DE2135246C3

DE2135246C3 -

Info

Publication number: DE2135246C3
Application number: DE2135246A
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Tokio Hagino; Kiyoshi Sagamihara Nakayama; Hajime Sagamihara Yoshida
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1970-07-17
Filing date: 1971-07-14
Publication date: 1973-11-08
Also published as: CA952051A; FR2101759A5; DE2135246A1; GB1361413A; US3787287A; IT946259B; DE2135246B2; JPS5546717B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung \on ι-Tyrosin durch aerobes Züchten eines Stammes von Corynebacterium glutamicum in einem hierfür üblichen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperaturen und pH-Werten.

Da i.-Tyrosin eine als Futterzusatz geeignete Aminosäure ist, wurde intensiv nach einem relativ billigen, in industriellem Maßstab durchführbaren Verfahren zih Herstellung dieser Verbindungen gesucht. Bisher wurde i-Tyrosin z. B. durch Fermentation eines Phenylalanin-abhängigen Stammes von Corynebacterium glutamicum hergestellt (vgl. die japanische bekanntgemachte Patentanmeldung 14 395/63). Es ist jedoch wünschenswert, L-Tyrosin in höheren als den nach dem bekannten Verfahren erhaltenen Ausbeuten herzustellen.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein billiges und in industriellem Maßstab durchführbares Verfahren zur Herstellung von L-Tyrosin auf mikrobiologischem Wege zur Verfügung zu stellen, bei dem hohe i.-Tyrosin-Ausbeuten erhalten werden. Diese Aufgabe wird, ausgehend von dem Verfahren der eingangs genannten Art, erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Herstellung von L-Tyrosin durch aerobes Züchten eines Stammes von Corynebacterium glutamicum in einem hierfür üblichen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperaturen und pH-Werten gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Corynebacterium glutamicum Corynebacterium glutamicum ATCC 21 562, Corynebacterium glutamicum ATCC 21 563, Corynebacterium glutamicum ATCC 21 564, Corynebacterium gluta micum ATCC 21 565, Corynebacterium glutamicum ATCC 21 566, Corynebacterium glutamicum ATCC 21 567, Corynebacterium glutamicum ATCC 21 568, Corynebacterium glutamicum ATCC 21 569, Corynebacterium glutamicum ATCC 21 570, Corynebacterium glutamicum ATCC 21 571, Corynebacterium glutamicum ATCC 21 572 oder Corynebacterium glutamicum ATCC 21 573 einsetzt.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich ! -Tyrosin in industriellem Maßstab mit ausgezeichneten Ausbeuten herstellen.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren Stämme von Corynebacterium glutamicum sind zumindest gegen eine der folgenden Verbindungen resistent: L-Tyrosin, Phenylalanin sowie deren Analoge 3-Aminotyrosin, 2-Aminotyrosin, p-Aminophenylahinin, \-Methyltyrosin, n-Tyrosin, p-Fluorphenylalanin, o-Fluorphenylalanin, /ί-2-Thienylalanin, 3-Hydroxytyrosin, /?-2-PyrroIyIalanin, /J-3-Furylalanin, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, o-Hydroxyphenylalanin, m-Hydroxyphenylalanin, 5-Hydroxy-2-pyridylalanin, p-Methylphenylalanin, p-Nitrophenyla!anin, m-Nitrophenylalanin, -2-Naphthylalanin, /7-2-Pyridylalanin, 3-Thionaphtli /lylalanin, ß-3-Thiazolyl»'min und Tyrosinhydroxamat. Einige der beim erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren Stämme besitzen außerdem eine Phenylalanin-Abhängigkeit. In den Beispielen sind für jeden der Stämme die jeweiligen Resistenzen und die Phenylalanin-Abhängigkeit angegeben.

Die Stämme mit den dort angegebenen Resistenzen wurden durch Mutation von Elternstämmen, welche diese Resistenz nicht besaßen, erhalten, wobei die Mutation durch übliche Methoden, wie Bestrahlen mit ultravioletter Strahlung, Röntgenstrahlung, Kobaii*°-Strahlung und chemische behandlung mit mutagenen Agentien, hei vorgerufen wurde.

Die im Verfahren der Erfindung eingesetzten resistenten Stämme produzieren eine mehrfache bis über lOfache L-Tyrosinmenge, verglichen mit dem in der bekanntgemachten japanischen Patentanmeldung 14 395/63 beschriebenen Verfahren.

Die Herstellung von i.-Tyrosin erfolgt im erfindungsgemäßen Verfahren durch Fermentation unter aeroben Bedingungen (Schüttelkultur oder belüfteter und gerührter Submerskultur) in einem wäßrigen Nährmedium bei Temperaturen von 20 bis 40⁰C und bei pH-Werten in der Nähe des Neutralpunktes, wie bei Fermentationen von Corynebacterium glutamicum üblich sind. Die Temperaturen und pH-Werte können entsprechend dem verwendeten Bakterienstamm variieren.

Im Verfahren der Erfindung können sowohl synthetische als auch komplexe Nährmedien unter Voraussetzung verwendet werden, daß sie geeignete Mengen einer Kohlenstoff- und einer Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und in dem Fall, daß ein Phenylalanin-abhängiger Stamm eingesetzt wird, Phenylalanin enthalten. Wenn dieser Wuchsstoff bereits in den im Nährmedium vorhandenen Komponenten enthalten ist, ist eine spezifische Ergänzung des Nährmediums mit diesem Wuchsstoff nicht notwendig.

Als Kohlenstoff- und Stickstoff quelle können sämtliche assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffverbindungen verwendet werden. Als Kohlenstoffquelle können z. B. Kohlenhydrate, wie Glucose, Glycerin, Fructose, Saccharose, Maltose, Mannose, Stärke, Stärkehydrolysat und Melasse, und organische Säuren, wie Brenztraubensäure, Milchsäure, Essigsäure und Fumarsäure, verwendet werden. Als Stick.stoffquelle können z. B. Ammoniak oder anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammon.umacetat, oder Harnstoff und andere stickstoffhaltige organische Materialien, wie Pepton, Caseinhydrolysat, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquell-

wasser. Fischmehl oder verdautes Fischmehl, entwässerter Sojabonnen-Preßkuchen oder das durch Verdauen daraus erhaltene Produkt und Chrysalishydrolysal verwendet werden. Als anorganische Verbindungen können z. B. Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumdihvdrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(Il (-sulfat, Mangansulfat und Calciumcarbonat verwendet werden.

Vorzugsweise wird vor dem Beimpfen des Kulturmediums der verwendete Stamm in einem Anzuchtmedium angezogen. Das Anzuchtmedium wird unter für das Wachstum des Stammes günstigen Bedingungen so lange inkubiert, bis eine geeignete Bakterienpopulation gewachsen ist. Die typische Inkubationrzeit beträgt etwa 24 Stunden. Die so erhaltene Vorkultur wird zum Beimpfen des bei der Fermentation verwendeten Nährmediums benutzt. Die Fermentation wird so lange durchgeführt, bis eine bexrächtliche ι Tyrosir, ienge gebildet und in der Kulturbrühe angereichert worden ist. Dies ist im allgemeinen nach 2- bis 5tägiger Fermentation der Fall. Nach beendeter Fermentation werden die Bakterienzellen entfernt, und das L-Tyrosin wird aus dem KulturSltrat nach üblichen Methoden, z. B. durch Konzentrierung, Ausfällen oder Ionenaustau^chbehandlung, isoliert. Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

1 s wird eine Vorkultur des gegen 3-Aminotyrosin residenten Stammes Corynebacterium glutamicum ATCC 21 568 durch 24stüi Jiges Inkubieren bei 30 C in einem 2% Glucose, '. % Pepton, 1% Hefeextrakt und 0,3% Natriumchlorid enthaltenden Anzuchtmedium hergestellt. 10 ml eines Fermentationsmediums in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben werden mit 1 ml dieser Vorkultur beimpft. Das Fermentationsmedium enthält 10% Rohrzucker, 0,05% K₂HPO₁, 0,05% KH₂PO₁, 0,025% MgSO₁ · 7H₂O, 2% Ammoniumsulfat, 0,5% Caseinhydrolysat, 30 μg Biotin/Liter und 2% CaCO₃. Der pH-Wert des Fermentationsmediums beträgt 7,2. Nach 4tägiger Fermentation unter Schütteln bei 30 C enthält die Kulturbrühe 5,7 mg L-Tyrosin/ml.

Nach beendeter Fermentation wird 1 1 der Kulturbrühe mit wäßriger Ammoniaklösung auf pH 10 eingestellt und anschließend zentrifugiert, wobei die Bakterienzellen und das CaCO₃ abgetrennt werden. Der Überstand wird sodann unter vermindertem Druck auf 50 ml eingeengt. Dieses Konzentrat wird mit Salzsäure auf pH 7,0 eingestellt und bei niedriger Temperatur stehengelassen. Die ausgefallenen L-Tyrosinkristalle werden abfiltriert. Die L-Tyrosin-Ausbeute beträgt 3,8 g.

Beispiel 2

Es werden die in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten Stämme von Corynebacterium glutamicum benutzt. Diese Stämme, die gegen die in der Tabelle angegebenen Tytosin- bzw. Phenylalanin-Analoge resistent sind, wurden durch mehrfache mutagene Behandlung erhalten. Die Phenylalanin-Abhängigkeit wurde vor der Resistenz hervorgerufen. Diese Stämme werden 24 Stunden unter Schütteln in einem Anzuchtmedium gemäß Beispiel 1 inkubiert. 10 ml eines Fer- mentationsmediums in einem großen Reagenzglas werden mit 1 ml der so hergestellten Vorkulturen beimpft. Das Fermentationsmedium enthält 10% Rohrzuckermelasse (berechnet als Glucose), 0,05% K₃HPO₄, 0,05% KH₂PO₄, 0,025% MgSO₁-7H₂O, 2% Ammoniumsulfat, 0,5% Maisquellwasser und 2% CaCO,,. Der pH-Wert des Fermentationsmediums beträgt 7,2. Die Fermentation wird A Tage bei 30 C durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle zusammengestelit.

	ATCC	Stamm	21	567, Phe-	von	PFPR.	Gebildete
	ATCC	rorynebacteriuni	21	569, Phe		MFP^R	L-Ty ros in
(	ATCC		21	570, Phe		PAP·¹	Menge,
	ⁱ⁰ ATCC	21	21	571, Phe	glutamicum	TA^R	mg/ml
ATCC	21	21	572, Phe		PFP^R,	6,7
ATCC	21		573, Phe	3AT^R		10,3
	21		3AT^R,		8,1
	21	562, Phe	3ATR,		7,4
	21	5t J, Phe	3AT^R,		7,7
PAP^R	565, Phe-	3AT^R,		12,3
ATCC		3AT^R,
²⁵ ATCC		5,8
ATCC	, MFP*	6,0
ATCC	, OFP^R	5,8
ATCC	, PFP"	4,9
566, PFP¹¹	4,3
563, MHP«

Phe-; Phenylalanin-abhängig,

3AT^R: resistent gegen 3-Aminotyrosin,

PFP^R: resistent gegen p-Fluorphenylalanin,

MFP^R: resistent gegen m-Fluorphenylalanin,

PAP¹¹: resistent gegen p-Aminophenylalanin,

TA^R: resistent gegen /3-2-Thienylalanin,

OFP^R: resistent gegen o-Fluorphenylalanin.

Beispiel 3

Es wird der Phenylalamn-abhängige, gegen 3-Aminotyrosin und p-Fluorphenylalanin resistente Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 21 569 verwendet. Dieser Stamm wird in einem Anzuchtmedium 24 Stunden inkubiert. Das Anzuchtmedium enthält 7% Rohrzuckermelasse (berechnet als Glucose), 0,3% Maisquellwasser, 0,1% KjHPO₄, 0,1% KH₂PO₁, 0,05% MgSO₁-7H₂O und 0,9% Sojabohnen-Preßkuchen-Hydrolysat (berechnet als Sojabohnen-Preßkuchen; das Sojabohnen-Preßkuchen-Hydrolysat wird durch Aufschließen von Sojabohnen-Preßkuchen mit 6η H₂SO₁ und Neutralisieren mit wäßriger Ammoniaklösung erhalten). 3 1 eines Fermentationsmediums in einem 5-1-Glasfermenter werfen mit 300 ml der so erhaltenen Vorkultur beimpft. Das Fermentationsmedium enthält 15% Rohrzuckermelasse (berechnet als Glucose), 0,1% Maisquellwasser, 0,1% KH₂PO₁, 0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄-7 H₂O und 0,9% Sojabohnen-Preßkuchen-Hydrolysat (berechnet als Sojabohnen-Preßkuchen). Der pH-Wert des Fermentationsmediunis beträgt 7,2.

Die Fermentation wird 72 Stunden bei 30°C unter Zufuhr von 3 1 Luft/Minute und unter Rühren mit einer Rührgeschwindigkeit von 600 UpM durchgeführt. Nach der vorgenannten Zeit enthält die Kulturbrühe 15,6 mg L-Tyrosin/'ml.

Claims

Patentanspruch:

\ erfahren zur Herstellung von L-Tyrosin durch aerobes Züchten eines Stammes \on Corynebacterium glutamicum in einem hierfür üblichen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperaturen und pH-Werten, dadurch gekennzeichnet, daß man als Corynebacterium glutamicum Corynebacterium glutamicum ATCC 21 562, Corynebacterium glutamicum ATCC 21 563, Corynebicterium glutamicum ATCC 21564. Corynebarteium glutamicum ATCC 21 565, Corynebactcrium glutamicum ATCC 21 566, Corynebacterium glutamicum ATCC 21 567, Corynebacterium glutamicum ATCC 21 568, Coiynebacterium glutamicum ATCC 21 569, Corynehacterium glutamicum ATCC 21 570, Corynebaeterium glutamicum ATCC 21 571, Corynebacterium glutamicum ATCC 21 572 oder Coryuebacterium dutamicum ATCC 21 573 einsetzt.