DE1205934B - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 1-Citrullin - Google Patents
Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 1-CitrullinInfo
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C12d
Deutsche Kl.: 6b-16/02
1205 934
A 47106IV a/6 b
18. September 1964
2. Dezember 1965
A 47106IV a/6 b
18. September 1964
2. Dezember 1965
Die Erfindung betrifft ein wirtschaftliches Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 1-Citrullin aus
leicht zugänglichen Ausgangsmaterialien.
Citrullin stellt wie Arginin und Ornithin ein Zwischenprodukt bei der Harnstoffbildung in menschlichen
und sonstigen lebenden Körpern dar und ist daher wie diese Verbindungen für Biochemiker und
Biologen von Interesse. Es hat auch bei medizinischen Untersuchungen als Zwischenprodukt bei der Bildung
von anderen für die Biochemiker wertvollen Verbindungen und als Nahrungszusatz Bedeutung gewonnen.
Citrullin wurde zunächst aus Wassermelonensaft isoliert. Es ist aber auch auf chemischem und biochemischem
Wege synthetisiert worden. Einige dieser Verfahren basieren auf der Hydrolyse von Arginin.
Es wurde gefunden, daß 1-Citrullin in relativ hohen Konzentrationen — von 1 bis 2 g/100 ecm Kulturmedium
— angereichert werden kann, wenn man Bacillus subtilis ATCC 15 562 oder Bacillus subtilis
ATCC 15 561 in einem Nährmedium, das neben üblichen Bestandteilen 5 bis 100 mg Arginin pro
100 ecm enthält, bei aeroben Bedingungen züchtet.
Die gemäß Erfindung benutzten auxotrophen Mutantenstämme von Bacillus subtilis kommen vermutlich
auch in der Natur vor. Einfacher werden sie durch Selektion aus dem Mikroorganismus Bacillus subtilis
Stamm K, dessen vegetative Zellen oder Sporen UV-Licht, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen oder
ähnlicher elektromagnetischer Bestrahlung ausgesetzt oder mit einer Natriumnitritlösung in Berührung gebracht
worden sind, gewonnen. Es können aber auch andere Mutationen hervorrufende Behandlungen angewendet
werden.
Die gemäß Erfindung verwendeten Mutantenstämme von Bacillus subtilis benötigen für die 1-Citrullinproduktion
Arginin. Ersetzt man aber das Arginin im Kulturmedium durch so nah verwandte Aminosäuren,
wie 1-Citrullin oder 1-Ornithin, bilden sich keine Wachstumsstufen und kein 1-Citrullin.
Unterschreitet die Argininkonzentration in dem Nährmedium die Menge von 5 bis 100 mg/100 ecm, so
ist die Geschwindigkeit des Mikroorganismenwachstums und der 1-Citrullinproduktion sehr gering. Bei
höheren Argininkonzentrationen geht das Wachstum der Mikroorganismen gewöhnlich schnell vonstatten,
jedoch das Maß der 1-Citrullinproduktion ist eingeschränkt. Wird dagegen das Wachstum der Mikroorganismen
durch Modifikationen der Fermentationsbedingungen in bekannter Weise eingeschränkt,
können ausreichende 1-Citrullinausbeuten auch bei
Argininkonzentrationen oberhalb des angegebenen Vorzugsbereichs erhalten werden.
Verfahren zur biotechnischen Herstellung von
1-Citrullin
1-Citrullin
Anmelder:
Ajinomoto Co., Inc., Tokio
Vertreter:
Vertreter:
Dr. G. W. Lotterhos
und Dr.-Ing. H. W. Lotterhos, Patentanwälte,
Frankfurt/M., Annastr. 19
Frankfurt/M., Annastr. 19
Als Erfinder benannt:
Shinji Okumura,
Masao Shibuya,
Shimpachi Konishi,
Teruo Shiro,
Noboru Katsuya, Kanagawa-ken (Japan)
Beanspruchte Priorität:
Japan vom 19. September 1963 (49 438)
Wie die Beispiele 3 und 4 mehr im einzelnen zeigen, kann die 1-Citrullinbildung noch weiter beschleunigt
werden, wenn neben Arginin 1-Leucin oder !-Isoleucin im Medium vorhanden ist. Durch einen Zusatz von
mindestens 50 mg/100 ecm 1-Leucin oder 1-Isoleucin zum Kulturmedium kann man die 1-Citrullinausbeute
um 10 bis 15% gegenüber derjenigen steigern, die bei sonst gleichem Fermentationsverfahren erhalten wird.
Durch höhere Konzentration läßt sich die Ausbeute noch weiter verbessern.
Maximale 1-Citrullinausbeuten bei hoher Geschwindigkeit können nur dann erzielt werden, wenn man die
Wasserstoffionenkonzentration im Kulturmedium regelt. Zweckmäßig wird im Kulturmedium ein pH-Bereich
zwischen 6,0 und 9,0 aufrechterhalten, indem man wäßriges Ammoniak, Calciumcarbonat oder
Alkalihydroxyd dem Nährmedium von Zeit zu Zeit je nach Bedarf zusetzt.
Abgesehen von dem Zusatz von Arginin und gegebenenfalls 1-Leucin oder 1-Isoleucin können die für
die 1-Citrullinproduktion gemäß Erfindung benutzten Kulturmedien eine völlig konventionelle Zusammensetzung
haben. Sie müssen assimilierbare Lieferanten für Kohlenstoff und für Stickstoff und die üblichen
geringfügigen Nährstoffe enthalten.
Einige Beispiele für geeignete Kohlenstofflieferanten
sind Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Maltose,
509 740/5*
Saccharose, Xylose, Galactose, Stärkehydrolysat und Melassen; jedoch auch Glycerin, organische Säuren,
wie Essig-, Fumar-, Malein-, Milch-, «-Ketoglutar-, Glucon-, Brenztrauben- und Citronensäure können
als Ergänzungskohlenstofflieferanten benutzt werden.
Der Stickstoff kann von Ammoniumsalzen anorganischer oder organischer Säuren, wie der Salz-, Phosphor-,
Salpeter-, Essig- und Milchsäure, von Harnstoff und von Ammoniak in wäßriger Lösung oder gasförmigem
Zustand geliefert werden.
Die ergänzenden anorganischen Nährstoffe umfassen die wesentlichen anorganischen Ionen, die aus
Kaliumphosphat, Magnesium-, Mangan-, Zink-, Ferrosulfat, Natriumchlorid und Calciumcarbonat zugänglich
sind. Organische, wachstumsfördernde Mittel, durch die die Ausbeute und die Geschwindigkeit der
Citrullinbildung verbessert werden, umfassen allgemein Aminosäuren, Biotin, Vitamine und Fettsäuren.
Sie können dem Kulturmedium in Form von Substanzen zugesetzt werden, die das aktive Mittel bei den
Fermentationsbedingungen liefern, wie Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Magermilch,
Chlorellaextrakt, Sojabohnenproteinhydrolysat sowie verschiedene andere Extrakte von pflanzlichen und
tierischen Geweben, die als solche wohlbekannt sind.
Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Das Nährmedium kann mit dem Sauerstoff
durch Schütteln, Rühren oder indem man Luft hindurchleitet, in Berührung gebracht werden. Beste
Ergebnisse erzielt man, wenn man während der Fermentation die Temperatur des Mediums zwischen 24
und 400C hält.
Der 1-Citrullingehalt des Nährmediums wurde durch
den Mikroversuch mit Hilfe von Lactobacillus casei (ATCC 7469) bestimmt. Zu diesem Zweck kann aber
auch eine andere bekannte Methode benutzt werden. Die isolierte Aminosäure wurde durch Papierchromatographie
und ihr charakteristisches Infrarotspektrum identifiziert.
Das 1-Citrullin kann aus dem Nährmedium in bekannter
Weise isoliert werden, beispielsweise indem man die Bakterienzellen abfiltriert oder abzentrifugiert,
aus der erhaltenen Flüssigkeit das 1-Citrullin an Ionenaustauscherharzen adsorbiert und dann durch
selektive Elution von Begleitmaterialien abtrennt.
Das Verfahren der Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.
Bacillus subtilis K-X-I A-9 (ATCC 15 562) wurde durch Selektion aus Bacillus-subtilis-K-Stamm, der
mit Röntgenstrahlen bestrahlt worden war, auf der Basis seines Argininbedarfs isoliert und auf einer
Bouillon-Agar-Schrägschnitte kultiviert. Ein Inokulum wurde auf ein Nährmedium übertragen.
Es wurde eine Nährlösung folgender Zusammensetzung hergestellt:
Süßkartoffelstärkehydrolysat
Süßkartoffelstärkehydrolysat
(Glucoseäquivalent) 10 %
KH2PO4 0,1%
MgSO4 · 7H2O 0,04%
Fe++ 2 ppm
Mn++ 2 ppm
Gemischte Aminosäuren 0,3 %
1-Arginin-Hydrochlorid 10 mg/100 ecm
Biotin 40γ/1
Thiamin-Hydrochlorid 200 γ/Ι
Magermilch 0,3 %
Das pH der Lösung betrug 7. 20-ccm-Ansätze der Lösung gab man in 500-ccm-Schüttelkolben, sterilisierte
sie mit Dampf in den Flaschen 5 Minuten bei HO0C und beimpfte sie mit den weiter oben angegebenen
Mikroorganismen, worauf man dem Medium 1% getrennt sterilisiertes dibasisches Ammoniumphosphat
und 1 g Calciumcarbonat zusetzte und die Fermentation bei 310C unter Schütteln durchführte.
Nach 24stündiger Fermentation setzte man dem Medium dibasisches Ammoniumphosphat in einer
Menge von nahezu 2% zu.
Die gesamte Fermentationsperiode dauerte 72 Stunden, und der schließlich erhaltene 1-Citrullingehalt des
Mediums betrug nach der Bestimmung mittels des Bioversuchs 1,2 g/100 ecm. Dieses Ergebnis sowie die
anderen Daten bezüglich der Zusammensetzung des Mediums während der Fermentation sind in der folgenden
Tabelle angegeben.
Fermentations dauer (Stunden) |
pH | Verbrauchte Glucose (g/100 ecm) |
Gebildetes 1-Citrullin (g/100 ecm) |
24 48 72 |
7,2 7,8 8,0 |
2,5 5,7 9,2 |
0,13 0,72 1,20 |
Die Zellen der Mikroorganismen filtrierte man vom Medium ab, führte das Filtrat durch eine mit einem
Kationenaustauscherharz des Η-Typs gepackte Kolonne, eluierte das 1-Citrullin aus der Kolonne mit
1,0 n-Ammoniumhydroxydlösung und fällte aus dem Eluat mit absolutem Äthanol das kristalline Rohprodukt.
Die Kristalle löste man in Wasser, behandelte die Lösung zur Entfärbung mit Aktivkohle und fällte
die reinen Kristalle aus. Man kristallisierte sie ferner aus einer kleinen Menge heißem Wasser um. Aus 11
Medium mit 12 g 1-Citrullin erhielt man 10,2 g reine Säure in kristalliner Form.
Bacillus subtilis K-X-I A-I (ATCC 15 561) erhielt
man aus Bacillus-subtilis-K-Stamm durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen und Selektion auf Grund seines
Argininbedarfs. Die Mikroorganismen kultivierte man in praktisch der gleichen Weise, wie im Beispiel 1 angegeben
(in diesem Fall wurde nur 1 g Calciumcarbonat den jeweiligen Medien zugegeben und die
Fermentation bei 34° C unter Belüftung und Rühren durchgeführt), auf einem Kulturmedium, das zu Beginn
folgende Zusammensetzung hatte:
Süßkartoffelstärkehydrolysat
(Glucoseäquivalent) 13 %
KH2PO4 0,3%
MgSO4-7 H2O 0,04%
Fe++ 2 ppm
Mn++ 2 ppm
Gemischte Aminosäuren 0,3 %
Sojabohnenproteinhydrolysat lccm/lOOccm
1-Arginin-Hydrochlorid 0,01%
Biotin 40y/l
Thiamin-Hydrochlorid 200 γβ
NH4Cl 1,5%
pH 7
Nach 24stündiger Fermentation fügte man dem Nährmedium Ammoniumchlorid in einer Menge von
nahezu 1,5 % zu. Nach 72stündiger Fermentation bei
34° C wies das Kulturmedium 1,6 g/100 ecm 1-Citrullin
auf.
Das Verfahren^ von Beispiel 2 wurde mit einem Kulturmedium wiederholt, das, abgesehen von einem
zusätzlichen Gehalt an 0,1% 1-Leucin, mit dem weiter oben beschriebenen identisch war. Der 1-Citrullingehalt
des Kulturmediums betrug nach 72 Stunden 1,9 g/100 ecm, womit eine Zunahme von nahezu
20% gegenüber den unter sonst gleichen Bedingungen in der Abwesenheit von 1-Leucin erzielten Ergebnissen
erreicht worden war.
B e i s.p i e 1 4
Das Verfahren von Beispiel 2 wurde mit einem Kulturmedium wiederholt, das, abgesehen von einem
zusätzlichen Gehalt an 0,1% !-Isoleucin, mit dem weiter oben beschriebenen identisch war. Der 1-Citrullingehalt
des Kulturmediums betrug nach 72 Stunden 1,8 g/100 ecm und war somit nahezu gleich dem,
der in Anwesenheit von 1-Leucin erzielt wurde.
5
5
Claims (2)
1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 1-Citrullin, dadurch gekennzeichnet,
daß Bacillus subtilis ATCC 15562 oder Bacillus subtilis ATCC 15561 in einem Nährmedium,
das neben üblichen Bestandteilen 5 bis 100 mg Arginin pro 100 ecm enthält, bei aeroben
Bedingungen gezüchtet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dem Nährmedium mindestens 50 mg
1-Leucin oder 1-Isoleucin pro 100 ecm zugesetzt
werden.
509 740/54 11.65 © Bundesdruckerei Berlin
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