DE69008959T2 - Verfahren zur Produktion von Protein mit Stämmen von Bacillus subtilis und Verfahren zur Vorbereitung dieser Stämme. - Google Patents
Verfahren zur Produktion von Protein mit Stämmen von Bacillus subtilis und Verfahren zur Vorbereitung dieser Stämme.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines bestimmten (vorgegebenen) Proteins bei Bakterien des Genus Bacillus, insbesondere Bacillus subtilis, sowie Bacillus-Stämme, insbesondere Bacillus subtilis, die in dem Verfahren verwendbar (nützlich) sind, und ein Verfahren zur Herstellung der genannten Stämme.
- In FR 84 06 701 (2 563 533) ist ein Verfahren zur Herstellung eines Bacillus-Stammes beschrieben, in dessen Chromosom ein bestimmtes (vorgegebenes) Gen amplifiziert worden ist, d.h. in mehreren Exemplaren (Kopien) vorliegt, bei dem man:
- a) in das Chromosom des genannten Stammes mindestens eine sogenannte Integrations-DNA-Sequenz integriert, die mindestens umfaßt
- . eine DNA-Sequenz, als amplifizierbare Einheit bezeichnet, mit der Struktur -D-M-D-, wobei das genannte Gen umfaßt M und an jedem Ende zwei identische Sequenzen D in der gleichen Richtung (Orientierung), welche die Integration des Gens M in ein nicht-essentielles Gen von Bacillus gewährleisten,
- . eine amplifizierbare Einheit, die außerdem ein selektionierbares Gen umfaßt,
- b) anschließend die durch Kultivierung auf einem dem selektionierbaren Gen entsprechenden Selektionsmedium erhaltenen Bacillus-Stämme selektioniert und die Stämme selektioniert, deren Genom der Anwesenheit einer erhöhten Anzahl von Kopien des genannten Gens gegenüber der Bakterienpopulation vor der Selektion entspricht.
- Auf diese Weise ist es gelungen, eine Amplifikationseinheit zu erhalten, die außer der duplizierten Sequenz ein gegen Kanamycin resistentes Gen (Kmr) und ein gegen Chloramphenicol resistentes Gen (Cmr) umfaßt. Eine Amplifikation der beiden Gene Kmr oder Cmr wurde erhalten durch Selektionieren der gegen erhöhte Antibiotika-Konzentrationen resistenten Stämme. Die Bildung eines Proteins mit den Stämmen nach diesem Verfahren wurde bisher jedoch nicht beschrieben.
- Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einerseits die Amplifikation eines Fragments des Genoms von Bacillus subtilis in einem höheren Grade auf stabile und kontrollierbare Weise zu induzieren und andererseits zu bewirken, daß die Zellenmaschinerie noch in der Lage ist, die Transkription, die Translation aller auf diese Weise amplifizierten Sequenzen und gegebenenfalls die Sekretion der durch ein amplifiziertes Gen codierten Proteine zu gewährleisten.
- Erfindungsgemäß wurde ein neues Verfahren zur Amplifikation eines Bacillus-Stammes gefunden, der in der Lage ist, ein bestimmtes (vorgegebenes) Protein in beträchtlicher Menge zu bilden, in dessen Chromosom ein bestimmtes (vorgegebenes) Gen, welches das genannte Protein codiert, amplifiziert worden ist. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man:
- a) mindestens eine sogenannte Integrations-DNA-Sequenz in das Chromosom des genannten Stammes integriert, die mindestens umfaßt:
- . ein stromaufwärts gelegenes induzierbares oder konditionelles (konditionierbares) Replikationssystem oder Replikon,
- . eine amplifizierbare Einheit mit der Struktur -D-M-D-, in der die in direkter Richtung orientierten Sequenzen D die Integration des Gens M in ein nicht-essentielles Gen des genannten Stammes gewährleisten, wobei das Gen M, welches das Struktur-Gen des genannten Proteins umfaßt, unter der Kontrolle steht von induzierbaren Elementen zur Expression und gegebenenfalls Sekretion des genannten Proteins bei Bacillus, wobei die amplifizierbare Einheit außerdem gegebenenfalls ein selektionierbares Gen umfaßt;
- b) gegebenenfalls eine Kultivierung auf einem dem selektionierbaren Gen entsprechenden Selektionsmedium durchführt und
- c) in einem geeigneten Kulturmedium die Aktivierung des genannten Replikons induziert.
- Da die Amplifikation durch Aktivierung des Replikons ausreichend hoch ist, kann man nämlich 40 bis 80 Kopien des Gens nach einer Aktivierung des Replikons über Nacht erhalten, man kann gegebenenfalls die Selektions-Stufe (b) auf einem dem selektionierbaren Gen entsprechenden Medium, die bisher erforderlich war, weglassen.
- Durch Kumulierung der beiden Amplifikations-Typen (b) und (c) kann man bis zu 250 Kopien des Gens erhalten, während das Verfahren nur durch den Selektionsdruck in Gegenwart eines selektionierbaren Gens bisher eine Amplifikation ergab, die nur 20 bis 30 Kopien des Gens lieferte.
- Es wurde außerdem festgestellt, daß die Zellenmaschinerie immer in der Lage war, die Transkription und Translation aller auf diese Weise amplifizierten Sequenzen sowie gegebenenfalls die Sekretion des gebildeten Proteins zu gewährleisten, wenn das amplifizierte Gen auch seine Elemente zur Expression und gegebenenfalls Sekretion umfaßt.
- Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung eines bestimmten (vorgegebenen) Proteins, bei dem die Amplifikation und Aktivierung der Elemente zur Expression und gegebenenfalls Sekretion des genannten Proteins gleichzeitig ablaufen, d.h. ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man, ausgehend von einem Stamm des Genus Bacillus, in dessen Chromosom in ein nicht-essentielles Gen des genannten Stammes integriert worden sind:
- a) eine amplifizierbare Einheit, die eine bestimmte (vorgegebene) DNA-Sequenz M umfaßt, die von zwei identischen und in direkter Richtung orientierten DNA-Sequenzen D umgeben (eingerahmt) ist, wobei die Sequenz M, die das Strukturgen des genannten Proteins umfaßt, unter der Kontrolle von bei Bacillus induzierbaren Elementen der Expression und gegebenenfalls Sekretion des genannten Proteins und fakultativ eines selektionierbaren Gens steht, und
- b) ein induzierbares oder konditionelles (konditionierbares) Replikationssystem oder Replikon, das ebenfalls in das genannte nicht-essentielle Gen des Chromosoms des Stammes stromaufwärts von der amplifizierbaren Einheit integiert ist;
- 1. gegebenenfalls die durch Kultivierung auf einem Selektionsmedium, das dem selektionierbaren Gen entspricht, erhaltenen amplifizierten Klone selektioniert und die Stämme entnimmt, deren Genom der Anwesenheit einer erhöhten Anzahl von Kopien des genannten Gens, bezogen auf die Bakterienpopulation vor der Selektion, entspricht;
- 2. in einem geeigneten Kulturmedium eine Gen-Amplifikation induziert oder konditioniert durch Aktivierung des Replikons und die Expression und Sekretion des Proteins durch Aktivierung der genannten Expressionselemente induziert; und
- 3. das genannte exprimierte Protein gewinnt (abtrennt).
- Es sei darauf hingewiesen, daß die Chronologie der Stufen des Verfahrens eine bestimmte Bedeutung in dem Sinne hat, daß eine Selektionierungsstufe nach der Überamplifikation der Stufe 2 durch Induktion des Replikons zu einer Änderung dieser Amplifikation führt.
- Es wurde auch gefunden, daß die Amplifikation außerdem im Bereich der homologen Rekombinationsfunktion kontrolliert werden kann. Wenn nämlich das native Gen recE von Bacillus inaktiviert ist und seine Expression blockiert ist, gibt es keine Rekombination mehr und parallel dazu entsteht keine Amplifikation trotz Induktion der Aktivierung des Replikons. Man kann das native Gen recE oder nur seinen Promotor inaktivieren und durch Transformation mit einem Gen, das für eine aktive Rekombinationsfunktion codiert, komplementieren, wobei das genannte Gen vorzugsweise der Kontrolle eines induzierbaren Promotors unterstellt wird. Das für die aktive Rekombinationsfunktion codierende Gen kann beispielsweise sein recE von Bacillus subtilis oder recA von E. coli.
- Der verwendete Transformations-Vektor kann ein Plasmid oder ein lysogener Phage sein, wie der Phage Φ 105.
- Die Kontrolle der Rekombinationsfunktion ergibt einen zweiten Kontrollwert für die Auslösung der Amplifikation, wobei die doppelte Kontrolle vorteilhaft ist und insbesondere eine Sicherheit mit sich bringt in dem Maße, in dem die Kontrolle der Aktivierung des Replikons nicht immer streng ist.
- Die vorliegende Erfindung betrifft somit außerdem ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen, wie sie oben genannt sind, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das für die homologe Rekombinationsfunktion in dem Chromosom des genannten Stammes codierende Gen inaktiviert und unter die Kontrolle eines induzierbaren Promotors gestellt wird, wobei das genannte Gen, das für die Rekombinationsfunktion codiert, ein heterologes Gen sein kann, wenn das native Gen inaktiviert worden ist, so daß in der Stufe 2 keine Amplifikation erfolgt, wenn man:
- - den Mangel an homologer Rekombination in dem Chromosom des Stammes durch ein Gen komplementiert, das für die homologe Rekombinationsfunktion in dem Chromosom des genannten Stammes, beispielsweise das Gen recE von Bacillus subtilis oder das Gen recA von E. coli codiert, und/oder
- - für den Fall, daß das genannte Gen unter die Kontrolle eines induzierbaren Promotors gestellt wird, die Aktivierung des genannten induzierbaren Promotors so induziert, daß die homologe Rekombinationsfunktion in dem Chromosom des genannten Stammes exprimiert.
- Gemäß einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das für die homologe Rekombinationsfunktion codierende Gen das native Gen recE des Stammes Bacillus ist und durch Transformation des genannten Stammes mit einem mutierten Gen recE inaktiviert worden ist, wobei das native Gen recE durch Gen-Substitution, insbesondere mit der Chromosomen- DNA des Stammes SBEK und Selektion des gegen Kanamycin resistenten Transformanden eliminiert wird.
- Der Stamm SBEK leitet sich ab von dem Stamm SB202 von B. subtilis; eine Insertion von 1,5 kb, die das Gen aphA3 (35) trägt, die Resistenz gegen Kanamycin verleiht, wurde in die codierende Sequenz des Gens recE eingeführt. Die Transformation eines Stammes von B. subtilis mit der Chromosomen-DNA des Stammes SBEK und die Selektion der gegen Kanamycin resistenten Transformanden (10 ug/ml) erlaubt die Isolation von mutierten Klonen in dem Gen recE in einer einzigen Stufe. Diese Konsruktion erlaubt die Inaktivierung des Gens recE, das in jedem beliebigen Stamm von Bacillus vorkommt.
- Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Bacillus-Stammes, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines Proteins verwendbar (nützlich) ist, in dessen Chromosom ein bestimmtes (vorgegebenes) Gen, welches das genannte Protein codiert, integriert und gegebenenfalls amplifiziert worden ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
- a) mindestens eine sogenannte Integrations-DNA-Sequenz in das Chromosom des genannten Stammes integriert, die umfaßt
- . ein stromaufwärts gelegenes induzierbares oder konditionelles (konditionierbares) Replikationssystem oder Replikon,
- . eine amplifizierbare Einheit mit der Struktur -D-M-D-, wobei die in direkter Richtung orientierten Sequenzen D die Integration des Gens M in ein nicht-essentielles Gen des genannten Stammes gewährleisten, wobei das Gen M, welches das Strukturgen des genannten Proteins umfaßt, unter der Kontrolle der induzierbaren Elemente zur Expression und gegebenenfalls Sekretion des genannten Proteins bei Bacillus steht, wobei die amplifizierbare Einheit außerdem gegebenenfalls ein selektionierbares Gen umfaßt;
- b) gegebenenfalls die Stämme von Bacillus, die gegebenenfalls durch Kultivierung auf einem dem selektionierbaren Gen entsprechenden Selektionsmedium erhaltenen worden sind, selektioniert; und
- c) die stabilen Stämme, deren Genom der Anwesenheit einer erhöhten Anzahl von Kopien des Gens gegenüber der Bakterienpopulation vor der Selektion entspricht, entnimmt (gewinnt).
- Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Stammes erlaubt die Herstellung eines Stammes zur Hyperproduktion des Proteins, das durch das integrierte heterologe Gen codiert ist, das stabil ist, ohne daß es erforderlich ist, einen Selektionsdruck aufrechtzuerhalten.
- Es wurde in vorteilhafter Weise festgestellt, daß das für die homologe Rekombinationsfunktion codierende Gen in dem Chromosom des genannten Stammes inaktiviert ist und/oder unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht, um eine doppelte Kontrolle der Amplifikation bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Proteinen mit Hilfe des so hergestellten Stammes zu erlauben.
- Es wurde aber außerdem festgestellt, daß man Klone des Bakterienstammes Bacillus bilden kann, die eine stabile amplifizierte Domäne tragen, wenn die Amplifikation ausgelöst wird durch Aktivierung des Replikationsursprungs und anschließend stabilisiert wird durch Blockierung der Expression der homologen Rekombinationsfunktion.
- Dieses Verfahren erlaubt in vorteilhafter Weise die Herstellung von Klonen eines amplifizierten Bakterienstammes, ohne daß die Durchführung einer Selektion erforderlich ist.
- Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Bacillus-Stammes, der insbesondere verwendbar (nützlich) ist in einem Verfahren zur Herstellung von Proteinen und insbesondere in einem Verfahren, wie es oben beschrieben wurde, in dessen Chromosom ein bestimmtes (vorgegebenes) Gen, das für das genannte Protein codiert, integriert und amplifiziert worden ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man:
- a) mindestens eine sogenannte Integrations-DNA-Sequenz in das Chromosom des genannten Stammes integriert, die mindestens umfaßt:
- . ein stromaufwärts gelegenes induzierbares oder konditionierbares Replikon,
- . eine amplifizierbare Einheit mit der Struktur -D-M-D-, wobei die in direkter Richtung ausgerichteten Sequenzen D die Integration des Gens M in ein nicht-essentielles Gen des genannten Stammes gewährleisten, wobei das Gen M, welches das Strukturgen des genannten Proteins umfaßt, unter der Kontrolle von induzierbaren Elementen der Expression und gegebenenfalls Sekretion des genannten Proteins bei Bacillus stehen und die amplifizierbare Einheit außerdem gegebenenfalls ein selektionierbares Gen umfaßt;
- b) gegebenenfalls die Stämme von Bacillus selektioniert, die gegebenenfalls durch Kultivierung auf einem dem selektionierbaren Gen entsprechenden Selektionsmedium erhalten werden;
- c) in einem geeigneten Kulturmedium eine genetische Amplifikation der Aktivierung des Replikons induziert;
- d) die Expression der homologen Rekombinationsfunktion in dem Chromosom des genannten Stammes blockiert; und
- e) die stabilen Stämme, deren Genom der Anwesenheit einer erhöhten Anzahl von Kopien des Gens gegenüber der Bakterienpopulation vor der Selektion entspricht, entnimmt (abtrennt).
- Die Kontrolle der Expression der homologen Erkennungsfunktion in der Stufe (c) erfolgt wie folgt:
- - man unterstellt das Gen, das für die homologe Rekombinationsfunktion codiert, in dem Chromosom des genannten Stammes der Kontrolle eines induzierbaren Promotors, wobei das genannte Gen das native Gen oder das heterologe Gen sein kann, wenn das native Gen inaktiviert worden ist, wobei man in diesem Falle in der Stufe (c) auch die Aktivierung des genannten Promotors des Gens, das für die Rekombinationsfunktion codiert, induziert und in der Stufe (d) die Induktion der Aktivierung des Promotors unterbricht, oder
- - man transformiert den genannten Stamm mit einem mutierten Gen recE, wobei das native Gen recE durch Substitution des Gens, insbesondere durch die Chromosomen-DNA des Stammes SBEK und Selektion der gegen Kanamycin resistenten Transformanden eliminiert worden ist.
- Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines bestimmten (vorgegebenen) Proteins, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen nach dem obigen Verfahren amplifizierten Stamm, in dem das bestimmte (vorgegebene) Gen für das genannte Protein codiert, in einem bestimmten Kulturmedium kultiviert und anschließend das exprimierte und gegebenenfalls sekretierte Protein gewinnt (abtrennt).
- In den erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Stämmen oder zur Herstellung von Proteinen stammt das Replikationssystem vorzugsweise aus einem Bakterien-Plasmid, obgleich dies nicht unerläßlich ist. Das Replikationssystem oder der Replikationsursprung ist in der Nähe, vorzugsweise in einem Abstand von weniger als 50 kb, von der Duplikation angeordnet und auf diese ausgerichtet. Es sei bemerkt, daß der Replikationsursprung nicht Teil der amplifizierten Sequenzen ist.
- Als konditionierbares (konditionelles) oder induzierbares Replikon kann ein wärmeempfindliches Replikon, wie z.B. das Plasmid pE194, verwendet werden, dessen Replikation natürlich wärmeempfindlich aktiv ist bei 37ºC und inaktiviert wird bei 51ºC.
- Die amplifizierbare Einheit liegt bei Bacillus zwischen nicht-replikativen Sequenzen, vorzugsweise stammt sie aus einem Bakterien-Plasmid, obgleich das nicht mehr unerläßlich ist. Insbesondere können die Sequenzen D aus dem Plasmid pBR322 stammen.
- Allgemein ist das selektionierbare Gen ein Gen mit einer Beständigkeit (Resistenz) gegen eine chemische Verbindung, insbesondere gegen ein Antibiotikum, wie z.B. Kanamycin oder Chloramphenicol.
- Unter diesen Bedingungen ist die Selektion des Stammes leicht, da es genügt, einen gegenüber dem Antibiotikum sehr resistenten Stamm zu selektionieren.
- Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man einen hyperproduktiven Stamm für das Protein erhalten, das durch das integrierte heterologe Gen codiert wird, das stabil ist, ohne daß es erforderlich ist, einen Selektionsdruck aufrechtzuerhalten.
- Als Bakterienstämme des Genus Bacillus, die erfindungsgemäß verwendet werden können, können insbesondere genannt werden:
- - Bacillus subtilis
- - Bacillus alcalophilus
- - Bacillus brevis
- - Bacillus circulans
- - Bacillus lentus
- - Bacillus licheniformis
- - Bacillus macerans
- - Bacillus megaterium
- - Bacillus polymyxa
- - Bacillus pumilus
- - Bacillus stearothermophilus
- - Bacillus coagulans
- Integrative Vektoren wurden konstruiert mit dem Ziel, fremde Gene (Fremdgene) in das Chromosom von Bacillus zu integrieren. Diese Vektoren sind im wesentlichen charakterisiert durch die Anwesenheit von homologen Segmenten des Chromosoms von Bacillus, welche die Integration gewährleistet. In der Technik sind diese Vektoren in ihren Prinzipien und ihren Ausführungsformen bekannt.
- Insbesondere in FR 8406701 (2 563 533) ist es erforderlich, daß zur Durchführung der Integration der Vektor eine DNA-Sequenz aufweist, die identisch ist mit derjenigen des Chromosoms des Bacillus-Stammes. In bestimmten Fällen verwendet man Vektoren, die Fragmente des Chromosoms von Wild-Bacillus, beispielsweise des gesamten oder eines Teil des Gens thy B oder Gens, das als X bezeichnet wird, trägt.
- Es ist auch möglich, in das Chromosom zuerst eine bestimmte (vorgegebene) Sequenz zu integrieren, die beispielsweise aus einem Bakterien-Plasmid wie pBR322 stammt, wobei es in diesem Falle ausreicht, anschließend einen Integrations-Vektor zu verwenden, der die gleiche Sequenz trägt.
- Im Falle von Bacillus subtilis werden das Replikationssystem und die amplifizierbare Einheit -D-M-D- zweckmäßig zwischen die Sequenzen thy B und x von Bacillus subtilis anstelle des Gens ilvA des genannten Stammes integriert.
- Bei einer speziellen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren bestehen die Elemente zur Expression und Sekretion des Gens, das für das genannte Protein codiert, aus dem durch Saccharose induzierbaren Promotor des Gens sacB, der von der Region sacR begleitet ist.
- Vorzugsweise verwendet man einen Teil des Lokus sacRB von Bacillus subtilis, die enthält
- 1) den Lokus sacB, der den Promotor und die Regulationsregion des Gens sacB enthält, und
- 2) die Region von sacB, welche die Signalsequenz der Lävan-Saccharase codiert.
- Insbesondere wurde das Gen celA von Clostridium thermocellum, das für die Endoglucanase A codiert, integriert. Die Endoglucanase A wurde als Protein-Modell gewählt, um die Wirksamkeit des Systems zu testen. Dieses Protein wurde gewählt wegen seiner Größe und seiner enzymatischen Aktivität, die leicht nachweisbar sind.
- Vorzugsweise verwendet man einen Stamm von Bacillus subtilis, der die Mutation sacUh aufweist, welche die Bildung von Lävan-Saccharase begünstigt.
- Es wurde festgestellt, daß die Expression der amplifizierten Gene und die Sekretion des Proteins viel stärker sind, wenn die Kultur in die stationäre Phase gelangt, d.h. bis zu 24 h nach Induktion der Gen-Amplifikation bei 37ºC.
- So führt das Gen celA, das unter der Kontrolle von Expressions- und Sekretions-Signalen des "Systems sacB" bei Bacillus subtilis steht, zu einer Hyperproduktion von EGA nach der Induktion der Expression durch Saccharose und dies auf einem besonders hohen Niveau in einem genetischen Kontext sacUh. Nach der Induktion der Gen-Amplifikation durch Replikation von pE194 und nach der Induktion der Expression von celA durch Saccharose enthielt der Überstand der so erhaltenen Bacillus subtilis-Kulturen das Produkt des Gens celA, das als Endoglucanase A bezeichnete Protein, das die Hauptmenge in dem Überstand (mehr als 90 % der Proteine) darstellte. Seine Konzentration wurde abgeschätzt zu etwa 10 mg/l pro optischer Dichteeinheit, d.h. sie war etwa 10-mal höher als die Ausbeute, die erhalten wurde, wenn die Klonierung von celA auf einem Multikopie- Plasmid wie pC194 durchgeführt wurde. Die Analyse der NH&sub2;- terminalen Sequenz des Proteins zeigte, daß dieses bei seiner Sekretion korrekt ausgereift war. Schließlich zeigte ein enzymatischer Aktivitätstest, daß das sekretierte Protein aktiv war.
- Ein von celA verschiedenes Gen konnte ebenfalls nach dem gleichen Verfahren amplifiziert werden. Es handelt sich dabei um CAT. Sein Produkt, die Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) ist intracellulär. Nach einer Überamplifikation (von 12 U/mg auf 900 U/mg) wurde eine Erhöhung von CAT auf das 90-fache in den Rohextrakten festgestellt. Das Verfahren erlaubt somit die Überproduktion von intracellulären Proteinen auf ebenso wirksame Weise wie von sekretierten Proteinen in dem Überstand.
- Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Bacillus- Stämme, insbesondere Bacillus subtilis, die durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung des Stammes, insbesondere des Stammes AP551, wie in der Fig. 9 dargestellt, erhalten werden.
- Weitere Charakteristika der vorliegenden Erfindung gehen aus den nachfolgenden Beispielen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen hervor.
- Die Fig. 1 repräsentiert die Tabelle 1 des Beispiels 1, in der die verwendeten Stämme und Plasmide aufgezählt sind.
- Die Fig. 2 repräsentiert die Tabelle, in der die CMC- ase-Aktivitäts-Ergebnisse in Kulturüberständen von verschiedenen transformierten Stämmen von Bacillus subtilis (Beispiel 1) angegeben sind.
- Die Fig. 3 repräsentiert die Konstruktion von pGJ1. Die fetten Linien repräsentieren die DNA-Fragmente von pBS430. Die schraffierten Rechtecke repräsentieren die das Gen celA codierenden Regionen. Die leeren Rechtecke repräsentieren die Regionen von pCT105, die das Gen celA flankieren. Die Pfeile geben die Richtung der Transkription der Gene an.
- Die Fig. 4 repräsentiert die Expression des Gens celA des Plasmids pGJ2 in verschiedenen Bacillus subtilis-Stämmen. Die fett gezeichnete Kurve repräsentiert das Bakterien-Wachstum. Die Symbole entsprechen der spezifischen CMC-ase-Aktivität, wenn die Wirts-Stämme waren: o sacUh; ΔsacSh; sacSc; Wild-Typ. Die spezifische Aktivität wurde errechnet pro mg Protein wie die CMC-ase-Aktivität. Die Protein-Konzentration wurde in Korrelation gesetzt zur Extinktion der Zell-Kultur, wobei eine optische Dichteeinheit bei 660 nm 250 ug Bakterien-Protein pro ml entspricht.
- Die Fig. 5 repräsentiert die Fusion der Region, welche die reife Sequenz von EGA codiert, mit der Region, welche die Signal-Sequenz von Lvs codiert, durch gerichtete Mutagenese. DGF3 ist der Mutagenese-Auslöser. Die deletierte Sequenz von PGJ3 (Fig. 6) ist in Form einer Haarspange dargestellt.
- Die Fig. 6 repräsentiert die Konstruktion von pGJ3. Die verwendeten Symbole sind die gleichen wie in Fig. 1. DGF3 entspricht dem Mutagenese-Auslöser und SEL1 entspricht dem Selektions-Auslöser.
- Die Fig. 7 repräsentiert die Elektrophorese auf SDS- Polyacrylamid-Gel. Aliquote Anteile (25 ul) des Überstandes von Bacillus subtilis QB136 nach der Kultivierung in der logarithmischen Phase, konzentriert auf das 25-fache auf einer Amicon-Membran, wurden auf ein 10 %iges Polyacrylamid-Gel aufgebracht. In der Figur sind die Densitometer-Bahnen dargestellt des mit Coomassie blaugefärbten Gels: a, QB136; b, QB136 (pGJ2); c, Molekulargewichtsreferenz-Marker, Phosphorylase b (94 kdal), Rinderserumalbumin (67 kdal), Lävan-Saccharase (50 kdal), Ovalbumin (43 kdal) und Kohlensäureanhydrase (30 kdal).
- Die Fig. 8 repräsentiert die Tabelle 3 des Beispiels 2, in der die verwendeten Stämme und Plasmide aufgezählt sind.
- a: die genetischen Modifikationen, die auf die Insertion von Plasmiden in das Chromosom von Bacillus subtilis zurückzuführen sind, sind die folgenden:
- 1) ins, gefolgt von einem "Plasmid", dargestellt durch das inserierte Plasmid;
- 2) del oder dup, gefolgt von dem "Gen oder der Sequenz", die Deletionen bzw. Duplikationen repräsentieren, die resultieren aus der Insertion des Plasmids;
- 3) pBR322Δ81 repräsentiert Sequenzen von pBR322, die in pHV33Δ81 vorhanden sind. Der Phänotyp sacUh führt zur Hyperproduktion von Lvs. CMC repräsentiert die Fähigkeit eines Stammes, die Carboxymethylcellulose zu hydrolysieren.
- Die Fig. 9 repräsentiert die Konstruktion der Stämme APO und AP551. Die verwendeten Symbole haben die folgenden Bedeutungen:
- : ein Gen, das gegenüber Chloramphenicol resistent ist Cmr
- : ein Fusions-Gen celA, das den Promotor des Gens der Lävan-Saccharase von Bacillus subtilis und die für ihre Signal-Sequenz codierende Region enthält, die in Lese-Phase fusioniert ist mit der Sequenz, welche die reife Sequenz der Endoglucanase A von C. thermocellum codiert;
- : die Sequenzen pBR322 von 3,9 kbp
- : das Plasmid pE194, welches das gegen Erythromcycin resistente Gen Emr trägt, wobei der Pfeil die Replikationsrichtung angibt. Die Linien repräsentieren die benachbarten Chromosomen-Sequenzen: X und thy beziehen sich auf ein Chromosomen-Segment mit unbestimmtem genetischem Inhalt bzw. das Chromosomen-Gen thyB. Die Amplifikations-Einheit (AU) ist angegeben. Die zur Charakterisierung der amplifizierten Strukturen verwendeten Restriktionsstellen PvuII und SacI sind angegeben.
- Die Fig. 10 repräsentiert die Gen-Amplifikation in AP551 und AP551i. Die Chromosomen-DNA wurde aus vier Klonen extrahiert, die auf 50 ug/ml Chloramphenicol selektioniert wurden, ausgehend von AP55li (Linie 4), und aus drei Klonen, selektioniert auf die gleiche Weise, ausgehend von AP551, die dann eine Nacht lang bei 37ºC kultiviert wurden (Linie 5). Nach der Restriktion durch PvuII und der Abtrennung durch Elektrophorese wurde in diesen Proben eine fluoreszierende Bande von 8,9 kb nachgewiesen. Sie fehlt bei der Chromosomen-DNA von AP551 vor der Amplifikation (Linie 3) und entspricht der Größe von U.A. (linearisiertes pHV551, Linie 2).
- Linie: Lambda HindIII.
- Die Fig. 11 repräsentiert ein SDS-PAGE, gefolgt von einer Färbung zur Bestimmung der Cellulase-Aktivität. Aliquote Anteile (20 ul) der Überstände der stationären Phase des Stammes sacUh AP551 von Bacillus subtilis, konzentriert auf das 20-fache auf einer Amicon-Membran, wurden auf ein 10 %iges Polyacrylamid-Gel aufgebracht. Spalte A, ein Protein rechts von einer Gruppe von Molekülmassen-Markern: Phosphorylase b (94 kdal), Rinderserumalbumin (67 kdal), Lävan-Saccharase (50 kdal), Ovalbumin (43 kdal), Kohlensäureanhydrase (30 kdal). Spalte b: Aktivität nach Beguin&sup5;².
- Die Fig. 12 repräsentiert die Angaben betreffend das NH&sub2;-terminale Ende von EGA. Die Pfeile zeigen die Spaltungsstellen (Schnittstellen) in dem sekretierten Protein in Bacillus subtilis sacUh AP 551 an. Der Prozentsatz jedes Produkts ist angegeben.
- Die Fig. 13 repräsentiert die kinetische Beziehung zwischen der Gen-Amplifikation und der Expression. Die verwendeten verschiedenen Symbole haben die folgenden Bedeutungen:
- Δ optische Dichte
- Anzahl der Kopien der Amplifikations-Einheit
- spezifische CAT-Aktivität
- spezifische CMC-ase Aktivität.
- Die Fig. 14 repräsentiert die Bildung von EGA und von CAT in einem 20 l-Fermenter.
- Die Fig. 15A und 15B repräsentieren die Amplifikations-Ergebnisse des Beispiels 4.
- Legende zur Fig. 15:
- . A : 24-stündige Exposition
- . B : 48-stündige Exposition
- Verteilung der Vertiefungen:
- . DNAs, extrahiert aus bei 51ºC kultivierten Stämmen
- - Vertiefungen 1, 4, 7: Stamm AP2
- - Vertiefungen 2, 5, 8: Stamm AP rec 4
- - Vertiefungen 3, 6, 9: Stamm AP rec 18
- . DNAs, extrahiert aus 2 h lang bei 37ºC kultivierten Stämmen
- - Vertiefungen 10, 13, 16: Stamm AP2
- - Vertiefungen 11, 14, 17: Stamm AP rec 4
- - Vertiefungen 12, 15, 18: Stamm AP rec 18
- Vertiefung 19: Größenmarker Raoul I
- Molekulargewichte der größten Fragmente
- (kb):
- 19; 15,7; 9,1; 8,0; 5,9; 4,6
- Es wurde ein Wirt-Vektor-System für die induzierbare Sekretion während der logarithmischen Wachstumsphase in Bacillus subtilis entwickelt. Es wurden der Promotor des Gens der Lävan-Saccharase von Bacillus subtilis und die Region, die seine Signal-Sequenz codiert, verwendet. Die Endoglucanase A von Clostridium thermocellum wurde als Protein-Modell zum Testen der Wirksamkeit des Systems verwendet. Es wurde eine wirksame induzierbare Sekretion von Endoglucanase A festgestellt bei Verwendung entweder der Signal-Sequenz der Lävan-Saccharase oder seiner geeigneten Signal-Sequenz.
- Es wurden verschiedene heterologe Proteine in Bacillus subtilis sekretiert und bei den meisten entwickelten Sekretions-Vektoren wurde das Sekretions-System von α- Amylase 28,29,31 verwendet, obgleich vor kurzem Exportationssysteme von Proteasen verwendet wurden 14,15,29,36,38. Ausgehend von diesen Systemen tritt jedoch die Expression während der stationären Phase auf, wenn die meisten der von Bacillus subtilis sekretierten Enzyme einschließlich der Haupt-Proteasen sekretiert werden. Es wird ein Sekretionsvektor auf der Basis des Systems Lävan-Saccharase von Bacillus subtilis hier beschrieben, der während der logarithmischen Wachstumsphase aktiv ist. Die Lävan-Saccharase wird codiert durch das Gen sacB und exprimiert, ausgehend von einem durch Saccharose stark induzierbaren Promotor, der in der Nähe der Stelle sacR angeordnet ist. Die Kontrolle seiner Expression wurde gründlich untersucht 12,34 und es stehen mehrere Regulations- Mutanten zur Verfügung: sacQh, sacSh, sacUh 20,21.
- Die extracelluläre Endoglucanase A (EGA; 1,4-ß-D-Glucan-glucanohydrolase EC 3.2.1.4) des anaeroben thermophilen Bakteriums Clostridium thermocellum, die durch das Gen celA codiert wurde, wurde als Protein-Modell zum Testen der Wirksamkeit des Sekretions-Systems sacB in Bacillus subtilis verwendet. Dieses Protein wurde wegen seiner Größe, die geeignet ist ²³, und seiner enzymatischen Aktivität, die auf einer Petri-Schale direkt leicht nachweisbar ist ¹&sup0;, ausgewählt. Außerdem wurde die EGA charakterisiert und gereinigt 23,32 und die DNA-Sequenz &sup5; seines Gens und die Initiierungs-Stellen der Transkription &sup7; sind bekannt. Das errechnete Molekulargewicht der reifen Sequenz von EGA beträgt 49 125, auf dem SDS-Polyacrylamid- Gel der überstehenden Kulturflüssigkeit von C. thermocellum erscheint jedoch eine Bande von 56 000, die auf eine Glycosylierung zurückzuführen ist &sup5;. Diese Faktoren erleichtern die Verwendung dieses Proteins als Modell für die heterologe Sekretion in Bacillus subtilis.
- Es wurde gezeigt, daß Bacillus subtilis in dem Kulturmedium nach der Transformation mit Hybrid-Plasmiden nach der Induktion durch Saccharose auf enzymatischem Wege aktive EGA sekretieren kann. Außerdem wurde die Wirksamkeit der Signal-Sequenzen der Lävan-Saccharase und von EGA miteinander verglichen, wenn sie mit dem Strukturgen von EGA fusioniert sind.
- Die verwendeten Stämme und Plasmide sind in der Tabelle 1 der Fig. 1 aufgezählt. Der Phage M13mp18-am4 wurde für die gerichtete Mutagenese verwendet. Für das Wachstum von E. coli wurde das Nährmedium Luria ²² verwendet, ergänzt durch Ampicillin (Ap) (100 ug/ml), Chloramphenicol (Cm) (10 ug/ml), Kanamycin (Km) (50 ug/ml) oder Tetracyclin (Tc) (10 ug/ml). Für das Wachstum von Bacillus subtilis wurde ein Sporulations-Nährmedium ³&sup0; verwendet, ergänzt durch Cm (5 ug/ml) oder Km (5 ug/ml) für die Selektion und von 2 % (Gew./Vol.) Saccharose für die Induktion des Promotors von sacB. Die Transformation von E. coli wurde gemäß Cohen et al. &sup9; durchgeführt und die Transformation von Bacillus subtilis wurde durchgeführt wie von Anagnostopoulos und Spizizen² beschrieben.
- Als Substrat für EGA wurde Carboxymethylcellulose (CMC) (viskoses Medium Nr. C -4888, der Firma Sigma Co.) verwendet. Der Nachweis der Endoglucanase-Aktivität durch analytische Bestimmung (Dosierung) mit Kongo-Rot auf einer Petri-Schale wurde durchgeführt wie von Cornet et al. ¹&sup0; beschrieben. Die enzymatische Bestimmung (Dosierung) wurde in einem Puffer PC (50 mM K&sub2;HPO&sub4;, 12 mM Citronensäure, pH 6,3) bei 60ºC durchgeführt. Die Carboxymethylcellulose (CMC-ase)-Aktivität wurde nach Beguin et al&sup6; bestimmt.
- Eine Aktivitätseinheit wurde definiert als die Enzymmenge, die 1 umol Glucose-Äquivalent pro min freisetzt. Der Nachweis der Cellulose-Aktivität in Polyacrylamid-Gelen unter Verwendung von Kongorot wurde nach Beguin &sup4; durchgeführt.
- Das angewendete Verfahren wurde beschrieben von Cater et al.&sup8;. Es wurde PGJ3 (Fig. 6) verwendet zur Herstellung einer einsträngigen Matrix, die mit einem Mutagenese-Auslöser DGF3
- und mit einem Selektions-Marker SEL1 (5'
- markiert wurde, die verwendet wurde zur Reversion der "Amber"-Mutation, die in einem der essentiellen Gene des Phagen M13 mp18-am4 vorhanden ist. Die Transfektion in HB2154-Zellen, die ein Defizit in ihrem Reparatursystem aufweisen, erlaubt die Gewinnung des Einfachstrangs, der die durch DGF3 eingeführte Mutation aufweist. Die 15 5'- Nucleotide des Mutagenese-Auslösers DGF3 sind komplementär zu den ersten 15 Nucleotiden der reifen Sequenz der EGA und die 15 3'-Nucleotide sind komplementär zu den 15 letzten Nucleotiden der Signal-Sequenz der Lävan-Saccharase (Lvs), die in pAE101¹¹ enthalten ist. Die Mutanten, die eine Fusion in der Lese-Phase zwischen der Signal-Sequenz Lvs und der reifen Sequenz von EGA enthalten, wurden nach einer scharfen Wäsche stark hybridisiert mit DGF3. Die einer Deletion der 19 Nucleotide der Signal-Sequenz von EGA entsprechende Mutation wurde nachgewiesen durch Sequenzierung mit Didesoxynucleotid²&sup7; unter Verwendung des synthetischen Auslösers DGF4
- der sich stromabwärts mit der deletierten Region hybridisiert.
- Die Region sacRB wurde durch Rekombination deletiert. Das Plasmid pBS413¹ enthält die Region sacRB auf benachbarten HindIII-Fragmenten. Das Plasmid wurde mit ClaI linearisiert, das in das Gen sacB einschneidet, und mit der Exonuclease Bal31 behandelt, um die vollständige Region sacRB zu deletieren. Das Fragment wurde anschließend mit dem Gen aphA3 von Streptococcus faecalis ligiert unter Bildung von pAE119, das in Bacillus subtilis nicht mehr replikativ ist. Das verwendete Gen aphA3 ist in einem Fragment ClaI von 1,5 kbp von pAT21 eingeschlossen ³&sup5;.
- Es wurde eine Konstruktion für die Expression von EGA hergestellt durch Schaffung einer Ligatur zu drei Fragmenten zwischen (a) dem Vektor pUC8, geschnitten mit BamHI und HindIII, (b) BamHI-RsaI von 440 bp der Region sacR, die den Promotor von sacB enthält, und seiner Regulationsregion, die aus pBS430 stammt 3,7, und (c) einem Fragment DraI-HindIII von 2,2 kbp des Plasmids pCT105¹&sup0;, welches die Ribosomen-Fixierungsstelle, die EGA codierende Region (Signal-Sequenz und reife Sequenz&sup5;) und die Terminierungsstelle des Gens&sup7; enthält (Fig. 3).
- Die gesuchte Konstruktion pGJI wurde in Form eines Transformanden Apr von E. coli isoliert, der den Phänotyp CMC&spplus; in dem Test auf der Petrischale darstellt ¹&sup0;. Um die Sekretion der EGA in Bacillus subtilis zu testen, wurde pC 194¹&sup6;, ein Plasmid von 2,91 bp, das einen funktionellen Replikationsursprung von Bacillus subtilis und ein Gen mit einer Resistenz gegen ein Antibiotikum (Cm) aufwies, an der Stelle HindIII mit pGJ1 ligiert. Das resultierende Plasmid pGJ2 wurde in verschiedene Stämme von Bacillus subtilis eingeführt: 168 (Wild-Typ), sacSc, sacSh und sacUh (Fig. 1). Die Transformanden Cmr von Bacillus subtilis, die das Gen celA von C. thermocellum auf dem Multikopie-Plasmid pC194 tragen, wurden durch die verbreiterten Zonen der Hydrolyse von CMC nach der Induktion durch Saccharose identifiziert. Die Größe der Höfe (Halos) variiert jedoch je nach Wirts-Stamm. Die Endoglucanase-Gehalte der flüssigen Kulturüberstände zeigten eine durch die Saccharose induzierbare Sekretion von EGA (Fig. 4, Fig. 2). Diese Ergebnisse zeigen an, daß die Regulierung-der Expression des Gens celA die gleiche ist wie diejenige des Gens sacB. Es wurde keine Expression des Gens celA in Abwesenheit von Saccharose in den induzierbaren Stämmen nachgewiesen. Der höchste Werte für die Sekretion von EGA wurde erhalten mit der Mutanten sacUh, die auch die Lävan- Saccharase übermäßig stark sekretiert unter Bildung einer um etwa 100-mal höheren Menge dieses Enzyms als Zellen vom Wild-Typ. Die Sekretion von EGA in einem Stamm sacUh ist nur etwa 10 mal höher als diejenige in einem Wild-Stamm, der die gleiche Konstruktion hat. Die Expression des Gens stammt jedoch aus einem Multikopie-Plasmid. Die Expression in einem Stamm sacUh von sacB auf einem Multikopie-Plasmid ist jedoch nur 5- bis 10-mal höher als diejenige, die in einer Mutanten sacU+ erzielt wird. Bacillus subtilis weist eine endogene ß-1,4-Endoglucanase-Aktivität auf ²&sup5;. In einem Stamm von Bacillus subtilis sacUh (pGJ2), der eine stärkere endogene Aktivität aufweist als der Stamm vom Wild-Typ, stellt diese Aktivität jedoch nur etwa 2 % der CMC-ase-Aktivität dar.
- Die Endoglucanase-Gehalte haben gezeigt, daß die Zellextrakte des Stammes sacUh (pGJ2) etwa 20 % der gesamten EGA-Aktivität enthalten, was anzeigt, daß der größte Teil der EGA in dem Medium sekretiert worden war (80 %).
- Die Region der DNA, welche die Signal-Sequenz der Lävan-Saccharase codiert und sacR trägt, wurde mit der Region fusioniert, welche die reife Sequenz der EGA codiert, durch gerichtete Mutagenese in dem Vektor M13&sup8; (Fig. 5). Der Vektor M13mp18-am4&sup8;, der eine "Amber"-Mutation in einem essentiellen Gen des Phagen aufweist, wurde mit BamHI und HindIII geschnitten und ligiert mit (a) einem Fragment BamHI-NaeI von 0,55 kbp des Plasmids pAE101¹¹, das sacR und die Signal-Sequenz der Lävan-Saccharase trägt, (b) einem Fragment NaeI-HindIII von 2,14 kbp des Plasmids pCT105¹&sup0;, welches die DNA enthält, welche die reife Sequenz EGA und 19 Nucleotide der Signal-Sequenz von EVA codiert (Fig. 6). Das resultierende Plasmid wurde als pGJ3 bezeichnet. Die 19 Nucleotide, die zu der Signal-Sequenz von EGA gehören, wurden aus pGJ3 deletiert und die Konstruktionen, welche die gesuchte Sequenz enthielten, wurden als pGJ4 bezeichnet. Die Plasmide enthielten jedoch eine Insertion von etwa 0,9 kbp in M13mp18 anstelle der erwarteten 2,7 kbp, entsprechend einer Deletion von etwa 1,9 kbp in der 3'-Region des Inserts. Dies wurde bestätigt durch Sequenzierung mit einem universellen Marker. Es wurde das vollständige Fusionsgen wieder hergestellt. Die drei Fragmente (a) 0,58 kbp des Fragments BamHI-AvaII von pGJ4, welche die Fusion in Phase mit der Signal-Sequenz von Lvs und der reifen Sequenz von EGA enthielten, (b) das partielle Fragment AvaII-HindIII von 2,09 kbp von pCT105 (Fig. 3) und (c) der Vektor pUC8, geschnitten mit BamHI- HindIII, wurden miteinander ligiert. Das resultierende Plasmid, welches die Fusion sacB-celA enthielt, wurde als pGJ5 bezeichnet.
- Um die Sekretion von EGA durch Bacillus subtilis mit dieser Fusion zu testen, wurde das Plasmid pC194 mit der Stelle HindIII von pGJ5 ligiert. Das resultierende Plasmid pGJ6 wurde in Bacillus subtilis sacUh (QB136) eingeführt. Alle getesteten Transformanden Cmr wiesen einen durch Saccharose induzierbaren Phänotyp CMC+ auf. Der Überstand von 1 Klon wurde in bezug auf seine Aktivität auf CMC nach der Induktion mit Saccharose analysiert und der Wert der Aktivität in dem Überstand war der gleiche wie derjenige von QB136 (pGJ2). Diese Ergebnisse zeigen, daß die Signal-Sequenzen von Lvs und EGA gleichermaßen wirksam sind in bezug auf die Sekretion in Bacillus subtilis.
- Die Analyse der Überstände von Bacillus subtilis QB 136, induziert durch Saccharose, das pGJ2 und pGJ6 trägt, durch SDS-Polyacrylamid-Gel hat eine Protein-Bande mit einer Molekularmasse von 46 000 gezeigt, die in den Kontrollen nicht nachgewiesen wurde (Fig. 7). Diese Bande besitzt eine CMC-ase-Aktivität durch Transfer auf Agarose-Gel, das CMC enthält &sup4;. Die Molekularmasse des Proteins, die dieser Bande entspricht, stimmt überein mit der errechneten Molekularmasse der reifen Sequenz EGA 49125, die aus der Nucleotid-Sequenz abgeleitet werden kann &sup5;. Die Stämme QB 136 und QB 136 (pGJ2) wurden mit Saccharose induziert und die Überstände wurden auf ihre Aktivität Lvs analysiert. Die nicht-transformierten Stämme liefern einen dreimal höhere Lvs-Aktivität als die Stämme, die pGJ2 tragen. Dieses Ergebnis stimmt überein mit den Densitometerkurven der mit Coomassie-Blau gefärbten Polyacrylamid-Gele (Fig. 7) und scheint eine Konkurrenz zwischen dem Gen sacB und dem heterologen Gen sacB/celA in bezug auf die Expression oder Sekretion (oder beide) anzuzeigen.
- Um zu testen, ob die Expression von sacB aus dem Chromosomen-Gen eine Überproduktion von celA stört, wurde die Region sacRB aus dem Chromosom der Wirts-Stämme deletiert. Zu diesem Zweck wurden die Wirts-Stämme mit pAE119 transformiert (vgl. Materialien und Verfahren) und die Transformanden Kmr wurde selektioniert. Bei mehr als 98 % der Transformanden war die Region sacRB ersetzt durch aphA3 durch ein Doppel-Crossing over. Das Plasmid pGJ2 wurde in Bacillus subtilis QB671 eingeführt, in dem die Region sacRB wie vorstehend bechrieben deletiert worden war. QB671 ist isogen mi QB90720, jedoch mit der Ausnahme, daß es sich handelt um sacA+ (die Saccharose inhibiert das Wachstum in den Stämmen sacA&supmin;-sacB-). Die Stämme QB671 (pGJ2) und QB671 ΔsacRB (pGJ2) wurden in geeigneten Medien wachsen gelassen und mit Saccharose induziert. Die CMC- ase-Aktivitäten der Überstände wurden analytisch bestimmt und es war nicht möglich, sie voneinander zu unterscheiden.
- Das heterologe Protein EGA von C. thermocellum wird exprimiert und sekretiert, ausgehend von Bacillus sübtilis, unter Verwendung des Promotors sacB nach der Induktion durch Saccharose. Die Sekretion von EGA tritt auf während der logarithmischen WAchstumsphase und reichert sich in dem Medium an. Die Konzentration an EGA ist während der stationären Phase größer, was anzeigt, daß das Protein in einer stabilen Form sekretiert wird. Eine Sekretion wird erhalten unter Verwendung entweder der Signal-Sequenz Lvs oder seiner geeigneten Signal-Sequenz. Die Analyse dieser beiden Signal-Sequenzen zeigt keinen signifikanten Unterschied gegenüber Signal-Sequenzen, die typisch sind für grampositive Bakterien. Die Expression des Enzyms in unterschiedlichen genetischen Umgebungen von Bacillus subti lis (sacSc, sacSh, sacUh) zeigte, daß ihre Regulierung wie diejenige des Gens sacB war und man findet eine starke enzymatische Aktivität in dem Kulturüberstand eines Stammes sacUh von Bacillus subtilis. Die Größe des Proteins (etwa 46 Kilodalton) stimmt mit dem Molekulargewicht überein, das von der reifen Protein-Sequenz abgeleitet wurde.
- Der Sekretions-Wert von Lvs nimmt ab, wenn das Gen celA exprimiert wird, ausgehend von dem Promotor sacB auf dem Multikopie-Vektor pC194, was auf eine Konkurrenz zwischen dem homologen System und dem heterologen System in bezug auf die Expression oder Sekretion (oder beide) hinzudeuten scheint. In einem Stamm ΔsacRB ist jedoch der Wert für die sekretierte EGA nicht erhöht. Man kann infolgedessen annehmen, daß die Anwesenheit einer einzigen Kopie des Gens sacB auf dem Chromosom nicht in signifikanter Weise in Konkurrenz tritt zu der Expression des Gens, ausgehend von dem Promotor sacB auf einem Multikopie-Plasmid.
- Die EGA-Aktivität in dem Überstand eines Stammes sacUh betrug 0,8 U/ml. Da die spezifische Aktivität von gereinigter EGA 140 U/mg beträgt ²&sup4;, entspricht dies einer Protein-Konzentration von etwa 1 mg/l/Einheit DO&sub6;&sub6;&sub0;. Dieser Wert ist vorteilhaft im Vergleich zu demjenigen, der für die Produktion von EGA in C. thermocellum und E. coli erhalten wird ¹&sup0;.
- Das DNA-Fragment, das den Promotor des Gens der Lävan-Saccharase (Lvs) von Bacillus subtilis und die seine Signalsequenz codierende Region enthält, fusioniert in Phase mit der Sequenz, welche die reife Sequenz von Endonuclease A von Clostridium thermocellum codiert, wurde in eine spezifische Stelle des Chromosoms von Bacillus subtilis eingeführt und amplifiziert. Die durch die Replikation des wärmeempfindlichen Plasmids pE194 induzierte DNA-Amplifikation erlaubte die Erhöhung der Anzahl der Kopien des Gens bis auf 250 Kopien pro Chromosom. Diese DNA-Amplifikation führte zu der Synthese und der Sekretion von aktiver Endoglucanase A in Bacillus subtilis. Das sekretierte heterologo Protein stellt das Hauptprotein des Kulturüberstandes des Stammes Bacillus subtilis sacUh dar. Die NH&sub2;-terminale Sequenz hat drei unterschiedliche Schnittstellen (Spaltungsstellen) in der Nähe der Erkennungssequenz des Peptidase-Signals gezeigt. Es scheint, daß die Anzahl der Kopien des Gens kein begrenzender Faktor für die Expression von heterologen Genen ist.
- In Beispiel 1 wurde die durch Saccharose induzierbare Expression des Gens celA von Clostridium thermocellum in Bacillus subtilis auf dem Multikopie-Vektor pC194 unter Verwendung der Regulations- und Sekretions-Signale der Lävan-Saccharase von Bacillus subtilis beschrieben. Diese Expression wird durch mindestens drei Loki reguliert: sacU, sacS und sacU²¹. Das Protein des Gens celA, die Endoglucanase A, wurde sekretiert und es wurde eine hohe enzymatische Aktivität gefunden in dem Kulturüberstand eines Stammes von Bacillus subtilis sacUh, der durch Saccharose transformiert und induziert wurde (Beispiel 1). Diese Konstruktionen haben eine beträchtliche strukturelle Instabilität gezeigt, die auf das Einfachstrang-Übergangsprodukt von pC194 zurückgeführt werden kann, das während seiner Replikation in Bacillus subtilis gebildet wird &sup4;&sup0;. Diese Instabilität des Plasmids kompliziert die biotechnologischen Entwicklungen und kann vermieden werden durch Einführung der Konstruktionen in das Chromosom, in dem gezeigt wurde, daß die Rekombination tausendmal weniger häufig ist als in Plasmiden &sup4;¹.
- Außerdem dient die Amplifikation eines heterologen Gens in dem Chromosom der Erhöhung der Expression. Es ist bekannt, daß eine Konstruktion in dem Chromosom von Bacillus subtilis, die besteht aus einem genetischen Marker, der direkt von duplizierten Sequenzen umgeben (eingerahmt) ist, zu einer Amplifikation des Markers und einer dieser duplizierten Sequenzen (die somit eine Amplifikations-Einheit darstellen) nach Anwendung eines Selektionsdruckes führen kann &sup4;³&supmin;&sup4;&sup4;. Es kann ein Maximum von 20 bis 50 Kopien von Amplifikationseinheiten pro Chromosom erhalten werden bei Anwendung einer Selektion mit einem antibiotischen Marker &sup4;&sup4;. Die Amplifikation des Chromosom-Gens in Bacillus subtilis kann durch Induktion der Replikation des benachbarten Plasmids pE194 stimuliert werden, das einen funktionellen Replikationsursprung in dem natürlicherweise wärmeempf indlichen Bacillus subtilis enthält. Diese Amplifikation tritt ohne Selektionsdruck auf und ergibt eine Anzahl von Kopien von Amplifikations-Einheiten von bis zu 250 Kopien pro Chromosom.
- Erfindungsgemäß wurde ein Fragment von 2,7 kbp der DNA des Plasmids pGJ5 (Beispiel 1) in die Amplifikationseinheit inseriert, die in das Chromosom von Bacillus subtilis sacUh eingeführt wurde (bei der CNCM unter der Nummer I-744 hinterlegter Stamm). Dieses DNA-Fragment enthält den Promotor des Gens des Lävan-Saccharase Bacillus subtilis (sacB) und die seine Signal-Sequenz codierende Region, die in Phase fusioniert ist mit der Sequenz, welche die reife Sequenz von EGA von C. thermocellum codiert. Nachstehend wird dieses DNA-Fragment als Fusions-Gen celA bezeichnet. Es wurde festgestellt, daß eine Hypersekretion der EGA mit hohen Gen-Amplifikationswerten erhalten wurde. Die EGA stellt in diesem Falle das von Bacillus subtilis sacUh sekretierte Hauptprotein dar. Die Analyse des NH&sub2;- terminalen Abschnitts der sekretierten EGA hat drei unterschiedliche Schnittstellen in der Nähe der Erkennungssequenz des Peptidase-Signals gezeigt. Es wurden die Amplifikationskinetiken angewendet zur Bestimmung der Anzahl der Kopien der Amplifikations-Einheit Die enzymatische Aktivität der durch die amplifizierte Struktur codierten Proteine hat eine Verzögerung (Verschiebung) zwischen dem Beginn der Amplifikation der Gene und ihrer Expression gezeigt.
- Es wurden zwei Strategien zur Amplifikation der Chromosomen-DNA entwickelt, um die Anzahl der Kopien des Gens in Bacillus subtilis zu erhöhen als Alternative zu Multikopien-Vektoren, die häufig instabil sind.
- Dieser Stamm enthält das gegen Chloramphenicol resistente Gen (Cmr) und das Fusionsgen celA, die von Kopien von pBR322 umgeben (eingerahmt) sind (vgl. den nachstehenden Abschnitt 6. Versuchsprotokoll) (Fig. 9). In diesem Stamm ist der Replikationsursprung von pE194 inaktiv wie das "i" anzeigt, das auf die Bezeichnung des Stammes folgt. Die Struktur ist in die Region thyB des Chromosoms von Bacillus subti lis sacUh45 integriert. Duplikationen dieses Typs bilden amplifizierte Strukturen, jedoch mit geringer Frequenz. Die amplifizierten Klone können selektioniert werden &sup4;&sup4;. Zellen von AP551i wurden auf Chloramphenicol ausgestrichen (ausgebreitet), um die amplifizierten Zellen zu selektionieren und die resistenten Zellen wurden isoliert (1 auf 10&sup5;). Die Chromosomen-DNA von vier selektionierten Klonen wurde analysiert und es wurde festgestellt, daß sie 20 bis 30 Kopien der Amplifikationseinheit enthielt, wie durch Elektrophorese auf einem Gel nach der Hydrolyse mit PvuII sichtbar gemacht wurde (Fig 10). Dieses Restriktionsenzym schneidet (spaltet) die Amplifikationseinheit einmal, was zu einer stark fluoreszierenden Bande von 8,9 kbp führt, die sich von anderen schwach fluoreszierenden Banden in jeder amplifizierten DNA unterscheidet und die in dem Elternstamm fehlt. Die Expression des amplifizierten Gens celA wurde nach der Induktion mit Saccharose analytisch bestimmt. Die Intensität der Amplifikationsbande (vgl. das Versuchsprotokoll) (Fig. 10) der getesteten Klone wurde in Korrelation gesetzt zu den Größen der Höfe, die aus der Hydrolyse der CMC (vgl. das Versuchsprotokoll) um die Kolonien herum entstanden, sichtbar gemacht durch den Test mit Kongorot auf einer Petrischale. Die Stabilität der Klone wurde in dem flüssigen Medium in Gegenwart von Saccharose mit und ohne Selektionsdruck (Cm) analysiert. Die CMC-ase-Aktivitäten der Überstände wurden bestimmt und sie waren unklar für jedes Isolat in Gegenwart oder in Abwesenheit von Cm, was die Stabilität der Amplifikation bestätigte &sup4;&sup4;. Die EGA-Aktivität in dem Überstand der Klone, welche die größte Anzahl von Kopien der Amplifikationseinheit repräsentierten, betrug 0,8 U/ml.
- Dieser Stamm ist isogen mit dem Stamm AP551i mit Ausnahme der Tatsache, daß er eine funktionelle Kopie des Plasmids pE194 in dem Chromosom enthält &sup4;&sup6;. Die Orientierung von pE194 in AP 551 ist so, daß seine Replikation, die in einer Richtung verläuft &sup4;&sup7;, in Richtung auf die Duplikation fortschreitet (Fig. 9). Wenn die Replikation von pE194 bei 37ºC aktiv ist, stellt man fest, daß die Amplifikation der DNA der Amplifikationseinheit induziert wird. Um die Anzahl der Kopien der Gene celA zu erhöhen, wurde die Amplifikation des Stammes AP551 in zwei Stufen durchgeführt. In der ersten Stufe wurden Stämme AP551 isoliert, die etwa 20 Kopien der Amplifikationseinheit enthielten, die durch Selektion erhalten wurde, wie oben für AP551i beschrieben. Diese Stufe wurde bei 51ºC, einer Temperatur durchgeführt, bei der das Replikon pE194 inaktiv ist. In der zweiten Stufe wurden diese Isolate in dem flüssigen Medium bei 37ºC ohne Antibiotikum in Gegenwart von Saccharose inkubiert. Bei dieser Temperatur ist das Replikon pE194 aktiv und eine Amplifikation der DNA wird induziert. Nach 25 Stunden ist ein Mittelwert von 250 Kopien der Amplifikationseinheit pro Chromosom festzustellen. Dies wird durch Elektrophorese der mit PvuII hydrolysierten Chromosomen-DNA auf einem Gel sichtbar gemacht, die eine besonders stark fluoreszierende Bande mit der erwarteten Größe der Amplifikationseinheit zeigt (Fig. 10). Die EGA-Aktivität der Überstände wurde bestimmt und sie betrug etwa 3,6 U/ml für alle getesteten Klone.
- Die Analyse der Kulturüberstände von Stämmen von Bacillus subtilis AP551, die durch Saccharose induziert wurden, durch Elektrophorese auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel (PAGE) zeigte eine Bande eines Hauptproteins mit einer geschätzten Molekularmasse von 46 000 (Fig. 11). Die Molekularmasse dieser Bande stimmt überein mit derjenigen, die aus der reifen Sequenz von EGA errechnet wurde, die 49 125 beträgt, die aus der Nucleotid-Sequenz abgeleitet wurde &sup5;. Diese Bande war aufgetreten wie diejenige von EGA durch Sequenzierung des NH&sub2;-terminalen Endes nach der SDS-PAGE und nach dem Transfer, wie von Matsudaira&sup4;&sup8; beschrieben. Der Transfer des Polyacrylamid-Gels auf ein die CMC enthaltendes Agarosegel zeigte, daß das Protein eine CMC-ase-Aktivität hat (Fig. 11).
- Die Angaben betreffend die NH&sub2;-terminale Sequenz (Fig. 12) zeigen, daß es mehrere Schnittstellen an den NH&sub2;-terminalen Enden des reifen Proteins gibt und daß nur 30 % des Produkts an der genau vorgesehenen Stelle geschnitten werden. Es wurden drei Schnittstellen des Signal-Hauptpeptids nachgewiesen und in allen Fällen lag die Schnittstelle am COOH-terminalen Ende eines Alaninrestes und in der Nähe der Erkennungsstelle der Signal-Peptidase. Die beiden letzten Phenylalanin-Asparagin-Reste der Signal-Sequenz von Lävan-Saccharase sind bei 45 % des Produkts vorhanden. Bei 25 % des Produkts fehlte ein Rest, der vergleichbar war mit der reifen EGA-Sequenz (Fig. 12).
- Die CMC-ase-Aktivität der Kulturüberstände wurde in Korrelation gesetzt zu der spezifischen Aktivität von EGA und die Analyse der Überstände durch SDS-PAGE scheint darauf hinzudeuten, daß die drei Formen des Proteins aktiv sind. Selbst in einer Mutante sacUh, die für ihre Überproduktion der Proteasen bekannt ist , wurde kein CMC-ase- Aktivitätsverlust während einer 25-stündigen Inkubation der Zellen beim Wachstum bis zur stationären Phase festgestellt. Dies zeigt an, daß die EGA gegen proteolytischen Abbau beständig war. Die EGA wird demnach in das Kulturmedium in einer aktiven und stabilen Form sekretiert.
- In dem Stamm AP551 ist das Strukturgen der Lävan-Saccharase sacB vorhanden. Der Kulturüberstand von AP551, der durch Saccharose induziert wurde, wurde durch seine Aktivität an endogener Lävan-Saccharase vor und nach der Amplifikation bestimmt. Die amplifizierten Isolate produzieren eine um mindestens das 20-fache geringere Lävan-Saccharase-Aktivität als die nicht-amplifizierten Isolate. Dies bestätigt die SDS-PAGE-Analyse, die zeigt, daß die Lävan-Saccharase das hauptsächlich sekretierte Protein in den Kontroll-Stämmen ist (nicht dargestelltes Ergebnis), in dem amplifizierten Stamm AP551 jedoch nicht nachgewiesen wurde (Fig. 11). Dies deutet auf einen Konkurrenzeffekt zwischen dem Gen sacB und dem rekombinanten Fusionsgen celA in bezug auf seine Expression oder Sekretion (oder beide) hin.
- Es wurde die Expression der beiden Gene, des Fusionsgens celA und des Gens Cmr, die alle beide in der Amplifikationseinheit enthalten waren, analysiert. Das Gen Cmr codiert für die Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) von pC194, die intracellulär ist &sup4;&sup9;. Man läßt AP551-Zellen in einem Nährmedium, ergänzt durch Saccharose ohne Antibiotikum 25 Stunden lang bei 37ºC, bei der Temperatur, bei der die Amplifikation induziert wird, wachsen. Nach einem Wachstum von 0, 2, 3, 4, 5, 17 und 25 Stunden werden aliquote Anteile entnommen. Der Gehalt an DNA, die CAT- Aktivität in den Zellextrakten und die EGA-Aktivität in den Überständen wurden analysiert. Die Ergebnisse sind in der Fig. 13 dargestellt.
- Die Anzahl der Kopien der Amplifikationseinheit nahm während der ersten fünf Stunden des Wachstums bei 37ºC schnell zu von 25 auf 200 Kopien pro Chromosom. Anschließend wurde der Amplifikationsgrad verlangsamt und nach 25 Stunden wurden im Durchschnitt 250 Kopien pro Chromosom erreicht. Die CAT-Aktivität blieb während der ersten Stunden des Wachstums konstant und nahm anschließend entsprechend der Gesamtzunahme der CAT-Aktivität um einen Faktor 50 zu. Vor der Zunahme der EGA-Aktivität entstand eine Verschiebung von einigen Stunden. Die Gesamterhöhung an EGA-Aktivität betrug das 10-fache.
- Die Expression des Fusions-Gens celA nach der Amplifikation in dem Chromosom von Bacillus subtilis wurde untersucht. Das Fusionsgen celA und das Marker-Gen Cmr wurden in den Bereich thyB des Chromosoms von Bacillus subtilis sacUh eingeführt, das von einer duplizierten Sequenz von 3,9 kbp umgeben (eingerahmt) war. Die Amplifikation wurde in zwei isogenen Stämmen AP551 und AP551i, die durch die Anwesenheit bzw. Abwesenheit eines konditionellen Replikationsursprungs in der Nähe der Duplikation voneinander verschieden waren, durchgeführt. In beiden Fällen wurde eine Amplifikation der Gene um einen Faktor 20 erhalten durch Selektion der gegenüber 50 ug/ml Cm resistenen Klone auf Petri-Schalen. In dem Stamm AP551 erlaubte die Aktivierung des Replikationsursprungs pE194 eine zusätzliche Amplifikation der Gene pro Chromosom, die ohne Selektionsdruck von 20 auf 250 Kopien ging. Die amplifizierte Struktur repräsentiert etwa 50 % des Chromosoms (die Amplifikationseinheit und das Chromosom weisen 9 kbp bzw. 5000 kpb auf). Solche amplifizierten DNA-Werte pro Zelle wurden bei Bacillus subtilis bisher niemals erreicht und sie sind vergleichbar mit dem Amplifikationswert, der bei der Species Streptomyces beobachtet wird &sup5;&sup0;.
- Die höchsten Gen-Amplifikationswerte führen zu den höchsten Expressionswerten an sekretierter EGA. In dem Überstand der amplifizierten Isolate kann die CMC-ase-Aktivität des Enzyms in Korrelation zu ihrer spezifischen Aktivität (140 U/mg) gesetzt werden ²&sup4; und sie entspricht einer Konzentration an Protein von etwa 10 mg/l/Einheit DO660, die 10-fach höher ist als die früher mit der gleichen Genkonstruktion erhaltenen Werte auf einem Multikopien-Plasmid-Vektor (vgl. Beispiel 1). Die Analyse der NH&sub2;-terminalen Sequenz von EGA zeigte drei Schnittstellen und der genaue Schnitt erfolgte in 30 % der Fälle. Alle anderen Formen entsprechen Hydrolysen im Bereich von Alanin, die in der Nähe der Schnittzone vorhanden sind (Fig. 12).
- Es wurden die durch die Replikation von pE194 induzierten Folgen der Amplifikation der DNA auf die Expression des Fusionsgens celA und des Marker-Gens Cmr analysiert. Die Aktivität der beiden Enzyme nimmt während der ersten Amplifikationsstadien langsam zu, was einem logarithmischen Wachstum entspricht. Mit dem Eintritt in die stationäre Phase und der Verlangsamung der Amplifikation nahmen jedoch die Expressionswerte der beiden Gene stark zu. Es schien eine Zeitverzögerung zwischen der Zunahme der Anzahl der Kopien der Gene und der Zunahme der Expression zu bestehen. Es sei darauf hingewiesen, daß die DNA- Amplifikation während der exponentiellen Wachstumsphase stark ist, während die wirksame Expression der amplifizierten Gene während der stationären Phase auftritt. Obgleich es schwierig ist, den Expressionswert der beiden exprimierten Gene miteinander zu vergleichen, ausgehend von verschiedenen Promotoren und angesichts der Tatsache, daß sie unterschiedlichen Regulierungsmechanismen unterliegen, scheinen die Anzahl der Genkopien und die Expressionswerte nicht proportional zueinander zu sein. Außerdem ist die Zunahme der Expressionsaktivität bei beiden Genen nicht ähnlich. Die CAT-Aktivität nimmt innerhalb von 25 Stunden um einen Faktor 50 zu, während die EGA-Aktivität nur um einen Faktor 10 zunimmt, was vermuten läßt, daß andere begrenzende Faktoren die Wirksamkeit des Verfahrens modulieren können.
- Zusammenfassend scheint es, daß eine erfindungsgemäße DNA-Amplifikation eine gute Alternative zu dem klassischen Multikopie-Expression-Vektor ist, insbesondere bei Bacillus subtilis, worin diese häufig instabil sind. Die obengenannten Ergebnisse zeigen, daß es möglich ist, die Anzahl der Kopien von heterologen Genen in Bacillus subti lis auf sehr hohe Werte zu erhöhen und daß die Zellenmaschinerie in der Lage ist, diese zusätzliche DNA zu transkribieren und translatieren. Dieses System erlaubt somit die Amplifikation von heterologen Genen auf Werte, bei denen die Anzahl der Kopien der Gene kein begrenzender Faktor für die Expression dieser Gene ist.
- Diese Plasmide und Stämme sind in der Tabelle 3 (Fig. 8) aufgezählt. Ihre Konstruktionen werden nachstehend beschrieben.
- Für das Wachstum von Escherichia coli wurde ein Nährmedium Luria²², ergänzt durch Ampicillin (Ap) (100 ug/ml) oder Chloramphenicol (Cm) (10 ug/ml), verwendet. Für das Wachstum von Bacillus wurde ein Sporulations-Nährmedium (sporenbildendes Nährmedium) ³&sup0;, ergänzt durch Cm (5-50 ug/ml) oder Erythromycin (0,3 ug/ml), als geeignet verwendet. Die Saccharose wurde den Medien zugesetzt zur Induktion des Promotors sacB in Bacillus subtilis in einer Endkonzentration von 2 % (Gew./Vol.). Die Transformation von E. coli wurde nach Cohen et al.&sup9; durchgeführt und die Transformation von Bacillus subtilis wurde durchgeführt, wie beispielsweise von Anagnostopoulos und J Spizizen² beschrieben.
- Die Carboxymethylcellulose (CMC) (Nr. C-4888 mit mittlerer Viskosität der Firma Sigma Co.) wurde als Substrat für die Bestimmung der EGA-Aktivität Verwendet. Der Nachweis der Endoglucanase-Aktivität durch den Kongorot- Test auf Petri-Schalen wurde durchgeführt wie von Corner et al (10) beschrieben. Die quantitative Bestimmung der EGA erfolgte in einem Puffer PC (50 mM K&sub2;HPO&sub4;, 12 mM Citronensäure, pH 6,3) bei 60ºC. Die Carboxymethylcellulase (CMC-ase)-Ativität wurde nach Beguin et al.&sup6; gemessen Eine Aktivitäts-Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die 1 umol Glucose-Äquivalent pro Minute freisetzt. Die spezifische CMC-ase-Aktivität wurde in Einheiten pro mg Gesamt-Zellprotein ausgedrückt. Der Nachweis der Cellulose-Aktivität in Polyacylamid-Gelen durch Replikation und Färbung mit Kongorot wurde wie von Beguin&sup5;² beschrieben durchgeführt.
- Die Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Aktivität wurde gemessen durch spektrophotometrische Bestimmung, wie von Shaw&sup4;&sup9; beschrieben. Die spezifische CAT-Aktivität wurde ausgedrückt in nmol pro Minute pro mg Protein.
- Der Stamm AP551 wurde in zwei Stufen nach dem Schema der Fig. 9 konstruiert.
- Das Plasmid pHV1220&sup4;&sup7; besteht aus
- - pE194cop6, dem Plasmid von Bacillus subtills, das Resistenz gegenüber Erythromycin (Emr) verleiht. Dieses Plasmid ist Wärmeempfindlich, seine Replikation wird bei 51ºC inaktiviert. Es ist in der Fig. dargestellt durch ein schwarzes Viereck, wobei der Pfeil die Richtung der Replikation angibt,
- - pBR322, von dem keine Sequenz bekannt ist, die bei Bacillus subtilis exprimiert wird. Es ist in der Fig. durch einen großen weißen Pfeil dargestellt,
- - thy und X, zwei verwandte Fragmente, die jedoch nicht benachbart zu dem Chromosom von Bacillus subtilis sind, die im Verhältnis zueinander jeweils in der gleichen Orientierung kloniert sind wie auf dem Chromosom. Thy trägt das Gen thyB, das bei 195º auf der genetischen Karte angeordnet ist. Thy und X sind in der Figur durch eine schwarze Linie dargestellt.
- Nach der Transformation der kompetenten Zellen von SB202 durch pHV1220 wurden die Transformanden auf ihre Resistenz gegenüber Erythromycin bei 51ºC selektioniert. Bei dieser Temperatur war nämlich pHV1220 nicht replikativ, es verhält sich wie ein integrativer Vektor in Bacillus subtilis: dieser Vektor ist in der Lage, in den homologen Regionen thy und X mit dem Bakterien-Chromosom zu rekombinieren. Wenn sich der Vektor durch Doppel-Crossing-over zwischen den jeweiligen Sequenzen "thy" und "x" integriert, tritt eine Deletion des Abschnitts des Chromosoms zwischen den beiden Loki und insbesondere des Gens ilvA auf. In dieser Stufe der Konstruktion wurden nur die Transformanden, die bei einer Integration durch Doppel- Crossing-over erhalten wurden (nachgewiesen durch ihren Phänotyp Ilv&supmin;, 50 % der Gesamtmenge) zurückbehalten. Der so konstruierte Stamm wurde als APO bezeichnet.
- pHV551 ist ein Hyrid-Plasmid, das besteht aus:
- - pBR322,
- - dem gegenüber Chloramphenicol resistenten Gen von pC194 (Cmr),
- - dem Abbau-Gen der Cellulose celA, kloniert unter der Kontrolle des Promotors sacB, der durch Saccharose induzierbar ist. Seine Konstruktion ist in Beispiel 1 beschrieben.
- Im Verlaufe der Transformation von APO durch pHV551 wurde die Chromosomen-DNA eines Stammes sacUh hinzugefügt.
- Die Transformanden wurden selektioniert auf ihre Resistenz gegenüber Chloramphenicol bei 51ºC. Unter den Transformanden wurden diejenigen, die durch Congression die Mutation sacUh erworben hatten, aufrechterhalten. Diese Mutation erlaubt ein höheres Aktivierungsniveau des Promotors sacBh gegenüber dem Wild-Allel.
- Das Plasmid pHV551 wurde durch Ligatur von pHV33Δ81&sup5;³ mit dem Fragment EcoRI-HindIII von 2,8 kbp von pGJ5 (Beispiel 1) erhalten. Das Plasmid pHV33Δ81 besteht aus einem Teil von pBR322 und dem Gen mit Resistenz gegenüber Chloramphenicol von cP193¹&sup6;. Das pHV33Δ81 repliziert sich in Escherichia coli, jedoch nicht in Bacillus subtilis. Das Fragment EcoRI-Hindlll von pGJ5 enthält den Promotor und die Region, welche die Signal-Sequenz von Lävan-Saccharase von Bacillus subtilis codiert, fusioniert in Phase mit der Sequenz, welche die reife Sequenz von EGA von C. thermocellum codiert. Das resultierende Plasmid, als pHV551 bezeichnet, wurde in das Chromosom von Bacillus subtilis, Stamm APO, integriert und durch Transformation und Selektion der Transformanden Cmr wurde der Stamm AP551 erzeugt (Fig. 9).
- pHV551 ist in Bacillus subtilis nicht replikativ. Es verhält sich somit wie ein integrativer Vektor, der in der Lage ist, mit dem Bakterien-Chromosom von APO in der Homologie-Region pBR322 zu rekombinieren. Wenn das Plasmid sich durch einfaches Crossing over integriert, tritt eine Duplikation seiner Homologie-Region pBR322 auf.
- Der resultierende Stamm AP551 umfaßt somit in der Region thyB seines Chromosoms:
- - das Plasmid pE194 cop6, dessen Replikation bei 51ºC inaktiviert wird und bei 37ºC funktionell ist,
- - die Gene celA und Cmr, die von einer Duplikation von 3,9 kb der Sequenzen von pBR322 umgeben (eingerahmt) sind. Diese Duplikation begrenzt die Amplifikations-Einheit (A.U.), die besteht aus einer der wiederholten Sequenzen und zwei Markern celA und Cmr. Diese Amplifikationseinheit wird in den weiter oben beschriebenen Versuchen bis auf das 250-fache amplifiziert.
- Im einzelnen trägt der Stamm AP551 in der Region thyB seines Chromosoms eine Struktur, die umfaßt: (a) das Plasmid pE194 cop-6 (nachstehend als pE194 bezeichnet), das von Natur aus wärmeempfindlich ist, die Replikation&sup4;&sup6;; (b) eine duplizierte Sequenz von 3,9 kbp von pBR322 (pBR322 repliziert sich nicht in Bacillus subtilis&sup5;&sup4;); (c) ein Segment von 2,3 kbp, welches das gegenüber Cm resistente Gen enthält, und (d) ein Segment von 2,7 kbp, welches das Fusionsgen celA enthält. Die beiden Sequenzen (b) sind beiderseits von (c) und (d) angeordnet und sie definieren (begrenzen) die Amplifikationseinheit, ein Element von 8,9 kbp, das besteht aus einem Segment von pBr322 und den Genen Cmr und dem Fuslonsgen celA. Die Orientierung von pE194 in den Zellen AP551 ist so, daß die an seinem Ursprung initiierte Replikation in Richtung der Replikation fortschreitet&sup4;&sup7;.
- Der Stamm AP551i wurde nach dem folgenden Verfahren konstruiert: dieser Stamm ist isogen mit dem Stamm AP551 mit Ausnahme der Tatsache, daß der Replikationsursprung von pE194 als Folge einer Deletion von 200bp in seiner Region inaktiviert ist&sup4;&sup7;. Außerdem wurde die Mutation sacUh in die Stämme AP551 und AP551i durch Congression mit der Chromosomen-DNA des Stammes sacUh QB 136 eingeführt. Die Mutanten sacUh wurden durch Aussortieren auf Medien, die eine Überproduktion von Protease und Lävan zeigen, die für Mutanten sacUh charakterisisch ist&sup4;&sup5;, isoliert. Die korrekte Konstruktion der Stämme AP551 und AP551i wurde durch Analyse nach Southern der Chromosomen-DNA nachgewiesen unter Verwendung von pHV33Δ81 als Sonde. Es wurden Untersuchungen durchgeführt mit Klonen, die vor der Amplifikation nur eine Kopie von pHV551 trugen.
- Die Chromosomen-DNA wurde aus Zell-Lysaten mit Phenol-Chloroform extrahiert, dann wurden eine Präzipitation mit Isopropanol und eine Behandlung mit der RNase von Nucleinsäuren durchgeführt.
- Der Nachweis der amplifizierten DNA erfolgte dürch Restriktionsanalyse der Chromosomen-DNA. Die Hydrolyse mit PvuII ergibt ein Fragment von 8,9 kbp, das einer Amplifikationseinheit entspricht, die dann, wenn der Amplifikationswert hoch ist, in Form einer getrennten Bande auf einem Agarosegel (Fig. 10) unterschieden werden kann.
- Der Amplifikationswert der DNA wurde durch "Punkt- Transfer" bestimmt. Bei hohen Amplifikations-Werten (mehr als 20 Kopien pro Chromosom) wurden die DNA-Proben vor der Analyse auf das 10- bis 100-fache in Chromosom-DNA vom Wild-Typ verdünnt. pC194, das zum Teil zur Amplifikationseinheit homolog ist, wurde als Sonde verwendet, und das Gen sacA&sup5;&sup5; wurde als Bezugs-Chromosom-Sonde verwendet, die eine Kopie pro Chromosom des Gens der Saccharase von Bacillus subtilis entspricht.
- Das Gen celA ist das Strukturgen für die vorher gereinigte Endoglucanase, ausgehend von C. thermocellum NCIB10692²³, die als Endoglucanase A bezeichnet wird. Die Carboxymethylcellulose (CMC) ist ein für Endoglucanase spezifisches Substrat. Die Endoglucanase A-Aktivität ist angepaßt an die Carboxymethylcellulase (CMC-ase)-Aktivität.
- Um die industrielle Durchführbarkeit der Produktionen von EGA und von CAT nach dem in B. subtilis entwickelten Chromosomen-Amplifikations-System zu testen, wurden Kulturen des Stammes AP551, die durch Saccharose induziert wurden, in einem 20 l-Fermenter hergestellt.
- Der für diese Versuche verwendete Stamm wurde dar ersten Stufe der Chromosomen-Amplifikation unterworfen, d.h. einer Selektion bei 51ºC auf einem Agar-Agar-Medium, das 50 ug/ml Chloramphenicol enthielt (vgl. Beispiel 2).
- Die Kolonien, die sich auf diesem selektiven Medium entwickeln, werden entnommen zum Impfen einer Vorkultur, die das Inokulum für den Fermenter darstellt. Die Vorkultivierung wird in einem flüssigen Medium ohne Antibiotikum und ohne Saccharose durch Inkubation bei 51ºC durchgeführt.
- Der 20 l-Fermenter wird dann mit dem Stamm AP551, dessen Chromosomen-DNA etwa 20 Kopien der Amplifikationseinheit enthält, geimpft.
- Das Kulturmedium des Fermenters enthält Saccharose, liegt somit in einem Zustand in dem Fermenter vor, in dem die Expression der Gene celA und Cmr induziert wird (vgl. Beispiel 1).
- Die Einleitung des Wachstums in dem Fermenter erfolgt bei 51ºC. Dann wird die Temperatur auf 37ºC gesenkt. Dies stellt die zweite Stufe der Amplifikation dar, die es erlaubt, daß die Amplifikationseinheit mehr als 200 Kopien pro Zelle erreichen kann (vgl. Beispiel 2).
- Bacillus subtilis, Stamm AP551
- Bactotrypton 12,5 g/l
- Hefeextrakt 24 g/l
- Glycerin 4 ml/l
- KH&sub2;PO&sub4; 2,3 g/l
- K&sub2;HPO&sub4; 12,54 g/l
- Chloramphenicol 50 ug/ml Vorkultur-Medium identisch mit dem obengenannten Medium, jedoch ohne Antibiotikum
- Hefeextrakt 10 g/l
- Biotrypcase 12 g/l
- KCl 20 mg/l
- KH&sub2;PO&sub4; 200 mg/l
- K&sub2;HPO&sub4; 100 mg/l
- MnSO&sub4; 10 mg/l
- CaCl&sub2; 9 mg/l
- MgSO&sub4;.7H&sub2;O 17 mg/l
- FeSO&sub4; 1 mg/l
- (NH&sub4;)&sub2;SO4 4 g/l
- Saccharose 40 g/l
- die Vorkulturen werden in 500 ml-Erlenmeyerkolben durchgeführt, die 150 ml Medium enthalten. Die Kolben werden gerührt und bei 51ºC inkubiert.
- die Enzym-Produktion erfolgt in einem 20 l-Fermenter, der 15 l Produktionsmedium enthält.
- Die Impfmenge beträgt 2 % (Vol./Vol.); der pH-Wert wird mit 20 %igem NH&sub4;OH auf 7 eingestellt; der gelöste Sauerstoff wird durch Rühren, das variiert zwischen 400 und 900 UpM, auf 20 % eingestellt, die Lufteinleitungsmenge wird auf 1 vvm eingestellt; die Temperatur beträgt zu Beginn des Wachstums 51ºC, dann, wenn die optische Dichte (bei 660 nm) einen Wert von 0,2 erreicht hat, wird die Temperatur auf 37ºC gesenkt.
- Saccharose wird diskontinuierlich zugeführt in Form von zwei Zugaben von 0,7 l Saccharose mit einem Titer von 300 g/l, wobei die Zugaben zwischen den Zeitpunkten 15 und 20 Stunden für die erste Zugabe und zwischen den Zeitpunkten 25 und 30 Stunden für die zweite Zugabe erfolgen.
- Die Kultivierung in dem 20 l-Fermenter wurde über einen Zeitaum von 40 Stunden durchgeführt.
- Das Zellwachstum, die EGA-Aktivität der Kulturüberstände, die CAT-Aktivität der Zellextrakte, die Entwicklung der Anzahl der Kopien der Amplifikations-Einheit wurden bestimmt anhand von Probeentnahmen aus der Kulturbrühe, die zu den Zeitpunkten 0 - 1,5 - 16 - 20 - 25 - 40 Stunden (Fig. 14) entnommen und gemessen wurden. Die Temperaturänderung von 51ºC auf 37ºC erfolgte innerhalb eines Zeitrums von 1,5 Stunden.
- Der Verlauf des Zellwachstum zeigt, daß die Biomasse maximal ist mit einer optischen Dichte von 15 (gemessen bei 660 nm) nach 25 h. Dann bleibt die Biomasse im wesentlichen konstant bis zum Zeitpunkt von 40 Stunden.
- Die CMCase-Aktivität der Kulturüberstände wächst zwichen den Zeitpunkten 0 und 25 Stunden von 0,05 U/ml auf 27 U/ml. Am Ende der Kultivierung nach 40 Stunden beträgt die CMCase-Aktivität 30 U/ml.
- Die intracelluläre spezifische CAT-Aktivität wächst zwischen den Zeitpunkten 0 und 25 Stunden schnell von 15 auf 1010 U/mg an, nach 40 Stunden erreicht diese Aktivität einen Wert von 1050 U/mg.
- Die Anzahl der Kopien der Amplifikationseinheit steigt während der ersten 14 Stunden des Wachstums bei 37ºC von 16 auf 240 Kopien pro Chromosom, dann nimmt sie allmählich ab.
- Die Produktionen von EGA, eines extracellulären Enzyms, und von CAT, eines intracellulären Enzyms, wurden in einem 20 l-Pilot-Fermenter durchgeführt. Es wurde der Stamm AP551 von Bacillus subtilis verwendet, der die in dem Chromosom amplifizierten Gene cel A und Cmr enthielt.
- Die Kettenüberimpfung wurde mit dem Stamm durchgeführt, in dem die Amplifikationseinheit auf 20 Kopien gebracht wurde. Die zusätzliche Amplifikation der Gene cel A und Cmr, welche die Anzahl der Kopien pro Chromosom auf 250 erhöht, wurde in dem Fermenter durchgeführt.
- Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt. Zum Vergleich sei an die in Beispiel 2 genannten Ergebnisse erinnert, die mit dem in einem Erlenmeyerkolben in 100 ml Nährmedium kultivierten Stamm AP551 erhalten wurden. Fermenter Erlenmeyerkolben Biomasse am Ende der Kultivierung D.O 660 nm Aktivität in dem Kulturüberstand U/ml Überstand EGA spezifische Aktivität U/mg Zellprotein Äktivität in der Kulturbrühe U/ml Überstand CAT spezifische Aktivität U/mg Zellprotein maximale Anzahl der Kopien der Amplifikationseinheit
- Die Chromosomen-Amplifikation der Gene EGA und CAT ist identisch, wenn das Wachstum in einem Erlenmeyerkolben oder in einem Fermenter durchgeführt wird. In einem Fermenter besteht jedoch unter den lang anhaltenden Wachstumsbedingungen die Neigung, daß die Anzahl der Kopien abnimmt.
- Die sekretierte EGA-Bildung in dem Kulturüberstand ist um einen Fakor 8 erhöht gegenüber der Kultivierung in einem Erlenmeyerkolben. Diese Erhöhung resultiert aus einer besseren spezifischen Aktivität (x 1,6), vor allem jedoch aus der Bildung einer größeren Biomasse (x 5).
- Unter Berücksichtigung der spezifischen Aktivität der gereinigten CMCase (140 U/ml) entspricht die EGA-Produktion in einem Fermenter einer Protein-Konzentration von etwa 14 mg/l/Einheit D.O., entsprechend 214 mg/l Kulturüberstand.
- Die CAT-Produktion pro Volumeneinheit der Fermentationsbrühe ist um den Faktor 5 erhöht. Dies resultiert nur aus der Erhöhung der Menge an gebildeter Biomasse, die spezifischen CAT-Aktivitäten, die im Erlenmeyerkolben und im Fermenter erhalten wurden, sind äquivalent.
- Zusammenfassend zeigen die obengenannten Ergebnisse, daß das Chromosomen-Amplifikations-System von in einer Species von Bacillus entwickelten heterologen Genen, wie es weiter oben beschrieben ist, seine Wirksamkeit unter vorindustriellen Kultivierungsbedingungen beibehält.
- Darüber hinaus wurden die Produktionen von EGA und von CAT stark erhöht. Diese Verbesserungen, die sich gleichzeitig auf ein sekretiertes Enzym und auf ein intracelluläres Enzym erstrecken, sind im wesentlichen verbunden mit der Erzielung einer größeren Menge an Biomasse. Die Verwendung des Fermenters erlaubt eine bessere Kontrolle und eine Maximierung des Zellwachstums.
- Die Vorgänge der Duplikation und Amplifikation der Gene bei den Prokaryonten laufen ab im Bereich der DNA- Segmente, die von wiederholten Regionen umgeben (eingerahmt) sind (56). Es wurde gezeigt (43), daß bei B. subtilis die Bildung einer amplifizierten Domäne, die stabil integriert ist in das Chromosom, eine Rekombinationsfunktion erfordert, die von dem Gen recE beherrscht wird. Die bisher beschriebenen Versuche der Amplifikation von Genen untersuchten jedoch ein Phänomen, das nur in seltenen (wenigen) Zellen abläuft und impliziert die Selektion von Klonen, die sich mit einer geringen Frequenz entwickeln (in der Größenordnung von 10 bis 5) und sich auf eine amplifizierte Domäne erstrecken, die der gewählten Selektion entspricht.
- Der erfindungsgemäße Versuch der Amplifikation von Genen unterscheidet sich davon dadurch, daß die amplifizierbare Domäne in der Nähe des Replikationsursprungs, insbesondere des Plasmiods pE 194 angeordnet ist, das in das Chromosom integriert ist, bei dem die Aktivierung (bei 37ºC) der Replikation (wärmeempfindlich) eine massive Amplifikation induziert, die sich schnell entwickelt (vgl. Beispiel 2).
- Es war daher nicht klar, ob die Auslösung der massiven Amplifikation, induziert durch die replikative Aktivität insbesondere des integrierten Plasmids pE194, unter der Abhängigkeit des Gens recE steht. Erfindungsgemäß wurde gezeigt, daß die untersuchte Amplifikation sich in einem genetischen Kontext nicht entwickelt, in dem das Produkt des Gens recE nicht exprimiert wird, und daß die Amplifikations-Kapazität wieder hergestellt wird, wenn die Rekombinationsfunktion komplementiert wird. Die Kontrolle der Expression der Rekombinationsfunktion kann daher als ein Mittel zur zusätzlichen Kontrolle der Entwicklung der Amplifikation verwendet werden.
- Der Stamm AP2 (vgl. Tabelle 1), der in diesem Beispiel verwendet wurde, trägt eine amplifizierbare Domäne, die sich von derjenigen des Stammes AP551 (vgl. Fig. 9, Beispiel 2) nur dadurch unterscheidet, daß das von den Kopien pBR322 umgebene (eingerahmte) Segment kürzer ist (Segment von 2,3 kb) und nur für Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) codiert. Die Amplifikation in dem Stamm AP2 entwickelt sich in analoger Weise zu derjenigen, wie sie für den Stamm AP551 in Beispiel 2 beschrieben worden ist.
- Das Gen recA des Stammes AP2 wurde unter Anwendung von zwei Methoden inaktiviert:
- 1. - Congression der Chromosomen-DNA eines Stammes AP2 und eines Stammes von B. subtilis 168, der die Mutation recE4 (MI112) trägt, in einem Empfängerstamm (SB202), dann Charakterisierung der Transformanden, die gleichzeitig die amplifizierbae Konstruktion des Stammes AP2 und die Mutation recE4 tragen.
- 2. - Transformation des Stammes AP2 mit der DNA des Stammes SBEK und Selektion der Transformanden, die das native Gen recE durch Gensubstitution verloren haben. Diese zuletzt genannte Methode wurde ermöglicht durch die Konstruktion des in diesem Beispiel beschriebenen Stammes SBEK.
- Die verwendeten Stämme sind in der Tabelle 1 beschrieben. Die durch Congression der Chromosomen-DNA der Stämme AP2 und MI112 in dem Enpfägnerstamm SB202 erhaltenen Transformanden wurden zunächst auf Chloramphenicol (bug/ml) selektioniert, dann durch Überimpfung auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Mitomycin C (40 ng/ml) getestet. Alle Selektionsstufen wurden bei 51ºC durchgeführt.
- Die Aufnahme der Mutation recE4, die nicht direkt selektioniert werden kann, in die DNA des Stammes MI112 wurde angewendet bei der Congression in Dosen, die 5-mal und 10-mal höher waren als die DNA-Menge des Stammes AP2. 21 Klone, die gegenüber Mitomycin C empfindlich waren, von 1500 durch Überimpfung getesteten Klonen wurden charakterisiert. Nach der Überprüfung durch Ausstreichen wurden nur 7 Klone beibehalten und zwei dieser Klone, bezeichnet als APrec4 und APrec18, wurden näher untersucht.
- Ein Chromosomen-Fragment, welches das Gen recE von B. subtilis trug, wurde in einen Phagen Φ 105 kloniert und es wurde gezeigt, daß der rekombinante Phage die Mutation recE4 komplementiert (57). Ausgehend von Sequenz-Elementen, über die wir verfügten, wurden Marker-Oligonucleotide synthetisiert und ein Fragment von 1,1 kb des Gens recE konnte nach der sogenannten PCR-Methode (58) amplifiziert werden unter Verwendung der DNA des rekombinanten Phagen Φ 105recl (57) als Substrat. Eines der verwendeten Marker-Oligonucleotide enthielt die Sequenz der Restriktionsstelle Kpnl und das andere Marker-Oligonucleotid enthielt die Sequenz der Restriktionsstelle HindIII in der Weise, daß das amplifizierte Fragment zwischen den Stellen Kpnl und HindIII des Klonierungsvektros pUC19 kloniert werden konnte. Es sei darauf hingewiesen, daß das amplifizierte Fragment, das eine andere Stelle HindIII trug, erst nach einer partielle Digestion mit HindIII als ganzes Fragment (1,1 kb) in pUC19 kloniert werden konnte. Dieses Fragment des Gens recE enthält eine einzelne Stelle Clal (Position 291, bezogen auf die Stelle Kpnl) und in dieser Stelle wurde ein Segment Clal-Clal von 1,5 kb, welches das Gen aphA3 des Transposons Tnl545 trägt, inseriert, das Resistenz gegenüber Kanamycin verleiht (35).
- Das so konstruierte Plasmid, das eine Insertion in der Sequenz des Gens recE trug, wurde an der einzelnen Stelle Scal des Vektors puC19 linearisiert (in dem Fragment recE gibt es keine Stelle Scal). Der Stamm SB202 wurde mit dieser linearen DNA transformiert, wobei die Transformanden auf Kanamycin (10 ug/ml) selektioniert wurden. Die Linearisierung des Plasmids bewirkt, daß die Integration des Gens aphA3 in dem Chromosomen-Lokus recE durch einen doppelten Rekombinationsvorgang erfolgt. Einer der Transformanden, dessen Chromosomen-Struktur durch einen "Southern-Transfer" nachgewiesen wurde, wurde als SBEK bezeichnet. Der Stamm SBEK trägt somit aufgrund seiner Konstruktion ein durch Insertion eines Fragments von 1,5 kb inaktiviertes Gen recE, das im übrigen Resistenz gegen Kanamycin (10 ug/ml) verleiht. Sensibilitätstests gegenüber Mitomycin C haben gezeigt, daß eine Dosis von 20 ng/ml Mitomycin C für den Stamm SBEK tödlich ist.
- Die DNA des Stammes SBEK kann zum Inaktivieren des Gens recE verwendet werden, unabhängig davon, um welchen Bacillus-Stamm es sich dabei handelt, vorausgesetzt, daß der Stamm mit der Chromosomen-DNA des Stammes SBEK transformiert werden kann und die Transformanden auf Kanamycin (10 ug/ml) selektioniert werden können. Insbesondere wurde der Stamm AP2 kompetent gemacht (2) und mit der DNA des Stammes SBEK transformiert. Die auf Kanamycin erhaltenen Transformanden (10 ug/ml) erwiesen sich als empfindlich gegenüber Mitomycin C (20 ng/ml), während der Stamm AP2 gegenüber dieser Dosis von Mitomycin C resistent war (beständig) war.
- Die Chromosomen-Struktur der zwei APrec-Klone, die durch Congression konstruiert wurden, wurde durch Southern-Transfer analysiert unter Verwendung des Plasmids pHV33Δ81 als Sonde. Der Klon APrec4 trägt zwei Amplifikationseinheiten (eine Amplifikationseinheit mehr als der Stamm AP2) und der Klon APrec18 trägt drei Amplifikationseinheiten.
- Die DNA des Stammes AP2 und der beiden APrec-Stämme, die 2 h lang bei 37ºC und 51ºC kultiviert wurden, wurde durch Elektrophorese auf Agarose-Gel in einem pulsierenden Feld nach Durchführung einer Restriktion und eines Southern-Transfer analysiert, wobei als Sonde das Plasmid pHV33Δ81 verwendet wurde, das die gesamte Amplifikationseinheit bedeckt. Das Ergebnis (Fig. 15) zeigt eindeutig, daß keiner der zwei APrec-Klone bei 37ºC amplifiziertes Material bildet im Gegensatz zu dem Stamm AP2, der als Kontrolle dient. Das Ergebnis wird wie folgt analysiert:
- - durch Digestion von Ncol entstehen zwei Verbindungs- Fragmente, die gemeinsam laufen (wandern) bei 13,5 kb und ein Fragment von 6,2 kb, das einer Amplifikationseinheit entspricht; die Intensität dieser Bande, bezogen auf die Bande der Verbindungsfragmente, ist deutlich stärker für das Material des Stammes AP2 bei 37ºC; dagegen besteht keine nachweisbare Differenz in bezug auf die relative Intensität dieser Banden bei den Stämmen APrec. Die Amplifikationsbande von 6,2 kb bei 61ºC ist überraschend im Falle des Stammes AP2 und zeigt einen Amplifikationsbeginn an, wahrscheinlich verursacht durch eine Inkubationstemeperatur deutlich unterhalb 51ºC. Im Falle der Stämme APrec ist die Bande von 6,2 kb zurückzuführen auf die Anwesenheit von mehreren Amplifikationseinheiten, wie die Analyse von Bgl II bestätigt;
- - die Digestion von Bgl II in Abwesenheit einer Amplifikation ergibt nur ein einziges Fragment, welches die gesamte amplifizierbare Domäne trägt. Dies wurde bei den Stämmen APrec beobachtet. Das Material des Stammes AP2 bei 51ºC zeigt eine Hauptbande und eine Gruppe von Nebenbanden, die Amplifikations-Zwischenprodukten entsprechen.
- Die nachstehend beschriebenen Komplementations-Versuche zeigen ebenfalls, daß dieses Fehlen einer Amplifikation nicht zurückzuführen ist auf eine zufällige Inaktivierung der replikativen Aktivität von pE194 im Verlaufe der Konstruktion der Stämme APrec.
- Der rekombinante Phage Φ 105 recl (57) trägt ein Chromosomen-DNA-Fragment, welches das Gen recE enthält. Für diesen Phagen wurden lysogene APrec-Stämme durch "Tüpfeln" bzw. "Spotting" gebildet, d.h. es wurde in Tropfen Lysat auf einen Bakterien-Rasen aufgebracht und ein sich im Zentrum der Lysis-Zone entwickelnder Klon wurde entnommen und gereinigt. Ein Klon für jeden der beiden APrec-Stämme wurde vollständig charakterisiert. Der Phänotyp der Lysogene ist die Resistenz gegenüber einer Dosis von 20 ng/ml Mitomycin C (Komplementation der Mutation recE4) und die Immunität gegenüber einer Überinfektion (Überimpfung) durch den Phagen Φ 105. Diese Stämme enthalten somit eine Kopie des Gens recE, die in das Genom des integrierten Phagen inseriert worden ist, sowie eine weitere Kopie dieses Gens, welche die Mutation recE4 trägt, an dem Lokus recE. Die mit den erhaltenen Lysogenen für jeden der beiden APrec-Klone durchgeführten Amplifikationskinetiken zeigten, daß die Amplifikationskapazität vollständig wiederhergestellt war. Dieses Ergebnis zeigt, daß es möglich ist, Konstruktionen des Gens recE in das Chromosom einzuführen, um auf den Amplifikations-Grad einzuwirken.
- Das Plasmid pPL608 (59) repliziert sich in B. subtilis (Replicon von pUB110) und trägt eine Kopie des Gens recA von E. coli unter der Kontrolle des Promotors spo2 (ein starker Promotor) in B. subtilis. Es wurde ein Derivat dieses Plasmids pPL608 Xba, das aus dem Gen mit Chloramphenicol-Resistenz deletiert worden war, konstruiert, um die Selektion in bezug auf das Marker-Chloramphenicol, getragen von der Chromosomen-Konstruktion, in den APrec-Stämmen aufrechterhalten zu können; das kleine Fragment Xbal von 500 pb wurde deletiert durch Digestion von Xbal von pPL608 und Religation des großen Fragments nach der Reinigung auf Agarosegel an sich selbst. Es wurden kompetente Bakterien APrec8 hergestellt (2) und mit der DNA des Plasmids pPL608 Xba transformiert. Die Transformanden wurden selektioniert in bezug auf die Kanamycin-Resistenz, die das Plasmid trug.
- Amplifikationstests haben eine große Menge amplifiziertes Material ergeben, insbesondere wenn die Kultivierung bei 37ºC die ganze Nacht fortgesetzt wurde. Die Analyse der amplifizierbaren Domäne des bei 51ºC gehaltenen Stammes hat jedoch gezeigt, daß der untersuchte Transformand 5 Amplifikationseinheiten trug, eine Situation, die günstig ist für eine starke Amplif ikation (vgl. Beispiel 2). Es war somit nicht möglich, diese Amplifikationsgrade mit denjenigen der recE enthaltenden Stämme zu vergleichen, dieser Versuch zeigt jedoch, daß das Gen recA von E. coli das mutierte Gen recE für den Amplifikationsprozeß komplementiert.
- In diesem Beispiel wurde gezeigt, daß die Amplifikation in den Zellen AP2 blockiert ist, wenn das Gen recE inaktiviert ist. Dieses Ergebnis war nicht zu erwarten, da es denkbar war, daß die Wirkung des Produkts des Gens recE (das für die Produktion von amplifizierten, stabil in das Chromosom integrierten Domänen erforderlich ist) sich auf eine Stabilisierungsstufe in dem Chromosom auswirkt nach der Produktion der durch biochemische Analyse nachgewiesenen amplifizierten Domänen. Das Fehlen jedes Amplifikationszwischenprodukts in den Analysen auf einem Gel des aus Stämmen extrahierten Materials, in denen das Gen recE inaktiviert ist, läßt dagegen vermuten, daß die Rekombinationsfunktion an der Auslösung des Amplifikationsprozesses teilnimmt, wahrscheinlich durch einen Rekombinationsvorgang im Bereich der wiederholten Sequenzen (pBR322).
- Ein anderer Rekombinationsvorgang, die Deletion des Chloramphenicol-Markers durch Rekombination zwischen den Sequenzen pBR322, die ebenfalls in den Zellen AP2 beschrieben wurde (47), und die biochemischen Analysen durch Blotting zeigen Chromosomen-Fragmente, die dieser Deletion entsprechen. Es wurde keine Deletions-Bande auf dem Material der APrec-Stämme beobachtet, was zeigt, daß dieser weitere Rekombinations-Vorgang, aktiviert durch die Replikation von pE194, durch Inaktivierung von recE ebenfalls blockiert ist.
- Der Nachweis, der in diesem Beispiel geführt wurde, daß das mutierte Gen recE durch das Gen recA von E. coli komplementiert werden kann (das unter der Kontrolle eines Promotors von B. subtilis steht) öffnet die Tür zu Komplementations-Forschungen, die einen der Rekombinations-Vorgänge gegenüber dem anderen (Amplifikation oder Deletion) begünstigen. Es ist auch möglich, daß der Grad der Expression der Rekombinationsfunktion als ein zweites Mittel der Kontrolle angesehen werden kann, mit dessen Hilfe die rekombinationsgenetische Antwort auf die Aktivierung der Replikation moduliert werden kann. Tabelle 1 Stämme und Plasmide Stämme Genotpy Phänotyp Literaturstellen diese Arbeit Plasmide
- a - Promotor-Region: Einführung einer Stelle Kpnl.
- b - Stopp-Region : Einführung einer Stelle HindIII
- 100 ul Reaktionsmischung, die nach Angaben der Firma Pharmacia enthält:
- - etwa 20 ng DNA des Phagen Φ 105 recl
- - Ausgangs-Oligonucleotide von 1,0 um
- - dNTPs jeweils 200 uM
- - Tris 10 mM pH 8,3; MgCl&sub2; 2 mM; 50 mM KCl
- - Gelatine 0,001 %
- - 2,5 Einheiten Taq-Polymerase
- Die Reaktion wird in der Apparatur "Gene ATAQ" der Firma Pharmacia durchgeführt.
- Gewählter Temperaturcyclus:
- - 94ºC 1 min
- - 52ºC 2 min
- - 72ºC 3 min
- Die Reaktion wird über 30 Temperaturcyclen durchgeführt:
- - Beginn 94ºC 5 min
- - 30 Cyclen
- - Ende 72ºC 10 min
- Programm "DNA star".
- Die Elektrophorese wird in einem Tris-Borat 0,5 X- Puffer bei einer Spannung von 8 V/Cm 16 h lang durchgeführt. Die Temperatur wird in der Küvette durch ein Wasserkreislauf-Kühlsystem konstant gehalten. Art des Feldwechsels:
- - Beginn: 0,3/0,1V
- - Ende: 3/1V
- - Agarosegel 1 %.
- 1. A. Amory, F. Kunst, E. Aubert, A. Klier und G. Rapoport, "Characterization of the sacQ genes from Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis" in "J. Bacteriol." 169:324-333 (1987).
- 2. C. Anagnostopoulos und J. Spizizen, "Requirements for transformation in Bacillus subtilis" in "J. Bacteriol" 81:741-746 (1961).
- 3. S. Aymerich, G. Gonzy-Tréboul und M. Steinmetz, "5'- Non-coding region sacR is the target of all identified regulation affecting the levansucrase gene in Bacillus subtilis" in "J. Bacteriol." 166:993-998 (1986).
- 4. P. Béguin, "Detection of cellulase activity in polyacrylamide gel using Congo red stained agar replicas" in "Anal. Biochem." 131:333-336 (1983).
- 5. P. Béguin, P. Cornet und J.-P. Aubert, "Sequence of a cellulase gene of the thermophilic bacterium Clostridium thermocellum" in "J. Baceteriol." 162:102-105 (1985).
- 6. P. Béguin, P. Cornet und J. Millet, "Identification of the endoglucanase encoded by the celB gene of Clostridium thermocellum" in "Biochimie" 65:495-500 (1983).
- 7. P. Béguin, M.Rocancourt, M.-C. Chebrou und J.-P. Aubert, "Mapping of mRMNA encoding endoglucanase A from Clostridium thermocellum" in "Mol Gen. Genet." 202:251-254 (1986).
- 8. P. Carter, H. Bedouelle and G. Winter, "Improved oligonucleotide site directed mutagenesis using M13 vectors in "Nucleic Acids Res." 13:4431-4443 (1985).
- 9. S.N. Cohen, A.C.Y. Chang und L. Hsu, "Non chromosomal antibiotic resistance in bacteria; genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA" in "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 69:2110-2114 (1972).
- 10. P. Cornet, J. Millet, P. Beguin and J.-P. Aubert, "Characterization of two cel (cellulose degradation) genes of Clostridium thermocellum coding for endoglucanases"., in "Bio/Technol. 1:589-594 (1983).
- 11. A. Edelman, G. Joliff, A. Klier und G. Rapoport, "A system for the inducible secretion of proteins from Bacillus subtilis during logarithmic growth" in "FEMS Microbiol. Lett." 52:117-120 (1988).
- 12. A. Fouet, M. Arnaud, A. Klier und G. Rapoport, "Characterization of the precursor form of the exocellular levansucrase from Bacillus subtilis" in "Biochem. Biophys. Res. Commun." 119:795-800 (1984).
- 13. T.J. Gibson, Ph.D. Thesis, University of Cambridge (1984).
- 14. M. Honjo, A. Akaoka, A. Nakayama, H. Shimada, I. Mita, K. Kawamura und Y. Furutani, "Construction of secretion vector and secretion of hIFN-B, S. 89-100, In A.T. GANESAN and J.A. Hoch (eds), "Bacillus Molecular genetics and Biotechnology Applications", Academic Press, New-York (1986).
- 15. M. Honjo, A. Nakayama, H. Shimada, A. Lio, I. Mita, K. Kawamura und Y. Furutani, "Construction of an efficient secretion host-vector system in Bacillus subtilis, S. 365-369 In A. T. Ganesan und J.A. Hoch (eds), "Genetics and Biotechnology of Bacilli", Academic Press, New-York (1988).
- 16. S. Horinouchi und B. Weisblum, "Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance", in "J. Bacteriol." 150:815-825 (1982).
- 17. A. Klier, A. Fouet, M. Debarbouille, F. Kunst und G. Rapoport, "Distinct control sites located upstream from the levansucrase gene of Bacillus subtilis" in "Molec. Microbiol." 1:233-241 (1987).
- 18. D. Le Coq, P. Joyet. B. Le Reverend und H. Heslot, "Expression of levansucrase/alpha-amylase gene fusions in Escherichia coli and Bacillus subtilis Teil B, S. 457-463, In M. Alacevic, D. Hranueli und Z. Toman (eds), Zagbreb, Jugoslawien: Pliva", 5th Int. Symp. Genet. Ind. Microorg.", Split, Jugoslawien (1986).
- 19. J.-A. Lepesant, Thesis, Paris VII (1974).
- 20. J.-A. Lepesant, F. Kunst, J. Lepesant-Kejzlarova und R. Dedonder, "Chromosomal location of mutations affecting sucrose metabolism in Bacillus subtilis Marburg" in "Molec. Gen. Genet." 118:135-160 (1972).
- 21. J.-A. Lepesant, F. Kunst, M. Pascal. J. Lepesant-Kejzlarova, M. Steinmetz und R. Dedonder, "Specific and pleitotropic regulatory mechanisms in the sucrose system of Bacillus subtilis, 168, S. 58-69 In D. Schlessinger (ed.), "Microbiology"-1976. American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1976).
- 22. T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, "Molecular cloning, a laboratory manual", Cold Spring Harbor, New-York (1982).
- 23. J. Petre, R. Longin und J. Millet, "Purification and properties of an endo-beta-1,4-glucanase from Clostridium thermocellum" in "Biochimie" 63:629-639 (1981).
- 24. D. Pétré, J. Millet, R. Longin, P. Geguin, H. Girard und J. -P. Aubert, "Purification and properties of the endoglucanase C of Clostridium thermocellum produced in Escherichia coli", in "Biochimi" 68:687-695 (1986).
- 25. L.M. Robson und G.H. Chambliss, "Characterization of the cellulolytic activity of a Bacillus isolate" in "Appl. Environ. Microbiol." 47:1039-1046 (1984).
- 26. M. Sacco, J. Millet und J.-P. Aubert, "Cloning and expression in Saccharomyces cerevisiae of a cellulase gene from Clostridium thermocellum" in "Ann. Microbiol. Inst. Pasteur." 135A:485-488 (1984).
- 27. F. Sanger, S. Nicklen und A.R. Coulson, "DNA sequencing with chain terminating inhibitors" in "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 74:5463-5467 (1977).
- 28. M. Sarvas, "Protein secretion in Bacilli." in "Current Topics in Microbiol. and Immunol." 125:103- 125 (1986).
- 29. C.W. Saunders, B.J. Schmidt, R.L. Mallonee und M.S. Guyer, "Secretion of human serum albumin from Bacillus subtilis" in "J. Bacteriol." 169:2917-2925 (1987).
- 30. P. Schaeffer, H. Ionesco. A Ryter und G. Balassa, "La sporulation de Bacillus subtilis, _étude génetique et physiologique", S. 553-563, In "Mécanismes de régulation des activités cellulaires chez les microoranismes, Paris: Centre National de la Recherche Scientifique" (1965).
- 31. C.H. Schein, K. Kashiwagi, A. Fujisawa und C. Weissmann, "Secretion of mature IFN-alpha2 and accumulation of uncleaved precursor by Bacillus subtilis transformed with a hybrid alpha-amylase signal sequence-IFN-alpha2-gene" in "Bio/Technology" 4 :719-725 (1986).
- 32. W.H. Schwarz, F. Grabnitz und W.L. Staudenbauer, "Properties of Clostridium thermocellum endoglucanase produced in Escherichia coli" in "Appl. Environ Microbiol." 51:1293-1299 (1986).
- 33. E. Soutschek-Bauer und W.L. Staudenbauer, "Synthesis and secretion of a heat-stable corboxymethylcellulase from Clostridium thermocellum in Bacillus subtilis and Bacillus stearothermophilus", in. "Mol. Gen. Genet." 208-537-541 (1987).
- 34. M. Steinmetz, D. Le Coq, S. Aymerich, G. Gonzy-Tréboul und P. Gay, "The DNA sequence of the gene for the secreted Bacillus subtilis enzyme levansucrase and its genetic control sites", in "Mol. Gen. Genet." 200:220-228 (1985).
- 35. P. Triau-Cuot and P. Courvalin, "Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III" in "Gene" 23:331-341 (1983).
- 36. N. Vasantha und L.D. Thompson, "Fusion of pro region of subtilisin to staphylococcal protein A and its secretion by Bacillus subtilis" in "Gene" 49:23-28 (1986).
- 37. J. Vieira und J. Messing, "The pUC plasmid and M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers" in "Gene" 19:259-268 (1982).
- 38. L.-F. Wang, S.-L. Wong, S.-G. Lee, N.K. Kalyan, P.P. Hung, S. Hilliker und R.H. Doi, "Expression and secretion of human atrial natriuretic alpha-factor in Bacillus subtilis using the subtilisin signal peptide", in "Gene" 69:39-47 (1988).
- 39. M.M. Zukowski und L. Miller "Hyperproduction of an intracellular heterologous protein in a sacUh mutant of Bacillus subtilis" in "Gene" 46:247-255 (1986)
- 40. H. Te Riele, B. Michel und S.D. Ehrlich, "Singlestranded plasmid DNA in Bacillus subtilis and Styphylococcus aureus" in "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 83:2541-2545 (1986).
- 41. B. Niaudet, L. Janniere und S.D. Ehrlich, "Recombination between repeated DNA sequences occurs more often in plasmids than in the chromosome of Bacillus subtilis" in "Mol. Gen. Genet", 197:46-54 (1984).
- 42. M. Young, "Gene amplification in Bacillus subtilis" in "J. Gen. Microbiol." 130:1613-1621 (1984).
- 43. A.M. Albertini, A. Galizzi, "Amplification of a chromosomal region on Bacillus subtilis" in "J. Bacteriol." 162:1203-1211 (1985).
- 44. L. Janniere, B. Niaudet, E. Pierre und S.D. Ehrlich, "Stable gene amplification in the chromosome of Bacillus subtilis" in "Gene 40:47-55 (1985).
- 45. F. Kunst, M. Pascal., J. Lepesant-Kejzlarova, J.-A. Lepesant, A. Billault und R. Dedonder, "Pleiotropic mutations affecting sporulation conditions and the syntheses of extracellular enzymes in Bacillus subtilis" 168" in "Biochimie" 56:1481-1489 (1974).
- 46. B. Weisblum, M.Y. Graham, T. Gryczan und D. Dubnau, "Plasmid copy number control: isolation and characterization of high-copy-number mutants of plasmid pE194" in "J. Bacteriol"., 137:635-643 (1979).
- 47. Ph. Noirot, M.A. Petit und S.D. Ehrlich, "Plasmid replication stimulates DNA recombination in Bacillus subtilis" in "J. Mol. Biol." 196:39-48 (1987).
- 48. P. Matsudaira, "Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes" in ".J. Biol. Chem." 262:10035-10038 (1987).
- 49. W.V. Shaw, "Chloramphenicol acetyltransferase from chloramphenicol-resistant bacteria" in "Methods Enzymol." 43:737-755 (1975).
- 50. M. Young und J. Cullum, "A plausible mechanism for large-scale chromosomal DNA amplification in streptomycetes" in FEBS lett." 212:10-14 (1987).
- 51. D. Pétré J. Millet, R. Longin, P. Béguin, H. Girard und J.-P. Aubert, "Purification and properties of the endoglucanase C of Clostridium thermocellum produced in Escherichia coli" in "Biochimie", 68:687-695 (1986).
- 52. P. Béguin, "Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using congo red stained agar replicas" in Anal. Biochem." 131:333-336 (1983).
- 53. M. Dagert, I. Jones, A. Goze, S. Romac, B. Niaudet und S.D. Ehrlich, "Replication functions of pC194 are necessary for eff icient plasmid transduction of M13 phage" in "EMBO J." 3:81-86 (1984).
- 54. B. Niaudet und S.D. Ehrlich, "In vitro genetic labeling of Bacillus subtilis cryptic plasmid pHV400" in "Plasmid" 2:48-58 (1979).
- 55. A. Fouet, A. Klier und G. Rapoport, "Cloning and expression in Escherichia coli of the sucrase gene from Bacillus subtilis", in "Mol. Gen. Genet." 186:399- 404.
- 56. G.A. Stark, und G.M. Wahl, "Gene amplification Ann. Rev. Biochem." 53:447-491 (1984).
- 57. R. Marrero und R.E. Yasbin, "Cloning of the Bacillus subti lis recE gene and functional expression of recE in B. subtilis" in "J. Bacteriol." 170:335-344 (1988).
- 58. S.J. Sharf, G.T. Horn und H.A. Erlich, "Science" 233:1076-1078 (1986)
- 59. Williams et al, "J. Bacteriol." 146:1162-1165 (1981).
- 60. Ph. Noirot, M.A. Petit und S.D. Ehrlich, "Plasmid replication stimulates DNA recombination in Bacillus subtilis" in "J. Mol. Biol" 196: 39-48 (1987).
- 61. Tanaka und Sakaguchi "Mol.Gen.Genet." 165: 269-276 (1978)
- 62. C. Yanish-Perron, J. Vieira und Messing, "Gene" 33: 103-119 (1985).
Claims (21)
1. Verfahren zur Herstellung eines bestimmten Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß
man, ausgehend von einem Stamm der Gattung Bacillus, in dessen Chromosom in ein nicht
essentielles Gen des Stamms integriert wurden:
a) eine amplifizierbare Einheit, umfassend eine bestimmte DNA-Sequenz M, die
umgeben ist von zwei im direkten Sinn angeordneten DNA-Sequenzen D, wobei die
Sequenz M ein Strukturgen des Proteins umfaßt, das kontrolliert wird von
Expressionselementen und gegebenenfalls bei Bacillus induzierbaren
Sekretionselementen des Proteins und wahlweise ein Selektionsmarker und
b) oberhalb der amplifizierbaren Einheit ein induzierbares oder konditionierbares
Replikon (réplicon conditionnel), das gleichzeitig integriert ist in das nicht essentielle
Gen des Chromosoms des Stamms;
1. gegebenenfalls die amplifizierten Klone selektiert, die erhalten wurden durch Kultur
auf einem für den Selektionsmarker geeigneten Kulturmedium, und man die Stämme
entnimmt, deren Genom der Anwesenheit einer verglichen mit der
Bakterienpopulation vor der Selektion vermehrten Anzahl von Kopien des besagten
Gens entspricht; und
2. in einem geeigneten Kulturmedium durch Aktivierung des Replikons eine
genetische Amplifikation induziert oder konditioniert, und man gegebenenfalls die
Sekretion des Proteins durch Aktivierung der Expressionselemente induziert,
3. das exprimierte Protein isoliert.
2. Venfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das für die homologe
Rekombinationsfunktion codierende Gen im Chromosom des Stamms inaktiviert ist oder
von einem induzierbaren Promoter kontrolliert wird, wobei das für die
Rekombinationsfunktion codierende Gen ein heterologes Gen sein kann, wenn das native
Gen inaktiviert wurde, so daß in der 2. Stufe von Anspruch 1 die Amplifikation nicht
stattfindet außer:
- man behebt den Mangel der homologen Rekombination durch ein Gen, das für die
homologe Rekombinatinsfunktion im Chromosom des Stammes codiert, wie das Gen
E von Bacillus subtilis oder das Gen recA von E. coli, und/oder
- man induziert die Aktivierung des Promoters, so daß die homologe
Rekombinationsfunktion im Chromosom des Stamms exprimiert wird, falls das Gen
von einem induzierbaren Promoter kontrolliert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem für die
homologe Rekombinationsfunktion codierenden Gen um das native Gen recE des Stamms
Bacillus handelt, das durch Transformation des Stamms mit einem mutierten Gen recE
inaktiviert wurde, wobei das native Gen recE durch Substitution des Gens enffernt wurde,
nämlich mit chromosomaler DNA des Stamms SBEK, der abstammt vom Stamm SB202
des B. subtilis, in den in die für das Gen recE codierende Sequenz eine Insertion von 1.5 kB
eingeführt wurde, die das Gen aphA3 trägt, und die gegen Kanamycin resistenten
Transformanden selektiert wurden.
4. Verfahren zur Herstellung eine nützlichen Stammes von Bacillus, nämlich im
Herstellungsverfahren für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in dessen
Chromosom eine bestimmtes für das Protein codierendes Gen integriert wurde,
gegebenfalls amplifiziert, dadurch gekennzeichnet, daß:
a) man die Integration von mindestnes einer DNA-Sequenz in das Chromosom des
Stamms durchführt, wobei die Integration mindestens umfaßt:
. ein induzierbares oder konditionierbares Replikon (réplicon conditionnel) oberhalb,
. eine amplifizierbare Einheit der Struktur -D-M-D-, wobei die Sequenzen D im
direkten Sinn orientiert sind und die Integration des Gens M in ein nicht essentielles
Gen des Stamms gewährleisten, und wobei das Gen M das Strukturgen des Proteins
umfaßt, kontrolliert von Expressionselementen und gegebenenfalls bei Bacillus
induzierbaren Sekretionselementen des Proteins, wobei die amplifizierbare Einheit
gegebenenfalls zusätzlich einen Selektionsmarker umfaßt;
b) man gegebenfalls die durch Kultur, gegebenenfalls auf einem für den
Selektionsmarker geeigneten Kulturmedium, erhaltenen Stämme von Bacillus
selektiert; und
c) man die stabilen Stämme entnimmt, deren Genom einer im Vergleich zur
Bakterienpopulation vor der Selektion vermehrten Anzahl von Kopien des Gens
entspricht.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch charakterisiet, daß das für die homologe
Rekombinationsfunktion codierende Gen im Chromosom des Stamms inaktiviert ist
und/oder von einem induzierbaren Promoter kontrolliert wird, wobei das Gen ein natives
Gen oder ein heterologes Gen sein kann, falls das native Gen inaktiviert wurde.
6 Verfahren zur Herstellung eines nützlichen Stammes von Bacillus, nämlich in einem
Verfahren zur Herstellung von Proteinen insbesonder im Verfahren nach einem der
Ansprüche 2 oder 3, eines Stammes, in dessen Chromosom ein bestimmtes, für das
Protein codierende Gen integriert und amplifiziert wurde, wobei das Verfahren dadurch
gekennzeichnet ist, daß:
a) man die Integration von mindestens einer DNA-Sequenz in das Chromosom des
Stammes durchführt, wobei die Integration mindestens umfaßt:
. ein induzierbares oder konditionales Replikon oberhalb,
. eine amplifizierbare Eineit der Struktur -D-M-D, wobei die Sequenzen D im direkten
Sinn angeordnet sind und die Integration des Gens M in ein nicht essentielles Gen
des Stamms gewährleisten, und wobei das Gen M das Strukturgen des Proteins
umfaßt, kontrolliert von Expressionselementen und gegebenenfalls bei Bacillus
induzierbaren Sekretionselementen, und wobei die amplifizierbare Einheit
gegebenenfalls einen Selektionsmarker umfaßt;
b) man gegebenenfalls die durch Kultur, gegebenenfalls auf einem für den
Selektionsmarker geeigneten Kulturmedium, erhaltenen Stämme selektiert;
c) man in einem geeigneten Kulturmedium eine genetische Amplifikation induziert
durch Aktivierung des Replikons;
d) man die Expression der homologen Rekombinationsfunktion im Chromosom des
Stamms blockiert; und
e) man die stabilen Stämme entnimmt, deren Genom der Anwesenheit einer im
Vergleich zu der Bakterienpopulation vor der Selektion erhöhten Anzahl von Kopien
des Gens entspricht.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Kontrolle der Expression
der homologen Rekombinationsfunktion im Schritt c) wie folgt erfolgt:
- indem das für die homologe Rekombinationsfunktion codierende Gen im
Chromosom des Stammes so plaziert wird, daß es der Kontrolle eines induzierbaren
Promoters unterliegt wobei das Gen das native Gen sein kann oder das heterologe
Gen, falls das native Gen inaktiviert wurde, wobei im letzteren Fall im Schritt c)
gleichermaßen eine Aktivierung des Promoters des für die homologe
Rekombinationsfunktion codierenden Gens induziert wird, und im Schritt d) die
Induktion der Aktivierung des Promoters unterbrochen wird,
oder
- man den Stamm mit einem mutierten Gen recE transformiert, wobei das native Gen
recE durch Substitution des Gens eliminiert wurde, nämlich mit chromosomaler DNA
aus dem Stamm SBEK, abstammend vom Stamm SB2O2 von B. subtilis, in dessen
für das Gen recE codierende Sequenz eine lnsertion von 1,5 kB eingeführt wurde, die
das Gen aphA3 trägt, und die gegen Kanamycin resistenten Transformanden
selektiert wurden.
8. Verfahren zur Herstellung eines bestimmten Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß man
einen Stamm nach einem der Annsprüche 6 oder 7, in dem das bestimmte Gen für das
Protein codiert, in einem Kulturmedium kultiviert und anschließend das exprimierte und
gegebenenfalls sezernierte Protein abtrennt.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das
Replikon aus einem bakteriellen Plasmid stammt.
10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die
Aktivierung des Replikons thermosensibel ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Replikon vom Plasmid
pE194 stammt.
12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es
sich bei dem Stamm um einen Stamm von Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus
brevis, Bacillus circulans, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus macerans, Bacillus
meoaterium. Bacillus polymyxa, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus
coagulans handelt.
13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das
Replikationssystem und die amplifizierbare Einheit DMD zwischen die Sequenzen thy B und
X integriert werden nach Deletion des Gens ilvA von Bacillus subtilis.
14. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, daurch gekennzeichnet, daß die
Sequenz D aus einem bakteriellen Plasmid wie dem Plasmid pBR322 stammt.
15. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es
sich bei dem Selektionsmarker um ein Resistenzgen gegen eine chemische Verbindung wie
Chloramphenicol oder Kanamycin handelt.
16. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die
Expressions- und Sekretionselemente von Bacillus subtilis aus einem Promoter sacB,
begleitet von einer durch Saccharose induzierbaren Region sacRB bestehen.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressions- und
Sekretionselemente von Bacillus subtilis aus einem Teil des Locus sacRB von Bacillus
subtilis stammen, der enthält:
1) den Locus sacR, enthaltend den Promoter der regulierenden Region des Gens
sacB, und
2) die Region von sacB, die für die Signalsequenz der Lävansaccharase codiert.
18. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es
sich bei dem Stamm um einen Mutanten-Stamm sacUh handelt.
19. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man
das exprimierte Protein gewinnt, während die Kultur in stationärem Zustand ist.
20. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es
sich bei dem Protein um Endoglucanase A (EGA) handelt, deren Strukturgen das bei
Clostridium thermocellum isolierte Gen ceiA ist, das kontrolliert wird von Expressions- und
Sekretionselementen bei Bacillus subtilis.
21. Stämme, erhalten nach dem Verfahren zur Herstellung von Stämmen nach einem der
vorstehenden Ansprüche.
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| FR898910143A FR2650292B1 (fr) | 1989-07-27 | 1989-07-27 | Procede de production de proteine a partir de souches de bacillus subtilis et procede de preparation desdites souches |
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| DE69008959T2 true DE69008959T2 (de) | 1994-12-22 |
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