DE2342912C2

DE2342912C2 - Herstellung von L-Histidin

Info

Publication number: DE2342912C2
Application number: DE2342912A
Authority: DE
Inventors: Hirotaka Kamijo; Koji Kubota; Osamu Kawasaki Kanagawa Mihara; Hiroshi Musashino Tokyo Okada; Shinji Tokyo Okumura
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1972-08-25
Filing date: 1973-08-24
Publication date: 1983-04-07
Also published as: JPS4941592A; DE2342912A1; GB1431593A; JPS5123593B2; FR2197066A1; US3875001A; FR2197066B1

Description

Brevibacterlum flavum FERM-P 1561 (Arginin), FERM-P 1562 (Methionin), FERM-P 1563 (Tryptophan), FERM-P 1564 (Uracll), FERM-P 2168 (Shikimisäure), FERM-P 2169 (Xanthin), FERM-P 2170 (Threonin), Brevibacterlum lactofermemum FERM-P 1565 (LEUCIN), FERM-P 1566 (Leucin und Tryptophan), FERM-P 1567 (Leucin und Phenylalanin), FERM-P 1568 (Phenylalanin) und/oder Corynebacterium acetoacldophllum FERM-P 1569 (Lysin).

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Hlstldln durch Kultivieren eines Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedluni, welches Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff, geringe Mengen von anorganischen Salzen einschließlich einer spezifisch erforderlichen Substanz oder Substanzen enthält, bis sich L-Histldin In dem Medium ansammelt und Gewinnen des angesammelten L-Histldins aus dem Medium.

Aus der US-PS 37 16 453 Ist bekannt, daß Histidin durch Fermentation von herkömmlichen Kulturmedien durch Mikroorganismen der Arten Brevibacterlum, Corynebacterlum und Arthrobacterlum, welche künstlich Induzierte Mutanten von Stämmen sind, die bei den gleichen Bedingungen zur Bildung von Histidin nicht fähig sind, hergestellt werden kann. Diese Mutanten sind gegenüber 2-Thlazolalanln In Konzentrationen von mehr als 1 mg/ml des Kulturmediums beständig.

Der Erfindung Hegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur fermentatlven Herstellung von L-Hlstldin (nachstehend auch kurz als Histidin bezeichnet) zur Verfügung zu stellen, das eine bessere Produktionsleistung erbringt als das bekannte Verfahren. Es wurde nun gefunden, daß bestimmte Mutanten der Arten Brevibacterlum und Corynebacterium, bei denen eine Beständigkeit gegenüber 2-Thlazolalanln mit speziellen Nährstofferfordernissen kombiniert Ist, außerordentlich gute Befähigung zur fermentatlven Erzeugung von Histidin zeigen.

Gegenstand der Erfindung Ist somit ein Verfahren zur Herstellung von L-Hlstldln durch Kultivieren eines Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen In einem wäßrigen Nährmedium, welches Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff, geringe Mengen von anorganischen Salzen einschließlich einer spezifisch erforderlichen Substanz oder Substanzen enthält, bis sich L-Hlstldln In dem Medium ansammelt und das Gewinnen des angesammelten L-Hlstldlns aus dem Medium.

Das Verfahren 1st dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus die nachstehenden Stämme einsetzt, wobei der jeweilige Klammerausdruck die spezifisch erforderliche Substanz bzw. Substanzen nennt:

Brevibacterlum flavum FERM-P 1561 (Arginin), FERM-P 1562 (Methionin), FERM-P 1563 (Tryptophan), FERM-P 1564 (Uracll), FERM-P 2168 (Shikimisäure), FERM-P 2169 (Xanthin), FERM-P 2170 (Threonin), Brevibacterlum lactofermentum FERM-P 1565 (Leucin), FERM-P 1566 (Leucin und Tryptophan), FERM-P 1567 (Leucin und Phenylalanin), FERM-P 1568 (Phenylalanin) und/oder Corynebacterium acetoacidophilum FERM-P 1569 (Lysin).

Die erfindungsgemäß verwendeten Mutanten werden aus den entsprechenden Ausgangsstämmen bzw. Stammstämmen durch herkömmliche Methoden hergestellt, die zum Teil In der genannten Patentschrift beschrieben werden. Beispiele hierfür sind die Aussetzung des Ausgangs-Stammes gegenüber einer ionisierenden Strahlung (Ultraviolettstrahlung, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen) oder gegenüber chemischen mutagenen Mitteln (Natrlumnitrlt, Nitrosuguanldln, Dläthylsulfat). So führt In typischer Welse das Aussetzen gegenüber 250 μg/ml Nltrosoguanl- > din bei 30° C über einen Zeltraum von 30 Minuten zu dem gewünschten Effekt.

Die erzeugten Mutanten werden auf ein sonst herkömmliches Kulturmedium Inokuliert, welches genügend 2-Thlazolalanin enthält, daß das Wachstum des Stammstammes bzw. Ausgangsstammes unterdrückt wird. Dies erfordert Im allgemeinen mehr als 1 mg 2-Thiazolalanln/ml, wobei die besten Hlstldln-erzeugenden Stämme auf Medien wachsen können, die 5 mg 2-Thlazolalanln je ml enthalten. Die beständigen Stämme werden gesammelt und sie können einer weiteren Behandlung mit mutagenen Mitteln unterworfen werden. Die Stämme, welche die oben angegebenen spezifischen Nährstoffe erfordern, werden sodann In herkömmlicher Weise aus der ersten oder zweiten Generation von Mutanten ausgewählt.

Diese Stämme erzeugen alle Hldlstin durch eine aerobe Fermentation von herkömmlichen wäßrigen Kulturmedien, die assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff und geringere Mengen von anorganischen SaI-zen und organische Nährstoffe mit Einschluß der spezifisch erforderlichen Substanz oder Substanzen enthalten. Die /υ r Durchführung des Verfahrens geeigneten Hldistln-erzeugenden Stämme, die derzeit verfügbar sind, sind untenstehend mit Ihrer Hinterlegungsnummer (FERM-P) beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology at Inage, Chlba-shl, Japan und den In Klammern angegebenen spezifischen Nährstoffen aufgeführt. Sie leiten sich von B. flavum ATCC 14067, B. lactofermentum ATCC 13869 und C. acetoacidophilum ATCC 13870 ab.

Brevlbacterium flavum

FERM-P 1561 (Arginin)

FERM-P 1562 (Methionin)
FERM-P 1563 (Tryptophan)

FERM-P 1564 (Uracll)

FERM-P 2168 (Shikimisäure)

FERM-P 2169 (Xanthin)

FERM-P 2170 (Threonin)
Brevibacterlum lactofermentum

FERM-P 1565 (Leucin)

FERM-P 1566 (Leucin und Tryptophan) FERM-P 1567 (Leucin und Phenylalanin)

FERM-P 1568 (Phenylalanin) Corynebacterlum acetoacldophllum FERM-P 1569 (Lysin)

Geeignete Kohlenstoffquellen für die Fermentationsmedien sind z. B. Kohlehydrate (Glucose, Saccharose, Stärkehydrolysat, Melassen, Stärke), organische Säuren (Essigsäure, Fumarsäure, Benzoesäure, Milchsäure, GIuconsäure und Fettsäuren) und Alkohole (Äthanol, Propanol, Butanol, Glycerin, Sorbit, Mannit).

Zur Erzielung einer guten Ausbeute an Histidin wird die Fermentation aerob unter Belüftung und Durchbewegung durchgeführt. Beste Ergebnisse erfordern einen pH-Wert, der Im Bereich von 5 bis 9 kontrolliert wird. Der gewünschte pH-Wert kann mittels gasförmigem oder wäßrigem Ammoniak, Calciumcarbonat, Alkallmetallhydroxiden, Harnstoff, organischen oder anorganischen Säuren aufrechterhalten werden. Einige dieser Mittel ergeben auch die erforderliche Stickstoffzuführung. Wenn die Fermentation bei 25° bis 37° C durchgeführt wird, dann erreicht die Hlstldin-Konzentratlon in der Brühe innerhalb von 2 bis 7 Tagen ein Maximum.

Das Histidin kann aus dem Kulturmedium durch eine Ionenaustauscherharzbehandlung der bekannten Art gewonnen werden. Eine solche wird z. B. In der US-PS 37 16 453 beschrieben. Darin sind auch die bekannten Methoden zur Identifizierung und zur quantitativen Bestimmung des Produktes beschrieben.

Die Erfindung wird In den Beispielen erläutert. Beispiel 1

30

Brevibacterlum flavum FERM-P 1561 wurde auf Boulllon-Agar-Schrägkulluren kultiviert. Ein wäßriges Fermentationsmedium, das je Deciliter 10 g Glucose, 5 g (NH₄)jSO₄, 0,1 g KH₂PO₄, 0,04 g MgSO₄ · 7H₂O, 0,2 mg FE", 0,2 mg Mn", 50 μg Biotin, 5,0 μg Thlamln ■ HCI, 0,3 ml Sojaprotelnhydrolysat, 50 mg Arginin und 5 g CaCO₃ enthielt, wurde auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. 20 ml-Ansätze des Mediums wurden jeweils in 500 ml Schüttelkolben überführt. Es wurde mit Wasser dampf sterilisiert und danach erfolgte die Inokulierung mit den Mikroorganismen. Jedes Kulturmedium wurde 72 Stunden bei 31° C geschüttelt. Es wurde festgestellt, daß die kombinierten Brühen 1,11 g/dl Histidin enthielten.

Die Mikrobenzellen wurden aus einem Liter der Brühe durcii Zentrifugleren entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde von Histidin befreit, indem sie über ein Säule mit dem stark sauren Ionenaustauscherharz Amberlite IR-120 (Η-Typ) geleitet wurde. Die Säule wurde gewaschen und sodann wurde das Histidin mit einer 3%igen Ammonlumhydroxid-Lösung eluiert. Das Eluat wurde teilweise im Vakuum verdampft. Das aus dem Konzentrat kristallisierte Histidin wurde in einer Menge von 7,3 g gewonnen.

Bei einem Vergleichsversuch wurde B.flavum ATCC 21 406 bei den gleichen Bedingungen In dem gleichen Fermentationsmedium kultiviert. Es wurde in guter Übereinstimmung mit Beispiel 1 der genannten Druckschrift eine Hlstldin-Konzentratlon von 0,40 g/dl erhalten.

Beispiel 2

Die Mikroorganismus-Stämme der FERM-P-Nummern 1562 bis 1569 und 2168 bis 2170 wurden bei den gleichen allgemeinen Bedingungen wie im Beispiel 1 In Fermentationsmedien kultiviert, welche hinsichtlich des Gehaltes von Glucose, Monokallumphosphat, Magnesiumsulfat E'sen(II)- und Mangan(II)-ionen, Thlamlnhydrochlorld und Calciumcarbonat mit dem Medium des Beispiels 1 identisch waren. Die Medien unterschieden sich hinsichtlich Ihrer Anfangskonzentrationen von Biotin, Ammoniumsulfat und Sojaprotelnhydrolysat nach den Angaben der Tabelle I. Zum Teil enthielten sie weitere organische Nährstoffe, die in Tabelle I als Meth. (Methionin), Try. (Tryptophan), Ur. (Uracll), Lys. (Lyslnhydrochlorld), ShIk. (Skiklmlsäure), Xan. (Xanthin), und Thre. (Threonin) abgekürzt sind. In der Tabelle werden auch die In jedem Medium angesammelten Histldlnmengen aufgeführt.

Tabelle I

Stamm FERM-P

Biot.

Amm. sulf.	Soya Prot.	Nährstoff	30	Histid
g/dl	Hydro., g/dl	mg/dl	50	g/dl
5	0,3	Meth.	50	1,08
5	0,3	Try.		1,02
5	0,3	Ur.	30	1,10
3	2,0	-		0,86
3	2,0	Try.		1,04
3	2,0	-	30	0,99
3	2,0	-	40	1,05
5	0,3	Lys.	15	0,52
5	0,3	Shik.	50	0,92
5	0,3	Xan.	0,85
5	0,3	Thre.	1,00

1562 1563 1564 1565 1566 1567 1568 1569 2168 2169 2170

500

Beispiel 3

acetat, 0,2 g Harnstoff, 0,1g KH₂PO₄, 40 mg 65 MgSO₄ · 7H₂O, 0,2 mg Fe", 0,2 mg Mn", 10 ^g Biotin, Die Mlkroorganlsmus-Stämme FERM-P 1561 bis 1569 20 μg Thlamln ■ HCI, 2 ml Sojaprotelnhydrolysat und wurden bei 31° C 20 Stunden In einem Kulturmedium 0,5 g Hefeextrakt enthielt und das auf einen pH-Wert kultiviert, welches je dl 3 g Glucose, 0,3 g Ammonium- von 7,5 eingestellt worden war.

Es wurde ein wäßriges Fermentationsmedlum bereitet, welches je dl 3 g Glucose, 0,5 g Ammoniumacetat, 0,2 g Harnstoff, 0,1g KHjPO₄, 0,04 g MgSO₄ · 7H₂O, 0,2 mg Fe~, 0,2 mg Mn⁴⁺, 10 μg Biotin, 5 \ig, Thlamin-HCl, 0,5 ml Maisquellwasser, 2 ml Sojaproteinhydrolysat enthielt und das auf einen pH-Wert von '. ,2 eingestellt worden war. 300 nil-Ansätze des Fermentationsmediums wurden jeweils in 11 Fermentationsgefäße gebracht. Sie wurden darin mit den erforderlichen Nährstoffen der Stämme gemäß den Angaben in den Beispielen 1 und 2 vermischt. Darauf erfolgte eine Sterilisierung und eine Inokulierung mit 15 ml-Pwtionen der oben genannten Samenkulturen. Es wurde bei einer Belüftungsrate von 300 ml/min, und einer Rührung mit 1500 Upm bei 31° C gehalten.

Zu jedem Fermentationsgemisch wurde eine Lösung, die Essigsäure und Ammoniumacetat In einem Molverhältnis von 4 :1 und Insgesamt 60 g/dl Acetationen enthielt, mit einer solchen Geschwindigkeit gegeben, daß ein pH-Wert von 7,2 bis 8,0 ohne Überschreitung einer Essigsäure-Konzentration von 1,5% erhalten wurde.

Nach 50 Stunden wurde in jedem Fermentationsmedium die Hlstldin-Konzentration bestimmt. In den Kulturen von B. flavum FERM-P 1561 bis 1564 betrugen in der angegebenen Reihenfolge die Histldln-Konzentrationen 0,92, 0,93, 0,88 und 1,06 g/dl. Die Mikroorganismen B.lactofermentum FERM-P 1565 bis 1568 lieferten 0,93, 0,77,0,95 und 1,02 g/dl Histidin. Die Brühe von C.acetoacidophllum FERM-P 1569 enthielt 0,49 g/dl Histidin.

Zu Vergleichszwecken wurden analoge Fermentationsversuche mit B.flavum ATCC 21 406 und C.acetoacidophllum ATCC 21 407 durchgeführt. In den jeweiligen Brühen wurden nach 50 Stunden 0,38 und 0,18 g/dl Histidin festgestellt. Die zwei letztgenannten Mikroorganismus-Stämme sind aus der genannten US-PS 37 16 453 bekannt. Sie sind zwar gegenüber 2-Thlazolalanln beständig, jedoch fehlen bei ihnen spezifische Nährstofferfordernisse.

Beispiel 4

hiocula der In Beispiel 3 genannten 11 Mikroorganismen wurden wie in vorstehendem Beispiel in einem Medium hergestellt, das anstelle von Ammoniumsulfat weitere 0,1 g/dl Harnstoff enthielt.

ίο Das grundlegende Fermentationsniedium, das verwendet wurde, enthielt je dl 1 g Glucose, 1,5 g Äthanol, 0,5 g Ammoniumsulfat, 0,2 g Harnstoff, 0,1 g KH₂PO₄, 0,04 g MgSO₄ · 7H₂O, 0,2 mg jeweils von Fe⁺+ und Mn~, 10 μg Biotin, 5,0 μg Thlamin · HCl, 2 ml Sojaproteinhydrolysat und 0,5 ml Malsquellwasser. Das Medium hatte einen pH-Wert von 7.2. 300 ml-Ansätze dieses Fermentationsmediums wurden mit den spezifischen Nährstoffen, die In den Beispielen 1 und 2 angegeben sind, vermischt. Es wurde mit Wasserdampf In 11 Fermentationsgefäßen sterlllsiert und es erfolgte eine Inokulierung mit 15 ml der jeweiligen Kulturen. Es wurde unter Belüften mit 300 ml/min, und Rührung mit 1500 Upm bei 31°C gehalten. Gasförmiges Ammoniak wurde jedem Fermentationsgemisch mit einer solchen Geschwindigkeit zugeführt, daß der pH-Wert zwischen 7,0 und 7,5 gehalten wurde. Es wurde so viel Äthanol zugeführt, daß eine Konzentration von 0,3 g/dl aufrechterhalten wurde.

Nach 48 Stunden wurden die 11 Brühen auf den Hlstidin-Gehalt untersucht. Die neun erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen ergaben In der Reihenfolge der ansteigenden FERM-P-Nummern 0,79, 0,70, 0,73, 0,84, 0,81, 0,66, 0,78, 0,85 und 0,40 g/dl Histidin. Demgegenüber enthielten die Brühen der zwei Kontrollstamme 0,28 bzw. 0,15 g/dl Histidin.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von L-Histldin durch Kultivierung eines Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, welches Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff, geringe Mengen von anorganischen Salzen einschließlich einer spezifisch erforderlichen Substanz oder Substanzen enthält, bis sich L-Hlstidin In dem Medium ansammelt und Gewinnen des angesammelten L-Histidlns aus dem Medium, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus die nachstehenden Stämme einsetzt, wobei der jeweilige Klammerausdruck die spezifisch erforderliche Substanz bzw. Substanzen nennt: