JP3046344B2 - 新規プロテアーゼ - Google Patents

新規プロテアーゼ

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JP3046344B2 JP2288110A JP28811090A JP3046344B2 JP 3046344 B2 JP3046344 B2 JP 3046344B2 JP 2288110 A JP2288110 A JP 2288110A JP 28811090 A JP28811090 A JP 28811090A JP 3046344 B2 JP3046344 B2 JP 3046344B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，ポリペプチドのアミノ酸配列中のグルタミ
ン酸残基のカルボキシル基側を特異的に開裂する新規プ
ロテアーゼ，該プロテアーゼのバシラス属菌からの製造
方法，該プロテアーゼをコードするDNA配列，該DNA配列
を有する発現ベクター，該発現ベクターを導入して得ら
れる形質転換体，および該形質転換体を用いたプロテア
ーゼの製造方法に関する。
（従来の技術） タンパク（ポリペプチド）に作用して，グルタミン酸
（Glu）残基のカルボキシル基側を特異的に開裂する酵
素として，スタフィロコッカス アウレウス（Staphylo
coccus aureus）V8株由来のV8プロテアーゼが知られて
いる（Gabriel R.Drapeauら,J.Biol.Chem.247,20,6720
−6726（1972））。この酵素はセリンプロテアーゼに分
類される。C.Carmonaら（Nucl.Acids Res.,15,6757（19
87））は，この酵素をコードするDNA配列をクローン化
している。
同様の酵素としては，放射菌であるストレプトマイセ
ス グリセウス（Streptomyces griseus）由来の酸性ア
ミノ酸特異的エンドペプチダーゼが知られている（Nori
o Yosihdaら,J.Biochem.104,3,451−456（1988））。さ
らに，バシラス サチリス（Bacillus subtilis）由来
のグルタミン酸特異的エンドペプチダーゼも知られてい
るTakuro Niidomeら,J.Biochem.108,965−970（199
0））。
上記酵素は，タンパク質構造解析などの目的のために
タンパクを上記位置で特異的に切断したい場合；遺伝子
組換え技術により目的タンパクを融合タンパクとして生
産させた場合に，該融合タンパクを切断して目的のタン
パクを得る場合などに有用である。後者の場合では，例
えば，目的タンパクをGlu残基を介して他のタンパクと
結合させて生産した後，この酵素で切断処理することに
より目的タンパクを分離することができる。そのため，
上記以外にもこのような酵素活性を有するプロテアーゼ
がさらに求められている。
（発明の目的） 本発明の目的は,Glu残基のカルボキシル基側を特異的
に開裂する酵素活性を有する新規のプロテアーゼ，該プ
ロテアーゼをコードするDNA配列，該DNA配列を有する発
現ベクター，該発現ベクターを導入して得られる形質転
換体，および該形質転換体を用いたプロテアーゼの製造
方法を提供することにある。
（発明の構成） 発明者らは，上記微生物以外の微生物菌株からV8プロ
テアーゼなどの酵素と同様の活性を有するプロテアーゼ
を得ようと種々の検討を行った。その結果，バシラス
リケニホルミス ATCC 14580株由来の上記性質を有する
新規プロテアーゼを見出した。さらに，このプロテアー
ゼをコードするDNA配列，該DNA配列を有する発現ベクタ
ー，該発現ベクターを導入して得られる形質転換体，お
よび該形質転換体を用いたプロテアーゼの製造方法を見
出し，本発明を完成するに至った。
本発明のプロテアーゼは，バシラス リケニホルミス
（Bacillus licheniformis）由来のプロテアーゼであ
って，ペプチドのグルタミン酸残基のα位のカルボキシ
ル基を含むペプチド結合を切断する性質を有する。
本発明のプロテアーゼは，第１図の＋１位のSerから
＋222位のGlnまでのアミノ酸配列を有し，ペプチドのグ
ルタミン酸残基のα位のカルボキシル基を含むペプチド
結合を切断する性質を有する。
本発明のDNA配列は，上記プロテアーゼをコードす
る。
本発明の発現ベクターは，上記DNA配列を有する。
本発明の形質転換体は，上記発現ベクターを宿主に導
入して得られる。
本発明のプロテアーゼの製造方法は，上記プロテアー
ゼを産生し得るバシラス リケニホルミスを培地中で培
養する工程，および生産されたプロテアーゼを該培地か
ら採取する工程を包含する。
本発明のプロテアーゼの製造方法は，上記形質転換体
を培養する工程，および生産されたプロテアーゼを該培
地から採取する工程を包含する。
本発明のプロテアーゼ（以下,BLaseと略称する）は，
バシラス属菌，特にバシラス リケニホルミス ATCC 1
4580株により生産される。本菌株はアメリカンタイプ
カルチャー コレクション（ATCC）から入手できる。
I.培養条件 上記菌株の培地は格別である必要はなく，通常の培地
が用いられる。例えば，グルコース，大豆粉，肉エキ
ス，コーンスティープカー，各種塩類などを含有する培
地が用いられる。培養pHは５〜9,好ましくはpH約7.0,培
養温度は15〜50℃，好ましくは約28℃であり，例えば，
好気的に攪拌または振盪しながら約36時間培養を行う。
本発明のBLaseは，主として細胞外に分泌される。
II.酵素の採取法 上記培養物から本酵素を採取・精製するには，既知の
製造法が単独で，もしくは併用して利用され得る。例え
ば，培養物をフィルタープレスし，限外濾過および遠心
分離を行い，濃縮除菌液を得る。これを適当な手段で精
製することにより本発明の酵素が得られる。例えば，上
記濃縮液をイオン交換クロマトグラフィーで粗分離した
後,S−セファロースを用いたクロマトグラフィーを行
い，次いで，アフィニティークロマトグラフィーを行う
ことにより，本酵素が得られる。後述の実施例１におい
ては，このような方法により,1.9×103〜2.4×103U/mg
（後述の活性測定法により測定）の酵素標品が得られ
た。後述の酵素の性質は，この酵素標品を用いて測定さ
れた。
III.活性測定法 Ｚ−Phe Leu Glu−pNA（Ｚはカルボベンゾキシ基，そ
してpNAはｐ−ニトロアニリン残基を示す）を基質と
し，該基質を，最終濃度が0.2mMとなるように,50mM Tri
s−HCl（pH7.5,2mMCaCl2および２％DMFを含有する）に
溶解させる。これに酵素液を加え,37℃にて10分間反応
させる。酵素反応により遊離する反応液中のｐ−ニトロ
アニリンの吸光度を410nmにて測定する。吸光度が1.0と
なるような酵素量を１単位（Ｕ）とする。
IV.酵素の性質 本発明のBLaseの酵素的並びにタンパク化学的性質を
以下に示す。
（１）作用および基質特異性 表１に示す合成基質を調製し，各合成基質を，表１に
示す濃度となるように,50mM Tris−HCl〔2mMCaCl2およ
び表１に示す割合でジメチルホルムアミド（DMF）また
はジメチルスルホキシド（DMSO）を含有する;pH7.5〕に
溶解させた。これに本酵素を加えて,25℃にて反応させ
た。酵素反応により遊離する反応液中のｐ−ニトロアニ
リンの吸光度（410nm）を測定することにより,1mgの基
質から１分間に遊離されるｐ−ニトロアニリンの量（nm
ol）を算出した。その結果を表１に示す。
タンパク性基質として，酸化インシュリンＢ鎖を選択
し，該基質に対する本酵素およびスタフィロコッカス
アウレウス由来のV8プロテアーゼの作用を次のようにし
て比較した。まず，酸化インシュリンＢ鎖を50mM NH4HC
O3,pH7.8,に溶解させ，酵素／基質＝1/100（W/W）とな
るように本酵素または上記V8プロテアーゼを加えて，所
定時間反応させた。反応混合物を,Vydac Protein C4300
Å,4.6×250mmカラムを用いたHPLCにかけ,0.1％TFA中０
％から50％のアセトニトリルを用いるリニアグラジエン
トで溶出を行った（アセトニトリルは１分間当り1.67％
上昇させた）。このようにして，ペプチドマッピングを
行なった結果，いずれの酵素を用いた場合にもGlu残基
のカルボキシル基を含むペプチド結合が切断されてお
り，酵素分解による生成物は一致した。
上記およびの結果から，本酵素は，ペプチドのグ
ルタミン酸残基のカルボキシル基を含むペプチド結合を
切断する，グルタミン酸特異的エンドペプチダーゼであ
ることが明らかである。
（２）至適pHおよび安定pH範囲 基質としてｚ−Phe Leu Glu−pNAを用い，該基質を10
％DMFおよび2mMCaCl2を含む50mM Tris−HCl溶液に溶解
させた。これに本酵素を加え,37℃にて15分間反応させ
た。酵素反応により遊離する反応液中のｐ−ニトロアニ
リンを吸光度410nmにて測定した。上記反応液のpHを変
化させて反応を行なったところ，反応の至適pHは8.0で
あることがわかった。
次に，各種pH条件下で，本酵素を25℃にて24時間保持
した後，活性測定法に準じて反応を行ない，残存活性を
測定した。その結果，安定pH範囲は6.5〜8.5であること
がわかった。
（３）温度安定性 本酵素を2mMのCaCl2を含む緩衝液中,pH7.8にて各種温
度条件下で15分間保持した後，活性測定法に準じて反応
を行なった。その結果，本酵素は上記条件において60℃
まで安定であることがわかった。CaCl2を含有しない緩
衝液中で保持した場合には,50℃まで安定であった。
（４）阻害剤の影響 本酵素はジイソプロピルフルオロホスフェート（DF
P）により完全に阻害される。このことから本酵素はセ
リンプロテアーゼに分類されることがわかる。
本酵素はＺ−Phe Leu Glu CH2Clにより完全に阻害さ
れる。このことからも本酵素はグルタミン酸特異的エン
ドペプチダーゼであることがわかる。
本酵素は,EDTAにより部分的に阻害される（最大阻害
率約72％）。このEDTAによる阻害は，金属イオンを低濃
度で添加することにより（10-3〜10-4MのCa2+,Mg2+など
を添加）完全に回復した。
上記の結果から，本酵素は典型的なセリンプロテアー
ゼであり，その安定性に金属イオンが関与していると考
えられる。
（５）分子量 SDS−PAGE（15％ゲル,1.0mm;分子量マーカー:Amersha
m製RAINBOWTWProtein Molecular Weight Marker）によ
り分子量の測定を行った結果，本酵素の分子量は26,000
と算出された。後述する本酵素の遺伝子配列分析から明
らかとなったアミノ酸配列をもとにしてその分子量を計
算すると23,567となり,SDS−PAGEの値とはやや異なる。
しかし，後述のタンパク化学的各種分析（アミノ酸組
成,N末端配列,C末端近傍のアミノ酸組成）の結果は，遺
伝子配列から明かとなった性状と良く一致する。従っ
て,SDS−PAGEにより得られた分子量は本来の分子量より
少し高く現れていると考えられる。
（６）等電点 ファルマシア社製FAST System（Pharmalite;pH3.0−1
0.0）を用いて調べた結果，本酵素の等電点はpH9.0以上
となり，正常な値は得られなかった。
（７）アミノ酸組成 本酵素を4Mメタンスルホン酸〔0.2％の３−（２−ア
ミノエチル）インドールを含む〕を用いて110℃で所定
の時間（24,48および72時間）加水分解した。それぞれ
の加水分解産物を日立アミノ酸分析機（Model 835）に
かけてアミノ酸分析を行った。その結果を表２に示す。
表２には，加水分解によるアミノ酸の破壊を補正した値
を示した。本酵素のDNA配列（後述）から明らかとなっ
たアミノ酸配列をもとにして算出したアミノ酸組成もあ
わせて表２に示す。これらの結果はよく一致することが
明らかである。
（８）アミノ酸部分配列 アミノ酸Ｎ末端配列 アプライド バイオシステムズ社477A Protein Seque
ncerを用いてＮ末端付近のアミノ酸配列分析を行った。
分析にあたっては，予めDFPで阻害された本酵素を用い
た。Ｎ末端から23残基までのアミノ酸配列を表３に示
す。
Ｃ末端アミノ酸配列 予めDFPで阻害した本酵素に，カルボキシペプチダー
ゼＡ（CPase A）またはカルボキシペプチダーゼＹ（CPa
se Y）を作用させ，遊離するアミノ酸を日立アミノ酸分
析機（Model 835）で定量した。その結果，いずれのCPa
seを用いた場合にもＣ末端を決定することができなかっ
た。しかし,C末端付近にGlu,Ser,Ala,Asnなどが存在す
ることが確認された。
V.BLaseをコードするDNA配列の決定 以下に，本発明を説明するうえで用いられる用語を説
明する。
“オリゴヌクレオチド”とは，短い一本鎖DNAを意味
する。オリゴヌクレオチドは，既知の方法により化学合
成することができる。本発明に用いるオリゴヌクレオチ
ドは，特に明示しない限り，化学合成され，セファデッ
クスG50を用いたゲルクロマトグラフィーおよび逆相シ
リカゲルカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー
（HPLC）により精製して得られる。
“PCR"とは，ポリメラーゼチェインリアクション（Po
lymerase chain reaction）の略であり,DNA上の一定の
領域を酵素的に増幅させる方法を意味する（Saikiら,Sc
ience,239,487−497（1988））。まず，増幅したいDNA
を熱変性させて一本鎖とし，この一本鎖の鋳型DNAのそ
れぞれの３′末端領域に相補的なオリゴヌクレオチドプ
ライマー（センス鎖およびアンチセンス鎖の２種類）を
アニーリングさせる。次に,DNAポリメラーゼの作用によ
ってそれぞれのプライマーからDNA鎖の伸長反応を行わ
せる。この一連の反応を繰り返すことにより，目的のDN
Aを10万倍〜100万倍に増幅することができる。
“サザン分析”とは，ある制限酵素によって切断して
得たDNA断片に目的の遺伝子が含まれているかどうかを
検定するための方法である。サザン分析を行うには，ま
ず二本鎖DNA上の特異的な塩基配列を認識してDNAを切断
する制限酵素でDNAを消化する。得られた消化物の１％
アガロースゲル電気泳動を行い，アルカリ処理より変性
させて１本鎖とし，ナイロンフィルターに移す。一方，
問題とする遺伝子の一部でありオリゴヌクレオチドもし
くはDNA断片を準備し，標識を施してプローブとする。
このプローブとナイロンフィルター上の１本鎖DNAとの
ハイブリッド形成により分析がなされる。
“ライゲーション（結合）”とは,2個の二本鎖DNA断
片の間にホスホジエステル結合を形成させることを意味
する。その際，二本鎖DNA断片自身の自己結合を防止す
るため，一方の断片の脱リン酸処理を常法（T.Maniatis
ら,Molecular Cloning,133−134（1982））により行っ
ておく。ライゲーションは，既知の緩衝液および反応条
件を用い,T4DNAリガーゼにより行うことができる。
“形質転換”とは，外来性の遺伝子（DNA）を細胞
（宿主細胞）内に導入することにより，該細胞の遺伝形
質が変化する現象を指す。形質転換後の細胞は形質転換
体と呼ばれ，外来DNAを該細胞の染色体外成分として，
または染色体に組み込まれて，複製され得る状態で有す
る。
次に，本発明のBLaseをコードするDNA配列の決定方法
を，工程の順に説明する。このDNA配列は，バシラス
リケニホルミス ATCC 14580株のゲノムDNAを,PCR解
析，サザン分析，直接シークエンス法などを組み合わせ
て分析することにより決定された。
（１）ゲノムDNA内部配列のPCR解析 BLaseをコードするDNA配列は，例えば，ゲノムDNAか
ら得ることができる。それには，まずバシラス リケニ
ホルミス ATCC 14580株のゲノムDNAを，該菌株の培養
細胞から既知の方法（M.Stahlら,Journal of Bacteriol
ogy,154,406−412（1983））に従って調製する。このゲ
ノムDNAを,PCR解析の鋳型DNAとして用いる。PCRに用い
るオリゴヌクレオチドプライマーは，上記IV項（８）で
得られる精製酵素のＮ末端付近のアミノ酸配列；および
該酵素を部分分解して得られるペプチドのアミノ酸配列
に基づいて，常法により合成することができる。例え
ば,BLaseのアミノ酸配列のＮ末端側第12位から19位に相
当するアミノ酸配列Thr Asn Thr TRh Ala Tyr Pro Tyr
をコードするオリゴヌクレオチド（但し,C末端のTyrの
コードするトリプレットの２番目の塩基まで;23mer）を
センスプライマーBL8とする。
これとは別に，上記精製酵素をリジルエンドペプチダ
ーゼで部分分解して得られたペプチドを配列決定したな
かで，最も信頼度の高いペプチドを選び，これをもとに
オリゴヌクレオチドを合成する。後述の実施例２に述べ
られているようにGly Tyr Pro Gly Asp Lysの配列が得
られたので，このアミノ酸配列をコードするオリゴヌク
レオチドに相補的な18merをアンチセンスプライマーBL8
3とする。
上記ゲノムDNA,センスプライマーBL8,およびアンチセ
ンスプライマーBL83を用いてPCRを行うことにより，ゲ
ノムDNA中の目的DNA鎖が伸長され，増幅される。得られ
たPCR産物をアガロースゲル電気泳動により解析する
と，約370bp長のDNA断片が得られる。このDNA断片を適
当なベクターに組み込み，サブクローニングを行なった
後，サンガー法によりDNA配列が決定される。上記アン
チセンスプライマーBL83の作成の基本となったアミノ酸
配列Gly Tyr Pro Gly Asp Lysは131〜136位に位置する
アミノ酸であることがわかる。
（２）ゲノムDNAのサザン分析 上記（１）項で調製したバシラス リケニホルミス
ATCC 14580株由来のゲノムDNAを，制限酵素Sal Iで消化
し，これをアガロースゲル電気泳動にかけて分離した
後，該DNA断片をナイロンメンブランフィルターにブロ
ッティングし，サザン分析を行う。ハイブリダイゼーシ
ョン用プローブは，（１）項で得られるBL8−BL83のPCR
産物を32P−dCTPを常法により標識して用いる。このBL8
−BL83とハイブリダイズした陽性DNA断片は，約3.1kbの
バンドとして認められる。
（３）PCR法によるゲノムDNAの塩基配列の決定 （１）項で得られたバシラス リケニホルミス ATCC
14580株のゲノムDNAをSal Iで消化し，これを適当なベ
クター，例えばpUC119ベクターに組み込み，既知のDNA
配列の一部分をプライマーとして用いPCR反応を行う。
例えば，上記ゲノムDNAの上流側に位置するpUC119のDNA
配列の一部をセンスプライマーRVとし，上記（２）項で
解析された375bpのDNA断片の３′末端付近の配列に相補
的なDNA配列をアンチセンスプライマーB125とする。
上記PCR反応を行なうことにより約1050bpのDNA断片が
得られる。このDNA断片の配列は，直接DNA塩基配列決定
法〔Gibbsら,Pro.Natl.Acad,Sci.86,1919−1923（198
9）〕により決定される。このようにしてBLaseをコード
するDNA配列のＮ末端から中途部分までの配列が決定さ
れる。
次に，下記の方法により，ゲノムDNAの３′末端側の
配列の決定が行われる。まず，上記と同様に，バシラス
リケニホルミスATCC 14580株のゲノムDNAをSal Iで消
化し，約3.1kbの断片を単離する。これをM13mpllに組み
込み,PCR反応を行う。プライマーとしては，（２）項で
解析された375bpのDNA断片の一部（上記アンセンスプラ
イマーB125よりも上流側）の配列がセンスプライマーB4
0として，そして，ゲノムDNAの下流側に位置するM13mpl
lのDNA配列の一部に相補的なDNA配列がアンチセンスプ
ライマーM4として用いられる。
上記PCR反応を行なうことにより約2.2kbのDNA断片が
得られる。このDNA断片の配列は，直接DNA塩基配列決定
法により決定される。このようにして，ゲノムDNAの
３′末端から中途部分までの配列が決定される。
このようにして決定されたBLaseの全DNA配列およびそ
れにより決定されるアミノ酸配列を第１図に示す。第１
図から，本発明のバシラス リケニホルミス由来の成熟
タンパクをコードする遺伝子は，−94位のfMetから−１
位のLysまでの94個のアミノ酸でなるシグナルペプチド
をコードするDNA配列；および＋１位のSerから＋222位
のSerまでの222個のアミノ酸でなる成熟タンパクをコー
ドするDNA配列を有することがわかる。通常はATGがfMet
をコードするが，ここではTTGが翻訳開始コドンである
と考えられる。５′非翻訳領域のSal I部位から332bpの
範囲には，−35領域およびプリブナウ配列を含むプロモ
ーター領域およびSD配列が存在（上記推定翻訳開始コド
ンTTGの９塩基上流に存在）する。３′非翻訳領域に
は，終止コドンTAAから８塩基下流に,13塩基対からなる
逆向き反復配列が存在する。
VI.発現ベクターの構築 本発明の発現ベクターの一例であるpHY300BLttは，第
３図に示すように，バシラス サチリス ATCC 6051株
由来のアルカリ性プロテアーゼのターミネーターを有す
るシャトルベクターであるpHY300PLKttに，第１図で示
される本発明のBLaseをコードするDNA断片（プロモータ
ー，シグナルペプチドをコードするDNA配列,BLase成熟
タンパクをコードする配列，およびターミネーターを含
む）を組み込むことにより得られる。上記pHY300PLKtt
は，第４図に示すように，大腸菌と枯草菌のシャトルベ
クターであるpHY300PLKに，バシラス サチリス ATCC
6051株由来のアルカリ性プロテアーゼのターミネーター
を組み込むことにより得られる。
上記工程を順に説明すると，まず，第４図に示すよう
に，バシラス サチリス ATCC 6051株からM.Stahlらの
方法（前出）によりゲノムDNAを単離し，これを鋳型DNA
とする。次にプライマーとして，バシラス サチリス
Ｉ−168株由来のアルカリプロテアーゼの遺伝子のター
ミネータ部分の５′末端付近に相当し,Xba I部位が付加
されたDNA配列でなる断片および３′末端部分に相当し,
Hind III部位が付加されたDNA配列に相補的なDNA配列で
なる断片を化学合成し，これを用いてPCR反応を行な
う。得られたDNA断片を,Xba IおよびHind IIIで分解
し，第４図に示す断片を得る。次に,pHY300PLKをXba
IおよびHind IIIで分解し，大きい方の断片を得る。
これらの断片およびを連結することにより，バシラ
ス サチリス ATCC 6051株由来のアルカリ性プロテア
ーゼのターミネータを有するシャトルベクターpHY300PL
Kttが構築される。
次に，バシラス リケニホルミス ATCC 14580株由来
の培養細胞からゲノムDNAを単離し，これを鋳型DNAとす
る。このDNA配列の５′末端付近に相当し,EcoR I部位が
付加されたDNA配列でなる断片および３′末端付近に相
当し,Xba I部位が付加されたDNA配列に相補的なDNA配列
でなる断片を合成し，これらをセンスプライマーおよび
アンチセンスプライマーとする。上記鋳型DNA,およびセ
ンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いて
PCR反応を行なう。得られた断片をEcoR IおよびXba Iで
切断し,BLaseをコードするDNA断片が得られる（第３
図）。この断片は，プロモーター，シグナルペプチド
をコードするDNA配列，成熟BLaseをコードするDNA配
列，およびターミネータを有する。次に，上記pHY300PL
KttをEcoRとXba Iとで分解し，大きいほうの断片が得
られる。上記断片およびを連結することにより，本
発明の発現ベクターであるpHY300BLttが得られる（第３
図）。
この発現ベクターpHY300BLttは,BLaseのプロモーター
支配下に,BLaseの−94位のfMETから−１位のLysでなる
シグナルペプチドをコードするDNA配列，＋１位のSerか
ら＋222位のGlnでなる成熟タンパクをコードするDNA配
列，その下流に存在するターミネーターを有する３′非
翻訳領域を有し，さらにその下流にはバシラス サチリ
ス ATCC 6051株由来のアルカリ性プロテアーゼのター
ミネーターを有する。
VII.形質転換体の調製およびBLaseの製造 VI項で得られた発現ベクターは，常法により適当な宿
主細胞に導入される。例えば，上記pHY300BLttは枯草菌
ISM 1214株（宝酒造）に,J.Spizienらの方法〔Proc.Nat
l.Acad.Sci.44,1072（1958）〕により導入される。得ら
れた形質転換体（Bacillus subtilis pHY300BLtt/ISW 1
214）は，宿主に適した培地で培養することにより，本
発明のBLaseを産生する。この形質転換体の培養物か
ら，前述のII項に記した方法によりBLaseが単離，精製
される。
（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。
実施例１ バシラス リケニホルミス ATCC 14580株を,2.0％グ
ルコース,2.0％ソイビーンミール,0.25％コーンスティ
ープリカー,0.5％（NH4）2SO4,0.05％K2HPO4,0.05％MgS
O4・7H2O,0.01％FeSO4・7H2O,および0.3％CaCO3を含むp
H7.0の培地で28℃にて36時間培養した。培養液95Lをフ
ィルタープレスし，限外濾過モジュール（ニットー限外
濾過モジュールNTU 2020T P18B（HF）,MW 20,000 Cut）
および遠心分離機（4200rpm,30分）を用いて約14Lに濃
縮した。この濃縮除菌液を2mM CaCl2水溶液で希釈して
約28L,1.90ms/cmとし，次いでHClを加えてpH6.0とし
た。これに2mM CaCl2を含む10mMアセテートバッファー,
pH6.0で平衡化したAmberlite CG−50約4Lを加え,4時間
室温にて攪拌した。上清にBLase活性のないことを確認
してからデッカンテーションにより上清を捨て,Amberli
te CG−50をガラスカラム（14×32cm）に充填した。
約10Lの10mMアセテートバッファー（pH6.0,2mM CaCl2
を含む）で洗浄後,0.5M酢酸ナトリウムバッファー（pH
8.5,2mM CaCl2を含む）で溶出した。
Amberlite CG−50より溶出したBLase活性分画を集め
（2.7L），これを水に対して２昼夜透析した。透析内物
を2mM CaCl2で8Lに希釈し（2.23ms/cm）,pH6.0に調整
後，カラム（５×40cm）に充填した約800mlのＳ−セフ
ァロース（2mMのCaCl2を含有する5mMアセテートバッフ
ァー,pH6.0であらかじめ平衡化）に吸着させた。次い
で，このカラムを上記平衡化に用いた衝撃液約5Lで洗浄
後,0〜0.2M CaClを含む緩衝液7Lで直線濃度勾配により
溶出した。BLase活性を折つ分画を集め（900ml）,2mM C
aCl2水溶液に対して一晩透析した（約950ml,0.86ms/c
m）。この透析内物をpH7.5に調整後，速やかにアフィニ
ティークロマトグラフィーを行った。上記アフィニティ
ークロマトグラフィーにおいて，担体としてはCHセファ
ロース4B（Phe Leu−Ｄ−GluOMe）約340mlを用い，これ
を３×48cmのカラムに充填して,2mMのCaCl2を含む5mM T
ris−HCl,pH7.5,で平衡化したものを用いた。上記透析
内物をカラムに吸着させた後，平衡化に使用したものと
同様の緩衝液約5Lで洗浄後,NaClを０〜0.7Mの割合で含
む同緩衝液3.5Lを用いて直線温度勾配により溶出を行な
った。
採取した各フラクションのBLase活性を，活性測定法
に準じて測定した。その結果を第５図に示す。別に，各
フラクションの280nmにおける吸光度を測定して，タン
パク濃度の目安とした。その結果をあわせて第５図に示
す。第５図から明らかなように,NaCl濃度が0.5M付近で
溶出される。得られたBLaseはSDS−PAGEで単一なバンド
を示した。このようにして，培養液95Lより比活性1.9×
103〜２×103U/mgの酵素標品833.1mg（Bio Rad Protein
assay kitで定量）が得られ，酵素活性の収率は275％で
あった。
実施例２ BLaseをコードするDNAの配列決定 （１）ゲノムDNAの内部配列のPCR解析 実施例１で得られた精製BLase（DEP処理済）100μｇ
を,1M尿素を含む0.05Mトリス−塩酸（pH9.0）150μｌ中
において,1μｇのリジルエンドペプチダーゼ（和光純
薬）で37℃で５時間消化した。酵素消化物を,TSKgel OD
S−120Tのカラム（TOSOH,4.6×250mm）を用いた高速液
体クロマトグラフィーで分解精製した。得られた消化断
片のアミノ酸配列を，アプライド バイオシステムズ社
製477A型プロテインシーケンサーで調べた。５種類の断
片のアミノ酸配列が決定され，そのうちの３種を下記に
記す。
Gly−Tyr−Pro−Gly−Asp−Lys （Ｉ） Ala−Ile−Val−His−Ile （II） Ser−Thr−Arg−Tyr−Phe−Ile−Pro−Ser （III） 次に，バシラス リケニホルミス ATCC 14580株の培
養細胞から,M.Stahlら（前出）の方法に従ってゲノムDN
Aを調製し，該DNAをPCR解析に用いる鋳型DNAとした。PC
Rに用いるオリゴヌクレオチドプライマーは，バシラス
リケニホルミス ATCC 14580株が生産するBLaseの既
知部分のアミノ酸配列に基づいて作成した。まず,BLase
のアミノ酸配列のＮ末端から第12位〜第19位のアミノ酸
配列（表３参照）Thr Asn Thr Thr Ala Tyr Pro Tyrを
コードするオリゴヌクレオチド（但し,C末端のTyrをコ
ードするトリプレットの２番目の塩基まで;23mer）を化
学合成し，これをセンスプライマーBL8とした。
次に，上記リジルエンドペプチダーゼの消化産物のう
ち最も信頼度が高いと考えられるアミノ酸配列（Ｉ）Gl
y Tyr Pro Gly Asp Lysをコードするオリゴヌクレオチ
ドに相補的な18merを化学合成し，アンチセンスプライ
マーBL83とした。
上記鋳型DNAおよびオリゴヌクレオチドプライマーを
用いて,PCR法〔Saikiら,Science 239,487−491（198
9）〕によりDNAを増幅させた。増幅産物の一部を１％ア
ガロースゲル電気泳動で分析したところ，約370bpのDNA
断片が確認された。この断片を単離し，クレノー断片で
処理することにより平滑末端とした後,Sma Iで消化され
たM13mpllにサブクローニングし，サンガー法〔Sanger
ら,Proc,Natl.Acad.Sci,74,5463−5467（1977）〕によ
りDNA配列を決定した。その結果,375bpのDNA配列が決定
され,BL83に相当するアミノ酸配列は131〜136位に位置
することがわかった。さらに上記（II）および（III）
のアミノ酸配列は21〜25位，および79〜86位にそれぞれ
存在することがわかった。
（２）ゲノムDNAのサザン分析 上記（１）項で調製したバシラス リケニホルミス
ATCC 14580株由来のゲノムDNAを，制限酵素Sal Iで消化
し，これを１％アガロースゲル電気泳動にかけて分離し
た後，該DNA断片をナイロンメンブランフィルターにブ
ロッティングし，サザン分析を行なった。ハイブリダイ
ゼーション用プローブとしては，（１）項で得られるBL
8−BL83のPCR産物を32P−dCTPを常法により標識したも
のを用いた。このBL8−BL83 PCR産物とハイブリダイズ
した陽性DNA断片は，約3.1kbのバンドとして認められ
た。
（３）PCR法によるゲノムDNAの塩基配列の決定 （１）項で得られたバシラス リケニホルミス ATCC
14580株のゲノムDNAをSal Iで消化し,T4DNAポリメラー
ゼで平滑末端とした。これを脱リン酸化されたpUC119 S
ma I消化ベクターに連結した。この連結反応は，市販の
キット（宝酒造）を用いて行なった。
次に下記のセンスプライマーRVおよびアンチセンスプ
ライマーB125を化学合成し，上記連結反応の反応液の一
部に加えてPCR反応を行なった。
センスプライマーRVは，上記ゲノムDNAの上流側に位
置するpUC119のDNA配列の一部であり，アンチセンスプ
ライマーB125は，上記（２）項で解析された375bpのDNA
断片のＣ末端付近の配列に相補的なDNA配列である。
上記PCR反応を行なうことにより約1050bpのDNA断片が
得られた。このDNA断片の配列を，直接DNA塩基配列決定
法〔Gibbsら,Pro.Natl.Acad,Sci.86,1919−1923（198
9）〕により決定した。このようにして本酵素をコード
するDNA配列のＮ末端から中途部分までの配列が決定さ
れた。
（１）項で得られたバシラス リケニホルミス ATCC
14580株のゲノムDNAをSal Iで消化し,1％アガロースゲ
ル電気泳動にかけて，約3.1kbのDNA断片を単離した。こ
れをクレノー断片により平滑末端とし，次いで脱リン酸
化されたM13mpll Sma I消化断片と連結された。これを
鋳型としてPCR反応を行なった。プライマーとしては，
（２）項で解析された375bpのDNA断片の配列の一部（プ
ライマーB125よりも上流側）をセンスプライマーB40と
して，そして，ゲノムDNAの下流側に位置するM13mpllの
DNA配列の一部に相補的なDNA配列をアンチセンスプライ
マーM4として用いた。
上記PCR反応を行なうことにより約2.2kbのDNA断片が
得られた。このDNA断片の配列は，直接DNA塩基配列決定
法により決定された。このようにして，ゲノムDNAの
３′末端から中途部分までの配列が決定された。
このようにして決定されたBLaseの全DNA配列およびそ
れにより決定されるアミノ酸配列を第１図に示す。
（４）発現ベクターの構築 シャトルベクターpHY300PLKttの構築 バシラス サチリス ATCC 6051株からM.Stahlらの方
法（前出）によりゲノムDNAを単離し，これを鋳型DNAと
する。次に，プライマーとして，バシラス サチリスＩ
−168株由来のアルカリプロテアーゼの遺伝子のターミ
ネーター部分の５′末端付近の配列に相当し,Xba I部位
が付加されたDNA配列の断片（センスプライマーＡ）お
よび３′末端付近の配列に相当しHind III部位が付加さ
れたDNA配列に相補的なDNA配列の断片（アンチセンスプ
ライマーＢ）を化学合成した。
上記鋳型DNAと，これらプライマーとを用いてPCR反応
を行った。得られたDNA断片を,Xba IおよびHind IIIで
分解し，第４図に示す断片を得た（第４図参照）。次
に，シャトルベクターpHY300PLK（宝酒造）をXba Iおよ
びHind IIIで分解し，大きい方の断片を得た（第４図
参照）。これらの断片およびを連結することによ
り，バシラスサチリスATCC 6051株由来のアルカリ性タ
ーミネーターを有するシャトルベクターpHY300PLKttが
得られた。
発現ベクターpHY300BLttの構築 バシラス リケニホルミスATCC 14580株の培養細胞か
らM.Stahlらの方法（前出）によりゲノムDNAを単離し，
これを鋳型DNAとした。このDNA断片の５′末端付近に相
当し,EcoR I部位が付加された１本鎖DNA断片および３′
末端付近に相当しXba I部位が付加されたDNA配列に相補
的な１本鎖DNA断片を合成し，これらをセンスプライマ
ーＣおよびアンチセンスプライマーＤとした。
上記鋳型DNAおよびセンスプライマーＣおよびアンチ
センスプライマーＤを用いてPCR反応を行った。得られ
た断片をEcoR IおよびXba Iで切断し,BLaseをコードす
るDNA断片を得た（第３図）。次に，上記pHY300PLKtt
をEcoR IとXba Iとで分解し，大きい方の断片を得
た。上記断片およびをT4DNAリガーゼを用いて連結
させた。連結混合物を用いて,E.coli K−12（C600株）
を形質転換し，これをアンピシリン含有平板寒天培地上
で培養し，アンピシリン耐性コロニーを得た。この菌体
からプラスミドDNAを単離し，上記DNA断片が正しい方
向に挿入されていることを，制限酵素切断パターンによ
り確認した。
（５）形質転換体の調製およびBLaseの製造 上記（４）項で得られた発現ベクターPHY300BLttを枯
草菌ISW1214株（宝酒造）に,J.Spizizenらの方法〔Pro
c.Natl.Acad.Sci.44,1072（1958）〕により導入した。
得られた形質転換体を，テトラサイクリン含有平板寒天
培地上で培養し，テトラサイクリン耐性菌（バシラス
サチリスpHY300BLtt/ISW1214）を得た。
この形質転換体（バシラス サチリスpHY300BLtt/ISW
1214）をLB培地（トリプトン10g,イーストエクストラク
ト5gおよびNaCl 5gに水を加えて1Lとする;pH7.2）5mlに
植菌し,37℃で18時間振盪培養した。この培養液1mlを，
次に示すSc+培地（120℃にて20分間オートクレーブで滅
菌済）10mlに加えて28℃で振盪培養を行って。
上記培養液を2500×ｇで５分間遠心分離し，上清を得
た。この上清のBLase活性を，発明の詳細な説明の項に
記載の活性測定法により測定した。その結果を表４に示
す。培地1Lあたりのタンパク質は,BLaseの比活性を2500
単位/mgとして換算した。
（発明の効果） 本発明によれば，ポリペプチドのアミノ酸配列中のグ
ルタミン酸残基のＣ末端を特異的に開裂する新規プロテ
アーゼ，該プロテアーゼのバシラス属菌からの製造方
法，該プロテアーゼをコードするDNA配列，該DNA配列を
有する発現ベクター，該発現ベクターを導入して得られ
る形質転換体，および該形質転換体を用いたプロテアー
ゼの製造方法が提供される。このようなプロテアーゼ
は，タンパクの分析，融合タンパクの所望の部位でのペ
プチド鎖の切断など，種々の目的に利用され得る。
【図面の簡単な説明】 第１図は，本発明のプロテアーゼのDNA配列および該配
列から推定されるアミノ酸配列を示す配列図である。 第２図は，バシラス サチリス Ｉ−168株由来のアル
カリ性プロテアーゼのDNA配列を示す配列図である。 第３図は，本発明の発現ベクターであるpHY300BLttの構
築を示す概略図である。 第４図は，上記pHY300BLttの構築に用いるシャトルベク
ターpHY300PLKttの構築を示す概略図である。 第５図は，バシラス リケニホルミスATCC 14580株培養
物の精製工程において，アフィニティーカラムからのBL
aseの溶出の過程を示すグラフである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:10） (72)発明者 ▲吉▼田 信男 兵庫県西宮市甲子園三番町５―８ (72)発明者 続木 博茂 京都府綴喜郡田辺町大住ケ丘５―12―15 (72)発明者 藤原 孝司 奈良県奈良市帝塚山３丁目７―２ (72)発明者 松本 浩一 大阪府豊中市東豊中町６―11 東豊中団 地72―401 (56)参考文献 特表 平５−505524（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，104（３）, 451−456（1988) 生化学，61（９），833（1989) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C12N 15/00 - 15/90 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の配列における＋１位のSerから＋222
    位のGlnまでのアミノ酸配列を含む，バシラス リケニ
    ホルミス（Bacillus licheniformis）由来のプロテア
    ーゼであって，ペプチドのグルタミン酸残基のカルボキ
    シル基を含むペプチド結合を切断する，プロテアーゼ：
  2. 【請求項２】バシラス リケニホルミス ATCC 14580
    株由来である，請求項１に記載のプロテアーゼ。
  3. 【請求項３】次の性質を有する請求項１に記載のプロテ
    アーゼ： （１）至適pH範囲：約8.0;および （２）安定pH範囲:25℃において6.5〜8.5。
  4. 【請求項４】以下の配列における＋１位のSerから＋222
    位のGlnまでのアミノ酸配列を有し，ペプチドのグルタ
    ミン酸残基のカルボキシル基を含むペプチド結合を切断
    する，プロテアーゼ：
  5. 【請求項５】請求項１または４に記載のプロテアーゼを
    コードするDNA配列。
  6. 【請求項６】以下の配列における605位のＴから1270位
    のＡまでの塩基配列を有する請求項５に記載のDNA配
    列：
  7. 【請求項７】以下の配列における−94位のfMetから＋22
    2位のGlnまでのアミノ酸配列を含むプロテアーゼをコー
    ドする，請求項５に記載のDNA配列：
  8. 【請求項８】以下の配列における323位のＴから1270位
    のＡまでの塩基配列を有する請求項７に記載のDNA配
    列：
  9. 【請求項９】請求項５に記載のDNA配列を有する発現ベ
    クター。
  10. 【請求項１０】バシラス属菌において発現可能な，請求
    項９に記載の発現ベクター。
  11. 【請求項１１】請求項９に記載の発現ベクターを宿主に
    導入して得られる形質転換体。
  12. 【請求項１２】前記宿主が，バシラス属菌である，請求
    項11に記載の形質転換体。
  13. 【請求項１３】請求項１または４に記載のプロテアーゼ
    を産生し得るバシラス リケニホルミスを培地中で培養
    する工程，および生産されたプロテアーゼを該培地から
    採取する工程を包含する，プロテアーゼの製造方法。
  14. 【請求項１４】請求項11に記載の形質転換体を培養する
    工程，および生産されたプロテアーゼを該培地から採取
    する工程を包含する，プロテアーゼの製造方法。
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