DE1642717C

DE1642717C - Verfahren zur Herstellung von L Pro Im

Info

Publication number: DE1642717C
Authority: DE
Inventors: Yuichi Nakanishi Toru Taketugu Yasuyuki Hofu Noguchi (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Publication date: 1972-10-19

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Prolin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in hierfür üblichen, Ammonium- und Chloridionen enthaltenden wäßrigen Nährmedien mit einem Gehalt an Biotin in einer für das Wachstum der Mikroorganismen mindestens ausreichenden Menge.

Es ist bereits bekannt, daß L-Prolin auf fermentativem Wege unter Verwendung einer Mutanten von Escherichia coli aus Glutaminsäure hergestellt werden kann. Es ist ferner bekannt, daß sich zur fermentativen Herstellung von L-Prolin aurh Neurospora sitophila und verschiedene Hefen eignen.

Aus der französischen Patentschrift 1 427 534 ist es bereit? bekannt, daß L-Prolin auf fermentativem Wege in einem ein Kohlenhydrat enthaltenden Nährmedium angereichert wird, wenn in diesem Brevibacterium flavum ATCC 15 940 kultiviert wird. Aus der USA.-Patentschrift 3 222 258 ist schließlich bereits ein Verfahren zur Herstellung von L-Prolin auf fermentativem Wege unter Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas und Candida in einem üblichen, Biotin, Ammonium- und Chloridionen in einer Konzentration von etwa 0,1 Mol/Liter enthaltenden Nährmedium bekannt.

Die bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von L-Prolin sind jedoch wegen der damit erzielbaren geringen Ausbeute für die großtechnische Herstellung dieser bekannten Aminsäure nicht geeignet.

Aufgabe der Erfindung ist es nun, ein verbessertes Verfahren zur fennentativen Herstellung von L-Prolin anzugeben, mit dessen Hilfe die den bisher bekannten Verfahren anhaftenden Nachteile beseitigt werden können und das insbesondere zur großtechnischen Herstellung von L-Prolin geeignet und einfach durchführbar ist

Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe dadurch gelöst werden kann, daß man ganz bestimmte Mikro-Organismen der Gattung Micrococcus glutamicus verwendet und in dem Nähnnedium eine Mindestkonzentration an Ammonium- und Chloridionen von jeweils 0,5 Mol pro Liter aufrechterhält.

Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herstellung von L-Prolin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in hierfür üblichen, Aß'-aonium- und Chloridioneri enthaltenden wäßrigen Nährmedien mit einem Gehalt an Biotin in einer für das Wachstum der Mikroorganismen mindestens ausreichenden Menge, das dadurch gekennzeichnet ist, daß als Mikroorganismen Micrococcus glutamicus ATCC 21 157, 21 158 oder 21 159 eingesetzt wird und die Ammonium- und Chloridionenkonzentration im Nährmedium jeweils mindestens 0,5 Mol pro Liter beträgt.

Bezüglich der Konzentration an Biotin in dem Nährmedium ist es zweckmäßig, die Kultivierung unter solchen Bedingungen durchzuführen, bei denen die Biotinkonzentration auf einem Wert gehalten wird.

bei dem die Mikroorganismenzellen optimal wachsen. Dabei hat sich gezeigt, daß die Konzentration an Ammoniumionen in dem Nährmedium möglichst hoch gehalten werden muß. Die Bildung von L-Prolin wird begünstigt, wenn die Konzentration des Ammoniumsalzes in dem Nährmedium auf einem Wert von mindestens etwa 4 Gewichtsprozent gehalten wird, insbesondere dann, wenn als Ammoniumsalz Ammoniumchlorid verwendet wird. Ferner wurde gefunden, daß durch die Anwesenheit von zusätzlichen Cnloridionen die Bildung von L-Prolin in synergistischer Weise begünstigt wird.

Die Abhängigkeit der i.-Prolinbildung von der Konzentration der Ammoniumionen und Chloridionen sowie der Konzentration an Biotin in dem Nährmedium geht aus den folgenden Tabellen hervor:

	0	1.23	Tabelle	1	(0.561)	4,92	6.15	7.38
	(0)	(0.1871		10.4	(0.748)	(0.935)	(1.122)
(NHJ₁SO₄ in g dl.	3,2	4.8	NaCl. & \l {CW MoII)	15,6	12,2	15,3	13,2
(NH₄* in Mol Liter)	5,7	9,4		24,4	17.4	19,0	14.8
	7.2	11.8	2.46 I 3,69	27.0	28,3	27,0	19,1
1.26 (0,187)	9,4	13,8	(0,374)	29.5	32,4	30,0	24.6
2.52 (0,374)	H). I	16.7	6,3	20.6	30.4	21.4	16.6
3.78 (0,561)	10.2	15.3	11,9	17.6	13.7	10.4
5,04 (0,748)		18,2
6.30 (0.935)		21,4
7.46 (1.122)		25.4
	21.8

Zusammensetzung des Nährmediums

Glukose

[NH₄I,Sf)₄

NaCI

KH,PO₄

K,HPO₄

MpSO₄ 7H.O

FeSf)₄ 7 H,Ό

MnSO₄ 4H,O

Bemerkung I) zu Tabelle I

ISg dl

wie in Tabelle I angegeben

0.10 g dl

(1.05 g dl

0.002 g dl

0,lX>2 ρ dl

ZnSO₄ 711,0 0.(X)I g dl

NiCI, ■ MU) 0,001 g dl

K-CrO₄ . ." 0.00! i; iü

Biotin 100 ■ Ί

Thiaminhulroehlorid - mg 1

Fleischextrakt 0,5 g dl

HainsipfT 0.5 g dl

CaCOj 5.0 g dl

Bemerkung 2) zu Tabelle I

Züchtungsbedingungen

20 ml des Nährmediums werden in einen Sakaguchi-IColben gegossen und sterilisiert. Der Stamm Micrococcus glutamicus ATCC 21 157 ird eingeimpft uiid unter aeroben Bedingungen unter Schütteln bei 28 bis 30⁵C 96 Stunden lang kultiviert.

Bemerkung 3) zu Tabelle I Die Zahlenwerte in der Tabelle I zeigen die gebildete L-Prolinmenge in mg/ml.

Tabelle U

	Biotin-	:	Menge	-0 (0J74	Menge	Ammoniumchlorid, g/dl	Menge	Menge	Menee	6,0 (1.121	Menge	Menge	Menge	10,0 (1.870)	Menge	Menge	Menee
	konzen-	an	Menge	der"	4.0 tü.748	an	an er	der	an	an er	der	an	an er	der
Zucker	t ration	erzeug tem	an er-	Bak- terien-	erzeug tem	zeugter L-GIu-	Bakte rien	erzeug tem	zeugter L-GIu-	Bakte rien-	erzeug tem	zeugter L-GIu-	Bakte rien
konzen		L-Prolin	zeueter L-GIu-	zeüen	L-Prolin	tamin-	zellen	L-Prolin	tamin-	Zellen	L-Prolin	tamin-	zellen
tration			tamin-			säure			säure			säure
	j'/i	mg/ml	säure	me dl	me ml	me ml	medi	me/ml	mg/ml	mg/dl	mg/ml	mg/ml	mg/dl
	5	16	me ml	B.O	5.1	20.5	lO.t	8.9	8.0	10.0	3.2	0.3	6,2
g/dl	1"	6.3	23.4	16.2	9.9	23.2	16.4	13.2	7.5	16.6	7.6	0.6	S.l
15	15	8.1	30.2	29.2	14.4	20.2	21.8	iS.l	17.4	18.4	13.2	1.2	10.2
	20	12.6	19.4	31.4	18.1	5.8	27.6	21.5	7.4	212	15.6	1.8	12.4
	30	115	3.6	312	18.8	4.6	31.2	26.5	3.2	25.8	17.8	1.5	14.8
	50	12.2	1.0	32.4	19.2	3.2	312	27.1	18	26.2	19.6	0.9	17.1
	100	12.2	0.9	32.8	19.5	16	318	"*7 ^	11	26.4	21.2	0.3	18.6
	1000	12.1	0.9	3L.	19.0	14	31.4	2Ϊ.3	1.9	26.2	23.5	0.1	19.2
	5	1.8	0.8	11.2	3.2	3.6	9,2	2.7	1.8	8.8	1.3	0.1	3.4
	10	7,1	,5.3	16.2	8.8	9.2	13.6	9.1	2.4	118	3.6	0.3	7.2
20	15	9.T	17.2	22.4	17.3	9.4	19.4	19.7	5.0	15.8	7.9	0.7	8.5
	20	15,8	19.4	29.2	216	15.4	21.2	26.5	3.3	17.8	13.2	1.2	9.1
	30	16.8	11.0	31.4	25.4	4.2	23.0	35.0	3.9	19,8	15,4	1.7	11.2
	50	17.1	2.8	32.0	26.2	3.S	25.0	36.4	19	21.2	17,6	1.4	14.1
	100	17.2		31.4	26.1	3.6	26.4	37.2	2,7	21.6	20,2	0.9	15.2
	1000	17.2	2.3	31.2	25.8	3.4	26.2	36.5	2.5	21.8	218	0.6	16.4
			2..

Bemerkung l|r: Tabelle II

Zusammensetzung des Nährmediums:

Glukose wie in der Tabelle

NH₄Cl wie in der Tabelle

K,H PO₄ 0.10 g/dl

KH₁PO₄ 0.10 g/dl

MgSO₄ · 7H,O 0,05 g dl

FeSO₄ · 7H,Ö 0.002 g/dl

MnSO₄ · 4H,0 0.002 g dl

ZnSO₄ -7H,Ö 0.001 g dt

NiCI, -6H,O 0.001 g dl

K₂CrO₄ .." Ü.OOI g/dl

Biotin wie in der Tabelle

Thiaminhydrociilorid 2 mg/1

Fleischextrakt 0,5 g/dl

Harnstoff 0 5 a/dl

CaCO₃ 5,0 g/dl

Bemerkung 2) zu Tabelle II

Züchtungsbedingungen Wie in Tabelle I.

Bemerkung 3) zu Tabelle II Die Mengen an Baktcricnzellen wurden an Hand des Gewichtes der getrockneten Bakterienzellen ermittelt.

Die Beziehung zwischen der Ammoniumchloridkonzcntration und der Biotinkonzentration geht aus den Tabellen I und II hervor, wobei Ammoniumsulfat als Ammoniumionenquelle, Natriumchlorid als Ch'.oridionenquelle und Ammoniumchlorid als Quelle sowohl für Ammonium- als auch Chloridionen eingesetzt wurden. Wie aus diesen Tabellen zu ersehen ist. steig», die Menge an gebildetem t-Prolin durch Erhöhung der Ammoniumionenkonzentration in dem Nährmedium an. Darüber hinaus wird die. Bildung von ι-Prolin durch eine steigende Chloridioncnkonzen· tration (Zugabe von Natriumchlorid) erheblich beschleunigt. Beträgt die Konzentration an beiden Ionen 0.5 Mol pro Liter oder darüber, dann verstärkt sich diese Neigung erheblich, wobei die Menge an gebildetem i-Prolin bei einer Konzentration von ungefähr 0.7 bis 1.2 Mol pro Liter ein Maximum erreicht.

Wie aus einem Vergleich der Tabellen I und II hervorgeht, kann die optimale Menge eine beträchtlich höhere Konzentration bei der Zugabe von Ammoniumchlnrid als Ammonium- und Chloridionenquelle erreichen als dies der Fall ist, wenn zwei Verbindungen, wie beispielsweise Ammoniumchlorid und Natriumchlorid, zugesetzt werden. Die Menge an gebildetem ι-Prolin kann auf diese Weise gesteigert werden.

to Diese Erscheinung scheint auf die Tatsache zurückzuführen zu sein, daß im Falle von Ammoniumchlorid der osmotische Druck in dem Medium nicht so stark erhöht wird, daß seine wachstumshemmende Wirkung auf die Mikroorganismen gering ist. wobei die unerwünschte hemmende Wirkung anderer Ionen, wie beispielsweise von Natrium- und Sulfationen, nicht eintritt. Ferner steht die Wirkung dieser beiden Ionen auf die Erzeugung von i.-Prolin in enger Beziehung

zu der Konzentration an Biotin in dem Nährmedium. Die Bildung von L-Prolin zeigt dann ein Maximum, wenn eine Biotinmenge in dem Nährmedium zugegen ist, die fur das Wachstum der Bakterienzellen ausreicht oder über dieser ausreichenden Menge liegt.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist sowohl ein synthetisches Nährmedium als auch ein natürliches Nährmeüium geeignet, sofern es die für das Wachsen des eingesetzten Mikroorganismus erforderlichen Nährstoffe enthält. Solche Nährstoffe sind bekannt. Zu ihnen gehören beispielsweise eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Verbindungen, wobei diese Nährstoffe von dem eingesetzten Mikroorganismus in entsprechenden Mengen verbraucht werden.

Als Kohlenstoffquelle seien beispielsweise genannt: Kohlehydrate, wie z. B. Glukose, Fruktose, Maltose, Rohrzucker. Stärke, Stärkehydrolysat und Melassen, oder irgendwelche anderen geeigneten Kohlenstoff quellen, wie beispielsweise Glycerin, Mannit. Sorbit, aliphatische organische Säuren, z. B. Gluer nsäure. Zitronensäure und Essigsäure. Diese Substanzen können entweder allein oder in Form von Mischungen aus zwei oder mehreren Substanzen eingesetzt werden.

Als Stickstoffquelle kommen verschiedene anorganische oder organische Salze oder Verbindungen in Frage, beispielsweise Harnstoff, Ammoniak, Ammoniumsalze, z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat. Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat, oder natürliche. Stickstoff enthaltende Substanzen, beispielsweise Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl. Fleischbrühe. Kaseinhydrolysate, lösliche Fischbestandteile oder Reiskleieextrakt. Diese Substanzen können ebenfalls allein oder in Form einer Mischung aus zwei oder mehreren Substanzen eingesetzt werden.

Anorganische Verbindungen, die dem Nährmedium zugesetzt werden können, sind beispielsweise Magnesiumsulfat. Natriumphosphat, Kaliumhydrogenphosphat. Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat. Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid oder andere Salze von Kalium, Magnesium, Eisen und Mangan. Außerdem können verschiedene Nährstoffe, wie beispielsweise Vitamine, Aminosäuren oder Nucleinsäuren, dem Nährmedium zugesetzt werden.

Die Chloi uionen können in Form von beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Calciumchlorid zugefügt werden. Lie Verwendung von Ammoniumchlorid, das beide Ionen enthält, ist sowohl aus wirtschaftlichen Gründen als auch hinsichtlich des Wirkungsgrades zu empfehlen.

Die optimale Konzentration an Biotin, die bei dem erfindungsgemäßen Fermentationsverfahren zur Erzeugung von ι.-Prolin eingesetzt wird, schwankt etwas mit· der Zusammensetzung des Nährmediums, den Züchtungsbedingungen u. dgl. Folglich ändert sich die dem Nährmedium zuzusetzende' Biotinkonzentration mit diesen Bedingungen. Im allgemeinen wird die Zugabe von etwa 30 bis 1000 v/l bevorzugt. Im Handel erhältliche Quellen für reines Biotin sowie Rohprodukte, die Biotin enthalten, sind einsetzbar. Falls Biotin enthaltende Substanzen, wie beispielsweise Melassen, in dem Medium verwendet werden, kann ein Teil des Biotins o';r die ganze erforderliche Biotinmenge in dieser Form zugeführt werden. Bekannte Biotinersatzverbindungen können ebenfalls eingesetzt werden. Von deri.<'igen verwendbaren Ersatzverbindungen seien beispielsweise Biotinhomologe, wie z. B. Biocitin und dJ-Desthiobiotin, Substanzen mit Pelargonsäuregruppen, wie beispielsweise 7-Keto-8-amino-pelargonsäuresalze und 7,8-Diketopelargonsäure, höhere ungesättigte Fettsäuren, wie beispielsweise Linoleinsäure und ölsäure sowie nichtionische oberflächenaktive Mittel, wie beispielsweise Sorbitanmonooleat und Polyoxyäthylensorbitanmonooleat, erwähnt. Substanzen, die als Äquivalente zu Biotin angesehen werden, können ebenfalls ge-

gebenenfails verwendet werden. Werden diese Ersatzmittel eingesetzt, dann richtet sich die zugesetzte Menge nach der Wirksamkeit des Ersatzmittels, die im allgemeinen bekannt ist.

Die Züchtung oder Fermentierung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, beispielsweise durch aerobes Schütteln oder durch Belüften und Rühren, und zwar bei einer Temperatur von etwa 25 bis 35^C C, verzugsweise 28 bis 32° C. und bei einen, ,Ή von ungefähr 6.0 bis 7,0. Es ist am zweckmäßigsten, das pH während der Züchtung auf den angegebenen Bereich einzustellen. Als Neutralisierungsmittel für diesen Zweck seien Ammoniak, Harnstoff, Natriumhydroxyd. Kaliumhydroxyd und Calciumcarboriat erwähnt, ι.-Prolin wird in der erhaltenen Fermentationsfiüssigkeil gewöhnlich nach 2- bis 5tägigem Züchten als Hauptprodukt angereichert.

Nach Beendigung d<:r Fermentation kann das L-Prolin aus eier Fermentalionsflüssigkeit durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz abgetrennt werden. Beispielsweise wird das Fermentationsmedium filtriert, die Fermentationsfiüssigkeit mittels eines Kationenaustauscherharzes behandelt und von letzterem anschließend das L-Prolin eluiert. Nach der Konzentrierung des Eluais unter vermindertem Druck wird Methanol zugesetzt, um in Methanol kaum lösliche Aminosäuren durch Filtration abzutrennen. Anschließend wird in der methanolischen i.-f'rolinlösung das Methanol durch Wasser ersetzt, worauf die Lösung durch ein Katiorenaustauscherharz sowie durch ein Anionenaustauscherharz zur Entfernung kleiner Mengen basischer und saurer Aminosäuren geleitet wird. Aus dem konzentrierten mit Methanol versetzten Eluat können nach Filtration und Einengen zur Trockne unter vermindertem Druck rohe Kristalle von L-Prolin erhalten werden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern. Die Prozentangaben sind Gewichtsprozent.

Beispiel 1

Ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung wird ir I 1 Wasser hergestellt:

25 g/dl Glukose,

6 g/dl NH₄Cl,

0.10g/dl KH₇PO₄,

0,15 e/dl K-HPO₄.

0,10 g/dl MgOO₄-TH₂O,

0,002 g/dl FeSO₄-7H₂O,

0,002 g/dl MnSO₄-4H₂O,

0.001 g/dl ZnSO₄-7H₂O,

2 mg/1 Thiaminhydrochlorid,

5,0 g/dl CaCO-,

0,5 g/dl Hefeextrakt,

0,5 g/dl Harnstoff,
80 v/dl Biotin.

20 ml des vorstehend beschriebenen Nährmediums werden in einen 500-ml-Sakaguchi-Kolben gegossen und 15 Minuten lane bei 12O⁰C sterilisiert. Die Phos-

phate und der Harnstoff werden jeweils getrennt sterilisiert. Auf Teile des erhaltenen Nährmediums, die in einzelnen Kolben enthalten sind, wird Micrococcus glutamicus ATCC 21 158 aufgeimpft. Das Züchten wird dann unter aerobem Schütteln 96 Stunden lang bei 30⁰C durchgeführt.

Die Menge des im Fermentationsmedium nach Beendigung des Züchtens angereicherten i.-Prolins beträgt im Durchschnitt 22,4 mg/ml. Die Menge an als Nebenprodukt anfallender Glutaminsäure beträgt durchschnittlich 4,2 mg/ml.

Nach Beendigung des Züchtens wird das erhaltene Fermentationsmedium gesammelt und auf ein Volumen von 11 gebracht. Anschließend wird das pH durch Zugabe von Schwefelsäure auf 2 eingestellt, worauf unlösliche Substanzen abfiltriert werden. Das Filtrat wird durch ein Kationenaustauscherharz (SuI-fonsäuretyp) geleitet, worauf nach der Adsorption eine Eluierung mit Ammoniakwasser durchgeführt wird. 0,31 der L-Prolin-Abflußfraktion werden unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von etwa 50 ml eingeengt. Anschließend wird kontinuierlich Methanol zugesetzt, wobei gleichzeitig die Lösung konzentriert wird. Auf diese Weise wird das Wasser durch Methanol ersetzt. Die Methanollösung wird zur Entfernung von Aminosäuren, die in Methanol kaum löslich sind, filtriert. Das Methanol wird durch Wasser ersetzt und diese wäßrige Lösung durch eine Kationenaustauscherharz-Kolonne sowie anschließend durch eine Anionenaustauscherharz-Kolonne geleitet. Nach der Konzentrierung des Efluats wird das Wasser erneut zur Entfernung von unlöslichen Substanzen durch Methanol ersetzt. Die erhaltene Methanollösung (etwa 100 ml) wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Dabei fallen 16-g roher i-Prolin-Kristalle an.

Beispiel 2

In 1 1 Wasser wird folgendes Nährmedium hergestellt:

20 g/dl Glukose,

5 g/dl (NH₄J₂SO₄,

5 g/dl NaCl,

0.10g/dl KH₂PO₄,

0.10 g/dl K₂HPO₄,

0.05 g/dl MgSO₄ -7H₂O,

0.002 g/dl MnSO₄ 4H₂O,

0,001 e/dl ZnSO₄ - 7H₂O,

0,001 g/dl NiCl₂ · 6H₂O,

0.001 g/dl K₂CrO₄,

1 mg/ml Thiaminhydrochlorid,

4.0g/di CaCO₃,

1,0 g/dl Hefeextrakt,

.0,5 g/dl Harnstoff,
50 γ ft Biotin.

20-ml-Portionen des vorstehend beschriebenen Nährmediums werden in konische 500-ml-Kolben gegeben und 15 Minuten lang bei 120⁰C sterilisiert. Die Phosphate und der Harnstoff werden getrennt sterilisiert. Jeder Kolben, welcher das Nährmedium enthält, wird mit Micrococcus glutamicus ATCC 21 157 beimpft. Das Züchten wird dann unter aerobem Schütteln 96 Stunden lang bei 28° C durchgeführt.

Die nach Beendigung des Züchtens im Fermentationsmedium angereicheue Menge an L-Prolin beträgt durchschnittlich 24,8 mg /ml. Die Menge der als Nebenprodukt anfallenden l.-Giutaminsäurc wird zu durchschnittlich 3.1 mg/ml ermittelt.

Nach Beendigung des Züchtens wird das l-'ermcntationsmedium gesammelt und auf ein Volumen von 1 1 gebracht. Die Abtrennung des ι,-Prolins erfolgt in der gleichen Weise wie im Beispiel 1. Auf diese Weise werden ungefähr 18 g roher i.-Prolin-Kristalle erhalten.

Beispiel 3

In 1 1 Wasser wird ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

25 g/dl Glukose,

5 g/dl NH₄Cl,
0,10g/dl KH₂PO₄,

0,15 g/dl K₂HPO₄,

0,05 g/dl MgSO₄-7H₂O,

0,003 g/dl MnSO₄-4H₂O,

0,002 g/dl ZnSO₄-7H₂O,
2 mg/1 Thiaminhydrochlorid.

4,0 g/dl CaCO₃,

0,5 g/dl Hefeextrakt,

0,5 g/dl Harnstoff,
100 yft Biotin.

31 des vorstehend beschriebenen Nährmediums werden in eine 5-1-Glas-Fermentierungsvorrichtung gegeben und 15 Minuten lang bei 120⁰C sterilisiert. Die Phosphate sowie der Harnstoff werden jeweils

3a getrennt sterilisiert. Anschließend wifd das Nährmedium mit einer Impfbaktcrienflüssigkeit aus Microcoecus glutamicus ATCC 21 159 beimpft. Das Züchten wird anschließend unter Belüften und Rühren der Submerskultur bei einer Temperatur von 30° C durchgeführt, wobei die Belüftung mit 3 I pro Minute erfolgt und mit einer Geschwindigkeit von 650 UpM gerührt wird.

Die Menge des im Fermentationsmedium nach Beendigung des Züchtens angereicherten i.-Prolins beträgt 30.4 mg/ml, während die Menge der als Nebenprodukt anfallenden L- Glutaminsäure zu 3,8 mg/ml ermittelt wird.

Nach Beendigung des Züchtens wird das erhaltene Fermentationsmedium in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise behandelt. Dabei werden 70 g rohei L-Prolin Kristalle erhalten.

Beispiel 4

Das Züchten wird nach der im Beispiel 1 beschriebenen Weise durchgeführt, mit der Ausnahme, dai die in der folgenden Tabelle III aufgeführten Sub stanzen an Stelle des im Beispiel 1 verwendeten Bia tins eingesetzt werden. Die Ergebnisse sind ebenfall:

in der folgenden Tabelle III zusammengefaßt.

	Biocitin	Tabelle III	Menge an er zeugtem	Menge
			L-Prolin	an als Neben produkt
6o Biotinersatz	Konzentration		erzeugte
			L-Gluta-
		(mg/ml)	minsäun
		18,8	(mg/ml)
6-5		(5,1)	7,1
200 yft		(17,6)
(20 γ ft)

FortNCt/uni·

	Konzentration	Menge an er zeugtem	Menge
Biotincrsatz		L-Prolin	an als Neben produkt
			erzeugter !.-Gluta
		(mg/m!)	minsäure
	200 ;/l	16,9	(mg/ml)
d,l-Desthiobiotin	(20 y/1)	13,6)	4,2
	2000 ;·/1	14.8	(14.4)
7,8-Diamino-	(200 -//I)	(1,9)	4,6
pclargonsäure		(15,6)

	5	Polyoxyäthylen-	Ij	10	Menge an er zeugtem	Menge
		lo sorbitanmono- oleat		i-Prolin	an als Neben produkt
Eiotincrsatz		Natriumlaurat	Konzentration		erzeugte
				L-Gluta
Calciuinoleat		(mg ml)	minsäur
	20,8	(mg ml)
	(7,9)	2,0
20 mg/ml	17,9	(25.1)
(2 mg/ml)	(3,2)	2,1
10 mg/ml	22,8	(21,4)
(1 mg/ml)	(5,9)	3,2
10 mg/ml		(23,7)
(1 mg/ml)

2660

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von L-Prolin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in hierfür üblichen, Ammonium- und Chloridionen enthaltenden wäßrigen Nährmedien mit einem Gehalt an Biotin in einer für das Wachstum der Mikroorganismen mindestens ausreichenden Menge, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen Micrococcus glutamicus ATCC 21157, 21158 oder 21159 eingesetzt wird und die Ammonium- und Chloridionenkonzentration im Nährmedium jeweils mindestens 0,5 M'ol/Liter beträgt.