DE1767940A1

DE1767940A1 - Verfahren zur Herstellung von Threonin durch Gaerung

Info

Publication number: DE1767940A1
Application number: DE19681767940
Authority: DE
Inventors: Shigeru Nakamori; Kounosuke Sano; Isamu Shiio
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1967-07-03
Filing date: 1968-07-03
Publication date: 1971-09-30
Also published as: FR1573433A; US3582471A; GB1223725A; DE1767940B2

Description

OR. E. WIEGAND DIPL-ING. W. NIEMANN

DR. M. KÖHLER DIPL-ING. C. GERNHARDT 17679 AO

MÖNCHEN HAMBURG

rELEFONi 55 54 76 8000 MüNCHEN 15, 3. JUli 1968

:i.EGRAMME. KARPATENT NUSSBAUMSTRASSE 10

.3 762/68 7/RS

Ajinomoto Go., Inc.
Tokyo (Japan)

Verfahren zur Herstellung von "Threonin durch

Gärung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfah: ..λ z\,x Herstelig von Threonin und insbesondere auf ein Verfahren J-^r Herstellung von Threonin durch Gärung oder Fermentation.

Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung von Threonin mit niedrigen Kosten aus leicht zur Verfugung stehenden Roh-

toffen. L-Threonin ist eine der essentiellen Aminosäuren für die Ernährung von Tieren. L-Threonin ist bei medizinischen Versuchen als Zwischenprodukt bei der Herstellung von anderen

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wortvollen Verbindungen für biochemiBche Zwecke und als Zusatzstoff für Nahrungsmittel verwendet worden.

In der US-Patentachrift 3 o99 604 ist berichtet worden, ύό,β gewisse Mikroorganismen L-Threonin in einem L-Homoserin enthaltenden Medium als Substrat erzeugen können. Die Schwäche ixeses Verfahrens besteht darin, daß die Kosten von L-Homoserin, ata als Hauptrohstoff verwendet wird, höher Bind als diejenigen von anderen Kohlenstoffquellen, wie Zuckern. Ea ist auch bekannt, daß gewisse Mutantenstämme von Escherichia coli, die Diaminopimelinsäure und Methionin für ihr Wachstum erfordern, und gewisse Mutantenstämme von Microcoocus glutamicus,der Methionin und Lysin*für sein Wachstum benötigt, L-Threonin in einem Medium durch Gärung' erzeugen kann.

Es ist nun jedoch gefunden worden, daß gewisse Mutantenstämme von der Gattung Brevibacterium und der Gattung Corynebacterium, die gegenüber °C-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure resistent sind, die Fähigkeit haben, beträchtliche Mengen von L-Threonin in einem Medium zu erzeugen und anzusammeln. P Die bei dem Verfahren gemäß der Erfindung zur Anwendung gelangenden Mutantenstämme gehören zur Gattung Brevibacterium oder der Gattung Corynebacterium und sind durch ihre Widerstandsfähigkeit gegen c£-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure, die ein Analoges zu Threonin ist, gekennzeichnet. Diese Eigenschaft ist ganz verschieden von den Nährstofferfordernissen. Die Mikroorganis- m mit anderen biologischen Eigenschaften, wie Nährstofferfor-

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BAD ORIGINAL

dernis und Widerstand gegenüber irgendeiner anderen Verbindung zusammen mit dem Widerstand gegenüber cC-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure, werden für das Verfahren gemäß der Erfindung angewendet.

Diese widerstandsfähigen Mutanten können durch Auslese von natürlichen Quellen oder durch das übliche künstliche Mutantenerzeugungsverfahren erhalten werden.

Repräsentative.Mikroorganismen, die bei dem Verfahren gemäß der Erfindung zur Anwendung gelangen können, sind Brevi- ™ bacterium flavum B-2 (ATCC 21269) und Brevibacterium flavum B-lo7, die beide aus Brevibacterium flavum No. 224-7 (ATCC 14o67) durch künstliche Mutation erhalten.wurden, und Corynebacterium acetoacidophilum C-5o2 (ATCC 2127ο), das aus Corynebacterium acetoacidophilum No. 41o (atCO 1387o)durch künstliohe Mutation erhalten wurde.

Tabelle I zeigt die Änderung des Wachstums' gemäß den verschiedenen Konzentrationen von oC -Amino-ß-hydroxyvaleriansäure in dem auf Brevibacterium flavum B-lo7 geprüften Kulturmedium ä als Beispiel dieser widerstandsfähigen Stämme und ihres Elternstammes Brevibaoterium flavum No. 2247 als Beispiel von empfindlichen Stämmen*

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Tabelle I

Konzentration von Relatives Wachstum

-Amino-ß-hydroxy-

valeriansäure (mg/ml) Brevi. flavum B-lo7 Brevi. flavum No.2247

0 100 100 0,5 98 81

1 100 . 48

2 86 22

3 89 22

4 89 21

5 ' 85 8

Bemerkung;

Die Gärung wurde bei 3o°C unter Verwendung von 3 ml des nachstehend angegebenen Mindestmediums mit einem Gehalt von fe cc-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure in den in Tabelle I angegebenen Mengen durchgeführt.

Naoh 24 Stunden Gärung wurde jedes Wachstum untersucht.

Mind e stme d ium:

Glucose 5 g/l

Harnstoff 1,5 g/l

(NH₄)₂S0₄ 1,5 g/l

K₂HPO₄ 3,o g/l

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Mindeetmedium : *) Spurenelemente schließen ein:

KH₂PO₄	It	O g/l	Na₂B₄	O₇.1OH₂	0 88	mg/l
MgSO₄	o,	1 g/l	(NH₄)	6^MO7°24	.4H₂O 37	mg/l
CaCl₂	o,	ool g/l		.6H₂O	97o	mg/l
Biotin	3o	Mg/l		.7H₂O	88oo	mg/l
Vitamin B₁	loo	PS/l	OuSO₄	.5H₂O	27o	mg/l
Spurenelemente	* 1	ml/1	MnCl₂	.4H₂O	72	mg/l
pH 7,o

"Aus den Ergebnissen in Tabelle I ist ersichtlich, daß das Wachstum von üblichen Mikroorganismen beträchtlich gehemmt wurde, wenn aC -Amino-ß-hydroxyvaleriansäure zu einem Medium in einer Menge von mehr als o,5 mg/ml zugegeben wurde, daß jedoch das Wachstum der Mutanten mit der Widerstandsfähigkeit gegenüber qC -Amino-ß-hydroxyvaleriansäure nicht durch den Zusatz einer solchen Menge vonoC-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure herabgesetzt wurde.

Yfenn das Wachstum eines Mikroorganismus, der in einem I 1 mg/ml voncC-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure enthaltenden Medium während 24 Stunden gezüchtet ist, mehr als 7o$ desjenigen Wachstums in einem Medium beträgt, das keine <X-Amlno-ß-hydroxyvalerianeäure enthielt, wird der Mikroorganismus als ein gegenüber cC -Amino-ß-hydroxyvaleriansäure resistenter oder widerstandsfähiger Mikroorganismus bezeichnet.

Der für das Verfahren gemäß der Erfindung verwendbare Mikroorganismus kann daher nach einer Methode erhalten werden, die

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eine Züchtung einer Mutanten von Brevibacterium flavura oder Corynebacterium aoetoacidophilum auf einem Versuchskulturmedium mit einem Gehalt von 1 mg/ml von cC-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure, eine Isolierung des Stammes, der eines kräftigen Wachstums auf diesem Versuchsmedium fähig ist, und einer Prüfung der Fähigkeit zur Erzeugung von L-Threonin umfaßt,

cC-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure, die bei dem Verfahren gemäß der Erfindung angewendet wird, wird wie folgt hergestellt: n-Propionaldehyd und ein Kupferkomplex von Glycin wurden in Gegenwart von alkalischem Material^umgesetzt und Kupfer wurde aus dem Reaktionsprodukt entfernt. cC -Amino-ß-hydroxyvaleriansäure wird aus dem so hergestellten Reaktionsprodukt in Form.einer . Substanz erhalten, die in absolutem Äthanol kaum löslich ist und einen höheren Rf-Wert duroh Papierchromatographie in einem Lö-Bungsmittelsystem aus Methylethylketon, n-Butanol und wäßriger konzentrierter Ammoniaklösung (3:5:1:1) zeigte

Das bei der Herstellung von L-Threonin gemäß dem Verfahren ψ nach der Erfindung verwendete Nähr- oder Kulturmedium kann ein vollständig übliches sein. Es muß eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und die üblichen Nährstoffe in geringen Mengen enthalten. Die Kohlenstoffq-uellen, die zur Verwendung bei dem Verfahren gemäß der Erfindung geeignet sind, sind Glucose, Maltose, Fructose, Stärkehydrolysat und Melassen. Organische Säuren, wie Essigsäure und Citronensäure, Alkohole und Kohlenwasserstoffe, werden auch als Kohlenstoffquellen verwendet. Eine Stickstoffquelle kann durch Ammoniumsalze

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von anorganischen Sauren, wie Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid, oder durch Ammoniak in wäßriger Lösung oder in gasförmigem Zustand vorgesehen sein. Organische Verbindungen, wie Aminosäuren, Harnstoff oder-Proteinhydrolysat, können auch verwendet werden. Die anorganische Substanz kann aus einem Phosphat, einem Calciumsalz, einem Magnesiumsalz, einem Eisensalz, einem Mangansa.lz od.dgl., wie dies üblich ist, bestehen. m

Nährstoffe und. andere Substanzen, die für das· Wachstum der Mutanten notwendig sind, sollen in dem Kulturmedium vorhanden sein. Die wachstumsfördernden Mittel und anderen Nährstoffe, welche die Ausbeute und das Ausmaß bzw. die Geschwindigkeit der Erzeugung von L-Threonin verbessern, sind z.B. Aminosäuren, verschiedene Vitamine, Sojabohnenproteinhydrolysat, Hefeextrakt, Maiseinweichflüssigkeit, Pepton, Caseinhydro-Iysat usw.

Die Gärung oder Fermentation wird zwischen 2o und 4o°C während etwa 24 bis 72 Stunden unter aeroben Bedingungen unter " Schütteln oder Belüftung und Rühren ausgeführt, wobei der pH-Wert des Mediums zwischen 5 und 9 eingestellt wird. Wenn der pH-Wert des Mediums unter 5,ο zu fallen sucht, wird er vorzugsweise durch Verwendung von NeutraliBierungsmitteln, wie Calciumcarbonat und wäßrigem Ammoniak eingestellt. Wenn andererseits organische Säuren als Kohlenstoffquellen verwendet werden, neigt der pH-Wert des Mediums zum Steigen, und vorzugsweise wird er dann innerhalb des genannten Bereichs durch die Verwendung der organischen Säuren und eines Neutralisierungsmittelq

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wie Salzsäure oder Schwefelsäure, eingestellt.

Die Gewinnung von !-Threonin aus der Züohtungsbrühe kann naoh bekannten Verfahren erfolgen. Die,Bakterienzellen können durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt werden, und !-Threonin kann duroh Anwendung von kationischem Austauschharz de.r Η-Type in Verbindung mit einem Konzentrationsverfahren unter verringertem Druok und einem Pällverfahren gewonnen werden. . *

Die Bestimmung des in der Brühe-angesammelten L-Threonins wurde durch Mikrobioversuch der¹ Anwendung von Streptococcus faeoalis (ATGG 8o43) ausgeführt. Das Produkt gemäß der Erfindung wurde als L-Threonin durch Beweglichkeit bei Elektrophorese, biologische Aktivität im Mikrobioversuoh und Rf-Wert-Bestimmung bei Papierchromatographie identifiziert.

Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 .

Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

Kohlenstoffquelle (von Tabelle II) Io # .'

Ammoniumsulfat 4 fi

Kaliumdihydrogenphosphat . o,3 $>

Magnesiumsulfat o,o4 fi

Biotin 3oo jig/l

Vitamin B₁ 2oo ;ig/l

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Fe^{++ v} 2 Teile/Million

Mn⁺⁺ · 2 Teile/Million

Sojabohnenproteinhydrolysat • (Gesamtstickstoff 2,2 g/dl) o,2 ml/dl

öalciumcarbonat

(getrennt sterilisiert) 5 #·

2o ml-Mengen des obengenannten Mediums wurden in 5oo ml- J SchütteIflaschen eingebracht und durch Wasserdampf in den Flaschen bei Ho⁰G 5 Minuten sterilisiert. Brevibacterium flavum B-2 wurde in diese Gärungsmedien eingeimpft und unter aeroben Bedingungen bei 3o°G 48 'Stunden lang gezüchtet. Me Menge an angesammeltem L-Threonin in jeder gezüchteten Brühe ist aus Tabelle II ersichtlich.

Tabelle II

Kohlenstoffquelle ' Konzentration ^lhreSln*!^)

Glucose Io io 6,4

Maltose Io $ 5,5

Sucrose Io io 4,4 ·

Fructose Io io 3,8

Zuckerrohrmelassen Io io . 2,7 (als Glucose)

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Die (mikrobiellen) Zellen wurden von der Garbrühe mit einem Gehalt von 6,4 g/l. L-Threonin durch Zentrifugieren abgetrennt und die Flüssigkeit wurde durch eine Säule vonKaticnev austauschharz (Η-Type) nach Entfernung von Ammoniak und Kohlensäure geführt. 4,6 g des reinen L-Threonine'in kristalliner Form wurden aus 1 Liter der Brühe erhalten.

Beispiel 2

Gärungen wurden unter Verwendung der in Tabelle III angegebenen Mikroorganismen unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 ausgeführt. Das· verwendete Medium war das gleiche wie bei Beispiel 1, wobei die Kohlenstoffquelle aus lo# Grluoose bestand·

Es wurde Brevibacterium flavum No. 2247 als Beispiel eines Mikroorganismus angewendet, der gegenüber ot—Amino-ßhydroxyvaleriansäure empfindlich war.

Tabelle III

Angew. Mikroorganismen Widerstands- Nährstoff- angesammelfähig gegen- erfordernie tes L-Threoüber Analogen · nin (g/l)

Brevi. flavum B-lo3 + - 2,8

Brevi.. flavum B-lo5 + - 3,3

Brevi. flavum B-lo7 + - 2,8

Brevi. flavum B-Io + Heu"", Lye" 3,7

Brevi. flavum No. 2247 - - o,o4

Bemerkung; Widerstandsfähig gegenüber ·

Analogen + : zeigt Widerstandsfähigkeit gegen

• cC -Amino-ß-hydroxyvaleriansäure

Widerstandsfähig gegenüber Analogen - t

Heu"*, Lys~ :

Nährstofferfordernis - ι zeigt Empfindlichkeit gegen CG-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure

zeigt, daß der Mikroorganismus Isoleucin und Lysin für sein Wachstum erfordert.

zeigt, daß der Mikroorganismus keinen Nährstoff für sein Wachstum erfordert.

Beispiel 3

Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

Glucose	Io £
Ammoniumsulfat	3 $
Kaliumdihydrogenphosphat	o,15 $>
Magne s iumsulfat	o,o4 i»
Biotin	2oo ,ug/l
Vitamin B_n	3oo uß/1

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Pe⁺⁺ „ 2 Teile/Million

Mn⁺⁺ 2 leiie/foillion

Sojabohnenproteinhydrolysat
(Gesamtstickstoff 2,2 g/dl) " 4 ml/l

Calciumcarbonat

(getrennt sterilisiert·) 5 $>·

Mengen von 2o ml des obengenannten Mediums wurden in 5 oo ml-Schütt elf las ehen eingebracht und durch Y/ass er dampf bei Ho⁰O 5 Minuten sterilisiert. Das Medium wurde mit Corynebacterium acetoaoidoplilumC~5o2 geimpft und die Gärung wurde unier aeroben Bedingungen bei 3o°C 64 Stunden ausgeführt. Die Menge, an in der Gärungsbrühe angesammeltem !-Threo nin betrug 3»6 g/l.

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Claims

~ 13 - Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung.von Ü-Threonin, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Threonin erzeugenden Stamm,der zu Brevibaoteriiim oder Corynebacterium gehört und gegenüber et -Amino-ß-hydroxyvaleriansäure widerstandsfähig ist, unter aeroben Bedingungen in einem Medium züchtet, das assimilier- j bare Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Substanzen und wachstumsfördernde Substanzen enthält, während der pH-Wert des Kulturmediums innerhalb des Bereichs von 5 bis 9 gehalten wird, und das erzeugte -L-Threonin gewinnt,

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Threonin erzeugende Stamm zu Brevibaoterium flavum oder Corynebacterium acetoacidophilum gehört.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm so beschaffen ist, daß sein Wachstum bei Züchtung in einem 1 mg/ml oC-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure ent- " haltenden Medium während 24 Stunden mehr als loft desjenigen in einem normalen Medium ist und daß der Stamm auch L-Threonin erzeugen kann. ■

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3_f dadurch gekennzeichnet, daß die assimilierbare Kohlenstoffquelle aus Kohlehydraten und organischen Säuren gewählt ist und daß der assimilierbare Stickstoff aus Ammoniak (wäßriger Ammoniaklösung oder gasförmigem Ammoniak), Ammoniumsalzen oder Harnstoff gewählt ist.

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5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Threonin erzeugende Stamm aus Brevibaoterium flavum B-2 (ATCC 21269) oder Corynebacterium acetoacidophilum 0-5o2 (ATCC 2127o) besteht.

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