DE1275980B

DE1275980B - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Inosinsaeure

Info

Publication number: DE1275980B
Application number: DEK44598A
Authority: DE
Inventors: Shukuo Kinoshita; Kiyoshi Nakayama; Zenroku Sato; Takeo Suzuki
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1960-11-11
Filing date: 1961-08-29
Publication date: 1968-08-29
Also published as: GB979141A; US3232844A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND DEUTSCHES 'MTTW* PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

Deutsche Kl.:

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

C12d

C07d

6b-16/02

12 ρ-7/10

P 12 75 980.7-41 (K 44598)

29. August 1961

29. August 1968

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Inosinsäure, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man Micrococcus glutamicus ATCC 14305 oder ATCC 14306 in einem üblichen Nährmedium in Gegenwart von Adenin züchtet. Bei dieser Züchtung wird unmittelbar Inosinsäure (Inosin-5'-phosphat) gebildet. Die Säure wirkt als kräftige Würze. Sie wird aus der Kulturflüssigkeit abgetrennt und isoliert.

Die für das Verfahren der Erfindung verwendeten Mikroorganismen benötigen zu ihrem Wachstum Adenin. Die Erscheinung, daß adeninabhängige Mikroorganismen in einem Kulturmedium und den Zellen Inosinsäure anreichern, wurde bisher in der Literatur nicht beschrieben. Ein adeninabhängiger Mikroorganismenstamm läßt sich auf Grund des heutigen Wissensstandes der Mikrobengenetik erhalten, indem man Mikroorganismen verschiedenen Mutationen auslösenden Behandlungen unterwirft, z. B. der Bestrahlung mit UV- Licht, Röntgenstrahlen oder Gammastrahlen bzw. der Behandlung mit Chemikalien.

Es ist z. B. das Davis'sche Verfahren bekannt, welches in J. Am. Chem. Soc, 70 4267 (1948), beschrieben ist. Der genaue Mechanismus der Anreicherung von Inosinsäure bei adeninabhängigen Mikro-Organismen ist bis jetzt nicht bekannt. Da jedoch Inosinsäure bei vielen Organismen ein Vorläufer der Adenin-Biosynthese ist [vgl. z. B. Buchanan und Mitarbeiter, Advances in Enzymology, Vol. 21, S. 199 (1959)], ist die Anreicherung von Inosinsäure durch adeninabhängige Stämme in gewisser Weise verständlich.

Als Nährmedium kann man für das Verfahren der Erfindung sowohl synthetische als auch natürliche Medien verwenden, sofern diese Medien die richtigen Mengen an Kohlenstoffverbindungen, wie Zucker bzw. zuckerähnliche Substanzen, Quellen für Stickstoff, anorganische Verbindungen und andere Nährstoffe enthalten. Als Quelle für Kohlenstoff und Stickstoff können in den Nährmedien zahlreiche Arten von Stoffen verwendet werden, z. B. als Kohlenstoffquelle Kohlehydrate, wie Glucose, Glycerin, Fructose, Rohrzucker, Maltose, Mannit, Galactose, Xylose, Lactose, Ribose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melasse u. dgl.

Die Konzentration dieser Verbindungen kann normalerweise zwischen etwa 1 und 20% (berechnet als Glucose) des Nährmediums betragen. Weiterhin können mit Erfolg verschiedene organische Säuren, wie Gluconsäure, Brenztraubensäure, Milchsäure, Essigsäure u. dgl. und verschiedene Aminosäuren, wie Glycokoll, Glutaminsäure, Alanin u. dgl., sowie andere Verfahren zur biotechnischen Herstellung von
Inosinsäure

Anmelder:

Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.

Chiyoda-ku, Tokio (Japan)

Vertreter:

Dr.-Ing. H. Ruschke, Patentanwalt,

1000 Berlin 33, Auguste-Viktoria-Str. 65

Als Erfinder benannt:

Shukuo Kinoshita, Tokio;

Kiyoshi Nakayama, Sagamihara-shi;

Takeo Suzuki,

Zenroku Sato, Tokio (Japan)

Beanspruchte Priorität:

Japan vom 11. November 1960 (44 406)

organische Verbindungen, wie Glutamin, verwendet werden.

Als Stickstoffquelle kann man Ammoniak, zahlreiche anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumacetat u. dgl., stickstoffhaltige organische Verbindungen, wie Harnstoff, Pepton, Caseinhydrolysate, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Fischmehl oder seine Abbauprodukte, Sojabohnenmehl oder seine Abbauprodukte, Chrysaliden-Hydrolysate u. dgl., sowie Aminosäuren, wie Glycokoll, Glutaminsäure, Alanin u. dgl. Bei Verwendung synthetischer Verbindungen, wie Harnstoff und Ammoniumsalze, und eines Materials als Stickstoffquelle mit geringem Adeningehalt ist es notwendig, Adenin oder einen adeninhaltigen Stoff gleichzeitig zu verwenden (einschließlich eines Adeninderivates, wie Adenosin) um im anfänglichen Nährmedium einen ausreichenden Adeningehalt zu gewährleisten. Vorzugsweise liegt der Gesamtgehalt an Adenin im Kulturmedium im Konzentrationsbereich von 2 bis 80y/ml des verfügbaren Adenins. Im Fall zu großer Adeninmengen nimmt trotz guten Wachstums der Mikroorganismen die Anreicherung von Inosinsäure ab. Es ist daher ein wichti-

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ger Faktor bei dem Fermentationsverfahren der Erfindung, daß die Fermentation bei einer Adeninkonzentration durchgeführt wird, die niedriger ist als die zum Wachstum der Mikroorganismen benötigte Menge. Als anorganische Verbindungen können mit Erfolg solche Verbindungen wie K₂HPO₄, KH₂PO₄, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonate dgl. verwendet werden.

Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, z. B. in Schüttelkulturen oder in belüfteten und gerührten Submerskulturen. Die Züchtungstemperatur liegt zwischen 20 und 40° C. Es ist bei dem Fermentationsverfahren der Erfindung äußerst wichtig, den pH-Wert des Kulturmediums während der Fermentation zu steuern. Sobald nämlich die Fermentation einsetzt, verändert sich der pH-Wert des Kulturmediums mit Fortschreiten der Fermentation. Vorzugsweise hält man den pH-Wert des Kulturmediums um 6,0 durch Zugabe einer geeigneten Base während der Züchtung. Man erhält hierdurch höhere Ausbeuten. Als Base kann man z. B. wäßriges Ammoniak, Natronlauge, Ammoniumcarbonat, Calciumcarbonat verwenden. Weiterhin kann man Harnstoff verwenden, wenn der eingesetzte Mikroorganismus Urease enthält. Die Züchtungsdauer beträgt im allgemeinen bei Micrococcus glutamicus ATCC14 305 oder ATCC 14306 2 bis 6 Tage. Während dieser Zeit werden im Kulturmedium und in den Zellen ausreichende Mengen an Inosinsäure gebildet und angereichert.

Nach Beendigung der Züchtung werden die Zellen abgetrennt und Inosinsäure aus dem Kulturmedium isoliert, beispielsweise unter Verwendung eines Ionenaustauschers, wie es im Beispiel 1 gezeigt ist. Andere bekannte Verfahren können ebenfalls zur Abtrennung von Inosinsäure aus der Kulturflüssigkeit angewandt werden, z. B. Absorptionsverfahren, Fällungsverfahren und Extraktionsverfahren.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Micrococcus glutamicus ATCC Nr. 14305 wurde über 24 Stunden bei 28° C in einem Nährmedium gezüchtet, das 2% Glucose, 1% Pepton, 0,5% Fleischextrakt, 0,25 % Natriumchlorid und lOy/1 Biotin enthielt. Diese Kultur wurde auf ein Nährmedium in einer Menge von 10 Volumprozent überimpft. Jeweils 30 ml der Nährmedien wurden in 250 ml fassende Erlenmeyerkolben gegeben, sterilisiert und bebrütet. Das zu vergärende Nährmedium wurde bei 28° C geschüttelt. Es wies folgende Zusammensetzung auf:

20 g Glucose, 15 g Ammoniumsulfat, 0,5 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g Kaliurnmonohydrogenphosphat, 0,25 g Magnesiumsulfat 7H₂O, 5 mg Adenin und 1 γ Biotin wurden zu 11 Lösung in Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde vor der Sterilisation auf 7,4 eingestellt. Nach der Sterilisation wurde die Lösung mit sterilisiertem Calciumcarbonat in einer Menge von 10 g/l versetzt.

Nach 72 Stunden Züchtung hatten sich in der Kulturflüssigkeit 84Oy/ml Inosinsäure angereichert. Gleichzeitig war auch L-Glutaminsäure angereichert worden. Auch in den Zellen konnte eine Anreicherung von Inosinsäure festgestellt werden. Nach Abtrennung der Zellen aus der Kulturflüssigkeit wurde das Kulturfiltrat (1,21) mit Bariumhydroxyd auf einen pH-Wert von 8,2 und hierauf durch Zugabe von Natronlauge 6g auf einen pH-Wert von 9,0 eingestellt und Phosphorsäure und andere Verunreinigungen abgetrennt. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde durch eine Ionenaustauschersäule geleitet, die mit dem am Prioritätstag unter dem Handelsnamen Diaion SA Nr. 200 erhältlichen Ionenaustauscher in der OH-Form gefüllt war. Die Austauschersäule wurde mit Wasser gewaschen und mit einer Lösung eluiert, die 0,5 η an Ameisensäure und 0,25 η an Ammoniumformiat war. Das Inosinsäure enthaltende Eluat wurde mit Bariumhydroxyd zur Ausfällung von Verunreinigungen behandelt, abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt und abgekühlt. Man erhielt 1,3 g unreines kristallines Bariumsalz der Inosinsäure. Durch Behandlung mit Natriumsulfat wurde das Bariumsalz in das Natriumsalz übergeführt. Die Verbindung wurde als Natriumsalz der Inosin-5'-phosphorsäure auf Grund der Elementaranalyse, der quantitativen Analyse der Base, des Zuckers (Ribose) und der Phosphorsäure, der Oxydation mit Perjodsäure und des UV-Absorptionsspektrums identifiziert.

Beispiel 2

Als Mikroorganismus wurde der Adenin und Methionin benötigende Stamm Micrococcus glutamicus ATCC14306 und als Nährmedium folgendes Medium verwendet: 5% Maltose, 1,5% Ammoniumsulfat, 0,1 °/₀ Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Kaliumrnonohydrogenphosphat, 0,5% Maisquellwasser, 0,5 % Caseinhydrolysat, 1,5 mg/1 Adenin. Der pH-Wert der Lösung wurde vor der Sterilisation auf 7,4 eingestellt.

Während der Fermentation wurde der pH-Wert des Kulturmediums durch Zugabe von Harnstoff auf einem pH-Wert von etwa 6 gehalten. Die anderen Arbeitsbedingungen stimmten mit denen des Beispiels 1 überein. Nach 96 Stunden Vergärung betrug die Konzentration an Inosinsäure im Kulturmedium 2,3 mg/ml.

Beispiel 3

Keimkultur
Medium

Glucose 2%

Pepton 1%

Hefeextrakt 0,8 %

pH-Wert eingestellt auf 7,4 durch Zusatz von

Natriumhydroxyd,
sterilisiert 15 Minuten bei 120° C.

In dem Medium wird in 20 Stunden bei 28⁰C eine Schüttelkultur von Micrococcus glutamicus ATCC Nr. 14305 hergestellt.

Fermentierung
Medium

Glucose 10%,

K₂HPO₄ 0,6%,

KH₂PO₄ 0,3%,

MgSO₄-7H₂O 0,2%,

MnSO₄-4H₂O 0,004%,

Natriumeitrat 1 %,

Harnstoff 0,1%,

Biotin 100 mcg/1,

Adenin 200 mcg/1,

pH-Wert eingestellt auf 7,4 durch Zusatz von
Natriumhydroxyd,

sterilisiert bei 120⁰C 15 Minuten lang.

300 ecm der Keimkultur werden auf 3000 ecm Fermentierungsmedium überimpft. Das Bebrüten wird bei 28 ⁰C unter Rühren mit 550 U/Min, und Belüften mit 1 Volumen Luft je Minute auf 1 Volumen Medium durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums wird durch Zusatz von Harnstofflösung auf etwa 7 eingeregelt. Wenn notwendig, wird Sojabohnenöl als Entschäumungsmittel hinzugesetzt. Nach einer Bebrütung von 60 Stunden sammeln sich 3,0 mg/ccm Inosinsäure an.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Inosinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man Micrococcus glutamicus ATCC 14 305 oder ATCC 14 306 in einem üblichen Nährmedium in Gegenwart von Adenin züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8 durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium 2 bis 80 y/ml Adenin enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adenin adeninhaltige Stoffe, wie Hefeextrakt, Hefehydrolysat, lösliche Fischprodukte oder Hydrolysate von Bakterienzellen verwendet.

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