含まれず、そして選択圧力が培養の間、適用されない場合、特に遺伝子がお互い相対的に隣接して位置する場合、コピーの配列同一性のために、宿主細胞の培養の間、コピー及び再び染色体から組換えする高い傾向が存在する。より良好な安定性を達成するために、逆平行の一列に並んで、密接した間隔で存在する2種の遺伝子をいかにして組み込むかは記載されている(Novo Nordisk: WO99/41358号)。
【0004】
組換えDNA技法の産業的使用に関する今日の公的データベースはいくつかの問題、及び抗生物質マーカー遺伝子の使用についての関心を提供して来た。抗生物質マーカー遺伝子が、マーカー遺伝子、及び産業的興味のポリペプチドをコードする付随する発現カセットの両者の複数コピーを担持する株を選択するための手段として従来使用されている。抗生物質マーカーを欠いている組換え生成宿主株のための現在の要求を満たすためには、非抗生物質マーカー遺伝子による、今日使用されている抗生物質マーカーの置換を可能にするであろう、現在の技法に代わる可能な技法を見出す必要がある。従って、抗生物質耐性マーカーを欠いている組換え生成株を供給するためには、宿主細胞染色体中に遺伝子を複数コピーで安定して組み込むための新規方法を見出すことが、産業的に興味あることである。
【0005】
発明の要約:
本発明は、異なった位置に注目の遺伝子の少なくとも1つのコピーをすでに含む細菌宿主株の十分に定義された染色***置中に、相同組換えにより注目の遺伝子の複数コピーを組み込むことの問題を解決する。これは、注目の遺伝子の少なくとも1つのコピーをすでに含む株の宿主染色体において1又は複数の条件付きで必須の遺伝子(この後、“組み込み遺伝子”と称する)の一部の欠失を行うことによって、又は他方では、遺伝子を非機能的にするためにそれを変更することによって;又は得られる株が欠失(例えば、特異的炭素源利用)、又は増殖必要条件(例えば、アミノ酸栄養要求性)を有するか、又は所定のストレスに対して敏感であるよう、宿主染色体中に少なくとも1つの一部の非機能的な、条件付で必須の遺伝子を組み込むことによって行われ得る。
【0006】
次に、注目の遺伝子の次の(すなわち、第2又は第3、等)コピーが、ベクター上に導入され、ここで前記遺伝子は、組み込み遺伝子の部分フラグメントをその上流端に有し、そして下流端には、宿主染色体上の組み込み遺伝子の下流のDNA配列に対して相同のフラグメントを有する。従って、宿主染色体も入って来るベクターのいずれも、組み込み遺伝子の完全なバージョンを含まない。非制限的な例においては、宿主染色体は、組み込み遺伝子の最初の2/3を含み、そしてベクターは最後の2/3を含むことができ、ベクター及び染色体上で組み込み遺伝子の1/3の配列オーバーラップを効果的に確立する。
【0007】
組み込み遺伝子の完全なバーションの発現は、ベクターと宿主染色体との間の相同組換えが一部の組み込み遺伝子配列を通して起こる場合、単に発生し、そしてこの特定の組換え現象は、すでに染色体上に含まれる同一の遺伝子中に注目の遺伝子により向けられる染色体中への相同組み込みバックグラウンドに対してさえ、効果的に選択され得る。
【0008】
この方法は、拡張された相同性が入って来るベクター上の注目の遺伝子と染色体における他の位置でのこの遺伝子の他のコピーとの間に存在したとしても、そして注目の遺伝子が宿主において1又は複数のコピーにすでに存在する場合、この遺伝子の発現に起因する定性的な表現型に基づいて所望する組み込み体を同定することが実施できないとしても、方向づけられた遺伝子組み込みを予定された遺伝子座での相同組換えにより可能にするであろう。
【0009】
本明細書における非制限的な例においては、市販のアミラーゼTermamyl(商標)(Novo Nordisk, Denmark)をコードする遺伝子の2個の逆平行コピー(逆転された配向)を含んで成るバチルス酵素生成株が供給される。D−アラニンラセマーゼをコードする、バチルス・スブチリスのdal遺伝子に相同の遺伝子がバチルス生成株において同定され、それが配列決定され、そして部分的欠失がバチルス2−コピーTermamyl(商標)株のdal遺伝子において行われた。上記方法に従って、安全なdal遺伝子を効果的に戻す方法において、dal遺伝子座に隣接する第3のTermamyl(商標)遺伝子コピーの安定した非タンデム染色体挿入をもたらすベクターが構成された。
【0010】
本明細書におけるもう1つの非制限的な例においては、アミラーゼコードの遺伝子の追加のコピーが、染色体上の他の場所に位置するアミラーゼ遺伝子の少なくとも第2のコピーをすでに含んでいるバチルス酵素生成株のキシロースイソメラーゼオペロン中に導入された。
また非制限的な例においては、本発明者は、バチルス酵素生成株のグルコネートオペロン中に追加のアミラーゼコードの遺伝子を組み込むことによって本発明の方法を示す。条件付で必須の遺伝子中への組み込みの他の非制限的例が下記に与えられる。
【0011】
従って、第1の観点においては、本発明は、染色体中の異なった位置に安定して組み込まれる注目の遺伝子の少なくとも2つのコピーを含んで成る細胞を構成するための方法に関し、ここで前記方法は、
a)注目の遺伝子の少なくとも1つの染色体コピーを含み、且つ遺伝子を非機能的にするために変更されている1又は複数の条件付きで必須の染色体遺伝子を含む宿主細胞を供給し;
b)i)段階a)の条件付で必須の遺伝子の変更された非機能的
コピー、及び
ii) 上記i)を1つの側に有し、そして段階a)の遺伝子に隣接する宿主細胞染色体に位置する宿主細胞DNA配列に対して相同のDNAフラグメントを他の側に有する注目の遺伝子の少なくとも1つのコピー、
を含んで成るDNA構造体を供給し;ここで前記i)の変更されたコピーと前記段階a)の変更された染色体遺伝子との間の第1の組換えが前記条件付きで必須の染色体遺伝子を機能的に戻し、そして前記細胞を選択性にし;
c)前記宿主細胞中に前記のDNA構造体を導入し、そして前記細胞を、条件付きで必須の機能的遺伝子を必要とする選択的条件下で培養し;そして
d)前記段階の選択的条件下で増殖する宿主細胞を選択し;ここで前記注目の遺伝子の少なくとも1つのコピーが段階a)の遺伝子に隣接する宿主細胞染色体中に組み込まれており;そして任意には、
e)個々の反復において、段階a)における異なった染色体遺伝子を用いて少なくとも1度、段階a)〜d)を反復する;
ことを含んで成る。
【0012】
本発明の第1の観点を記載するもう1つの手段は、染色体中の異なった位置に安定して組み込まれる注目の遺伝子の少なくとも2つのコピーを含んで成る細胞を構成するための方法に関し、ここで前記方法は、
a)注目の遺伝子の少なくとも1つの染色体コピーを含んで成る宿主細胞を供給し;
b)前記宿主細胞の条件付で必須の染色体遺伝子を変更し、それにより前記遺伝子が非機能的になり;
c)i)段階b)の染色体遺伝子の変更された非機能的
コピー、及び
ii) 上記i)を1つの側に有し、そして段階b)の遺伝子に隣接する宿主細胞DNA配列に対して相同のDNAフラグメントを他の側に有する注目の遺伝子の少なくとも1つのコピー、
を含んで成るDNA構造体を製造し;ここでi)の変更されたコピーと段階b)の変更された染色体遺伝子との間の第1の組換えが前記条件付きで必須の染色体遺伝子を機能的に戻し、そして前記細胞を選択性にし;
d)前記宿主細胞中に前記のDNA構造体を導入し、そして前記細胞を、段階b)の機能的遺伝子を必要とする選択的条件下で培養し;そして
e)段階d)の選択的条件下で増殖する宿主細胞を選択し;ここで前記注目の遺伝子の少なくとも1つのコピーが段階b)の遺伝子に隣接する宿主細胞染色体中に組み込まれており;そして任意には、
f)個々の反復において、段階b)における異なった染色体遺伝子を用いて少なくとも1度、段階a)〜e)を反復する;
段階を含んで成る。
【0013】
本明細書における遺伝的手段はまた、本発明の方法を実施するために必要なDNA構造体の形で記載される。
従って、第2野観点においては、本発明は、
i)宿主細胞からの条件付きで必須の染色体遺伝子の変更された非機能的コピー、好ましくは部分的に欠失されたコピー;及び
ii)上記i)を1つの側に有し、そしてi)の条件付きで必須の遺伝子に隣接する宿主細胞染色体に位置する宿主細胞DNA配列に対して相同のDNAフラグメントを他の側に有する注目の遺伝子の少なくとも1つのコピー、
を含んで成るDNA構造体に関する。
【0014】
本発明は、条件付で必須の遺伝子座に隣接して染色体上に安定して組み込まれる注目の遺伝子の少なくとも2つのコピーを含んで成る宿主細胞を得るための方法を提供する。
従って、第3の観点においては、本発明は、染色体中に安定して組み込まれる注目の遺伝子の少なくとも2つのコピーを含んで成る宿主細胞に関し、ここで少なくとも1つのコピーが条件付で必須の遺伝子座に隣接して組み込まれ、そして前記細胞は第1の観点で定義される方法のいずれかにより得られる。
【0015】
本発明の観点を記載するもう1つの手段は、染色体中に安定して組み込まれる注目の遺伝子の少なくとも2つのコピーを含んで成る宿主細胞に関し、ここで個々のコピーは条件付で必須の異なった遺伝子座に隣接して組み込まれ、そして前記細胞は第1の観点に定義される方法のいずれかにより得られる。
本発明の方法は、非機能にされた、条件付で必須の遺伝子の補充に依存し、そしてそのような非機能的遺伝子を含んで成る多くの適切な宿主細胞は本明細書に記載されている。本発明の複数回の遺伝子組み込みを実施するためには、いくつかの非機能的な、条件付で必須の遺伝子を含んで成る宿主細胞を供給することが好都合である。
【0016】
第4の観点においては、本発明は、バチルス・リケニホルミスに関し、ここで少なくとも2種の条件付きに必須の遺伝子が非機能的にされ、好ましくは前記遺伝子がxylA, galE, gntK, gntP, glpP, glpF, glpK, glpD, araA, metC, lysA及びdalから成る群から選択される。
本発明の方法に使用するための、本明細書に記載されるような宿主細胞は、本発明の範囲により包含される予定である。
本発明のもう1つの観点は、前記第1の観点に定義されるような方法への前記観点に定義されるような細胞の使用に関する。
【0017】
上記で言及されるように、本発明の遺伝的手段が、本明細書に記載され、そして本発明の範囲は、当業界において通常であるように、宿主細胞に存在するが又はそこにおいて増殖される場合、そのような構造体を含んで成る。
本発明のさらにもう1つの観点は、前記第2の観点において定義されるようなDNA構造体を含んで成る細胞に関する。
最終の観点においては、本発明は、前記観点のいずれかに定義されるような細胞を、酵素を生成するために適切な条件下で培養し、そして任意には、前記酵素を精製することを含んで成る、興味ある酵素を生成するための方法に関する。
【0018】
定義:
本発明によれば、従来の分子生物学、微生物学、及び当業者の範囲内の組換えDNA技法が使用され得る。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor, New York (herein “Sambrook など., 1989”) DNA Vloning: A Practical Approach, Volumes I and II/D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Syntesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds (1985)); Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Gude To Molecular Cloning (1984) を参照のこと。
【0019】
“ポリヌクレオチド”は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーであり、前記ポリヌクレオチドの配列は、前記ポリマーの5’末端から3’末端に読み取られる塩基の実際の配列である。ポリヌクレオチドは、RNA及びDNAを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組合せから調製され得る。
【0020】
“核酸分子”、又は“ヌクレオチド配列”とは、一本鎖形又は二本鎖ヘリックスのいずれかでのリボヌクレオチド(アデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジン;“RNA分子”)又はデオキシリボヌクレオチド(デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン又はデオキシシチジン;“DNA分子”)のリン酸エステルポリマー形を言及する。二本鎖DNA−DNA、DNA−RNA及びRNA−RNAヘリックスが可能である。
【0021】
用語、核酸分子及び特にDNA又はRNA分子は、分子の一次及び二次構造のみを言及し、そしてそれを、いずれかの特定の三次又は四次形に制限しない。従って、この用語は、中でも、線状又は環状DNA分子(例えば、制限フラグメント)、プラスミド及び染色体に見出される二本鎖DNAを包含する。特定の二本鎖DNA分子の構造を論じる場合、配列は、DNAの非転写鎖(すなわち、mRNAに対して相同の配列を有する鎖)にそって、5’側から3’側の方向に配列を単に供給する通常の慣例に従って本明細書に記載され得る。“組換えDNA分子”は、分子生物学的操作をうけたDNA分子である。
【0022】
DNA“コード配列”又は“読み取り枠(ORF)”は、適切な調節配列の制御下に置かれる場合、インビトロ又はインビボで細胞において転写され、そしてポリペプチド翻訳される二本鎖のDNA配列である。ORFは、ポリペプチドを“コードする”。コード配列の境界は、5’(アミノ)末端での開始コドン及び3’(カルボキシル)末端での翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、原核配列、真核mRNAからのcDNA、真核(例えば、哺乳類)DNAからのゲノムDNA配列及び合成DNA配列を包含するが、但しそれらだけには限定されない。コード配列が真核細胞における発現のために意図される場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は、通常3’コード配列に位置するであろう。
【0023】
発現ベクターは、その転写を提供する追加のセグメントに操作可能的に連結される興味あるポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る、直鎖又は環状DNA分子である。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列、及び任意には1又は複数の複製起点、1又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル及び同様のものを包含するであろう。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスDNAに起因し、又は両要素を含むことができる。
【0024】
転写及び翻訳制御配列は、宿主、例えば真核細胞においてコード配列の発現を提供する、DNA調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター及び同様のものであり、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。
“分泌シグナル配列”は、それが合成される細胞の分泌経路を通して、より大きなポリペプチドの成分として、その大きなポリペプチドを方向づけるポリペプチド(“分泌ペプチド”)をコードするDNA配列である。前記大きなポリペプチドは、分泌経路を通して、遷移の間、分泌ペプチドを除去するために切断される。
【0025】
用語“プロモーター”とは、RNAポリメラーゼの結合、及び転写プロモーターの開始を提供するRNA配列を含む遺伝子の部分を示すためのその技術的に認識される手段のために本明細書において使用される。プロモーター配列は通常、遺伝子の5’側の非コード領域に見出されるが、但し必ずしもそうではない。
染色体遺伝子は、その遺伝子がコードするポリペプチドが機能的形でもはや発現され得ない場合、“非機能的”にされる。遺伝子のそのような非機能性は、当業界において知られている広範囲の種類の遺伝子操作又は変更により誘発され得、それらのいくつかは、Sambrookなど. (上記)に記載されている。遺伝子のORF内の部分的欠失はしばしば、突然変異、例えば置換、挿入、フレームシフト、等のように、遺伝子を非機能的にするであろう。
【0026】
“操作可能的に連結される”とは、DNAセグメントを言及する場合、そのDNAセグメントが、それらが協力して機能し、例えば転写工程が、プロモーターセグメントへのRNA−ポリメラーゼ結合を通して起こり、そしてポリメラーゼが、転写ターミネーターセグメントに遭遇する場合、停止するまで、前記コードセグメントを通して転写を続行するよう整列されることを示す。
本明細書においては、宿主細胞における“異種”DNAとは、前記細胞に起因しない外因性DNAを言及する。
【0027】
本明細書において使用される場合、用語“核酸構造体”とは、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA又はRNA起源のいずれかの核酸分子を示すことを意図する。用語“構造体”とは、一本鎖又は二本鎖であり得、そして興味あるポリペプチドをコードする、完全な又は部分的な天然に存在するヌクレオチド配列に基づかれ得る核酸セグメントを示すことを意図する。構造体は任意には、他の核酸セグメントを含むことができる。
【0028】
本発明のポリペプチドをコードする本発明の核酸構造体は、適切には、ゲノム又はcDNAライブラリーを調製し、そして標準の技法(Sambrookなど., 前記)に従って、合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてのハイブリダイゼーションにより、ポリペプチドのすべて又は一部をコードするDNA配列についてスクリーニングすることによって得られるゲノム又はcDNA起源のものであり得る。
【0029】
前記ポリペプチドをコードする本発明の核酸構造体はまた、確立された標準の方法、例えばBeaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859−1869により記載されるホスホアミジット方法、又はMatthesなど., EMBO Journal 3 (1984), 801−805により記載される方法により合成的に調製され得る。ホスホアミジット方法によれば、オリゴヌクレオチドは、例えば自動DNA合成機により合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、そして適切なベクターによりクローン化される。
【0030】
さらに、核酸構造体は、標準の技法に従って、合成、ゲノム又はcDNA起源(適切な場合)のフラグメント(完全な核酸構造体の種々の部分に対応する)を連結することによって調製される、混合された合成及びゲノム、混合された合成及びcDNA、又は混合されたゲノム及びcDNA起源のものであり得る。核酸構造体はまた、例えばアメリカ特許第4,683,202号又はSaikiなど., Science239 (1988) 487−49) に記載のように、特定のプライマーを用いてのポリメラーゼ鎖反応により調製され得る。
用語“核酸構造体”は、核酸構造体が本発明のコード配列の発現のために必要な制御配列を含む場合、用語“発現カセット”と同じ意味である。
【0031】
用語“制御配列”とは、核酸配列のコード配列の発現のために必要であるか、又はそのために好都合であるすべての成分を包含するよう定義される。個々の制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して生来であっても又は外来性であっても良い。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーターシグナル配列、及び転写ターミネーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。最少で、制御配列は、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを包含する。制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と制御配列との連結を促進する特定の制限部位を導入するためにリンカーを提供され得る。
【0032】
制御配列は、適切なプロモーター配列、すなわち核酸配列の発現のために宿主細胞により認識される核酸配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を仲介する転写及び翻訳制御配列を含む。プロモーターは、選択の宿主菌細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列であり得、そして宿主細胞に対して相同であるか又は異種である細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。
【0033】
制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、すなわち転写を終結するよう宿主細胞により認識される配列でもあり得る。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の3’側末端に操作可能的に連結される。選択の宿主細胞において機能的であるいずれかのターミネーターが、本発明において使用され得る。
制御配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわち核酸配列の3’末端に操作可能的に連結され、そして転写される場合、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するためにシグナルとして宿主細胞により認識される配列であり得る。選択の宿主細胞において機能するいずれかのポリアデニル化配列が、本発明において使用され得る。
【0034】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードし、そしてそのコードされたポリペプチドを宿主細胞の分泌路中に方向づけるシグナルペプチドコード領域でもあり得る。核酸配列のコード配列の5’側末端は、本来、分泌されたポロペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読み取り枠を整合して、天然において連結されるシグナルペプチドコード領域を含むことができる。他方では、コード配列の5’側末端は、分泌されたポリペプチドをコードするそのコード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含むことができる。
【0035】
通常、そのコード配列がシグナルペプチドコード領域を含まない外来性シグナルペプチドコード領域が必要とされる。他方では、外来性シグナルペプチドコード領域は、コード配列に通常関連する天然のシグナルペプチドコード領域に対して、ポリペプチドの増強された分泌を得るために、天然のシグナルペプチドコード領域を単純に置換することができる。シグナルペプチドコード領域は、アスペルギラス種からのグルコアミラーゼ又はアミラーゼ遺伝子、リゾムコル種からのリパーゼ又はプロテイナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシアエからのα−因子のための遺伝子、バチルス種からのアミラーゼ又はプロテアーゼ、又はウシプロプレキモシン遺伝子から得られ得る。しかしながら選択の宿主細胞の分泌路中に発現されたポリペプチドを方向づけるいずれかのシグナルペプチドコード領域が、本発明に使用され得る。
【0036】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端で位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド(又は多くの場合、チモーゲン)として知られている。プロポリペプチドは一般的に不活性であり、そしてプロポリペプチドからプロペプチドの触媒又は自己触媒分解により成熟した活性ポリペプチドに転換され得る。プロペプチドコード領域は、バチルス・スブチリスアルカリプロテアーゼ遺伝子(aprE)、バチルス・スブチリス中性プロテアーゼ遺伝子(nprT)、サッカロミセス・セレビシアエα−因子遺伝子、又はミセリオプソラ・サーモフィリア ラッカーゼ遺伝子から得られる(WO95/33836号)。
【0037】
宿主細胞の増殖に関して、ポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することがまた所望される。調節システムの例は、調節化合物の存在を包含する、化学的又は物理的刺激に応答して、遺伝子の発現の開始又は停止を引き起こすそれらのシステムである。原核生物系における調節システムは、lac, tac及びtrpオペレーターシステムお包含する。調節配列の他の列は、遺伝子増幅を可能にするそれらの配列である。真核システムにおいては、それらはメトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、及び重金属と共に増幅されるメタロチオネイン遺伝子を包含する。それらの場合、ポリペプチドをコードする核酸配列が、調節配列によりタンデムに配置される。
【0038】
特に細胞宿主細胞において本発明の核酸構造体の転写を方向づけるための適切なプロモーターの例は、E.コリlacオペロン、ストレプトミセス・コエリカラー(Streptomyces coelicolor)アガラーゼ遺伝子(dagA)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)Lバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)α−アミラーゼ遺伝子(amyL)、Bチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)マルトゲン性アミラーゼ遺伝子(amyM)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliguefaciens) α−アミラーゼ遺伝子(amyQ)、
【0039】
バチルス・アミロリケファシエンスBAN AMYLASE GENE(amyM)、バチルス・リケニホルミスペニシリナーゼ遺伝子(penP)、バチルス・サブチリスxylA及びzylB遺伝子及び原生動物のβ−ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター(Villa−Kamaroffなど., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727−3731)、及びtac プロモーター(De Boer など., 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 21−25)である。さらなるプロモーターは、“Useful proteins from recombinant bacteria” in Scientific American, 1980, 242: 74−94; 及びSambrookなど., 1989, 前記に記載される。
【0040】
本発明はまた、本発明の核酸配列、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを含んで成る組換え発現ベクターにも関する。上記に記載される種々の核酸及び制御配列が、そのような部位でポリペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換を可能にするために1又は複数の便利な制限部位を包含することができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得る。他方では、本発明の核酸配列は、前記核酸配列又はその配列を含んで成る核酸構造体を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、コード配列は、そのコード配列が発現及びたぶん分泌のための適切な制御配列と操作可能的に連結されるよう、ベクターに位置する。
【0041】
組換え発現ベクターは、組換えDNA方法に便利にゆだねられ得、そして核酸配列の発現をもたらすことができるいずれかのベクター(たとえば、プラスミド又はウィルス)であり得る。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入される予定である宿主細胞とベクターとの適合性に依存するであろう。ベクターは、線状又は閉環された環状プラスミドであり得る。ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち染色体存在物として存在するベクター(その複製は染色体複製には無関係である)、たとえばプラスミド、染色体外要素、ミニクロモソーム又は人工染色体であり得る。
【0042】
ベクターは自己複製を確かめるためのいずれかの手段を含むことができる。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。ベクターシステムは、宿主細胞のゲノム中に導入される全DNA又はトランスポゾンを一緒に含む、単一のベクター又はプラスミド、又は複数のベクター又はプラスミドであり得る。
【0043】
本発明のベクターは好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする1又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、1つの遺伝子であり、その生成物は、殺生物剤、抗生物質又はウィルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養要求性、及び同様のものを提供する。
【0044】
“条件付きで必須の遺伝子”は、“非抗生物質選択マーカー”として機能することができる。条件付きで必須の細菌性選択マーカーの非制限的例は、細菌がD−アラニンの不在下で培養される場合、唯一必須である、バチル・スブチリス又はバチルス・リケニホルミスからのdal遺伝子である。また、UDP−ガラクトースのターンオーバーに関与する酵素をコードする遺伝子は、細胞がガラクトースの存在下で増殖されるか、ガラクトースの存在下で生じる場合、細胞において条件付きで必須のマーカーとして機能することができる。
【0045】
そのような遺伝子の非制限的な例は、UTP−依存性ホスホリラーゼ(EC2. 7. 7. 10)、UDP−グルコース−依存性ウリジルイルトランスフェラーゼ(EC2. 7. 7. 12)又はUDP−ガラクトースエピメラーゼ(EC5. 1. 3. 2)をコードするB. スブチリス又はB.リケニホルミスからのそれらの遺伝子である。また、バチルスのキシロースイソメラーゼ遺伝子、例えばxylAが、単一の炭素源としてキシロースを含む最少培地において増殖される細胞において選択マーカーとして使用され得る。グルコネートを利用するために必須な遺伝子、すなわちgntK及びgntPがまた、単一の炭素源としてグルコネートを含む最少培地において増殖される細胞において選択マーカーとして使用され得る。条件付きで必須の遺伝子の他の非制限的例は、下記に与えられる。
【0046】
抗生物質選択マーカーは、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、エリトロマイシン、テトラサイクリン、ネオマイシン、ヒグロマイシン又はメトトレキセートのような抗生物質に対する抗生物質耐性を付与する。
さらに、選択は、選択マーカーが別々のベクター上に存在する場合、WO91/17243号に記載されるように、同時−形質転換により達成され得る。
【0047】
本発明のベクターは好ましくは、ベクター、又はそのベクターの小さな部分の宿主細胞ゲノム中への安定した組み込み、又は細胞のゲノムに関係なく細胞におけるベクターの自律的複製を可能にする要素を含む。
ベクター、又はそのベクターの小さな部分は、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に込みこまれ得る。染色体組み込みに関しては、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列、又は相同又は非相同組換えによるゲノム中へのベクターの安定した組み込みのためのベクターのいずれか他の要素に依存する。
【0048】
他方では、ベクターは、宿主細胞のゲノム中への相同組換えによる組み込みを方向づけるための追加の核酸配列を含むことができる。その追加の核酸配列は、染色体における正確な位置での宿主細胞ゲノム中へのベクターの組み込みを可能にする。正確な位置での組み込みの可能性を高めるために、組み込み要素は好ましくは、相同組換えの可能性を高めるために対応する標的配列と高い相同性を示す十分な数の核酸、たとえば100〜1,500個の塩基対、好ましくは400〜1,500個の塩基対、及び最も好ましくは800〜1,500個の塩基対を含むべきである。組み込み要素は、宿主細胞のゲノムにおける標的配合と相同であるいずれかの配列であり得る。さらに、組み込み要素は、非コード又はコード核酸配列であり得る。
【0049】
ベクター、発現カセット、増幅単位、遺伝子、又は実際、いずれかの定義されるヌクレオチド配列のコピー数は、いずれの時点ででも宿主細胞に依存する同一のコピーの数である。遺伝子又はもう1つの定義される染色体ヌクレオチド配列は、染色体上に1,2又はそれよりも多くのコピーで存在することができる。自律的に複製するベクターは、宿主細胞当たり1、又は数百のコピーで存在することができる。
【0050】
自律複製に関しては、ベクターはさらに、問題の宿主細胞におけるベクターの自律的複製を可能にする複製の起点を含むことができる。複製の細菌起点の例は、プラスミド、pBR322、PUC19、pACYC177, pACYC184, pUB110, pE194, pTA1060及びpAMβ1の複製の起点である。複製の起点は、宿主細胞においてその機能を感温性にする突然変異を有する起点であり得る(例えば、Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433を参照のこと)。 本発明はまた、ポリペプチドの組換え生成に都合良く使用される、本発明の核酸配列を含んで成る組換え宿主細胞に関する。用語“宿主細胞”は、複製の間に生じる突然変異のために、親細胞とは同一でない、親細胞のいずれかの子孫を包含する。
【0051】
細胞は好ましくは、本発明の核酸配列を含んで成るベクターにより形質転換され、続いて宿主染色体中にベクターが組み込まれる。“形質転換”とは、本発明の核酸配列を含んで成るベクターの宿主細胞中への導入を意味し、その結果、前記ベクターは、染色体組み込み体として、又は自己複製する染色体外ベクターとして維持される。組み込みは一般的に、核酸配列が細胞において安定して維持される傾向があるので、好都合であると思われる。宿主染色体中のベクターの組み込みは、上記のように、相同又は非相同組換えにより生じることができる。
【0052】
宿主細胞の選択は、ポリペプチド及びその源をコードする遺伝子にかなりの程度、依存するであろう。宿主細胞は、単細胞微生物、例えば原核生物、又は非単細胞微生物、例えば真核生物であり得る。有用な単細胞生物は、細菌、例えばグラム陽性細菌、例えばバチルス細胞、例えばバチルス・アルカロフィラス(Bacillus alkalopilus)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス・コーギュランス(Bacillus coagulans)、バチルス・ランタス(Bacillus lantus)、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、
【0053】
バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)及びバチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis);又はストレプトミセス細胞、例えばストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)又はストレプトミセス・ムリナス(Streptomyces murinus);又はグラム陰性細菌、例えばE.コリ及びシュードモナスsp. (Pseudomonas sp.) である。好ましい態様においては、細菌宿主細胞は、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・ステアロサーモフィラス又はバチルス・スブチリス細胞である。
【0054】
細菌宿主細胞の形質転換は、プロトプラス形質転換(例えば、Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111−115を参照のこと)、コンピテント細胞の使用(例えば、Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823−829, 又はDubnar and Davidoff−Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209−221を参照のこと)、エレクトロポレーション(例えば、Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742−751を参照のこと)、又は接合(例えば、Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771−5278を参照のこと)によりもたらされ得る。
【0055】
上記に記載される、形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞は、所望するポリペプチドの発現を可能にする条件下で適切な栄養培地において培養され、この後、得られるポリペプチドが細胞ブイヨンから回収される。
細胞を培養するために使用される培地は、宿主細胞を増殖するために適切ないずれかの従来の培地、例えば適切な補充物を含む最少又は複合培地であり得る。適切な培地は、商業的供給者から入手でき、又は公開された処方(例えば、American Type Culture Collectionのカタログ)に従って調製され得る。培地は、当業界において知られている方法を用いて調製される(例えば、細菌及び酵母についての文献、例えばBennett, J.W. and Lasure, L., editors, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991を参照のこと)。
【0056】
ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、ポリペプチドはその培地から直接的に回収され得る。ポリペプチドが分泌されない場合、それは細胞溶解物から回収される。ポリペプチドは、培養培地から、従来の方法、例えば遠心分離又は濾過により培地から宿主細胞を分離し、上清液又は濾液のタンパク質性成分を塩、例えば硫酸アンモニウムにより沈殿せしめることにより回収され、問題のポリペプチドの型に依存して、種々のクロマトグラフィー方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過のクロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィー又は同様の方法により精製される。
【0057】
ポリペプチドは、ポリペプチドに対して特異的である当業界において知られている方法を用いて検出され得る。それらの検出方法は、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成又は酵素基質の消出を包含する。例えば、酵素アッセイは、ポリペプチドの活性を検出するために使用され得る。
【0058】
本発明のポリペプチドは、当業界において知られている種々の方法、例えばクロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除)、電気泳動方法(例えば、分離用等電点電気泳動(IEF))、示差溶解性(例えば、硫酸アンモニウム沈殿)、又は抽出(例えば、Protein Purification, J. C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照のこと)により精製され得る。
【0059】
発明の特定の記載:
本発明の第1の観点に従っての、異なった位置で染色体中に安定して組み込まれる注目の遺伝子の少なくとも2つのコピーを含んで成る細胞を構成するための方法:
本発明の方法においては、第1の相同組換えによる宿主細胞の染色体中へのDNA構造体の方向付けられ、そして選択可能組み込みの後、第2の組換えが、構造体に含まれるDNAフラグメントと、第1の観点の方法の段階b)の遺伝子に隣接して位置する相同宿主細胞DNA配列との間で起こる(ここで前記構造体のDNAフラグメントは前記宿主細胞DNA配列に対して相同である)ことが構想される。
【0060】
従って、本発明の好ましい態様は、DNA構造体を導入し、そして選択的条件下で細胞を培養する段階に続いて、又は宿主細胞を選択する段階に続いて、第2の組換えが前記DNAフラグメントと前記相同宿主細胞DNA配列との間で起こる、第1の観点の方法に関する。
本発明の好ましい態様は、段階d)に続いて、及び段階e)の前、第2の組換えが前記DNAフラグメントと前記相同宿主細胞配列との間で起こる、第1の観点の方法に関する。
さらに、第1の組換え組み込み体の選択を容易にするマーカー遺伝子を前記DNA構造体に付加することが構想され、ここで前記マーカー遺伝子は上記に記載されるように第2の組換えにより再び前記宿主細胞染色体から切除される。
【0061】
好ましい態様においては、本発明は、DNA構造体がさらに、第2の組換えにより染色体から組換えされるよう、前記構造体に位置する少なくともマーカー遺伝子を含んで成る、第1の観点の方法に関し;好ましくは、前記少なくとも1つのマーカー遺伝子は耐抗生物質性を付与し、より好ましくは前記抗生物質は、クロラムフェニコール、カナマイシン、アンピシリン、エリトロマイシン、スペクチノマイシン及びテトラサイクリンから成る群から選択され;そして最も好ましくは、選択条件下で増殖し、そして染色体に少なくとも1つのマーカー遺伝子を含まない宿主細胞が選択される。
【0062】
本発明の方法はまた、第2の組換え現象の後、染色体に組み込まれたまま存続するDNA構造体のその部分にマーカー遺伝子を含むことによって行われ得る。しかしながら、染色体にマーカー遺伝子を有さないことが好ましいので、マーカー遺伝子を除去する他の手段が、組み込みが行われた後、用いられるべきである。DNAの一部がレゾルバーゼ部位又はres−部位として知られている一定の認識配列を両端に有する場合、そのDNAの部分を切除する特定の制限酵素又はレゾルバーゼは、当業界において良く知られている。例えば、引用により本明細書に組み込まれるWO96/23073号(Novo Nordisk A/S)を参照のこと。
【0063】
本発明の好ましい態様は、DNA構造体がさらに、変更されたコピーとDNAフラグメントとの間に位置する少なくとも1つのマーカー遺伝子を含み、そして前記少なくとも1つのマーカー遺伝子が、特定のレゾルバーゼにより認識されるヌクレオチド配列を両端に有し、好ましくは前記ヌクレオチド配列がresであり;さらにより好ましくは、前記少なくとも1つのマーカー遺伝子が、選択条件下で増殖される宿主細胞の選択に続いて、レゾルバーゼ酵素の作用により染色体から除去される、第1の観点の方法に関する。
【0064】
注目の遺伝子は宿主細胞により天然において生成される酵素をコードすることができ、実際、宿主細胞に対して内因性の遺伝子のコピーの数を高めることが単純に所望される。
従って、本発明の好ましい態様は、注目の遺伝子が宿主細胞に起因する第1の観点の方法に関する。
【0065】
もう1つの好ましい態様においては、本発明は第1の観点の方法に関し、ここで注目の遺伝子は酵素、好ましくはデンプ分解酵素、脂肪分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解酵素、オキシドレダクターゼ又は植物細胞壁分解酵素、及びより好ましくは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カルボヒドロラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、β−ガラクロシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インバーターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼから成る群から選択された活性を有する酵素をコードする。
【0066】
上記で言及されるように、注目の遺伝子は宿主細胞に対して内因性であるがしかしながら、本発明の方法により得られる生成細胞は、組み込み工程が完結される場合、できるだけ小さな外因性の外来性又は異種DNAを含むことが好都合である。
従って、本発明の好ましい態様は、選択的条件下で増殖する前記選択された宿主細胞は、実質的に外因性DNAを含まず、好ましくは興味ある組み込まれる遺伝子当たり500以下の塩基対、より好ましくは300個以下のbp、さらにより好ましくは100個以下のbp、さらにより好ましくは50個以下のbp、より好ましくは25個以下のbp、又は最も好ましくは外因性DNAを含まない、第1の観点の方法に関する。
【0067】
本発明のさらに好ましい態様は、選択条件下で増殖する前記選択された宿主細胞が、内因性起源のみのDNAを含んで成る、第1の観点の方法に関する。
もう1つの態様は、第1の観点の段階e)において選択される宿主細胞が内因性起源のDNAのみを含んで成る方法に関する。
変更又は操作、例えば遺伝子又はその遺伝子のプロモーターを部分的に欠失することにより、又は遺伝子又はその遺伝子のプロモーター領域に突然変異を導入することにより遺伝子を非機能的にする多くの手段は、当業界に存在する。
本発明の好ましい態様は、宿主細胞の条件付に必須の染色体遺伝子が、前記遺伝子を部分的に欠失することによって、又は前記遺伝子に1又は複数の突然変異を導入することによって変更される、第1の観点の方法に関する。
【0068】
本発明は、宿主細胞における少なくとも1つの条件付きで必須の染色体遺伝子を1つの段階において非機能的にすることに関し、そして特に、非機能的にされるべき多くの条件付で必須の遺伝子に関する。前記遺伝子は当業界において知られているような部分的欠失又は突然変異により非機能的にされ得;特に、前記遺伝子は、下記非制限的な例に示されるように、“欠失プラスミド”の使用を通して非機能的にされ得る。第1の観点の方法の段階b)の変更された染色体遺伝子に関するそれぞれの好ましい態様に関しては、最も好ましい態様は本明細書における非制限的例に示され、そしてこの目的のために構成される遺伝子手段、例えば“欠失プラスミド”を構成するために使用されるPCRプライマー配列が言及される。
【0069】
従って、本発明の好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、D−アラニンラセマーゼをコードし、好ましくは前記遺伝子はバチルス細胞からのdal相同体であり、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのdalに相同であり、そして最も好ましくは、前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのdal遺伝子である、第1の観点の方法に関する。
【0070】
本発明のもう1つの好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、D−アラニンラセマーゼをコードし、そして配列番号12における位置1303〜2469に示されるバチルス・リケニホルミスのdal配列に対して、少なくとも75%、好ましくは80%、好ましくは85%、より好ましくは90%、又はより好ましくは95%及び最も好ましくは少なくとも97%同一である、第1の観点の方法に関する。
【0071】
条件付きで必須の遺伝子は特定の炭素源、例えばキシロース又はアラビノースの使用に関与するポリペプチドをコードすることができ、この場合、宿主細胞は、前記遺伝子が非機能的である場合、特定の炭素源のみにより補充された最少培地においては増殖することができない。
本発明の好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、1種の特定の主要炭素源のみにより補充された最少培地上での前記宿主細胞の増殖のために必要とされる1又は複数の遺伝子である、第1の観点の方法に関する。
【0072】
本発明の好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、キシロースオペロンのものであり、好ましくは前記遺伝子はバチルス・サブチリスからのxylA遺伝子に相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのキシロースイソメラーゼオペロンの1又は複数の遺伝子に相同である、第2の観点の方法に関する。
【0073】
本発明の好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、ガラクトキナーゼ(EC2. 7. 1. 6)、UTP−依存性ピロホスホリラーゼ(EC2. 7. 7. 10)、UDP−グルコース−依存性ウリジルイルトランスフェラーゼ(EC2. 7. 7. 12)又はUDP−ガラクトースエピメラーゼ(EC5. 1. 2. 3)をコードし、好ましくは前記遺伝子はUDP−ガラクトースエピメラーゼ(EC5. 1. 2. 3)をコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルスのgalEに相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのgalEである、第1の観点の方法に関する。
【0074】
本発明の好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、グルコネートオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグルコネートキナーゼ(EC2. 7. 1. 12)又はグルコネートペルミアーゼ、又は両者をコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのgntk又はgntP遺伝子に対して相同の1又は複数の遺伝子であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスからのgntK又はgntP遺伝子である、第1の観点の方法に関する。
【0075】
本発明のもう1つの好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、グルコネートオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグルコネートキナーゼ(EC2. 7. 1. 12)又はグルコネートペルミアーゼ、又は両者をコードし、そしてバチルス・リケニホルミスのgntK及びgntPのいずれかに対して、少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは95%及び最も好ましくは少なくとも97%同一である、第1の観点の方法に関する。
【0076】
本発明のもう1つの好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、グリセロールオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグリセロール摂取促進体(ペルミアーゼ)、グリセロールキナーゼ又はグリセロールデヒドログナーゼをコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのglpP, glpF, glpK及びglpD遺伝子に対して相同の1又は複数の遺伝子であり、そして最も好まくは前記遺伝子は配列番号26で示されるバチルス・リケニルホルミスからのglpP, glpF, glpK及びglpD遺伝子の1又は複数の遺伝子である、第1の観点の方法に関する。
【0077】
本発明のもう1つの好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、グリセロールオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグリセロール摂取促進体(ペルミアーゼ)、グリセロールキナーゼ又はグリセロールデヒドログナーゼをコードし、そして配列番号26で示されるバチルス・リケニホルミスのglpP, glpF, glpK及びglpD配列のいずれかに対して、少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは95%及び最も好ましくは少なくとも97%同一である、第1の観点の方法に関する。
【0078】
本発明のもう1つの好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、アラビノースオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はアラビノースイソメラーゼをコードし、より好ましくは前記遺伝子は、バチルス・スブチリスからのaraA遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子は配列番号38で示されるバチルス・リケニホルミスからのaraA遺伝子である、第1の観点の方法に関する。
【0079】
本発明の好ましい態様は、変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、アラビノースオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はアラビノースイソメラーゼをコードし、そして配列番号38で示されるバチルス・リケニホルミスのaraA配列に対して、少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは95%及び最も好ましくは少なくとも97%同一である、第1の観点の方法に関する。
【0080】
他の条件付きで必須の遺伝子、例えば1又は複数のアミン酸を合成するために細胞に必要とされる遺伝子は、文献において十分に記載されており、ここでアミノ酸の合成のために必要とされるポリペプチドをコードする非機能的遺伝子は、そのアミノ酸のために細胞を栄養要求性にし、そして前記細胞は、前記アミノ酸が増殖培地に供給される場合、増殖することができる。そのような遺伝子の機能性の回復は、その細胞によるアミノ酸のそれ自体での合成を可能にし、そしてそれは栄養要求細胞のバックグラウンドに対して選択できるようになる。
【0081】
従って、本発明の好ましい態様は、前記宿主細胞の条件付で必須の染色体遺伝子が、アミノ酸合成に関与する1又は複数のポリペプチドをコードし、そして前記遺伝子の非機能性が細胞を1又は複数のアミノ酸のために栄養要求性にし、そして前記遺伝子の機能性の回復が前記細胞を前記アミノ酸のため原栄養性にする、第1の観点の方法に関する。
【0082】
本発明の特に好ましい態様は、前記宿主細胞の条件付きで必須の染色体遺伝子が、リシン又はメチオニン合成に関与する1又は複数のポリペプチドをコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのmetC又はlysA遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスからのmetC又はlysA遺伝子である、第1の観点の方法に関する。
【0083】
本発明のもう1つの特に好ましい態様は、前記宿主細胞の条件付きで必須の染色体遺伝子が、配列番号42で示されるバチルス・リケニホルミスのmetC配列、又は配列番号48で示されるバチルス・リケニホルミスのlysA配列に対して、少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは95%、及び最も好ましくは少なくとも97%同一である、第1の観点の方法に関する。
【0084】
本明細書のおいて記載される場合、本発明の方法は、バイオテク産業のために非常に適切であり、そして次の多くの好ましい生物はこの産業において非常に良く知られている:特にグラム陽性宿主細胞、及びバチルス属の一定の宿主細胞、特にバチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュランス、バチルス・クラウジ、バチルス・コアギランス、バチルス・ラクタス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・スブチリス及びバチルス・スリンギエンシス。
【0085】
本発明の好ましい態様は、前記宿主細胞が、グラム陽性細菌細胞、好ましくはバチルス細胞及び最も好ましくは、バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュランス、バチルス・クラウジ、バチルス・コアギランス、バチルス・ラクタス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・スブチリス及びバチルス・スリンギエンシスから成る群から選択されたバチルス細胞である、第1の観点の方法に関する。
【0086】
本発明のもう1つの好ましい態様は、DNA構造体がプラスミドである、第1の観点の方法に関する。
本明細書において他で記載されるように、本発明は、本発明の方法を実施するための遺伝的手段、例えば宿主細胞及び本発明のDNA構造体、例えば次のものを含んで成る第2の観点のDNA構造体を供給する:
i)宿主細胞からの条件付きで必須の染色体遺伝子の変更された非機能的コピー、好ましくは部分的に欠失されたコピー;及び
ii)上記i)を1つの側に有し、そしてi)の条件付きで必須の遺伝子に隣接する宿主細胞染色体に位置する宿主細胞DNA配列に対して相同のDNAフラグメントを他の側に有する注目の遺伝子の少なくとも1つのコピー。
【0087】
本発明の好ましい態様は、i)において変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、D−アラニンラセマーゼをコードし、好ましくは前記遺伝子はバチルス細胞からのdal相同体であり、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのdalに相同であり、そして最も好ましくは、前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのdal遺伝子である、第2の観点のDNA構造体に関する。
【0088】
本発明のもう1つの好ましい態様は、i)において変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、D−アラニンラセマーゼをコードし、そして配列番号12における位置1303〜2469に示されるバチルス・リケニホルミスのdal配列に対して、少なくとも75%、好ましくは80%、好ましくは85%、より好ましくは90%、又はより好ましくは95%及び最も好ましくは少なくとも97%同一である、第2の観点のDNA構造体に関する。
本発明のさらにもう1つの好ましい態様は、宿主細胞からの条件付きに必須の染色体遺伝子の変更された非機能的コピーが、1種の特定の主要炭素源のみにより補充された最少培地上での前記宿主細胞の増殖のために必要とされる1又は複数の遺伝子である、第2の観点のDNA構造体に関する。
【0089】
本発明の好ましい態様は、i)において変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、キシロースオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はバチルス・サブチリスからのxylA遺伝子に相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのキシロースイソメラーゼオペロンの1又は複数の遺伝子に相同である、第2の観点のDNA構造体に関する。
【0090】
本発明のもう1つの好ましい態様は、i)において変更される前記宿主細胞の染色体遺伝子が、ガラクトキナーゼ(EC2. 7. 1. 6)、UTP−依存性ピロホスホリラーゼ(EC2. 7. 7. 10)、UDP−グルコース−依存性ウリジルイルトランスフェラーゼ(EC2. 7. 7. 12)又はUDP−ガラクトースエピメラーゼ(EC5. 1. 2. 3)をコードし、好ましくは前記遺伝子はUDP−ガラクトースエピメラーゼ(EC5. 1. 2. 3)をコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルスのgalEに相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのgalEである、第2の観点のDNA構造体に関する。
【0091】
本発明の1つのより好ましい態様は、条件付きに必須の染色体遺伝子が、グルコネートオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグルコネートキナーゼ(EC2. 7. 1. 12)又はグルコネートペルミアーゼ、又は両者をコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのgntk又はgntP遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスからのgntK又はgntPの1又は複数の遺伝子である、第2の観点のDNA構造体に関する。
【0092】
本発明のさらにもう1つの好ましい態様は、条件付きに必須の染色体遺伝子が、グリセロールオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグリセロール摂取促進体(ペルミアーゼ)、グリセロールキナーゼ又はグリセロールデヒドログナーゼをコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのglpP, glpF, glpK及びglpD遺伝子にに対して相同の1又は複数の遺伝子であり、そして最も好まくは前記遺伝子は配列番号26で示されるバチルス・リケニルホルミスからのglpP, glpF, glpK及びglpD遺伝子の1又は複数の遺伝子である、第2の観点のDNA構造体に関する。
【0093】
本発明の特に好ましい態様は、条件付きに必須の染色体遺伝子が、アラビノースオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はアラビノースイソメラーゼをコードし、より好ましくは前記遺伝子は、バチルス・スブチリスからのaraA遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子は配列番号38で示されるバチルス・リケニホルミスからのaraA遺伝子である、第2の観点のDNA構造体に関する。
【0094】
本発明の1つのより好ましい態様は、条件付きに必須の染色体遺伝子が、アラビノースオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はアラビノースイソメラーゼをコードし、より好ましくは前記遺伝子は、バチルス・スブチリスからのaraA遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子は配列番号38で示されるバチルス・リケニホルミスからのaraA遺伝子である、第2の観点のDNA構造体に関する。
【0095】
本発明の好ましい態様は、条件付きに必須の染色体遺伝子が、アラビノースオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はアラビノースイソメラーゼをコードし、そして配列番号38で示されるバチルス・リケニホルミスのaraA配列に対して、少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは95%及び最も好ましくは少なくとも97%同一である、第2の観点のDNA構造体に関する。
【0096】
本発明のさらにもう1つの好ましい態様は、条件付で必須の染色体遺伝子が、アミノ酸合成に関与する1又は複数のポリペプチドをコードし、そして前記遺伝子の非機能性が、遺伝子の他の機能的コピーを有さない細胞に存在する場合、細胞を1又は複数のアミノ酸のために栄養要求性にし、そして前記遺伝子の機能性の回復が前記細胞を前記アミノ酸のため原栄養性にし;好ましくは、条件付きで必須の染色体遺伝子が、リシン又はメチオニン合成に関与する1又は複数のポリペプチドをコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのmetC又はlysA遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスからのmetC又はlysA遺伝子である、第2の観点のDNA構造体に関する。さらにより好ましくは、条件付きで必須の染色体遺伝子が、配列番号42で示されるバチルス・リケニホルミスのmetC配列、又は配列番号48で示されるバチルス・リケニホルミスのlysA配列に対して、少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは95%、及び最も好ましくは少なくとも97%同一である。
【0097】
本発明は、バイオテク産業において非常に有用である生成宿主細胞、例えば染色体中に安定して組み込まれる注目の遺伝子の少なくとも2つのコピーを含んで成り、その少なくとも1つのコピーは条件付きで必須の遺伝子座に隣接して組み込まれている、第3の観点の宿主細胞を構成するための方法を提供し、ここで前記細胞は第1の観点に定義されるいずれかの方法により得ることができる。
【0098】
第1の観点の方法は、宿主細胞の染色体中への注目の遺伝子の組み込みを記載し、その結果、前記注目の遺伝子は、条件付きで必須の遺伝子座に隣接して存在する位置に組み込まれる。注目の遺伝子及び遺伝子座の正確な相対的位置は、前記方法のために主要な関連性のものではないが、しかしながら一般的に言及すると、より安定した組み込みを達成するためにではあるが、しかしまた、宿主細胞ゲノム中への不必要なDNA配列の組み込みを最少にするために、前記2種の遺伝子及び遺伝子座を分離する塩基対での距離を最少にすることが興味の対象である。
【0099】
従って、本発明の好ましい態様は、前記注目の遺伝子が、前記条件付きで必須の遺伝子座から、1000個以下の塩基対、好ましくは750個の以下の塩基対、より好ましくは500個以下の塩基対、さらにより好ましくは250個以下の塩基対、及び最も好ましくは100個以下の塩基対、分離される、第3の観点の宿主細胞に関する。
【0100】
上記に言及されるように、宿主細胞ゲノムにおける組み込まれているか又は不必要なDNA配列、特に外因性起源のDNAの存在を最少にすることが興味ある対象であり、そして理想的な宿主細胞は、内因性起源のDNA、例えば異なった十分に定義される染色***置に組み込まれる興味ある内因性遺伝子の複数のコピーのみを含む。
【0101】
従って、本発明の好ましい態様は、実質的に外因性DNAを含まず、好ましくは興味ある組み込まれる遺伝子当たり500個以下の塩基対、より好ましくは300以下のbp、さらにより好ましくは100以下のbp、さらにより好ましくは50個以下のbpを含み、又は最も好ましくは外因性DNAを含まない、第3の観点の宿主細胞に関する。
本発明のもう1つの好ましい態様は、内因性DNAのみを含む、第3の観点の宿主細胞に関する。
一定の細菌株が、前記に言及されるようにバイオテク産業において宿主細胞として好ましい。
【0102】
本発明の好ましい態様は、前記宿主細胞が、グラム陽性細菌細胞、好ましくはバチルス細胞及び最も好ましくは、バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュランス、バチルス・クラウジ、バチルス・コアギランス、バチルス・ラクタス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・スブチリス及びバチルス・スリンギエンシスから成る群から選択されたバチルス細胞である、第3の観点の宿主細胞に関する。
【0103】
本発明のもう1つの好ましい態様は、注目の遺伝子のコピーが、D−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子、好ましくはバチルス・スブチリスからのdal遺伝子に相同の遺伝子、より好ましくは配列番号12における位置1303〜2469に示されるバチルス・リケニホルミスのdal配列に対して少なくとも75%同一である遺伝子、さらにより好ましくは、配列番号12における位置1303〜2469に示されるバチルス・リケニホルミスのdal配列に対して少なくとも95%及び最も好ましくは少なくとも97%同一である、第3の観点の宿主細胞に関する。
【0104】
本発明の特に好ましい態様は、注目の遺伝子のコピーが、1種の特定の主要炭素源のみにより補充された最少培地上での前記宿主細胞の増殖のために必要とされる遺伝子に隣接して組み込まれる、第3の観点の宿主細胞に関する。
本発明のもう1つの好ましい態様は、注目の遺伝子のコピーが、キシロースオペロンの遺伝子に隣接して、好ましくはバチルス・スブチリスからのxylR又はxylA遺伝子に相同の遺伝子に隣接して、及び最も好ましくは、バチルス・リケニホルミスからのxylR又はxylAに隣接して組み込まれる、第3の観点の宿主細胞に関する。
【0105】
本発明の1つのより好ましい態様は、注目の遺伝子のコピーが、ガラクトキナーゼ(EC2. 7. 1. 6)、UTP−依存性ピロホスホリラーゼ(EC2. 7. 7. 10)、UDP−グルコース−依存性ウリジルイルトランスフェラーゼ(EC2. 7. 7. 12)又はUDP−ガラクトースエピメラーゼ(EC5. 1. 2. 3)をコードする遺伝子、好ましくは前記遺伝子はUDP−ガラクトースエピメラーゼ(EC5. 1. 2. 3)をコードする遺伝子、より好ましくは前記遺伝子はバチルスのgalEに相同である遺伝子、そして最も好ましくはバチルス・リケニホルミスのgalEに隣接して組み込まれる、第3の観点の宿主細胞に関する。
【0106】
本発明の追加の好ましい態様は、注目の遺伝子のコピーが、グルコネートオペロンの遺伝子に隣接して、好ましくはグルコネートキナーゼ(EC2. 7. 1. 12)又はグルコネートペルミアーゼをコードする遺伝子に隣接して、より好ましくはgntR, gntK, gntp及びgntZから成る群から選択されたバチルス・スブチリス遺伝子に相同の遺伝子に隣接して、及び最も好ましくはバチルス・リケニホルミスからのgntR, gntK, gntP又はgntZに隣接して組み込まれる、第3の観点の宿主細胞に関する。
【0107】
本発明のさらに追加の好ましい態様は、注目の遺伝子のコピーが、グリセロールオペロンの1又は複数の遺伝子、好ましくは前記遺伝子はグリセロール摂取促進体(ペルミアーゼ)、グリセロールキナーゼ又はグリセロールデヒドログナーゼをコードする遺伝子、より好ましくはバチルス・スブチリスからのglpP, glpF, glpK及びglpD遺伝子に対して相同の遺伝子、及び最も好まくは配列番号26で示されるバチルス・リケニルホルミスからのglpP, glpF, glpK及びglpD遺伝子に隣接して組み込まれる、第3の観点の宿主細胞に関する。
【0108】
本発明のもう1つの特に好ましい態様は、注目の遺伝子のコピーが、アラビノースオペロンの遺伝子であり、好ましくはアラビノースイソメラーゼをコードする遺伝子に隣接して組み込まれ、より好ましくは前記遺伝子は、バチルス・スブチリスからのaraA遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子は配列番号38で示されるバチルス・リケニホルミスからのaraA遺伝子である、第3の観点の宿主細胞に関する。
【0109】
本発明のさらに好ましい態様は、注目の遺伝子のコピーが、アミノ酸合成に関与する1又は複数のポリペプチドをコードする遺伝子に隣接して組み込まれ、そして前記遺伝子の非機能性が細胞を1又は複数のアミノ酸のために栄養要求性にし、そして前記遺伝子の機能性の回復が前記細胞を前記アミノ酸のため原栄養性にし;好ましくは、注目の遺伝子のコピーが、リシン又はメチオニン合成に関与する1又は複数のポリペプチドをコードする遺伝子に隣接して組み込まれ、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのmetC又はlysA遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスからのmetC又はlysA遺伝子である、第3の観点の宿主細胞に関する。
【0110】
また好ましくは、注目の遺伝子のコピーが、配列番号42で示されるバチルス・リケニホルミスのmetC配列、又は配列番号48で示されるバチルス・リケニホルミスのlysA配列に対して、少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは95%、及び最も好ましくは少なくとも97%同一である遺伝子に隣接して組み込まれる。
【0111】
前記第3の観点の宿主細胞は、ポリペプチド、例えば酵素の産業的生成のために特に興味あるものである。
【0112】
本発明の好ましい態様は、前記注目の遺伝子が、酵素、好ましくはデンプ分解酵素、脂肪分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解酵素、オキシドレダクターゼ又は植物細胞壁分解酵素、及びより好ましくは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カルボヒドロラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、β−ガラクロシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インバーターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼから成る群から選択された活性を有する酵素をコードする、第3の観点の宿主細胞に関する。
【0113】
また好ましくは、前記注目の遺伝子が、ヒト身体において生物学的活性を有するペプチド、好ましくは医薬的活性ペプチド、より好ましくはインスリン/プロ−インスリン/プレ−プロ−インスリン又はそれらの変異体、成長ホルモン又はその変異体、又は血液凝固因子VII又はVIII又はそれらの変異体をコードする。 本発明のさらに好ましい態様は、抗生物質マーカーが存在しない第3の観点の宿主細胞に関する。
【0114】
本発明は、第1の観点の方法への使用のために適切である宿主細胞、特に1,2又はそれ以上の条件付きで必須の遺伝子が非機能的にされている宿主細胞の構成を教授する。下記非制限的な例においては、本発明の好ましい、条件付きで必須の遺伝子が、本発明の特定の欠失プラスミドを用いることによる部分的欠失を通して、いかにして非機能的にされるかが示される。特に、本発明は、少なくとも2種の条件付きに必須の遺伝子が非機能的にされ、好ましくは前記遺伝子がxylA, galE, gntK, gntP, glpP, glpF, glpK, glpD, araA, metC, lysA及びdalから成る群から選択される、第4の観点のバチルス細胞、好ましくはバチルス・リケニホルミスサイブに関する。
【0115】
前記第3の観点のそのような宿主細胞の使用は、同様に、第1の観点の方法において構想される。
第1の観点の方法のための本発明により提供されるもう1つの遺伝子的手段は、第2の観点のDNA構造体を含んで成る宿主細胞である。
本発明の最終観点は、第3の観点の細胞を、興味ある酵素を生成するために適切な条件下で培養し、そして任意には、前記酵素を精製することを含んで成る、興味ある酵素の生成方法に関する。
【0116】
実施例
例1:
バチルス・リケニホルミスST4671(WO99/41358号)は、B.リケニホルミスのα−アミラーゼ遺伝子、amyLの領域に対向する相対的配向で挿入される、その染色体に2つの安定して組み込まれるamyL遺伝子コピーを含んで成る。次の例は、amyL遺伝子の3個の安定して染色体コピーを含んで成るが、しかし外来性DNAを欠いている株をもたらすB.リケニホルミス染色体のもう1つの定義される領域中への選択できる、意図された組み込みによる第3のamyL遺伝子コピーのこの株中への挿入を記載する。
キシロースイソメラーゼ欠失/組み込み概略(図1):
バチルス・リケニホルミスキシロースイソメラーゼ領域の配列は、受託番号Z80222として、GenBank/EMBLから入手できる。
【0117】
“欠失プラスミド”と称するプラスミドを、感温性親プラスミド上にキシロースイソメラーゼ領域からの2種のPCR増幅されたフラグメントをクローニングすることによって構成した。PCRフラグメントを、“A”及び“B”と示し、ここでAはxylRプロモーター及びxylR遺伝子の一部を含んで成り;そしてBはプロモーター及び遺伝子の最初の70個の塩基対を欠いているzylAの内部フラグメントを含んで成る。レゾルバーゼ(res)部位を両端に有するスペクチノマイシン耐性遺伝子を、プラスミド上のフラグメントAとBとの間に導入した。このスペクチノマイシン耐性遺伝子は後で、レゾルバーゼ−介在性部位特異的組換えにより除去され得る。
【0118】
キシロースイソメラーゼ欠失を、感温性プラスミドの組み込み及び切除により介在される、フラグメントA及びBを通しての二重相同組換えにより欠失プラスミドからバチルス標的株の染色体にトランスファーした。得られる株は、“欠失株”と称した。この株は、単独の炭素源としてキシロースを含む最少培地上で増殖することはできない。
【0119】
“組み込みプラスミド”を、欠失株のキシロースイソメラーゼ領域中への遺伝子の挿入のために構成した。XylAプロモーター及び約1kbのxylA遺伝子を含んで成る“C”と称するフラグメントをPCR−増幅した。しかしながら、後で記載されるように、xylAプロモーター及びxylA遺伝子の最初の250塩基対を含んで成る、“D”と称する小さな方のフラグメントのみを都合良く増幅し、そしてクローン化した。組み込みプラスミドは、感温性ベクター上のフラグメントA及びDを含んで成る。発現カセットをまた、フラグメントAとDとの間の組み込みプラスミドにクローン化した。
【0120】
感温性組み込みプラスミドを、B.リケニホルミス欠失株にトランスファーし、そしてそれを染色体に組み込み;感温性ベクターの続く切除を確保し、そして次に単一の炭素源としてキシロースを有する最少培地上で増殖する“組み込み株”を単離した。そのような組み込み株は、フラグメントA及びDを通しての二重相同組換えにより、染色体xylA遺伝子を戻した。この工程においては、発現カセットは、染色体中に組み込まれた。
プラスミド構造体:
PCR増幅を、Amersham Pharmacia BiotechからのReady−To−G0 PCR Beadsによりその製造業者の説明書に記載のようにして、55℃のアニーリング温度を用いて行った。
【0121】
プラスミド pSJ5128 及び pSJ5129:
Aフラグメント(xylRプロモーター、及びxylR遺伝子の一部)を、バチルス・リケニホルミスPL1980染色体DNAから、下記プライマーを用いて増幅した:
#183235:[HindIII←Z80222 1242−1261→](配列番号1):
5’−GACTAAGCTTCTGCATAGTGAGAGAAGACG;
#183234:[EcoRI; BglII; NotI; MluI; SalI; ScaI←Z80222 2137−2113→](配列番号2):
5’−GACTGAATTCAGATCTGCGGCCGCACGCGTGTCGACAGTACTGAAATAGAGGAAAAAATAAGTTTTC。
【0122】
PCRフラグメントをCcoRI及びHindIIIにより消化し、そして精製し、次にEcoRI及びHindIIIにより消化されたpUC19に連結した。その連結混合物をエレクトロポレーションによりE.コリSJ2中に形質転換し、そして形質転換をアンピシリン耐性(200μg/ml)について選択した。3個のそのようなアンピシリン耐性形質転換体のPCR−フラグメントを配列決定し、そしてすべては正しかったことが見出された。SJ5128(SJ2/pSJ5128)及びSJ5129 (SJ2/pSJ5129) と称するクローンを保持した。
【0123】
プラスミド pSJ5124, pSJ5125:
Bフラグメント(プロモーター及びコード領域の最初の70個の塩基対を欠いているxylAの内部部分)を、B.リケニルホルミスPL1980染色体DNAから下記プライマーを用いて増幅した:
#183230[EcoRI←Z80222 3328−3306→](配列番号3):
5’−GACTGAATTCCGTATCCATTCCTGCGATATGAG;
#183227[BamHI; BglII←z80222 2318−2342→](配列番号4):
5’−GACTGGATCCAGATCTTATTACAACCCTGATGAATTTGTCG。
【0124】
PCRフラグメントをEcoRI及びBamHIにより消化し、そして精製し、次にEcoRI及びBamHIにより消化されたpUC19に連結し、そしてエレクトロポレーションによりE.コリSJ2を形質転換した。形質転換体をアンピシリン耐性(200μg/ml)について選択した。2種のクローンは、DNA配列決定により確かめる場合、正しく、そしてSJ5124(SJ2/pSJ5124)及びSJ5125(SJ2/pSJ5125)として保持した。
【0125】
プラスミド pSJ5130:
Cフラグメント(xylAプロモーター及び約1kbのzylA遺伝子を含む)を、B.リケニホルミスPL1980染色体DNAから、下記プライマーを用いてPCR増幅した:
#183230(上記参照のこと、配列番号3);
#182339[BamHI;BglII;NheI;SacII←Z80222 2131−2156←](配列番号5):
5’−GACTGGATCCAGATCTGCTAGCATCGATCCGCGGCTATTTCCATTGAAAGCGATTAATTG。
【0126】
PCRフラグメントをEcoRI及びBamHIにより消化し、そして精製し、次にEcoRI及びBamHIにより消化されたpUC19に連結し、そしてエレクトロポレーションによりE.コリSJ2中に形質転換した。形質転換体を、アンピシリン耐性(200μg/ml)について選択した。十分な長さのPCRフラグメントを含んで成る1つのクローンが、−35〜−10の配列間のプロモーター領域に単一の塩基対欠失を有することが見出された。この形質転換体は、SJ5130(SJ2/pSJ5130)として保持された。
【0127】
プラスミド pSJ5131;
このプラスミドは上記のように、pSJ5130として構成されたが、しかしxylAプロモーター、及びxylAコード配列の最初の250個の塩基対を含んで成る、400塩基対のPCRフラグメントのみ(Dフラグメント)を含むことが分かっている。DNA配列決定は、配列誤差がそのフラグメントに存在しなかったことを確認した。形質転換体をSJ5131(SJ1/pSJ5131)として保持した。
【0128】
プラスミド pSJ5197, pSJ5198:
それらのプラスミドを、感温性、移動性ベクター上のA(zylR)フラグメントを含んで成る。それらは、pSJ5129からの0.9kbのBglII−HindIIIフラグメントを、pSH2789からの5.4kbのBglII−HindIIIフラグメントに連結し、そして前記結合混合物によりB.スブチリスDN1885コンピテント細胞を形質転換することによって構成し、続いてエリトロマイシン耐性(5μg/ml)について選択する。2種のクローンSJ5197(DN1885/pSJ5197)及びSJ5198(DN1885/pSJ5198)を保持した。
【0129】
プラスミド pSJ5211, pSJ5212:
それらのプラスミドを、Bフラグメントに続いて挿入されるres−spc−resカセットを含む。それらは、pSJ3358からの1.5kbのBclI−BamHIフラグメントを、pSJ5124のBglII部位中に連結し、そしてその連結混合物を用いて、E.コリSJ2を形質転換することによって構成し、そしてアンピシリン耐性(200μg/ml)及びスペクチノマイシン耐性(120μg/ml)について選択する。res−spc−resカセットが可能な配向で挿入されている2種のクローンSJ5211 (SJ2/pSJ5211)及びSJ5212 (SJ2/pSJ5212) を保持した。
【0130】
欠失プラスミド:
プラスミド pSJ5218:
このプラスミドは、A及びBフラグメントを両端に有するres−spc−resカセットを含む。それは、pSJ5211からの2.5kbのEcoRI−BamHIフラグメントを、pSJ5197からの5.3kbのEcoRI−BglIIフラグメントに連結し、そしてその連結混合物を用いてE.スブチリスDN1885を形質転換し、そして30℃で、エリトロマイシン耐性(5μg/ml)及びスペクチノマイシン耐性(120μg/ml)について選択することによって構成された。1つの形質転換体SJ5218(DN1885/pSJ5218)を保持した。
【0131】
組み込みプラスミド:
プラスミド pSJ5247, pSJ5248:
それらのプラスミドは、短い400bpのDフラグメント(PxylA−xylA)、及び感温性の移動性ベクター上のAフラグメント(xylR)を含んで成る。それらは、pSJ5131からの0.4kbのBglII−EcoRIフラグメントを、pSJ5197からの5.3kbのBglII−EcoRIフラグメントに連結し、そしてその連結混合物を用いて、B.スブチリスDN1885を形質転換し、そして30℃でエリトロマイシン耐性(5μg/ml)について選択することによって製造された。2種の形質転換体SJ5247(DN1885/pSJ5247)及びSJ5248(DN1885/pSJ5248)を保持した。
【0132】
染色体 xylA 欠失を有する株の構成:
欠失プラスミドpSJ5218を用いて、B.スブチリス接合ドナー株PP289−5(染色体dal−欠失及びプラスミドpBC16及びpLS20を含む)のコンピテント細胞を形質転換し、形質転換体を、30℃で、D−アラニン(100μg/ml)を含むプレート上で、スペクチノマイシン(120μg/ml)、エリトロマイシン(5μg/ml)及びテトラサイクリン(5μg/ml)に対する耐性について選択した。2種の形質転換体SJ5219及びSJ5220を保持した。
【0133】
WO99/41358号に記載される2−コピーB.リケニルホルミスα−アミラーゼ株SJ4671を、接合において受容体として使用した。
ドナー株SJ5219及びSJ5220を、D−アラニン(100μg/ml)、スペクチノマイシン(120μg/ml)、エリトロマイシン(5μg/ml)及びテトラサイクリン(5μg/ml)により補充されたLBPSGプレート(リン酸塩(0.01MのK3PO4)、グルコース(0.4%)及びスターチ(0.5%)を有するLBプレート)上で30℃で一晩、増殖した。受容体株を、LBPSGプレート上で一晩、増殖した。
【0134】
接種針上のドナー及び受容体を、D−アラニン(100μg/ml)を含むLBPSGプレートの表面上で混合し、そして30℃で5時間インキュベートした。次に、このプレートを、エリトロマイシン(5μg/ml)及びスペクチノマイシン(120μg/ml)を有するLBPSG上で複製し、そして30℃で2日間インキュベートした。それらの4種の接合は、13〜25のトランス接合体をもたらした。
【0135】
テトラサイクリン感受性(pBC16の不在を示す)トランス接合体を、エリトロマイシン(5μg/ml)及びスペクチノマイシン(120μg/ml)を含むLBPSG上で50℃で再単離し、一晩インキュベートし、そして50℃でのプレートからの単一のコロニーを、10mlのTY液体培養物中に接種し、そして26℃で3日目、振盪しながらインキュベートした。次に、アリコートを、新鮮な10mlのTY培養物に移し、そして30℃で一晩インキュベートした。培養物を、120μg/mlのスペクチノマイシンを有するLBPSG上にプレートし、30℃での一晩のインキュベーションの後、それらのプレートを、それぞれスペクチノマイシン及びエリトロマイシン上にレプリカ培養し、そしてエリトロマイシン感受性、スペクトロマイシン耐性単離物を、すべての株接合から得た。
【0136】
染色体xylAプロモーター、及びres−spc−resカセットにより置換されたxylAコード配列の最初の70個の塩基対を含む次の株を保持した:
SJ5231:SJ4671受容体、SJ5219ドナー;
SJ5232:SJ4671受容体、SJ5220ドナー。
株表現型を、次の通りにして調製されたTBS最少培地寒天プレート上でアッセイした。400mlの水及び10gの寒天を121℃で20分間、オートクレーブし、そして60℃に冷却した。次の無菌溶液を添加する:
【0137】
1Mのトリス、pH7.5 25ml;
2%のFeCl3・6H2O 1ml;
2%のクエン酸三ナトリウム・2H2O 1ml;
1MのK2HPO4 1.25ml;
10%のMgSO4・7H2O 1ml;
10%のグルタミン 10ml;及び
20%のグルコース 12.5ml;又は
15%のキシロース 16.7ml
【0138】
バチルス・リケニホルミスSJ4671は、グルコース及びキシロースTSSプレート上で良く増殖し、褐色のコロニーを形成した。
xylA欠失株SJ5231−SJ5232は、グルコースTSSプレート上で良く増殖するが、しかし非常に薄く、透明な増殖が、長期のインキュベーションの後でさえ、TSSキシロースプレート上に形成される。それらの株は、単独の炭素源としてキシロースを明らかに使用することができない。
【0139】
xyl 領域中への指図され、且つ選択可能な組み込み:
組み込みプラスミドpSJ5247(D及びAフラグメントを含む)、及び負の対照としてのpSJ5198(Aフラグメントのみを含む)を用いて、B.スブチリス接合ドナー株PP289−5(染色体dal−欠失、及びプラスミドpBC16及びpLS20を含む)のコンピテント細胞を形質転換し、形質転換体を、D−アラニン(100μg/ml)を有するプレート上でエリトロマイシン(5μg/ml)及びテトラサイクリン(5μg/ml)に対する耐性について30℃で選択した。
【0140】
保持される形質転換体は次のものであった。
SJ5255:PP289−5/pSJ5198;
SJ5257:PP289−5/pS5248;
ドナー株SJ5255及びSJ5257を、受容体SJ5231への接合に使用した。トランス接合体の選択を、30℃でエリトロマイシン(5μg/ml)に対して行った。トランス接合体をキシロースを含むTSSプレート上に50℃で画線培養した。同時に、ST5221を、キシロースイソメラーゼ陽性対照株として画線培養した(また、50℃で)。
【0141】
一晩のインキュベーションの後、すべての株は非常に薄く、透明な増殖を形成した。しかしながら、対照は良好に増殖し、そしてコロニーは褐色であった。
50℃でのもう1日のインキュベーションの後、いくつかの褐色コロニーが、SJ5257、すなわちPxylA−xylAフラグメント(D)を有する組み込みプラスミドを含む株に由来するトランス接合体において、薄い、透明な増殖のバックグラウンド上に出現した。それらのコロニーは着実に増殖し、そして追加のコロニーが、50℃での継続したインキュベーションの間、出現した。
褐色コロニー(及び最初の一晩のインキュベーションの後に見られる薄く、透明な増殖よりもさらなる増殖は存在しない)は、SJ5255(染色体xylA遺伝子を回復することができない負の対照)由来のトランス接合体から観察されなかった。
【0142】
xyl 領域中へのα−アミラーゼ遺伝子の意図された組み込み:
amyL 含有の組み込みプラスミドの指図された構成:
プラスミドpSJ5291及びpSJ5292を、組み込みベクタープラスミドpSJ5247から、このプラスミドのBglIIによる消化、及びpSJ4457からのBglII−BclIフラグメントを含む1.9kbのamyLの挿入により構成した(WO99/41358号に記載される)。この連結混合物を用いて、B.スブチリスDN1885を形質転換し、そして2種の形質転換体をSJ5291及びDJ5292として保持した。
【0143】
接合性ドナー株の構成、 B .リケニホルミス宿主へのトランスファー及び染色体組み込み:
プラスミドpSJ5291及びpSJ5292を用いて、B.スブチリス接合ドナー株PP289−5(染色体dal−欠失及びプラスミドpBC16及びpLS20を含む)のコンピテント細胞を形質転換し、形質転換体を、D−アラニン(100μg/ml)を含むプレート上で30℃でエリトロマイシン(5μg/ml)及びテトラサイクリン(5μg/ml)に対する耐性について選択した。
【0144】
保持される形質転換体は、SJ5293(PP298−5/pSJ5291)及びSJ5294(PP289−5/pSJ5292)であった。それらの2種の株は、キシロースイソメラーゼ欠失株SJ5231及びSJ5232への接合においてドナーとして使用された。トランス接合体を、エリトロマイシン(5μg/ml)を含むLBPGAプレート上で選択し、そして個々の接合からの1又は2種のテトラサイクリン−感受性トランス接合体を、TSS−キシロースプレート上に画線培養し、これを50℃でインキュベートした。
【0145】
2日のインキュベーションの後、良く増殖するコロニーを、抗生物質を有さない液体TY培地(10ml)中に接種し、そしてそれらの培養物を30℃で振盪しながらインキュベートした。一晩のインキュベーションの後、個々の培養物100μlを、新しい10mlのTY培養物に移し、そしてインキュベーションを反復した。この方法をさらに2回、反復し、そしてさらに、培養物を30℃でTSS−キシロースプレート上にプレートした。約1週間後、すべてのプレートを、TSS−キシロース、及びエリトロマイシン(5μg/ml)を含むLBPSG上に複製した。次の日、推定上のEm−感受性株を、同じプレート型上に再画線培養した。
【0146】
すべてTSS−キシロースプレート上で良く増殖する次のEm感受性株を保持した:
SJ5308(接合ドナーSJ5293、宿主SJ5231からの);
SJ5309(接合ドナーSJ5293、宿主SJ5231からの);
SJ5310(接合ドナーSJ5293、宿主SJ5232からの);
SJ5315(接合ドナーSJ5294、宿主SJ5231からの)。
【0147】
サザン分析:
2−コピーamyL株SJ4671、及び株SJ5303, SJ5309, SJ5310及びSJ5315を、TY−グルコースにおいて一晩、増殖し、そして染色体DNAを抽出した。染色体DNAをHindIIIにより消化し、アガロースゲル電気泳動により分離されたフラグメントを、Immobilon−N(商標)フィルター(Millipore(商標))に移し、そしてHindIIIにより消化されたpSJ5292に基づいてビオチニル化されたプローブにハイブリダイズした(NEBlot Photope Kit 及びPhotope Detection kit 6kを用いて)。
【0148】
前記2−コピー株においては、2種のamyl遺伝子コピーが、約10kbのHindIIIフラグメント上に存在する。さらに、xyl領域へのハイブリダイゼーションのためである約2.8kbのフラグメントがハイブリダイズする。キシロース遺伝子領域中への第3のamyL遺伝子の挿入を有する4種の株にいては、約2.8kbのフラグメントが欠失しており、そして約4.6kbのフラグメントにより置換されていた。これは、キシロース遺伝子領域中へのamyL遺伝子の組み込みに基づいて完全に予測される。2−コピー挿入のために約10kbのフラグメントが保持される。
結論として、サザン分析は、株SJ5308, SJ5309, SJ5310及びSJ5315がそれらの染色体に、正しく挿入された第3amyL遺伝子コピーを有することを示す。
【0149】
振盪フラスコ評価:
キシロースイソメラーゼ領域に組み込まれるamyL遺伝子を有する株、及びいくつかの対照株を、振盪フラスコにおける100mlのBPX培地中に接種し、そして300rpmで振盪しながら37℃で7日間インキュベートした。
培養物ブイヨンにおけるα−アミラーゼ活性をPhadebasアッセイにより決定した:
【0150】
相対的α−アミラーゼ
株 単位/ml
────────────────────────────────────
SJ4270(1−コピーamyL株) 100
SJ4671(2−コピーamyL株) 161
SJ5231(xylA遺伝子欠失を有する2−コピーamgL) 148
SJ5308(3−コピーamyL株) 200
SJ5309(3−コピーamyL株) 245
SJ5310(3−コピーamyL株) 200
SJ5315(3−コピーamyL株) 200
────────────────────────────────────
【0151】
個々の振盪フラスコからのアリコートを、アミラーゼインジケータープレート上にプレートした。すべてのコロニーはアミラーゼ陽性であった。SJ4671, SJ5309およびSJ5315の個々からの4個の単一コロニーを、新鮮なBPX振盪フラスコ中に接種し、これを上記のようにして培養した。培養物ブイヨンにおけるα−アミラーゼ活性をPhadebasアッセイにより決定した。
【0152】
相対的α−アミラーゼ
株 単位/ml
────────────────────────────────────
SJ4671(2−コピーamyL株) 100
SJ4671 102
SJ4671 88
SJ4671 84
SJ5309(3−コピーamyL株) 149
SJ5309 141
SJ5309 135
SJ5309 149
SJ5315(3−コピーamyL株) 135
SJ5315 147
SJ5315 159
SJ5315 153
────────────────────────────────────
それらの振盪フラスコ条件下で、3−コピーamyL株は、2−コピー株よりも約50%、よりα−アミラーゼを生成するように思われる。
【0153】
例2:
B.リケニホルミスα−アミラーゼ遺伝子amyLの領域において反対方向に相対的配向で挿入されている、その染色体に2つの安定して組み込まれたamyL遺伝子コピーを有するバチルス・リケニホルミスの株は、SJ4671として、WO99/41358号に記載されている。amyL遺伝子の第3コピーを、上記のようにしてxylRAに挿入した。
これは、B.リケニホルミス染色体のもう1つの領域中への選択可能な指図された組み込みによる第4のamyL遺伝子コピーのこの3−コピー株中への挿入を記載する。
【0154】
グルコネート欠失 / 組み込み概略(図2):
グルコネート利用のためのgntR, gntK, gntP, gntZ遺伝子を含んで成るバチルス・リケニホルミスグルコネートオペロンの配列領域は、受託番号D31631としてGenbank/EMBLから入手できる。前記領域は、図2に示されるように図解され得る。
【0155】
欠失を、“A”(gntKの一部及びgntP遺伝子の一部を含む)及び“B”(gntZの内部フラグメントを含む)として示される、PCR増幅されたフラグメントを、感温性プラスミド上にクローニングすることによって導入した。欠失株の選択における助力として、レゾルバーゼ部位を両端に有するカナマイシン耐性遺伝子を、フラグメント“A”と“B”との間に導入し、図2における“欠失プラスミド”と称するプラスミドをもたらした。このカナマイシン耐性遺伝子は、WO96/23073号に記載されるように、レゾルバーゼ介在性部位特異的組換えにより、後で除去された。
【0156】
欠失を、感温性プラスミドの組み込み及び切除により介在されるフラグメント“A”及び“B”を通しての二重相同組換えにより標的株の染色体にトランスファした。その結果は、図2において“欠失株”と称する株であった。この株は、単独の炭素源としてグルコネートを含む最少培地上で増殖することはできない。
【0157】
プラスミド構成体:
遺伝子挿入のために使用される組み込みプラスミドを構成するために、PCRフラグメント“C”を増幅した。このフラグメントは、約1kbのgntPの内部フラグメントを含んだ。組み込みプラスミドは、感温性ベクター上でのフラグメント“B”及び“C”から成る。組み込みのために予定される発現カセットを、“B”と“C”との間にクローン化した。B.リケニホルミス欠失株へのトランスファ−及び感温性ベクターの組み込み及び切除に基づいて、単独の炭素源としてグルコネートを含む最少培地上で増殖した株を単離した。
【0158】
そのような株は、フラグメント“B”及び“C”を通しての二重相同組換えにより染色体gntP遺伝子を回復した。この工程において、発現カセットは、染色体中に組み込まれ、図2の“組み込み株”がもたらされた。
PCR増幅を、55℃のアニーリング温度を用いて、Amersham Pharmacia BiotechからのReady−To−Go PCR Beadsにより、その製造業者の説明書に記載のようにして行った。
【0159】
欠失プラスミド pMOL1789 及び pMOL1790:
“B”フラグメント(gntZの内部部分を含む)を、バチルス・リケニホルミスからの染色体DNAから、下記プライマーを用いて増殖した:
#187338[AvaI←D31631 4903−4922→](配列番号6):
5’−TATTTCCCGAGATTCTGTTATCGACTCGCTC;
#187339[EagI←D31631 5553−5538→](配列番号7):
5’−GTTTTCGGCCGCTGTCCGTTCGTCTTT。
【0160】
フラグメントを、AvaI及びEagIにより消化し、AvaI及びEagIにより消化されたpMOL1642に連結し、そしてその連結されたプラスミドを、形質転換により、B.スブチリスJA578中に導入し、エリトロマイシン耐性(5μg/ml)について選択した。3種のクローンの挿入体を配列決定し、そしてすべては正しいことが見出された。MOL1789(JA578(repF+)/pMOL1789)及びMOL1790(JA578/pMOL1790)を保持した。gntZに対する“B”フラグメントのエンドポイントが、図2に示される。
【0161】
プラスミド pMOL1820 及び pMOL1821:
“A”フラグメント(gntKの一部及びgntP遺伝子の一部を含む)を、バチルス・リケニホルミスの染色体DNAから、下記プライマーを用いて増幅した:
#184733[←D31631 3738−3712→](配列番号8):
5’−GTGTGACGGATAAGGCCGCCGTCATTG;
#184788[←D31631 3041−3068→](配列番号9):
5’−CTCTTGTCTCGGAGCCTGCATTTTGGGG。
【0162】
前記フラグメントを、ClaI及びEcoRIにより消化し、EcoRI及びClaIにより消化されたpMOL1789に連結し、そしてB.スブチリスPL1801を形質転換により形質転換し、エリトロマイシン耐性(5μg/ml)について選択した。3種のクローン上の挿入体を配列決定し、そしてすべては正しいことが見出された。MOL1820(JA578/pMOL1820)及びMOL1821(JA578/pMOL1821)を保持した。gntZに対する“A”フラグメントのエンドポイントを図2に示す。
【0163】
組み込みプラスミド pMOL1912 及び pMOL1913:
それらのプラスミドは、gntKの短いC−末端部分、及び感温性、移動可能ベクター上のgntPの完全な読み取り枠(“C”フラグメント)を含む。それらを、下記プライマーを用いて、バチルス・リケニホルミスの染色体DNAから増幅された0.9kbのフラグメントを連結することによって製造した:
#1656D07[←D31631 3617−3642→](配列番号10):
5’−AGCATTATTCTTCGAAGTCGCATTGG;
#B1659F03[BglII←D31631 4637−4602→](配列番号11):
5’−TTAAGATCTTTTTTATACAAATAGGCTTAACAATAAAGTAAATCC。
【0164】
前記フラグメントを、BglII及びEcoRIにより消化し、BglII及びEcoRIにより消化されたpMOL1820に連結し、そしてその連結混合物を用いて、形質転換によりB.スブチリスPL1801を形質転換し、エリトロマイシン耐性(5μg/ml)について選択した。3種のクローン上の挿入体を配列決定し、そしてすべては正しいことが見出された。MOL1912(PL1801/pMOL1789)及びMOL1913(PL1801/pMOL1913)を保持した。gntZに対する“C”フラグメントのエンドポイントは、図2に示される。
【0165】
それらのフラグメントは、それらがgntP遺伝子のすぐ上流にプロモーター配列を有さない場合でさえ、機能的gntPを発現することが見出された。グルコネートに基づいての増殖について選択することによって、gntP領域における直接的な組み込みを可能にするためには、組み込みプラスミドpMOL1912上のgntP遺伝子のN−末端配列の一部を欠失することが必要であった。
【0166】
プラスミド pMOL1972 及び pMOL1973:
それらのプラスミドは、N−末端の53個のアミノ酸をコードする最初の158kbを除いて、全gntP遺伝子を含むpMOL1912の欠失誘導体である。プラスミドpMOL1912を、StuI及びEcoRVにより消化し、そして再連結した。連結混合物を用いて、B.スブチリスPL1801を形質転換し、エリトロマイシン耐性(5μg/ml)について選択した。欠失を、制限消化により確証した。MOL1972(PL1801/pMOL1972)及びMOL1973(PL1801/pMOL1973)を保持した。
【0167】
それらのプラスミドは、gntP欠失されたバックグラウンドにおいて遊離プラスミドとして導入される場合、TSSグルコネートプレート上で増殖を維持しない。染色体gntP欠失を有する株の構成:
欠失プラスミドpMOL1920を用いて、B.スブチリス接合ドナー株PP289−5(染色体dal−欠失、及びプラスミドpBC16及びpLS20を含む)のコンピテント細胞を形質転換し、D−アラニン(100μg/ml)を有するプレート上で30℃で、カナマイシン耐性(10μg/ml)、エリトロマイシン耐性(5μg/ml)及びテトラサイクリン耐性(5μg/ml)について選択した。2種の形質転換体MOL1822及びMOL1823を保持した。
【0168】
WO99/41358号に記載される2−コピーB.リケニホルミスα−アミラーゼ株SJ4671を、接合における受容体として使用した。
ドナー株MOL1822及びMOL1823を、D−アラニン(100μg/ml)、カナマイシン(10μg/ml)、エリトロマイシン(5μg/ml)及びテトラサイクリン(5μg/ml)により補充されたLBPSGプレート(リン酸塩(0.01MのK3PO4)、グルコース(0.4%)及び澱粉(0.5%)を有するLBプレート)上で30℃で一晩、増殖した。受容体株を、LBPSGプレート上で一晩、増殖した。
【0169】
ループいっぱいのドナー及び受容体を、D−アラニン(100μg/ml)を有するLBPSGプレートの表面上で混合し、そして30℃で5時間インキュベートした。次に、このプレートを、エリトロマイシン(5μg/ml)及びカナマイシン(10μg/ml)を含むLBPSG上で複製し、そして30℃で2日間インキュベートした。それらの4回の接合は、25〜50個のトランス接合体をもたらした。
【0170】
テトラサイクリン感受性(pBC16の不在を示す)トランス接合体を、エリトロマイシン(5μg/ml)及びカナマイシン(10μg/ml)を含むLBPSG上で50℃で再単離し、一晩インキュベートし、そして50℃でのプレートからの単一のコロニーを、10mlのTY液体培養物に接種し、そして振盪しながら、26℃で3日間インキュベートし、次にアリコートを新鮮な10mlのTY培養物に移し、そしてインキュベーションを30℃で一晩続けた。次に、培養物を、10μg/mlのカナマイシンを有するLBPSG上にプレートし、30℃での一晩のインキュベーションの後、それらのプレートを、それぞれ、カナマイシン及びエリトロマイシン上にレプリカ培養し、そしてエリトロマイシン感受性、カナマイシン耐性単離物を、すべての株の組合せから得た。C−末端をコードするgntP遺伝子の一部がres−kana−resカセットイより置換される次の株と維持した:
【0171】
MOL1871:SJ4671受容体、MOL1822ドナー;
MOL1872:SJ4671受容体、MOL1823ドナー。
株表現型を、次の通りにして調製されたTBS最少培地寒天プレート上でアッセイした:
400mlの水及び10gの寒天を121℃で20分間、オートクレーブし、そして60℃に冷却した。次の無菌溶液を添加する:
【0172】
1Mのトリス、pH7.5 25ml;
2%のFeCl3・6H2O 1ml;
2%のクエン酸三ナトリウム・2H2O 1ml;
1MのK2HPO4 1.25ml;
10%のMgSO4・7H2O 1ml;
10%のグルタミン 10ml;及び
20%のグルコース 12.5ml;又は
15%のグルコネート 16.7ml
【0173】
バチルス・リケニホルミスSJ4671は、グルコース及びグルコネートTSSプレート上で良く増殖し、褐色のコロニーを形成した。gntP欠失株MOL1871及びMOL1872は、グルコースTSSプレート上で良く増殖するが、しかし非常に薄く、透明な増殖が、長期のインキュベーションの後でさえ、TSSグルコネートプレート上に形成される。それらの株は、単独の炭素源としてグルコネートを明らかに使用することができない
同じgntP欠失方法を、アミラーゼ発現カセットの第4コピーの組み込みを調製するために、前記に記載される3−コピー株SJ5309に対して行う。
【0174】
gnt 領域中への指図され、且つ選択可能な組み込み:
組み込みプラスミドpMOL1972(“B”及び“C”フラグメントを含む)、及び負の対照としてのpMOL1789(“Bフ”ラグメントのみを含む)を用いて、B.スブチリス接合ドナー株PP289−5(染色体dal−欠失、及びプラスミドpBC16及びpLS20を含む)のコンピテント細胞を形質転換し、形質転換体を、D−アラニン(100μg/ml)を有するプレート上でエリトロマイシン(5μg/ml)及びテトラサイクリン(5μg/ml)に対する耐性について30℃で選択した。
【0175】
保持される形質転換体は次のものであった。
MOL1974:PP289−5/ pMOL1972;
MOL1975:PP289−5/ pMOL1973;
ドナー株MOL1974及びMOL1975を、受容体MOL1871及びMOL1872への接合に使用した。トランス接合体の選択を、30℃でエリトロマイシン(5μg/ml)に対して行った。トランス接合体をグルコネートを含むTSSプレート上に50℃で画線培養した。同時に、SJ4671を、グルコネート陽性対照株として画線培養した(また、50℃で)。
【0176】
一晩のインキュベーションの後、すべての株は非常に薄く、透明な増殖を形成した。しかしながら、対照は良好に増殖し、そしてコロニーは褐色であった。50℃でのもう1日のインキュベーションの後、いくつかの褐色コロニーが、MOL1871及びMOL1872に由来するトランス接合体において、薄い、透明な増殖のバックグラウンド上に出現した。それらのコロニーは着実に増殖し、そして追加のコロニーが、50℃での継続したインキュベーションの間、出現した。
コロニーは、gntP欠失株MOL1871及びMOL1872から観察されなかった。
【0177】
α−アミラーゼ遺伝子の gnt 領域中への指図された組み込み:
amyL 含有組み込みプラスミドの構成:
次のことが上記の選択原理を用いて、gnt領域にα−アミラーゼ遺伝子を有する発現カセットを組み込むための構成計画である。組み込みプラスミドpMOL1972をBglIIにより消化し、そしてpSJ4457(WO99/41358号に記載される)からのamyLを含む1.9kbのBglII−BclIフラグメントを、連結により挿入する。次にその連結混合物を用いて、B.スブチリスDN1885を形質転換し、そしてエリトロマイシン(5μg/ml)を有するLBPSGプレート上で選択された形質転換体を、プラスミドDNAの制限消化により確かめた。
【0178】
接合性ドナー株、 B .リケニホルミスへのトランスファー及び染色体組み込み: 発現カセットを有する組み込みプラスミドを用いて、B.スブチリス接合ドナー株PP289−5(染色体dal−欠失、及びプラスミドpBC16及びpLS20を含む)のコンピテント細胞を形質転換し、D−アラニン(100μg/ml)を含むプレート上でエリトロマイシン(5μg/ml)及びテトラサイクリン(5μg/ml)に対する耐性について5℃で選択した。
発現カセットを含む組み込みプラスミドを含んで成る形質転換体を保存し、そして上記欠失株MOL1871及びMOL1872について記載されるようにして構成された3−コピー株SJ5309のgntP欠失受容体との接合においてドナーとして使用される。
【0179】
トランス接合体を、エリトロマイシン(5μg/ml)を含むLBPGAプレート上で選択し、そして個々の接合からの1又は2種のテトラサイクリン−感受性トランス接合体を、TSS−グルコネートプレート上に画線培養し、これを50℃でインキュベートした。2日のインキュベーションの後、良く増殖するコロニーを、抗生物質を有さない液体TY培地(10ml)中に接種し、そしてそれらの培養物を30℃で振盪しながらインキュベートした。一晩のインキュベーションの後、個々の培養物100μlを、新しい10mlのTY培養物に移し、そしてインキュベーションを反復した。この方法をさらに2回、反復し、そしてさらに、培養物を30℃でTSS−グルコネートプレート上にプレートした。
【0180】
約1週間後、すべてのプレートを、TSS−グルコネート、及びエリトロマイシン(5μg/ml)を有するLBPSG上にレプリカ培養し、そしてインキュベートする。次の日、推定上のEm感受性株を、同じプレート型に再画線培養する。
前述のキシロース領域における組み込みに関して、サザン分析及び振盪フラスコ評価を行い、α−アミラーゼ発現カセットのgnt領域における組み込みの部位、及びこの4−コピー株からの高められた収率を確かめる。
【0181】
例3:
バチルス・リケニホルミスST4671(WO99/41358号)は、B.リケニホルミスのα−アミラーゼ遺伝子、amyLの領域に対向する相対的配向で挿入される、その染色体に2つの安定して組み込まれるamyL遺伝子コピーを含んで成る。次の例は、B.リケニホルミス染色体のもう1つの定義される領域中への選択できる、意図された組み込みによる第3のamyL遺伝子コピーのこの株中への挿入を記載する。
【0182】
D −アラニンラセマーゼ欠失 / 組み込みの概略:
バチルス・リケニホルミスD−アラニンラセマーゼ領域のDNA配列をこの研究において決定し、そして配列番号12における位置1303−2469に示される。“Dal−欠失プラスミド”と称するプラスミドを、感温性親プラスミド上にバチルス・リケニホルミスのD−アラニンラセマーゼ領域からの1つの2281bpのPCR増幅されたフラグメントをクローニングすることによって構成した。2281bpのPCRフラグメントを“A”と称し、ここでAは、dal遺伝子のATG開始コドンの上流の245塩基対〜dal遺伝子の下流の867塩基対の配列を含んで成る。
【0183】
クローン化されたフラグメントA上のdal遺伝子のC−末端部分の586塩基対の欠失を行い、下記に示されるようなフラグメント“B”及び“C”を含むプラスミドをもたらした。レゾルバーゼ(res)部位を両端に有するスペクチノマイシン耐性遺伝子を、プラスミド上のフラグメント“B”と“C”との間に導入した。このスペクチノマイシン耐性遺伝子は後で、レゾルバーゼ介在性部位特異的組換えにより除去する。
【0184】
D−アラニンラセマーゼ欠失を、感温性Dal−欠失プラスミドの組み込み及び切除により介在される、フラグメント“B”及び“C”を通しての二重相同組換えによりDal−欠失プラスミドからバチルス標的株の染色体にトランスファーした。得られる株は、“Dal−欠失株”と称した。この株は、単独の炭素源としてD−アラニンを含まない培地上で増殖することはできない。
【0185】
組み込みプラスミドを、欠失株のD−アラニン領域中への遺伝子の挿入のために構成した。ATG開始コドンの下流の41塩基対から出発してdal遺伝子の1117塩基対を含んで成る、“D”と称するフラグメントをPCR−増幅することが意図された。プロモーター領域を、E.コリrrnBリボソームRNAオペロン(EMBL/e09023:塩基対197−295)の3’−末端配列からのT1及びT2ターミネーターにより置換した。
【0186】
組み込みプラスミドは、感温性ベクター上のフラグメントD及びCを含んで成る。組み込みのために意図される発現カセットを、フラグメントDとCとの間にクローン化した。感温性ベクターのB.リケニホルミス欠失株へのトランスファー、組み込み及び切除に基づいて、D−アラニンを有さない培地上で増殖する株を単離した。そのような“組み込み株”は、フラグメントD及びCを通しての二重相同組換えにより、染色体dal遺伝子を回復した。
【0187】
プラスミド構成:
PCR増幅を、55℃のアニーリング温度を用いて、Amersham Pharmacia BiotechからのReady−To−Go PCR Beadsにより、その製造業者の説明書に記載のようにして行った。
【0188】
プラスミド pJA744:
Aフラグメント(dal−領域)を、バチルス・リケニホルミスSJ4671染色体DNAから次のプライマーを用いて増幅した:
#148779:[dal領域におけるSphI部位の上流](配列番号14):
5’−GATGAACTTCTGATGGTTGC;
#148780:[BamHI<dal] (配列番号15):
5’−AAAGGATCCCCCTGACTACATCTGGC。
【0189】
PCRフラグメントを、SpHI及びBamHIにより消化し、そして精製し、次に、SphI及びBamHIにより消化されたpPL2438に連結した。B.スブチリスJA691(repF+, dal−)コンピテント細胞の前記連結混合物による形質転換に続いて、カナマイシン耐性(10μg/ml)について選択した。正しいクローンは、JA691 dal表現型を補充することができた。
【0190】
プラスミド pJA770:
このプラスミドは、BとCとのフラグメント間に挿入されたres−spc−resカセットを含む。それは、pJA744のBclI−BclI部位中にpSJ3358からの1.5kbのBclI−BamHIフラグメントを連結することによって構成された。連結混合物によるB.スブチリスJA691コンピテント細胞の形質転換に続いて、カナマイシン耐性(10μg/ml)及びスペクチノマイシン耐性(120μg/ml)について選択した。スペクチノマイシン耐性遺伝子の配向を、BclI及びBamHIにより切断することによって決定することができた。
【0191】
Dal 欠失プラスミド:
プラスミド pJA851:
フラグメント(ermC遺伝子及びpE194の複製起点を含んで成る)を、下記プライマーを用いて、pSJ2739プラスミドDNAからPCR増幅した:
#170046 [NotI;<ermC遺伝子及びpE194の複製起点](配列番号16):
5’−AAAGCGGCCGCGAGACTGTGACGGATGAATTGAAAAAGC;
#170047[EcoRI;←ermC遺伝子及びpE194の複製起点→](配列番号17):
5’−AAAGAATTCGTGAAATCAGCTGGACTAAAAGG。
PCRフラグメントを、EcoRI及びNotIにより消化し、そして精製し、次にEcoRI及びNotIにより消化されたpJA770に連結した。その連結混合物によるS.スブチリスJA691コンピテント細胞の形質転換に続いて、エリトロマイシン耐性(5μg/ml)及びスペクチノマイシン耐性(120μg/ml)について選択した。
【0192】
プラスミド pJA748:
フラグメント(プロモーター領域を伴なわないで、dal遺伝子を含んで成る)を、バチルス・リケニホルミスSJ4671 DNAから下記プライマーを用いてPCR増幅した:
#150506[BamHI;<dal遺伝子](配列番号18):
5’−AAAGGATCCCGCAAGCAAAGTTGTTTTTCCGC;
#150507[kpnI;<−dal遺伝子](配列番号19):
5’−AAAGGTACCGAAAGACATGGGCCGAAATCG。
PCRフラグメントを、KpnI及びBamHIにより消化し、そして精製し、次にKpnI及びBamHIにより消化されたpPL2438に連結した。B.スブチリスJA691コンピテント細胞の前記連結混合物による形質転換に続いて、カナマイシン耐性(10μg/ml)について選択した。
【0193】
プラスミド pJA762:
フラグメント(bp197〜295のE.コリrrnB末端配列EMBL[e09023]からのT1及びT2ターミネーターを含んで成る)を、E.コリSJ2 DNAから下記プライマーを用いてPCR増幅した:
#158089[kpnI;<rrnBのT1及びT2ターミネーター](配列番号20):
5’−AAAGGTACCGGTAATGACTCTCTAGCTTGAGG;
#158090[ClaI;rrnBのT1及びT2ターミネーター](配列番号21):
5’−CAAATCGATCATCACCGAAACGCGGCAGGCAGC。
PCRフラグメントを、KpnI及びClaIにより消化し、そして精製し、次にKpnI及びClaIにより消化されたpJA748に連結した。B.スブチリスJA691コンピテント細胞の前記連結混合物による形質転換に続いて、カナマイシン耐性(10μg/ml)について選択した。
【0194】
プラスミド pJA767:
フラグメント(dal(DFS)の下流の0.7kbpのDNA配列を含んで成る)を、B.リケニホルミスSJ4671(WO99/41358)DNAから、下記プライマーを用いてPCR増幅した:
#150508[HindIII;<DFS](配列番号22):
5’−ATTAAGCTTGATATGATTATGAATGGAATGG;
#150509[NheI:<DFS](配列番号23):
5’−AAAGCTAGCATCCCCCTGACTACATCTGGC。
PCRフラグメントを、HindIII及びNheIにより消化し、そして精製し、次にKpnI及びClaIにより消化されたpJA762に連結した。前記連結混合物によるB.スブチリスJA691コンピテント細胞の形質転換に続いて、カナマイシン耐性(10μg/ml)について選択した。
【0195】
プラスミド pJA776:
このプラスミドは、D及びCフラグメントを両端に有するamyLカセットを含む。それは、pSJ4457からの2.8kbのHindIII−NheIフラグメントを、pJA767からの4.2kbのBamHI−HindIIIフラグメントに連結し、そしてその連結混合物によりB.スブチリスJA69コンピテント細胞を形質転換し、続いてカナマイシン耐性(10μg/ml)について選択することによって構成された。
【0196】
Dal 組み込みプラスミド:
プラスミド pJA1020:
このプラスミドは、D及びCフラグメントを両端に有するamyLカセットを含む。さらに前記プラスミドは、プラスミドpE194複製起点、repF及びEmr−遺伝子を含む。それは、pJA776の2.7kbのEcoRI−NheIフラグメントを、pJA851の3.8kbのEcoRI−NheIフラグメントに連結し、そしてその連結混合物を用いて、B.スブチリスJA691コンピテント細胞を形質転換し、続いてエリトロマイシン耐性(5μg/ml)について選択することによって構成された。
【0197】
染色体 dal 欠失の構成:
欠失プラスミドpJA851を用いて、B.スブチリス接合ドナー株PP289−5(染色体dal−欠失及びプラスミドpBC16及びpLS20を含む)を形質転換し、そして形質転換体を、D−アラニンを有するプレート上でスペクチノマイシン(120μg/ml)、エリトロマイシン(5μg/ml)及びテトラサイクリン(5μg/ml)に対する耐性について30℃で選択した。形質転換体をJA954として維持し、そして次の接合実験においてドナーとして使用した。
【0198】
2−コピーamyL B.リケニホルミスSJ4671(WO99/41358号)を、次の接合実験において受容体として使用した。
ドナー株JA954を、D−アラニン(100μg/ml)、スペクチノマイシン(120μg/ml)、エリトロマイシン(5μg/ml)及びテトラサイクリン(5μg/ml)により補充されたLBPSGプレート(リン酸塩(0.01MのK3PO4)、グルコース(0.4%)及び澱粉(0.5%)を有するLBプレート)上で30℃で一晩、増殖した。受容体株SJ4671を、LBPSGプレート上で一晩、増殖した。
【0199】
ドナー及び受容体の接種針のほぼ1ループを、D−アラニン(100μg/ml)を有するLBPSGプレートの表面上で混合し、そして30℃で5時間インキュベートした。次に、このプレートを、エリトロマイシン(5μg/ml)及びスペクチノマイシン(120μg/ml)を有するLBPSG上に複製し、そして30℃で2日間インキュベートした。それらの4回の接合は、13〜25のトランス接合体をもたらした。
【0200】
テトラサイクリン感受性(pBC16の不在を示す)トランス接合体を、エリトロマイシン(5μg/ml)及びスペクチノマイシン(120μg/ml)を有するLBPSGプレート上で50℃で再単離し、そして一晩インキュベートした。50℃でのプレートからの単一のコロニーを、D−アラニン(100μg/ml)を含む10mlのTY液体培地中に接種し、そして26℃で3日間、振盪しながらインキュベートし、この後、アリコートを新鮮な10mlのTY培養に移し、そしてインキュベーションを30℃で一晩、続けた。その培養物を、120μg/mlのスペクチノマイシン及び100μg/mlのD−アラニンを含むLBPSG上でプレートし、30℃での一晩インキュベーションの後、それらのプレートを、それぞれD−アラニン(100μg/ml)、スペクチノマイシン及びエリトロマイシンを有する/有さないLBPSG上にレプリカ培養した。
【0201】
D−アラニン栄養要求性、エリトロマイシン感受性及びスペクチノマイシン耐性単離物を、すべての株の組合せから得た。染色体dalプロモーター、及びres−spc−resカセットにより置換されるdalコード配列の最初の672塩基を含んで成る次の株を保持した:
【0202】
B .リケニホルミス JA967:SJ4671受容体、JA954ドナー。
株表現型を、D−アラニン(100μg/ml)を補充されているか又はそれを補充されていない、120μgのスペクチノマイシンを有するLBPG上でアッセイした。
バチルス・リケニホルミスSJ4671は、D−アラニンを有するか又はそれを有さないブイヨンプレート上で良く増殖する。dal欠失株JA967は、D−アラニンを有するLBPG上では良く増殖するが、しかしD−アラニンを有さないLBPGプレート上では増殖しない。それらの株は、培地にD−アラニンを添加しないでは、明確に増殖することができない。
【0203】
B.リケニホルミスdal−領域の配列(配列番号12):
dal−領域(ydcC遺伝子、ターミネーター、及びdalの下流の配列(DFS)を含んで成る)を、バチルス・リケニホルミスATCC14580染色体DNAから下記プライマーを用いてPCR増殖した:
#145507[<ydcC−dal−DFS>](配列番号24):
5’−GCGTACCGTTAAAGTCGAACAGCG;
#150509[NheI;<ydcC−dal−DFS>](配列番号25):
5’−AAAGCTAGCATCCCCCTGACTACATCTGGC。
【0204】
配列番号12の位置1303−2469に示されるバチルス・リケニホルミスの配列をコードするD−アラニンの配列決定及び公的なデータベースにおける続く相同性の研究は、新しく単離されたdal遺伝子がバチルス・スブチリスのdal遺伝子とわずか約67%の配列同一性を有し、他のD−アラニンラセマーゼコードの遺伝子がこの新規のB.リケニホルミスdal遺伝子に対して高い相同性を示すことを表した。
【0205】
接合性ドナー株、 B .リケニホルミスへのトランスファー及び染色体組み込み: 発現カセットを有する組み込みプラスミドpJA1020を用いて、B.スブチリス接合ドナー株PP289−5(染色体dal−欠失、及びプラスミドpBC16及びpLS20を含む)のコンピテント細胞を形質転換し、D−アラニン(100μg/ml)を含むプレート上でエリトロマイシン(5μg/ml)及びテトラサイクリン(5μg/ml)に対する耐性について5℃で選択した。
発現カセットを含む組み込みプラスミドを含んで成る形質転換体を保存し、そして2−コピー株JA967のdal欠失受容体との接合においてドナーとして使用される。
【0206】
トランス接合体を、エリトロマイシン(5μg/ml)を含むLBPGプレート上で選択し、そして個々の接合からの1又は2種のテトラサイクリン−感受性トランス接合体を、TSS−グルコネートプレート上に画線培養し、これを50℃でインキュベートした。2日のインキュベーションの後、良く増殖するコロニーを、抗生物質を有さない液体TY培地(10ml)中に接種し、そしてそれらの培養物を30℃で振盪しながらインキュベートした。一晩のインキュベーションの後、個々の培養物100μlを、新しい10mlのTY培養物に移し、そしてインキュベーションを反復した。この方法をさらに2回、反復し、そしてさらに、培養物を30℃でLBPGプレート上にプレートした。
【0207】
すべてのプレートを、LBPGS、スペクチノマイシン(120μg)を有するLBPGS及びエリトロマイシン(5μg/ml)を有するLBPSG上にレプリカ培養し、そしてインキュベートする。次の日、推定上のスペクチノマイシン−エリトロマイシン感受性株を、同じプレート型に再画線培養する。
キシロース領域における組み込みに関して、サザン分析及び振盪フラスコ評価を行い、α−アミラーゼ発現カセットのdal領域における組み込みの部位、及びこの3−コピー株からの高められた収率を確かめる。
【0208】
例4:
この研究においては、バチルス・スブチリスゲノム及びB.リケニホルミス染色体の特定の領域(配列番号26)に対する相同性研究が行われ、そしてB.リケニホルミス領域が遺伝子glpP, glpF, glpK及びglpDを含むことが見出された。分析された領域のサイズは、5761個のヌクレオチドであり、そしてそのDNA配列番号26で示される。
【0209】
glpPコード領域は、配列番号26における位置261〜位置818である。ブラストプログラムを用いてのEMBL及びSwiss−protデータベースの研究は、B.スブチリスglpP遺伝子(DNAレベルに基づいて)及びB.スブチリスGlpPタンパク質(タンパク質レベルに基づいて)との最も接近した相同性を示した。B.スブチリスglpPコード領域とのDNAレベルに基づいての同一性は、GCGプログラムパッケージ(Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc.)におけるGAPプログラムを用いて構成された一列整列において72.4%であった。B.スブチリスGlpPタンパク質に対する推定されるGlpPタンパク質の同一性は78.9%であった。
【0210】
glpFコード領域は、配列番号26における位置1048〜位置1863である。ブラストアルゴリズムを用いてEMBL及びSwiss−protデータベースの研究は、B.スブチリスglpF遺伝子(DNAレベルに基づいて)及びB.スブチリスGlpFタンパク質(タンパク質レベルに基づいて)に対して最も接近した相同性を示した。B.スブチリスglpFコード領域に対するDNAレベルに基づいて同一性は、72.8%であた。B.スブチリスGlpFタンパク質に対する推定されるGlpFタンパク質の同一性は、79.3%であった。
【0211】
glpKコード領域は、配列番号26における位置1905〜位置3395である。ブラストアルゴリズムを用いてEMBL及びSwiss−protデータベースの研究は、B.スブチリスglpK遺伝子(DNAレベルに基づいて)及びB.スブチリスglpKタンパク質(タンパク質レベルに基づいて)に対して最も接近した相同性を示した。B.スブチリスglpKコード領域に対するDNAレベルに基づいて同一性は、75.6%であた。B.スブチリスglpKタンパク質に対する推定されるglpKタンパク質の同一性は、85.9%であった。
【0212】
glpDコード領域は、配列番号26における位置3542〜位置5209である。ブラストアルゴリズムを用いてEMBL及びSwiss−protデータベースの研究は、B.スブチリスglpD遺伝子(DNAレベルに基づいて)及びB.スブチリスglpDタンパク質(タンパク質レベルに基づいて)に対して最も接近した相同性を示した。B.スブチリスglpDコード領域に対するDNAレベルに基づいて同一性は、72.9%であた。B.スブチリスglpDタンパク質に対する推定されるglpDタンパク質の同一性は、81.9%であった。
さらに、B.リケニホルミス領域は、yhxB遺伝子の一部を含み、そしてそのコード領域は位置5394で開始し、そして配列番号26に示される配列決定されたフラグメントの末端を越えて延長する。
【0213】
指図された染色体組み込みのためへの glpD 遺伝子の使用:
前述の例の方法に類似して、glpD遺伝子のセグメント及びその下流の領域を、B.リケニホルミスの染色体DNAからPCR増幅し、そして組合し、第1段階において、glpD遺伝子の3’末端の欠失、及び第2段階において、glpD遺伝子の回復及び染色体中への注目の遺伝子のための発現カセットの同時挿入のために有用なベクターを提供する。
【0214】
“glpD”と称するglpD遺伝子の内部ブラグメントを、本明細書における他の場所にも記載されている標準のPCRプロトコールに従って、下記2種のプライマーを用いてPCR増幅した:
(配列番号27)5’−GACTGAATTCGCAATTTGAAGTGAAAATGGTAGC;及び
(配列番号28)5’−GACTGGATCCAGATCTCATCTTTTCGGGAAGTC。
得られるフラグメントを精製し、そしてEcoRI及びBamHIにより消化し、EcoRI及びBamHIにより消化されたpUC19に連結し、そしてその連結混合物を用いて、E.コリSJ2を形質転換し、そしてアンピシリン耐性(200μg/ml)について選択した。正しい配列を有するクローンを保持し、そしてSJ5767(SJ2/pSJ5767)と命名した。
【0215】
glpD遺伝子の3’末端の下流のB.リケニホルミス染色体55〜555塩基対に由来するDNAのフラグメントを、下記プライマーを用いて増幅した:
(配列番号29):
5’−GACTGAATTCAGATCTGCGGCCGCACGCGTAGTACTCCCGGCGTGAGGCTGTCTTG;及び
(配列番号30):
5’−GACTAAGCTTCAGTTACGCTCAAACACGTACG。
得られるフラグメントを精製し、そしてEcoRI及びHindIIIにより消化し、EcoRI及びHindIIIにより消化されたpUC19に連結し、そしてその連結混合物を用いて、E.コリSJ2を形質転換し、そしてアンピシリン耐性(200μg/ml)について選択した。正しい配列を有するクローンを保持し、そしてSJ5789(SJ2/pSJ5789)と命名した。
【0216】
次に、glpD遺伝子の内部フラグメントを、pSJ3358からの1.5kbのBclI−BamHIフラグメントの切除及びBglIIにより消化されているpSJ5767中へのそれの挿入により、レゾルバーゼ部位を両端に有するスペクチノマイシン耐性遺伝子と組合した。その連結混合物を用いて、E.コリSJ2を形質転換し、アンピシリン(200μg/ml)及びスペクチノマイシン(120μg/ml)耐性について選択した。正しい配列を有するクローンを保持し、そしてSJ5779(SJ2/pSJ5779)と命名した。
【0217】
B.リケニホルミス染色体におけるglpDの3’末端の欠失のための最終プラスミドを構成するために、pSJ5789をHindIII及びBglIIにより消化し、そして0.5kbのフラグメントを、pSJ2739の5.5kbのHindIII−BglIIフラグメントに連結した。その連結混合物を用いて、B.スブチリスDN1885を形質転換し、30℃でエリトロマイシン(5μg/ml)耐性について選択した。その得られるプラスミドを、EcoRI及びBglIIにより消化し、4.8kbのフラグメントを、pSJ5779から切除された2.4kbのEcoRI−BamHIフラグメントに連結し、そしてその連結混合物を用いて、B.スブチリスDN1885を形質転換し、エリトロマイシン耐性(5μg/ml)について30℃で選択した。
【0218】
欠失プラスミドを、前記例に記載のようにして、B.スブチリス接合ドナー株pp289−5の使用によりB.リケニホルミス中にトランスファーし、そして欠失を、前記例に記載されるのと実質的に同じ方法を用いて、染色体にトランスファーする。
得られるglpD欠失株を、単独の炭素源としてグリセロールを有するTSS最少培地寒天プレート上での増殖について試験する。
【0219】
組み込みプラスミドを、相同組換えにより染色体glpD遺伝子を修復でき、そしてglpD遺伝子の完全な3’末端を含むフラグメントを担持するよう企画した。glpDタンパク質のアミノ酸配列を保持するよう企画された部位特異的突然変異によりglpD遺伝子内に存在するBglII部位を除去することが有用であった。この突然変異には、次の通りに、PCRにより導入された。
glpD遺伝子の内部フラグメントを、プライマー(配列番号27及び配列番号28)を用いて増幅した。
【0220】
glpD遺伝子の3’末端を、下記プライマーを用いて増幅した:
(配列番号31):
5’−CCGAGATTTCCCGAAAAGATGAAATTTGGACTTCTGAATCCGGACTG及び;
(配列番号32):
5’−GACTAAGCTTAGATCTGCTAGCATCGATTGATTATTAACGAAAATTCACC。
2種の増幅されたフラグメントを混合し、そしてその混合物を、プライマー(配列番号27及び配列番号32)を用いてPCR増幅のための鋳型として使用した。
【0221】
得られるフラグメントを、EcoRI及びHindIIIにより消化し、EcoRI及びHindIIIにより消化されたpUC19に連結し、そしてその連結混合物を用いて、E.コリSJ2を形質転換し、そしてアンピシリン耐性(200μg/ml)について選択した。正しい配列を有するクローンを保持し、そしてSJ5775(SJ2/pSJ5775)と命名した。
【0222】
最終組み込みベクタープラスミドを構成するために、pSJ5789をHindIII及びBglIIにより消化し、そしてその0.5kbのフラグメントを、pSJ2739の5.5kbのHindIII−BglIIフラグメントに連結した。その連結混合物を用いて、B.スブチリスDN1885を形質転換し、30℃でエリトロマイシン耐性(5μg/ml)について選択した。得られるプラスミドを、EcoRI及びBglIIにより消化し、pSJ5775から切除された1.5kbのBglII−EcoRIフラグメントに連結し、そして連結混合物を用いて、B.スブチリスDN1885を形質転換し、エリトロマイシン耐性(5μg/ml)について30℃で選択した。
【0223】
この組み込みベクタープラスミドは、発現カセットが挿入される、glpD遺伝子の3’末端からすぐ下流に多くの制限酵素部位を有する。
得られる組み込みプラスミドを、前記例に記載のようにして、B.スブチリス接合ドナー株PP289−5の使用により、B.リケニホルミスglpD欠失株中にトランスファーした。
【0224】
組み込みプラスミドがglpD配列を通して染色体中に込み込まれている細胞を、50℃でグリセロール最少培地上で増殖するそれらの能力により単離する。そのような細胞を、第2組換え現象により、組み込まれたプラスミドを失っているが、しかし染色体上の発現カセットと一緒に、glpD遺伝子の修復されたバージョンを保持している株の単離のための開始点として使用する。
そのような株を得るための方法は、染色体のキシロースイソメラーゼ領域で組み込まれる発現カセットを有する株を単離するために使用される前記例に記載される方法に相当する。
【0225】
指図された染色体組み込みのためへの glpFK 遺伝子の使用:
前述の例の方法に類似して、glpF遺伝子のセグメント及びその上流のglpP領域を、B.リケニホルミスの染色体DNAからPCR増幅し、そして組合し、第1段階において、glpF遺伝子のプロモーター及び5’末端の欠失、及び第2段階において、プロモーター及びglpF遺伝子の回復及びglpFプロモーターの上流の染色体中への注目の遺伝子のための発現カセットの同時挿入のために有用なベクターを提供する。glpFプロモーターの欠失は、glpF遺伝子及びその下流のglpK遺伝子の発現を破壊することが予測される。PCR増幅を、前記のようにして行った。
【0226】
glpP遺伝子を含むDNAフラグメントを、下記プライマーを用いて増幅した:
(配列番号33):
5’−GACTAAGCTTGTGAAGGAGATGGAACATGAG;及び
(配列番号34):
5’−GACTGGATCCAGATCTGCGGCCGCACGCGTCGACAGTACTATTTTTAGTTCCAGTATTTTTTCC。 得られるフラグメントを精製し、そしてHindIII及びBamHIにより消化し、HindIII及びBamHIにより消化されたpUC19に連結し、そしてその連結混合物を用いて、E.コリSJ2を形質転換し、そしてアンピシリン耐性(200μg/ml)について選択した。正しい配列を有するクローンを保持し、そしてSJ5753(SJ2/pSJ5753)と命名した。
【0227】
glpF遺伝子のほとんどを含むが、しかしコード配列の最初の160塩基対を欠いているDNAフラグメントを、下記プライマーを用いて増幅した:
(配列番号35):5’−GAGCTCTAGATCTTCGGCGGCATCAGCGGAGC;及び
(配列番号36):5’−GACTGAATTCCTTTTGCGCAATATGGAC。
得られるフラグメントを、XbaI及びEcoRIにより消化し、XbaI及びEcoRIにより消化されたpUC19に連結し、そしてその連結混合物を用いて、E.コリSJ2を形質転換し、そしてアンピシリン耐性(200μg/ml)について選択した。正しい配列を有するクローンを保持し、そしてSJ5765(SJ2/pSJ5765)と命名した。
【0228】
glpF遺伝子プロモーター及び5’末端の欠失のために有用なプラスミドを構成するために、glpP含有フラグメントを、HindIII−BglIIフラグメントとしてpSJ5753から切除し、glpFフラグメントを、BglII−EcoRIフラグメントとしてpSJ5765から切除し、そしてそれらのフラグメントを、pSJ2739のHindIII−EcoRIフラグメントに連結する。その連結混合物を用いて、S.スブチリスDN1885を形質転換し、30℃でエリトロマイシン耐性(5μg/ml)について選択する。
【0229】
得られるプラスミドを、BglIIにより消化し、そしてレゾルバーゼ認識部位を両端に有するスペクトロマイシン耐性遺伝子を含む、pDJ3358からの1.5kbのBclI−BamHIフラグメントに連結する。その連結混合物を用いて、B.スブチリスDN1885を形質転換し、エリトロマイシン耐性(5μg/ml)及びスペクチノマイシン耐性(120μg/ml)について30℃で選択する。
このようにして構成された欠失を、前記例に記載のようにして、B.スブチリス接合ドナー株PP289−5の使用によりB.リケニホルミス中にトランスファーし、そして欠失を、前記例に記載されるのと実質的に同じ方法を用いて、染色体にトランスファーする。
【0230】
得られるglpF欠失株を、単一の炭素源としてグリセロールを有するTSS最少培地寒天プレート上での増殖について試験する。
組み込みプラスミドを、相同組換えによりglpFK遺伝子領域を修復でき、そしてglpFプロモーター及び損なわれていないglpF遺伝子を担持するよう企画する。このフラグメントを、染色体B.リケニホルミスDNAから、下記プラスミドを用いて増幅する:
(配列番号36);及び
(配列番号37):
5’−GAGCTCTAGATCTGCTAGCATCGATCCGCGGTTAAAATGTGAAAAATTATTGACAACG。
【0231】
得られるフラグメントを、XbaI及びEcoRIにより消化し、XbaI及びEcoRIにより消化されたpUC19に連結し、そしてその連結混合物を用いて、E.コリSJ2を形質転換し、アンピシリン耐性(200μg/ml)について選択する。続いて、増幅されたフラグメントを、BglII−EcoRIフラグメントとしてこのプラスミドから切除し、HindIII−BglIフラグメントとしてpSJ5753から切除されるglpP包含フラグメントに、及びpSJ2739のHindIII−EcoRIフラグメントに連結される。この連結混合物を用いて、B.スブチリスDN1885を形質転換し、30℃でエリトロマイシン耐性(5μg/ml)について選択する。続いて、興味ある発現カセットを、glpP遺伝子の末端とglpFプロモーターとの間のリンカー領域中に挿入する。
【0232】
その得られる組み込みプラスミドを、前記例に記載のようにして、B.スブチリス接合ドナー株pp289−5の使用によりB.リケニホルミスglpF欠失株中にトランスファーする。
組み込みプラスミドがglpF配列を通して染色体中に組み込まれているコロニーを、50℃でグリセロール最少培地プレート上で増殖するそれらの能力により単離する。そのようなコロニーを、第2の組換え現象により、組み込まれたプラスミドを失っているが、しかし発現カセットと共に、glpF遺伝子の修復されたバージョンを保持している株の単離のための開始点として使用する。
そのような株を得るための方法は、染色体のキシロースイソメラーゼ領域で組み込まれた発現カセットを有する株を単離するための前記方法に相当する。
【0233】
染色体組み込みのためへの glpD 及び glpFK の連続的使用:
この方法は、開始株として、glpD遺伝子欠失及びglpF遺伝子欠失の両者を有する株の使用を認識し、そしてグリセロール−3−リン酸により補充された最少培地上で増殖する、glpK遺伝子生成物を発現することができない株の能力を利用するが、ところが、glpDを欠いている株はこの基質上で増殖することはできない。 次に、前記方法は、glpD遺伝子を修復するよう企画された組み込みプラスミドをまず導入し、そしてグリセロール−3−リン酸を含む最少培地上での増殖を用いて正しい組み込みについて選択することである。これは、glpD遺伝子に続いて発現カセットのコピーを挿入する。
【0234】
第2段階においては、発現カセットのもう1つのコピーが、glpF遺伝子を修復するよう企画された組み込みベクターを用いて、glpPとglpF遺伝子との間に挿入され得、そしてグリセロールを有する最少培地上での増殖を用いて適切な組み込みを選択する。
2種の発現カセットが同一である(又は、強い相同性であるか、又は相同領域を含む)場合、それらが、最終株において、お互いに対して反対の配向で組み込まれ、従って、グリセロール上での増殖に関する選択が存在しない条件下で相同組換えにより株からのそれらの欠失を妨げるような配向でベクタープラスミド中にそれらの発現カセットを挿入することが好都合である。
【0235】
例5:
この研究においては、バチルス・スブチリスゲノム及びB.リケニホルミス染色体の第2の特定の領域(配列番号38)に対する相同性研究が行われ、そして前記領域がB.リケニホルミスのabnA遺伝子の3’−末端、及びaraA遺伝子の5’−末端を含むことが見出された。分析された領域のサイズは、1500個のヌクレオチドであり、そしてそのDNA配列番号38で示される。
【0236】
abnAコード領域の3’−末端は、配列番号38における位置1〜位置592である。ブラストプログラムを用いてのEMBL及びSwiss−protデータベースの研究は、B.スブチリスabnA遺伝子(DNAレベルに基づいて)及びB.スブチリスabnAタンパク質(タンパク質レベルに基づいて)との最も接近した相同性を示した。その対応するB.スブチリスabnAコード領域とのDNAレベルに基づいての同一性は、68.9%であった。その対応するB.スブチリスabnAタンパク質に対する推定されるabnAタンパク質の同一性は75.8%であった。
【0237】
abnAコード領域の5’−末端は、配列番号38における位置859〜位置1500である。ブラストアルゴリズムを用いてEMBL及びSwiss−protデータベースの研究は、B.スブチリスabnA遺伝子(DNAレベルに基づいて)及びB.スブチリスabnAタンパク質(タンパク質レベルに基づいて)に対して最も接近した相同性を示した。その対応するB.スブチリスabnAコード領域に対するDNAレベルに基づいて同一性は、68.2%であた。その対応するB.スブチリスabnAタンパク質に対する推定されるabnAタンパク質フラグメントの同一性は、62.6%であった。バチルス・ステアロサーモフィラスAraAタンパク質フラグメントに対する、一列整列で得られる同一性は75.8%であった。
【0238】
指図された染色体組み込みのためへの abnA 遺伝子の使用:
前述の例の方法に類似して、abnA遺伝子のセグメント及びその下流の領域を、B.リケニホルミスの染色体DNAからPCR増幅し、そして組合し、第1段階において、プロモーター及びabnA遺伝子の5’末端の欠失、及び第2段階において、プロモーター及びabnA遺伝子の回復及びabnAプロモーターの上流の染色体中への注目の遺伝子のための発現カセットの同時挿入のために有用なベクターを提供する。PCR増幅は前記のようにして行われた。
【0239】
araAの上流のabnA遺伝子のフラグメントを、下記プライマーを用いて増幅した:
(配列番号39):
5’−GACTAAGCTTCATCCGGCGATCAGTTTAATGC;及び
(配列番号40):
5’−GACTGAATTCAGATCTGCGGCCGCACGCGTCGACAGTACTATTTTTTTTTGACAGATTTCAGAAC。
【0240】
得られるフラグメントを、HindIII及びEcoRIにより消化し、HindIII及びEcoRIにより消化されたpUC19に連結し、そしてその連結混合物を用いて、E.コリSJ2を形質転換し、そしてアンピシリン耐性(200μg/ml)について選択した。正しい配列を有するクローンを保持し、そしてSJ5751(SJ2/pSJ5751)と命名した。 araA遺伝子の内部部分を含むフラグメントを、下記プライマーを用いて増幅した:
(配列番号41):
5’−GACTGGATCCAGATCTAGTCGAGTACAAAGCGGTGGC;及び
(配列番号42):
5’−GACTGAATTCGACCAGCCAAGCTGAATCTGC。
【0241】
得られるフラグメントを、BamHI及びEcoRIにより消化し、BamHI及びEcoRIにより消化されたpUC19に連結し、そしてその連結混合物を用いて、E.コリSJ2を形質転換し、そしてアンピシリン耐性(200μg/ml)について選択した。正しい配列を有するクローンを保持し、そしてSJ5752(SJ2/pSJ5760)と命名した。
abnA遺伝子フラグメントを、pSJ5751からHindIII−BglIIフラグメントとして切除し、pSJ2739の5.5kbのHindIII−BglIIIフラグメントに連結し、そしてその連結混合物を用いて、B.スブチリスDN1885を形質転換し、30℃でエリトロマイシン耐性(5μg/ml)について選択した。保持される形質転換体は、SJ5756(DN1885/pSJ5756)であった。
【0242】
プラスミドpSJ5760をBglIIにより消化し、そしてレゾルバーゼ認識部位を両者に有するスペクチノマイシン耐性遺伝子を含む、pSJ3358からの1.5kbのBamHI−BclIフラグメントを挿入した。クローンは、SJ5777(SJ2/pSJ5777)として保持された。
最終欠失プラスミドを、EcoRI−BamHIフラグメントとしてのpSJ5777からのaraA−res−spc−resフラグメントの切除、及びpSJ5756の大きなEcoRI−BglIIフラグメントへのこの連結により構成した。その連結混合物を用いて、B.スブチリスDN1885を形質転換し、30℃でエリトロマイシン耐性(5μg/ml)及びスペクトロマイシン耐性(120μg/ml)について選択した。保持される正しい形質転換体は、SJ5803(SJ2/pSJ5803)であった。
【0243】
欠失プラスミドpSJ5803を、前記例に記載のようにして、B.スブチリス接合ドナー株PP289−5の使用によりB.リケニホルミス中にトランスファーし、そして欠失を、前記例に記載されるのと実質的に同じ方法を用いて、染色体中にトランスファーする。
得られるareA欠失株を、単一の炭素源をしてアラビノースを有するTBS最少培地寒天プレートでの増殖について試験する。
【0244】
組み込みベクタープラスミドを、相同組換えによりaraA遺伝子領域を修復でき、そしてpSJ5756のabnA遺伝子フラグメントの他に、araAプロモーター及びaraA遺伝子の5’末端を担持するよう企画する。araAプロモーターフラグメントを、配列番号26として与えられる配列に基づいて合成されたプライマーを用いて、染色体B.リケニホルミスから増幅する。前記プラスミドを、注目の遺伝子のための発現カセットがabnA遺伝子から下流にではあるが、しかしaraAプロモーターの上流に挿入され得るよう構成する。
【0245】
得られる組み込みプラスミドを、前記例に記載のようにして、B.スブチリス接合ドナー株PP289−5の使用により、B.リケニホルミスaraA欠失株中にトランスファーする。組み込みプラスミドaraA配列を通して染色体中に組み込まれているコロニーを、50℃でアラビノース最少培地プレート上で増殖するそれらの能力により単離する。そのようなコロニーは、第2の組換え現象により、組み込まれたプラスミドを失っているが、しかし発現カセットと共に、araA遺伝子の修復されたバージョンを保持している株の単離のための出発点として使用される。
そのような株を得るための方法は、染色体のキシロースイソメラーゼ領域で組み込まれる発現カセットを有する株を単離する前記方法に相当する。
【0246】
例6:
この研究においては、バチルス・スブチリスゲノム及びB.リケニホルミス染色体の第3の特定の領域(配列番号42)に対する相同性研究が行われ、そしてB.リケニホルミス領域がB.リケニホルミスのispA遺伝子及びmetC遺伝子を含むことが見出された。分析された領域のサイズは、4078個のヌクレオチドであり、そしてそのDNA配列番号42で示される。
【0247】
ispAコード領域の3’−末端は、配列番号42における位置1〜位置647である。この特定の配列を用いてのEMBL及びSwiss−protデータベースのBLAST研究は、B.スブチリスispA遺伝子(DNAレベルに基づいて)及びB.スブチリスispAタンパク質(タンパク質レベルに基づいて)との最も接近した相同性を示した。その対応するB.スブチリスispAコード領域とのDNAレベルに基づいての同一性は、AlignXTMプログラム(Vector NTITM 6.0 プログラムパッケージ、InformaxTM,Inc.)を用いて構成された一列整列において72.6%であった。その対応するB.スブチリスispAタンパク質に対する推定されるispAタンパク質の同一性は82.3%であった。
【0248】
metCコード領域の5’−末端は、配列番号42における位置1121〜位置3406である。この特定の配列を用いてEMBL及びSwiss−protデータベースの研究は、B.スブチリスmetC遺伝子(DNAレベルに基づいて)及びB.スブチリスMetCタンパク質(タンパク質レベルに基づいて)に対して最も接近した相同性を示した。B.スブチリスmetCコード領域に対するDNAレベルに基づいて同一性は、72.6%であた。B.スブチリスMetCタンパク質に対する推定されるMetCタンパク質の同一性は、84.6%であった。
【0249】
指図された染色体組み込みのためへの metC 遺伝子の使用:
metC遺伝子のセグメント及びその下流の領域を、B.リケニホルミスの染色体DNAからPCR増幅し、そして組合し、metC遺伝子の3’末端の欠失のために有用なベクターを提供する。
metC遺伝子の3’末端の下流の4〜671塩基対の、B.リケニホルミス染色体に由来するDNAのフラグメントを、次のプライマーを用いて増幅した:
(配列番号44):
5’−AAAAAACCCGAGTTTCACAAAAAATCCACTACAAACGCCGCC;及び
(配列番号45):
5’−TTTTTTTTAAGCTTATGCCGCATGTTCCTTGCTGTTTTCAC。
【0250】
得られるフラグメントをAvaI及びHindIIIにより消化し、AvaI及びHindIIIにより消化されたpMOL1887に連結し、そしてその連結混合物を用いて、B.スブチリスPL1801を形質転換し、そして30℃でエリトロマイシン(5μg/ml)及びカナマイシン(10μg/ml)耐性について選択した。1つのクローンを、CLO57(PL1801/pCLO57)として保持した。
【0251】
metC読み取り枠中への247〜754塩基対の、B.リケニホルミス染色体の由来のmetC遺伝子の内部フラグメントを、下記プライマーを用いて増幅した。
(配列番号46):
5’−AAAAAAATCGATTCAGGGATATAAACGATCCG;及び
(配列番号47):
5’−TTTTTTTTTTCCATCGCACTGGGATATCAGCTCTTCATAAGCATC。
【0252】
得られるフラグメントをClaI及びBstXIにより消化し、ClaI及びBstXIにより消化されたpCLO57に連結し、そしてその連結混合物を用いて、B.スブチリスPL1801を形質転換し、そして30℃でエリトロマイシン(5μg/ml)及びカナマイシン(10μg/ml)耐性について選択した。1つのクローンを、CLO58(PL1801/pCLO58)として保持した。
【0253】
得られる欠失プラスミドpCLO58は、内部metCフラグメント、続いてレゾルバーゼ部位を両端に有するカナマイシン耐性遺伝子、続いて最終的に、metC遺伝子の下流のDNAフラグメントから成るカセットを有する。欠失プラスミドpCLO58を、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする遺伝子が染色対上に組み込まれていることを除いて、前記に記載されているPP289−5と同系遺伝子である接合ドナー株PP1060−1にトランスファーした。得られる株CLO71(PP1060−1/pCLO58)を、30℃でのエリトロマイシン耐性について選択した。ドナー株CLO71を、B.リケニホルミス受容体SJ3047と接合し、30℃でエリトロマイシン及びdal+表現型について接合体を選択した。
【0254】
1つの接合体CLO74を、カナマイシン(20μg/ml)上に画線培養し、染色体中に組み込まれるプラスミドを有する細胞について選択した。得られる株CLO78のSMS−グルコース最少プレート上へのプレート化は、プラスミドがmetC遺伝子の内部部分に組み込まれ、メチオニンの必要性をもたらしたことを示した。CLO78を、第2組換え現象により、前記組み込まれたプラスミドを失ったが、しかしmetC遺伝子の欠失されたバージョンを保持している株の単離のための開始点として使用した。
【0255】
CLO80と称するそのような株は、損なわれていないmetC遺伝子について選択的条件下で、前記例に実質的に記載されるようなmetC遺伝子座での組み込みのために指図され得るカセットを担持するプラスミドのための受容体として使用されることが適切である。
【0256】
例7:
この研究においては、バチルス・スブチリスゲノム及びB.リケニホルミス染色体の第4の特定の領域(配列番号48)に対する相同性研究が行われ、そしてB.リケニホルミス領域がB.リケニホルミスのspoVAF遺伝子の3’及びlysA遺伝子を含むことが見出された。分析された領域のサイズは、3952個のヌクレオチドであり、そしてそのDNA配列番号48で示される。
spoVAFコード領域の3’−末端は、配列番号48における位置1〜位置310である。B.スブチリスspoVAFコード領域に対する、DNAレベルに基づいての同一性は62.7%であった。B.スブチリスspoVAFタンパク質に対する推定されるspoVAFタンパク質の同一性は55.2%であった。
【0257】
lysAコード領域は、配列番号48における位置1048〜位置2367である。この特定の配列を用いてEMBL及びSwiss−protデータベースの研究は、B.スブチリスlysA遺伝子(DNAレベルに基づいて)及びB.スブチリスLysAタンパク質(タンパク質レベルに基づいて)に対して最も接近した相同性を示した。B.スブチリスlysAコード領域に対するDNAレベルに基づいて同一性は、73.0%であた。B.スブチリスLysAタンパク質に対する推定されるLysAタンパク質の同一性は、82.2%であった。
【0258】
指図された染色体組み込みのためへの lysA 遺伝子の使用:
前述の例の方法に類似して、lysA遺伝子のセグメントを、B.リケニホルミスの染色体DNAからPCR増幅し、そして組合し、第1段階において、リシンのための細胞を栄養要求性にするlysA遺伝子の部分的欠失、及び第2段階において、lysA遺伝子の回復及び染色体中への注目の遺伝子のための発現カセットの同時挿入のために有用なベクターを提供する。PCR増幅は前記のようにして行われた。 前記例の方法に基づけば、この方法を行うための必要なプライマー及び選択的条件を決定することは、当業者の範囲内である。
【0259】
一般的な材料及び方法:
インビトロDNA研究、細菌株の形質転換、等は、分子生物学の標準の方法を用いて行われた(Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. “Molecular Cloning, A laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982: Ausubel, F. M., など. (eds.) “Current Protocols in Molecular Biology”. John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.) “Molecular Biological Methods for Bacillus”. John wiley and Sons, 1990)。
特にことわらない限り、DNA操作のための酵素は、その供給者の規格に従って使用された。使用される培地(TY、BPX及びLB寒天)は、ヨーロッパ特許056780号に記載されている。
【0260】
アミラーゼ活性は、その供給者により記載されるように、Pharmacia & UpjohnからのPhadebas(商標)Amylase Testにより決定された。
容易な欠失のための部位特異的組換え酵素のための認識部位(プラスミドpAMbetalからのレゾルバーゼにより認識されるres部位)を両端に有する耐性遺伝子、例えばスペクチノマイシン耐性又はカナマイシン耐性遺伝子の使用は、アメリカ特許第5,882,888号に記載されている。その特許においては、プラスミドpSJ3358及び株B.スブチリスPP289−5が記載されている。
【0261】
pUC19は、Yanisch−Perron, C., Vieira, J., Messing, J. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene33, 103−119に記載されている。
pE194は、Horinouchi, S., and Weisblum, B. (1982). Nucleo tide seqquence and functional map of pE194, a plasmid that specifies inducible resistance to macrolide, lincosamide, and streptogramin type B antibiotics. J. Bacteriol., 150, 804−814に記載されている。
プラスミドpSJ2739は、アメリカ特許第6,100,063号に記載されている。
プラスミドpMOL1642は、配列番号49及び次の表に示されている:
【0262】
【表1】
【0263】
株E.コリSJ2及びバチルス・スブチリスDN1885は、Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, l., Jensen, B. R., Sjoholm, C. (1990). Cloning of aldB, Which encodes acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis, Journal of Bacteriology 172, 4315−4321に記載されている。
バチルス・スブチリスPL1801は、破壊されたapr及びnpr遺伝子を有するB.スブチリスDN1885である。
バチルス・リケニホルミスPL1980は、アルカリプロテアーゼ遺伝子中へのクロラムフェニコール耐性遺伝子の挿入によりアルカリプロテアーゼを生成することができなくされた、B.リケニホルミスの株である。
【0264】
バチルス・スブチリスJA578は、染色体上のdal遺伝子(EMBL:BSDAL, 受容体M16207)の下流に挿入されているrepF発現カセット(配列番号50)を有するB.スブチリス168 spo, amyEである。配列番号50で示されるrepF発現カセットは、バチルス・ステアロテルモフィラス(EMBL: BSAMYL02, 受託番号M36539)からのマルトース生成性アミラーゼプロモーターPamyM(配列番号50における位置1−181)、プラスミドpE194 (EMBL: PPCG2, 受託番号J01755) からのrepF遺伝子(配列番号50における位置212−808)に融合される、RBSを含むリンカー(配列番号50における位置182−211)、配列番号50における位置212でのRepF開始コドン、及び配列番号50における位置809での停止コドンを含んで成る。
バチルス・スブチリスJA691は、B.スブチリスJA578 dal−である。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、B.リケニホルミスキシロースイソメラーゼ領域、PCRフラグメント、欠失及び組み込みプラスミド、及び株の図示である。
【図2】図2は、B.リケニホルミスグルコネート領域、PCRフラグメント、欠失及び組み込みプラスミド、及び株の図示である。
【図3】図3は、B.リケニホルミスD−アラニンラセマーゼコード領域、PCRフラグメント、欠失及び組み込みプラスミド、及び株の図示である。
Claims (66)
- 染色体中の異なった位置に安定して組み込まれる注目の遺伝子の少なくとも2つのコピーを含んで成る細胞を構成するための方法であって、 a)注目の遺伝子の少なくとも1つの染色体コピーを含み且つ遺伝子を非機能的にするために変更されている1又は複数の条件付きで必須の染色体遺伝子を含む宿主細胞を供給し;
b)i)段階a)の条件付で必須の遺伝子の変更された非機能的
コピー、及び
ii)上記 i)を1つの側に有し、そして段階a)の遺伝子に隣接する宿主細胞染色体に位置する宿主細胞DNA配列に対して相同のDNAフラグメントを他の側に有する注目の遺伝子の少なくとも1つのコピー、
を含んで成るDNA構造体を供給し;ここで前記i)の変更されたコピーと前記段階a)の変更された染色体遺伝子との間の第1の組換えが前記条件付きで必須の染色体遺伝子を機能的に戻し、そして前記細胞を選択性にし;
c)前記宿主細胞中に前記のDNA構造体を導入し、そして前記細胞を、条件付きで必須の機能的遺伝子を必要とする選択的条件下で培養し;そして
d)前記段階の選択的条件下で増殖する宿主細胞を選択し;ここで前記注目の遺伝子の少なくとも1つのコピーが段階a)の遺伝子に隣接する宿主細胞染色体中に組み込まれており;そして任意には、
e)個々の反復において、段階a)における異なった染色体遺伝子を用いて少なくとも1度、段階a)〜d)を反復する;
ことを含んで成る方法。 - 染色体中の異なった位置に安定して組み込まれる注目の遺伝子の少なくとも2つのコピーを含んで成る細胞を構成するための方法であって、
a)注目の遺伝子の少なくとも1つの染色体コピーを含んで成る宿主細胞を供給し;
b)前記宿主細胞の条件付で必須の染色体遺伝子を変更し、それにより前記遺伝子が非機能的になり;
c)i)段階b)の染色体遺伝子の変更された非機能的
コピー、及び
ii)上記 i)を1つの側に有し、そして段階b)の遺伝子に隣接する宿主細胞DNA配列に対して相同のDNAフラグメントを他の側に有する注目の遺伝子の少なくとも1つのコピー、
を含んで成るDNA構造体を製造し;ここで前記i)の変更されたコピーと前記段階b)の変更された染色体遺伝子との間の第1の組換えが前記条件付きで必須の染色体遺伝子を機能的に戻し、そして前記細胞を選択性にし;
d)前記宿主細胞中に前記のDNA構造体を導入し、そして前記細胞を、段階b)の機能的遺伝子を必要とする選択的条件下で培養し;そして
e)段階d)の選択的条件下で増殖する宿主細胞を選択し;ここで前記注目の遺伝子の少なくとも1つのコピーが段階b)の遺伝子に隣接する宿主細胞染色体中に組み込まれており;そして任意には、
f)個々の反復において、段階b)における異なった染色体遺伝子を用いて少なくとも1度、段階a)〜e)を反復する;
ことを含んで成る方法。 - 前記DNA構造体を導入し、そして選択的条件下で前記細胞を培養する段階に続いて、又は宿主細胞を選択する段階に続いて、第2の組換えが前記DNAフラグメントと前記相同宿主細胞DNA配列との間で起こる、請求項1又は2記載の方法。
- 前記DNA構造体がさらに、第2の組換えにより染色体から組換えられるように、前記構造体に位置する少なくとも1つのマーカー遺伝子を含んで成る、請求項3記載の方法。
- 前記少なくとも1つのマーカー遺伝子が、好ましくはクロラムフェニコール、カナマイシン、アンピシリン、エリトロマイシン、スペクチノマイシン及びテトラサイクリンから成る群から選択された抗生物質に対する耐性を付与する、請求項4記載の方法。
- 前記選択的条件下で増殖し、そして染色体に前記少なくとも1つのマーカー遺伝子を含まない宿主細胞が選択される、請求項4又は5記載の方法。
- 前記DNA構造体がさらに、前記変更されたコピーとDNAフラグメントとの間に位置する少なくとも1つのマーカー遺伝子を含んで成り、そして前記少なくとも1つのマーカー遺伝子が特定のレゾルバーゼにより認識されるヌクレオチド配列を端に有し、好ましくは前記ヌクレオチド配列がresである、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- 前記少なくとも1つのマーカー遺伝子が、選択的条件下で増殖する宿主細胞の選択に続いて、レゾルバーゼ酵素の作用により染色体から切除される請求項7記載の方法。
- 前記注目の遺伝子が前記宿主細胞に起因する請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
- 前記注目の遺伝子が、酵素、好ましくはデンプ分解酵素、脂肪分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解酵素、オキシドレダクターゼ又は植物細胞壁分解酵素、及びより好ましくは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カルボヒドロラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、β−ガラクロシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インバーターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼから成る群から選択された活性を有する酵素をコードする請求項1〜9のいずれか1項記載の方法。
- 選択的条件下で増殖する前記選択された宿主細胞は、実質的に外因性DNAを含まず、好ましくは注目の組み込まれる遺伝子当たり500以下の塩基対、より好ましくは300個以下のbp、さらにより好ましくは100個以下のbp、さらにより好ましくは50個以下のbp、より好ましくは25個以下のbp、又は最も好ましくは外因性DNAを含まない請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
- 選択条件下で増殖する前記選択された宿主細胞が、内因性起源のみのDNAを含んで成る請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
- 前記宿主細胞の条件付に必須の染色体遺伝子が、前記遺伝子を部分的に欠失することによって、又は前記遺伝子に1又は複数の突然変異を導入することによって変更される請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。
- 変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、D−アラニンラセマーゼをコードし、好ましくは前記遺伝子はバチルス細胞からのdal相同体であり、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのdalに相同であり、そして最も好ましくは、前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのdal遺伝子である請求項1〜13のいずれか1項記載の方法。
- 変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、D−アラニンラセマーゼをコードし、そして配列番号12における位置1303〜2469に示されるバチルス・リケニホルミスのdal配列に対して、少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは95%及び最も好ましくは少なくとも97%同一である請求項1〜13のいずれか1項記載の方法。
- 変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、1種の特定の主要炭素源のみにより補充された最少培地上での前記宿主細胞の増殖のために必要とされる1又は複数の遺伝子である請求項1〜13のいずれか1項記載の方法。
- 変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、キシロースオペロンのものであり、好ましくは前記遺伝子はバチルス・サブチリスからのxylA遺伝子に相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのキシロースイソメラーゼオペロンの1又は複数の遺伝子に相同である請求項16記載の方法。
- 変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、ガラクトキナーゼ(EC2. 7. 1. 6)、UTP−依存性ピロホスホリラーゼ(EC2. 7. 7. 10)、UDP−グルコース−依存性ウリジルイルトランスフェラーゼ(EC2. 7. 7. 12)又はUDP−ガラクトースエピメラーゼ(EC5. 1. 2. 3)をコードし、好ましくは前記遺伝子はUDP−ガラクトースエピメラーゼ(EC5. 1. 2. 3)をコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルスのgalEに相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのgalEである請求項16記載の方法。
- 変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、グルコネートオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグルコネートキナーゼ(EC2. 7. 1. 12)又はグルコネートペルミアーゼ、又は両者をコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのgntk又はgntP遺伝子に対して相同の1又は複数の遺伝子であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスからのgntK又はgntP遺伝子である請求項16記載の方法。
- 変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、グルコネートオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグルコネートキナーゼ(EC2. 7. 1. 12)又はグルコネートペルミアーゼ、又は両者をコードし、そしてバチルス・リケニホルミスのgntK及びgntPのいずれかに対して、少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは95%及び最も好ましくは少なくとも97%同一である請求項16記載の方法。
- 変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、グリセロールオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグリセロール摂取促進体(ペルミアーゼ)、グリセロールキナーゼ又はグリセロールデヒドログナーゼをコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのglpP, glpF, glpK及びglpD遺伝子に対して相同の1又は複数の遺伝子であり、そして最も好まくは前記遺伝子は配列番号26で示されるバチルス・リケニルホルミスからのglpP, glpF, glpK及びglpD遺伝子の1又は複数の遺伝子である請求項16記載の方法。
- 変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、グリセロールオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグリセロール摂取促進体(ペルミアーゼ)、グリセロールキナーゼ又はグリセロールデヒドログナーゼをコードし、そして配列番号26で示されるバチルス・リケニホルミスのglpP, glpF, glpK及びglpD配列のいずれかに対して、少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは95%及び最も好ましくは少なくとも97%同一である請求項16記載の方法。
- 変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、アラビノースオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はアラビノースイソメラーゼをコードし、より好ましくは前記遺伝子は、バチルス・スブチリスからのaraA遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子は配列番号38で示されるバチルス・リケニホルミスからのaraA遺伝子である請求項16記載の方法。
- 変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、アラビノースオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はアラビノースイソメラーゼをコードし、そして配列番号38で示されるバチルス・リケニホルミスのaraA配列に対して、少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは95%及び最も好ましくは少なくとも97%同一である請求項16記載の方法。
- 前記宿主細胞の条件付で必須の染色体遺伝子が、アミノ酸合成に関与する1又は複数のポリペプチドをコードし、そして前記遺伝子の非機能性が細胞を1又は複数のアミノ酸のために栄養要求性にし、そして前記遺伝子の機能性の回復が前記細胞を前記アミノ酸のため原栄養性にする請求項1〜13のいずれか1項記載の方法。
- 前記宿主細胞の条件付きで必須の染色体遺伝子が、リシン又はメチオニン合成に関与する1又は複数のポリペプチドをコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのmetC又はlysA遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスからのmetC又はlysA遺伝子である請求項25記載の方法。
- 前記宿主細胞の条件付きで必須の染色体遺伝子が、配列番号42で示されるバチルス・リケニホルミスのmetC配列、又は配列番号48で示されるバチルス・リケニホルミスのlysA配列に対して、少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは95%、及び最も好ましくは少なくとも97%同一である請求項25記載の方法。
- 前記宿主細胞が、グラム陽性細菌細胞、好ましくはバチルス細胞及び最も好ましくは、バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュランス、バチルス・クラウジ、バチルス・コアギランス、バチルス・ラクタス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・スブチリス及びバチルス・スリンギエンシスから成る群から選択されたバチルス細胞である請求項1〜27のいずれか1項記載の方法。
- 前記DNA構造体がプラスミドである請求項1〜28のいずれか1項記載の方法。
- i)宿主細胞からの条件付きで必須の染色体遺伝子の変更された非機能的コピー、好ましくは部分的に欠失されたコピー;及び
ii)上記i)を1つの側に有し、そしてi)の条件付きで必須の遺伝子に隣接する宿主細胞染色体に位置する宿主細胞DNA配列に対して相同のDNAフラグメントを他の側に有する注目の遺伝子の少なくとも1つのコピーを含んで成るDNA構造体。 - i)において変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、D−アラニンラセマーゼをコードし、好ましくは前記遺伝子はバチルス細胞からのdal相同体であり、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのdalに相同であり、そして最も好ましくは、前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのdal遺伝子である請求項30記載のDNA構造体。
- i)において変更される前記宿主細胞の条件付きに必須の染色体遺伝子が、D−アラニンラセマーゼをコードし、そして配列番号12における位置1303〜2469に示されるバチルス・リケニホルミスのdal配列に対して、少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは95%及び最も好ましくは少なくとも97%同一である請求項30記載のDNA構造体。
- 宿主細胞からの条件付きに必須の染色体遺伝子の変更された非機能的コピーが、1種の特定の主要炭素源のみにより補充された最少培地上での前記宿主細胞の増殖のために必要とされる1又は複数の遺伝子である請求項30記載のDNA構造体。
- 条件付きに必須の染色体遺伝子が、キシロースオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はバチルス・サブチリスからのxylA遺伝子に相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのキシロースイソメラーゼオペロンの1又は複数の遺伝子に相同である請求項33記載のDNA構造体。
- 条件付きに必須の染色体遺伝子が、ガラクトキナーゼ(EC2. 7. 1. 6)、UTP−依存性ピロホスホリラーゼ(EC2. 7. 7. 10)、UDP−グルコース−依存性ウリジルイルトランスフェラーゼ(EC2. 7. 7. 12)又はUDP−ガラクトースエピメラーゼ(EC5. 1. 2. 3)をコードし、好ましくは前記遺伝子はUDP−ガラクトースエピメラーゼ(EC5. 1. 2. 3)をコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルスのgalEに相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスのgalEである請求項33記載のDNA構造体。
- 条件付きに必須の染色体遺伝子が、グルコネートオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグルコネートキナーゼ(EC2. 7. 1. 12)又はグルコネートペルミアーゼ、又は両者をコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのgntk又はgntP遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスからのgntK又はgntPの1又は複数の遺伝子である請求項33記載のDNA構造体。
- 条件付きに必須の染色体遺伝子が、グリセロールオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグリセロール摂取促進体(ペルミアーゼ)、グリセロールキナーゼ又はグリセロールデヒドログナーゼをコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのglpP, glpF, glpK及びglpD遺伝子にに対して相同の1又は複数の遺伝子であり、そして最も好まくは前記遺伝子は配列番号26で示されるバチルス・リケニルホルミスからのglpP, glpF, glpK及びglpD遺伝子の1又は複数の遺伝子である請求項33記載のDNA構造体。
- 条件付きに必須の染色体遺伝子が、グリセロールオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はグリセロール摂取促進体(ペルミアーゼ)、グリセロールキナーゼ又はグリセロールデヒドログナーゼをコードし、そして配列番号26で示されるバチルス・リケニホルミスのglpP, glpF, glpK及びglpD配列のいずれかに対して、少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは95%及び最も好ましくは少なくとも97%同一である請求項33記載のDNA構造体。
- 条件付きに必須の染色体遺伝子が、アラビノースオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はアラビノースイソメラーゼをコードし、より好ましくは前記遺伝子は、バチルス・スブチリスからのaraA遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子は配列番号38で示されるバチルス・リケニホルミスからのaraA遺伝子である請求項33記載のDNA構造体。
- 条件付きに必須の染色体遺伝子が、アラビノースオペロンの1又は複数の遺伝子であり、好ましくは前記遺伝子はアラビノースイソメラーゼをコードし、そして配列番号38で示されるバチルス・リケニホルミスのaraA配列に対して、少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは95%及び最も好ましくは少なくとも97%同一である請求項33記載のDNA構造体。
- 条件付で必須の染色体遺伝子が、アミノ酸合成に関与する1又は複数のポリペプチドをコードし、そして前記遺伝子の非機能性が、遺伝子の他の機能的コピーを有さない細胞に存在する場合、細胞を1又は複数のアミノ酸のために栄養要求性にし、そして前記遺伝子の機能性の回復が前記細胞を前記アミノ酸のため原栄養性にする請求項33記載のDNA構造体。
- 条件付きで必須の染色体遺伝子が、リシン又はメチオニン合成に関与する1又は複数のポリペプチドをコードし、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのmetC又はlysA遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスからのmetC又はlysA遺伝子である請求項41記載のDNA構造体。
- 条件付きで必須の染色体遺伝子が、配列番号42で示されるバチルス・リケニホルミスのmetC配列、又は配列番号48で示されるバチルス・リケニホルミスのlysA配列に対して、少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは95%、及び最も好ましくは少なくとも97%同一である請求項41記載のDNA構造体。
- 染色体中に安定して組み込まれる注目の遺伝子の少なくとも2個のコピーを含んで成る宿主細胞であって、少なくとも1つのコピーが条件付で必須の遺伝子座に隣接して組み込まれ、そして前記細胞が請求項1〜29のいずれか1項記載の方法により得ることができる宿主細胞。
- 前記注目の遺伝子が、前記条件付きで必須の遺伝子座から、1000個以下の塩基対、好ましくは750個の以下の塩基対、より好ましくは500個以下の塩基対、さらにより好ましくは250個以下の塩基対、及び最も好ましくは100個以下の塩基対、分離される請求項44記載の細胞。
- 実質的に外因性DNAを含まず、好ましくは興味ある組み込まれる遺伝子当たり500個以下の塩基対、より好ましくは300以下のbp、さらにより好ましくは100以下のbp、さらにより好ましくは50個以下のbpを含み、又は最も好ましくは外因性DNAを含まない請求項44又は45記載の細胞。
- 内因性DNAのみを含む請求項44又は45記載の細胞。
- 前記宿主細胞が、グラム陽性細菌細胞、好ましくはバチルス細胞及び最も好ましくは、バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュランス、バチルス・クラウジ、バチルス・コアギランス、バチルス・ラクタス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・スブチリス及びバチルス・スリンギエンシスから成る群から選択されたバチルス細胞である請求項44〜47のいずれか1項記載の細胞。
- 注目の遺伝子のコピーが、D−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子、好ましくはバチルス・スブチリスからのdal遺伝子に相同の遺伝子、より好ましくは配列番号12における位置1303〜2469に示されるバチルス・リケニホルミスのdal配列に対して少なくとも75%同一である遺伝子、さらにより好ましくは、配列番号12における位置1303〜2469に示されるバチルス・リケニホルミスのdal配列に対して少なくとも95%及び最も好ましくは少なくとも97%同一である請求項44〜48のいずれか1項記載の細胞。
- 注目の遺伝子のコピーが、1種の特定の主要炭素源のみにより補充された最少培地上での前記宿主細胞の増殖のために必要とされる遺伝子に隣接して組み込まれる請求項44〜49のいずれか1項記載の細胞。
- 注目の遺伝子のコピーが、キシロースオペロンの遺伝子に隣接して、好ましくはバチルス・スブチリスからのxylR又はxylA遺伝子に相同の遺伝子に隣接して、及び最も好ましくは、バチルス・リケニホルミスからのxylR又はxylAに隣接して組み込まれる請求項50記載の細胞。
- 注目の遺伝子のコピーが、ガラクトキナーゼ(EC2. 7. 1. 6)、UTP−依存性ピロホスホリラーゼ(EC2. 7. 7. 10)、UDP−グルコース−依存性ウリジルイルトランスフェラーゼ(EC2. 7. 7. 12)又はUDP−ガラクトースエピメラーゼ(EC5. 1. 2. 3)をコードする遺伝子、好ましくは前記遺伝子はUDP−ガラクトースエピメラーゼ(EC5. 1. 2. 3)をコードする遺伝子、より好ましくは前記遺伝子はバチルスのgalEに相同である遺伝子、そして最も好ましくはバチルス・リケニホルミスのgalEに隣接して組み込まれる請求項50記載の細胞。
- 注目の遺伝子のコピーが、グルコネートオペロンの遺伝子に隣接して、好ましくはグルコネートキナーゼ(EC2. 7. 1. 12)又はグルコネートペルミアーゼをコードする遺伝子に隣接して、より好ましくはgntR, gntK, gntp及びgntZから成る群から選択されたバチルス・スブチリス遺伝子に相同の遺伝子に隣接して、及び最も好ましくはバチルス・リケニホルミスからのgntR, gntK, gntP又はgntZに隣接して組み込まれる請求項50記載の細胞。
- 注目の遺伝子のコピーが、グリセロールオペロンの1又は複数の遺伝子、好ましくは前記遺伝子はグリセロール摂取促進体(ペルミアーゼ)、グリセロールキナーゼ又はグリセロールデヒドログナーゼをコードする遺伝子、より好ましくはバチルス・スブチリスからのglpP, glpF, glpK及びglpD遺伝子に対して相同の遺伝子、及び最も好まくは配列番号26で示されるバチルス・リケニルホルミスからのglpP, glpF, glpK及びglpD遺伝子に隣接して組み込まれる請求項50記載の細胞。
- 注目の遺伝子のコピーが、アラビノースオペロンの遺伝子であり、好ましくはアラビノースイソメラーゼをコードする遺伝子に隣接して組み込まれ、より好ましくは前記遺伝子は、バチルス・スブチリスからのaraA遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子は配列番号38で示されるバチルス・リケニホルミスからのaraA遺伝子である請求項50記載の細胞。
- 注目の遺伝子のコピーが、アミノ酸合成に関与する1又は複数のポリペプチドをコードする遺伝子に隣接して組み込まれ、そして前記遺伝子の非機能性が細胞を1又は複数のアミノ酸のために栄養要求性にし、そして前記遺伝子の機能性の回復が前記細胞を前記アミノ酸のため原栄養性にする請求項44〜50のいずれか1項記載の細胞。
- 注目の遺伝子のコピーが、リシン又はメチオニン合成に関与する1又は複数のポリペプチドをコードする遺伝子に隣接して組み込まれ、より好ましくは前記遺伝子はバチルス・スブチリスからのmetC又はlysA遺伝子に対して相同であり、そして最も好ましくは前記遺伝子はバチルス・リケニホルミスからのmetC又はlysA遺伝子である請求項56記載の細胞。
- 注目の遺伝子のコピーが、配列番号42で示されるバチルス・リケニホルミスのmetC配列、又は配列番号48で示されるバチルス・リケニホルミスのlysA配列に対して、少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは95%、及び最も好ましくは少なくとも97%同一である遺伝子に隣接して組み込まれる請求項56記載の細胞。
- 前記注目の遺伝子が、酵素、好ましくはデンプ分解酵素、脂肪分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解酵素、オキシドレダクターゼ又は植物細胞壁分解酵素、及びより好ましくは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カルボヒドロラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、β−ガラクロシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インバーターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼから成る群から選択された活性を有する酵素をコードする請求項44〜58のいずれか1項記載の細胞。
- 注目の遺伝子が、抗微生物ペプチド、好ましくは抗真菌ペプチド又は抗菌ペプチドをコードする請求項44〜58のいずれか1項記載の細胞。
- 前記注目の遺伝子が、ヒト身体において生物学的活性を有するペプチド、好ましくは医薬的活性ペプチド、より好ましくはインスリン/プロ−インスリン/プレ−プロ−インスリン又はそれらの変異体、成長ホルモン又はその変異体、又は血液凝固因子VII又はVIII又はそれらの変異体をコードする請求項44〜58のいずれか1項記載の細胞。
- 抗生物質マーカーが存在しない請求項44〜61のいずれか1項記載の細胞。
- 少なくとも2種の条件付きに必須の遺伝子が非機能的にされ、好ましくは前記遺伝子がxylA, galE, gntK, gntP, glpP, glpF, glpK, glpD, araA, metC, lysA及びdalから成る群から選択されるバチルス・リケニホルミス細胞。
- 請求項1〜29のいずれか1項記載の方法への請求項63記載の細胞の使用。
- 請求項30〜45のいずれか1項記載のDNA構造体を含んで成る細胞。
- 注目の酵素の生成方法であって、請求項44〜62のいずれか1項記載の細胞を、前記酵素を生成するために適切な条件下で培養し、そして任意には、前記酵素を精製することを含んで成る方法。
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