DE2531999B2 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin - Google Patents
Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-LysinInfo
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Description
Micrococcus glutamicus NRRL B-Il 124
und NRRL B-Il 125.
Brevibacterium flavum NRRL B-11 130,
NRRLB-Il 131,NRRLB-Il 132,
NRRLB-Il 126,NRRLB-Il 127,
NRRLB-Il 128 und NRRL B-Il 129 sowie
Corynebacterium glutamicum NRRL B-11 135,
NRRLB-Il 136,NRRLB-Il 145,
NRRLB-Il 146,NRRLB-Il 147,
NRRLB-Il 148,NRRLB-Il 149 und
NRRLB-Il 150.
und NRRL B-Il 125.
Brevibacterium flavum NRRL B-11 130,
NRRLB-Il 131,NRRLB-Il 132,
NRRLB-Il 126,NRRLB-Il 127,
NRRLB-Il 128 und NRRL B-Il 129 sowie
Corynebacterium glutamicum NRRL B-11 135,
NRRLB-Il 136,NRRLB-Il 145,
NRRLB-Il 146,NRRLB-Il 147,
NRRLB-Il 148,NRRLB-Il 149 und
NRRLB-Il 150.
10
Die meisten dieser Mutanten sind in den US-PS 29 79 439, 36 16 218, 36 87 810, 37 07 441 und 37 08 395
sowie der GB-PS11 86 988 beschrieben.
Zur Herstellung von L-Lysin unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Stämme werden diese
Stämme aerob in einem Nährmedium gezüchtet, das assimilierbare Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische
Verbindungen und andere Nährstoffe enthält.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes biotechnisches Verfahren zur Herstellung
von L-Lysin unter Verwendung von L-Lysin bildenden Mutanten von coryneformen, Glutaminsäure bildenden
Bakterien zu schaffen. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß durch
Zusatz einer Kulturbrühe bestimmter L-Leucin bilde 1-der Mutante zum Nährmedium die Ausbeute an L-Lysin
erheblich gesteigert wird. Dieser Effekt ist größer als bei jo Zusatz von L-Leucin zum Nährmedium in einer Menge,
die der in der Kulturbrühe enthaltenen L-Leucinmenge entspricht. Es wurde ferner festgestellt, daß dieser
Effekt nicht nur bei L-Lysin bildenden Stämmen auftritt, die einen L-Leucin-Bedarf haben, sondern auch bei r>
solchen L-Lysin bildenden Stämmen, die die verschiedensten Eigenschaften besitzen.
Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
Die Herstellung von L-Leucin auf biotechnischem Wege ist bekannt. Ebenso wie bei den L-Lysin bildenden
Mutanten haben die L-Leucin bildenden Mutanten im allgemeinen mindestens eine der folgenden Eigenschaften,
nämlich einen Bedarf an verwandten Aminosäuren, wie L-Isoleucin, L-Methionin oder L-Valin, und eine vi
Resistenz gegenüber verwandten Aminosäuren, wie L-Leucin und ihren Analogen, wie oc-Aminobuttersäure,
herrührend von der vollständigen oder unvollständigen Blockade des biosynthetischen Sytheseweges und der
vollständigen oder unvollständigen Abweichung von Rückkopplungssteuerungen. Die Produktivität dieser
Stämme zur Bildung von L-Leucin wird verbessert durch Vereinigung anderer als der vorstehend beschriebenen
Eigenschaften, beispielsweise einem Bedarf an Aminosäuren, wie L-Phenylalanin. Die Produktivität
wird ferner verbessert durch Vereinigung der Resistenz gegenüber Aminosäuren, wie L-Lysin oder L-Histidin,
und ihren Analogen, wie S-(2-Aminoäthyl)-L-cystein oder 2-Thiazolalanin.
Bevorzugte L-Leucin bildende Mutanten sind w>
Brevibacterium flavum NRRL B-12 133,
Brevibacterium lactof ermentum NRRLB-Il 134,
Corynebacterium glutamicum NRRL B-Il 137
Brevibacterium lactof ermentum NRRLB-Il 134,
Corynebacterium glutamicum NRRL B-Il 137
bis 11 144, b5
NRRLB-Il 151 und NRRL B-Il 152 sowie
Corynebacterim acetoacidophilum NRRL
B-Il 153.
Corynebacterim acetoacidophilum NRRL
B-Il 153.
Einige der vorgenannten Stämme sind in der JA-OS
101 589/74 beschrieben.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich die L-Lysinausbeute dadurch erheblich verbessern, daß man
bestimmte L-Lysin bildende Mutanten in einem Nährmedium züchtet, das durch die Kulturbrühe von
bestimmten L-Leucin bildenden Mutanten ergänzt wird. Der Mechanismus ist unbekannt Es ist bekannt, die
Produktivität der L-Lysin bildenden Stämme durch Zusatz verschiedener Aminosäuren zu verbessern. Wie
vorstehend bereits beschrieben wurde, beruht die Wirkung des Zusatzes der Kulturbrühe der L-Leucin
bildenden Mutanten nicht auf dem in der Kulturbrühe vorhandenen L-Leucin. Die Kulturbrühe der L-Leucin
bildenden Mutanten enthält neben L-Leucin noch andere Aminosäuren, doch kann die Wirkung des
Zusatzes der Kuiturbrühe nicht diesen Aminosäuren zugeschrieben werden. Dies wird nachstehend näher
erläutert
Im erfindungsgemäßen Verfahren kann entweder ein synthetisches oder ein natürliches Nährmedium verwendet
werden, sofern es die für den jeweils eingesetzten Stamm erforderlichen assimilierbaren Kohlenstoffquellen,
Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen und andere wachstumsfördernde Substanzen enthält
Je nach der Art des eingesetzten Mikroorganismus kommen als Kohlenstoffquellen Kohlenhydrate, wie
Glucose, Fructose, Sorbit, Mannit, Glycerin, Stärke, Stärkehydrolysate, Melasse, Zuckerrübenmelasse, Carbonsäuren,
wie Essigsäure, Fumarsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Bernsteinsäure, und Alkohole, wie
Methanol oder Äthanol, in Frage. Bevorzugt sind in der Praxis Melasse, Zuckerrübenmelasse, Essigsäure und
Glucose.
Als Stickstoffquellen können Ammoniak, organische und anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid,
Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumacetat oder Ammoniumphosphat, stickstoffhaltige
Verbindungen, wie Harnstoff, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysate,
Fischmehl, abgebautes Fischmehl, entfettetes Sojabohnenmehl, abgebautes entfettetes Sojabohnenmehl oder
Produkte der Säurehydrolyse von Sojabohnenprotein, verwendet werden.
Spezielle Beispiele für verwendbare anorganische Verbindungen sind Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat,
Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)-sulfat, Mangansulfat und Calciumcarbonat.
Wenn die verfahrensgemäß eingesetzten L-Lysin bildenden Mutanten einen Nährstoffbedarf an Aminosäuren,
Vitamine oder Purinbasen haben, muß dem Nährmedium natürlich dieser Nährstoff in der entsprechenden
Menge zugesetzt werden. Beispielsweise benötigen die coryneformen Glutaminsäure bildenden
Bakterien und somit auch deren L-Lysin bildende Mutanten zum Wachstum Biotin. Das Nährmedium muß
daher auch Biotin in entsprechender Menge enthalten.
Die Erhöhung der L-Lysin-Ausbeute im erfindungsgemäßen Verfahren wird durch Zusatz der Kulturbrühe
A erreicht, die bei der Züchtung einer L-Leucin bildenden Mutante erhalten wird. Die Kulturbrühe A
kann dem L-Lysinfermentationsmedium entweder unmittelbar oder nach der Abtrennung der Mikroorganismen
zugesetzt werden. In beiden Fällen muß natürlich die Kulturbrühe A oder dessen Filtrat sterilisiert
werden, bevor es im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird.
Die Zur Ergänzung des Nährmediums für die
fs?
Sl
Sl
L-Lysinbildung erforderliche Menge an Kulturbrühe A hängt von der Art der Mikroorganismen und der
Zusammensetzung der Nährmedien bei der L-Lysin- und L-Leucinproduktion ab. Vorzugsweise enthält das
L-Lysinfermentationsmedium die Ku'iurbrühe A in einer Menge von 2 bis 150 ml/Liter, bezogen auf das
Volumen des Nährmediums der L-Lysinfermentation. Die optimalen Mengen können durch einfache Vorversuche
bestimmt werden.
Die Kulturbrühe A kann dem Nährmedium insgesamt zu Beginn oder in Anteilen während der Fermentation
zugesetzt werden. Im letztgenannten Fall kann die Kulturbrühe A auf einmal, absatzweise oder kontinuierlich
eingespeist werden. Vorzugsweise ist die Zufuhr der Kulturbrühe A bis zum Ende der log-Phase, d. h. der
exponentiellen Wachstumsphase, beendet. Im allgemeinen ist die log-Phase nach 10 bis 24 Stunden nach
Beginn der Züchtung beendet
Die Fermentation der L-Lysin bildenden Mutanten wird unter den üblichen Bedingungen durchgeführt, d. h.
unter aeroben Bedingungen, beispielsweise unter Belüftung und Rühren oder unter Schütteln bei
Temperaturen von 25 bis 4O0C und pH-Werten von 6 bis 8,5. Im allgemeinen hat sich nach 30 bis 150 Stunden eine
beträchtliche Menge an L-Lysin im Nährmedium angesammelt Nach beendeter Züchtung wird das
L-Lysin nach üblichen Methoden isoliert und gereinigt, beispielsweise durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz
und durch Umkristallisation.
Die Kulturbrühe für die L-Leucin bildende Mutante wird nach üblichen Methoden hergestellt Es kann jede
L-Leucin bildende Mutante von coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien mit den vorstehend
beschriebenen Eigenschaften zur Herstellung der Kulturbrühe verwendet werden. Ebenso wie bei der
L-Lysinfermentation kann entwder ein synthetisches oder ein natürliches Nährmedium auch bei der
L-Leucinfermentation eingesetzt werden, sofern es die zum Wachstum des Mikroorganismus erforderlichen
Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen und andere Nährstoffe enthält. Es
können die gleichen Verbindungen verwendet werden, wie bei der L-Lysinfermentation. In der Praxis sind als
Kohlenstoffquellen Melasse, Zuckerrübenmelasse, Essigsäure und Glucose bevorzugt. Sofern die Stämme
einen speziellen Nährstoffbedarf haben, müssen diese Nährstoffe natürlich im Nährmedium vorhanden sein.
Die Züchtung der L-Leucin bildenden Mutanten wird ebenfalls unter üblichen Bedingungen durchgeführt, im
allgemeinen unter aeroben Bedingungen, beispielsweise unter Belüftung und Rühren oder als Schüttelkultur bei
Temperaturen von 25 bis 40° C, pH-Werten von 6 bis 9
und während eines Zeitraums von 48 bis 120 Stunden.
Die nachstehenden Versuchsbeispiele erläutern die Bestimmung des bevorzugten Bereiches der Menge an
Kulturbrühe A der L-Leucin bildenden Mutante, die dem L-Lysinfermentationsmedium zuzusetzen ist.
Versuchsbeispiel 1
Aus folgenden Bestandteilen wird ein Basalmedium hergestellt:
Glucose
(NH4J2SO4
KH2PO4
MgSO4 · 7 H2O
FeSO4 · 7 H2O
MnSO4 ■ 4 H2O
(NH4J2SO4
KH2PO4
MgSO4 · 7 H2O
FeSO4 · 7 H2O
MnSO4 ■ 4 H2O
150 g/l
40 g/l
lg/1
0,4 g/l
0,01 g/l
6 mg/1
lg/1
0,4 g/l
0,01 g/l
6 mg/1
Biotin | 300 y/1 |
Thiamin-HCl | 200 y/1 |
Säurehydrolysat von | |
Sojabohnenprotein | lg/1 |
CaCO3 | 5 g/l |
L-Threonin | 600y/ml |
DL-Methionin | 200y/ml |
Der pH-Wert des Basalmediums beträgt vor dem
ίο Sterilisieren 7,4.
Durch Zusatz einer Kulturbrühe eines L-Leucin bildenden Stammes mit einer Leucinkonzentration von
15,6 g/Liter zum Basalmedium in unterschiedlichen Mengen werden 6 Nährmedien hergestellt Brevibacterium
flavum NRRL B-Il 127 wird in 10 ml-Anteile des
Basalmediums sowie die erhaltenen 6 Nährmedien in '250 ml fassenden Erlenmeyerkolben überimpft und 110
Stunden bei 28° C unter Schütteln gezüchtet Nach beendeter Züchtung werden die L-Lysin-Ausbeute und
das Wachsum der Zellen bestimmt Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt
25 Konzentration der ein | Ausbeute an | Wachstum |
gesetzten Kulturbrühe | L-I.ysin | der Zellen |
des L-Leiicin | ||
bildenden Stammes | g/l Trocken | |
ml/1 30 |
g/l | zellen |
0 | 32 | 9,8 |
2 | 40 | 10,9 |
5 | 48 | 12,5 |
10 | 55 | !3,8 |
35 20 | 60 | 15,3 |
40 | 59 | 14,7 |
60 | 56 | 13,5 |
Die Kulturbrühe des L-Leucin bildenden Stammes, wird folgendermaßen hergestellt:
Corynebacterium glutamicum NRRL B-11 151 wird in
3 Liter eines Einsaatmediums in einem 5 Liter fassenden Fermenter überimpft. Das Einsaatmedium hat folgende
Zusammensetzung:
D-GIucose
Pepton
Hefeextrakt
Maisquellwasser
NaCl
Harnstoff
Biotin
50 g/l
10 g/l
10 g/l
5 g/l
2,5 g/l
3 g/l
5 g/l
2,5 g/l
3 g/l
50 y/1
Der pH-Wert des Einsaatmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,2.
Die Züchtung wird 18 Stunden bei 3O0C, einer
Belüftungsgeschwindigkeit von 3 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 600 U/min durchgeführt.
1 Liter der erhaltenen Einsaatkultur wird in 10 Liter eines Hauptfermentationsmediums in einem 30 Liter
fassenden Fermenter überimpft. Das Hauptfermentationsmedium hat folgende Zusammensetzung:
Ammoniumacetat | 5,0 g/l |
KH2PO4 | 2,0 g/l |
MgSO4 ■ 7 H2O | 0,5 g/l |
FeSO4 · 7 H2O | 0,1 g/l |
MnSO4 · 4 H2O | 0,01 g/l |
Biotin | 50y/l |
Thiamin · hvdrochlorid | 100me/l |
Der pH-Wert des Hauptfermentationsmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,4.
Die Züchtung wird 60 Stunden bei 30° C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 Liter/min und einer
Rührgeschwindigkeit von 400 U/min durchgeführt.
3 Stunden nach Beginn der Züchtung werden innerhalb 56 Stunden 10 Liter eines Gemisches aus
71 g/Liter Ammoniumacetat und 380 g/Liter Essigsäure kontinuierlich eingespeist. Dabei wird der pH-Wert des
Mediums bei 6,8 und die Essigsäurekonzentration bei 1,2 ι ο
bis 18 g/Liter gehalten. Nach beendeter Züchtung enthält die Kulturbrühe 15,6 g/Liter L-Leucin.
Versuchsbeispiel 2
Versuchsbeispiel 1 wird wiederholt, jedoch wird Corynebacterium glutamicum NRRL B-Il 148 als
L-Lysin bildender Stamm verwendet. Die Kulturbrühe des L-Leucin bildenden Stammes wird in den in Tabelle
Il angegebenen Mengen eingesetzt. Die Ergebnisse sind ebenfalls in dieser Tabelle zusammengefaßt.
Tabelle II | Ausbeute an | Wachstum |
Konzentration der zu | L-Lysin | der Zellen |
gesetzten Kulturbrühe | ||
des L-Leucin | g/l Trocken | |
bildenden Stammes | g/l | zellen |
ml/Liter | 30 | 9,0 |
0 | 37 | 10,1 |
2 | 48 | 12,6 |
5 | 56 | 13,5 |
10 | 62 | 14,9 |
20 | 58 | 14,4 |
40 | 55 | 14,0 |
60 | 53 | 13,8 |
80 | 54 | 13,3 |
100 | 52 | 13,5 |
150 | ||
JO
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Corynebacterium glutamicum NRRL B-II 145 wird als L-Lysin bildender Stamm in 330 ml eines Einsaatmediums
in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyerkolben überimpft und 24 Stunden bei 28° C unter Schütteln
gezüchtet. Das Einsaatmedium hat folgende Zusammensetzung:
40 g/l
0,5 g/l
1,5 g/l
3 g/I
03 g/l
0,5 g/l
1,5 g/l
3 g/I
03 g/l
20 g/I
5 g/1
5 g/1
D-Glucose
KH2PO4
K2HPO4
Harnstoff
MgSO4 · 7 H2O
Pepton
Fleischextrakt
Biotin
Der pH-Wert des Einsaatmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,2.
Es werden 5 Medien folgender Zusammensetzung hergestellt:
Medium A-I:
Zuckerrübenmelasse
50
KH2PO4 | 0,7 g/l |
Harnstoff | 3 g/l |
Säurehydrolysat von | |
Sojabohnenprotein | 20 g/l |
Der pH-Wert des Mediums beträgt vor dem Sterilisie ren 7,4.
Medium A-2:
Medium A-I + 13 ml/Liter einer Kulturbriihi
eines L-Leucin bildenden Stammes mit 15,0 g/Litei
L-Leucin
Medium A-3:
Medium A-I + 200 mg/Liter L-Leucin
Medium A-4:
Medium A-I + 13 ml/Liter einer Kulturbrühi
eines L-Glutaminsäure bildenden Stammes mii 60 g/Liter L-GIutaminsäure
Medium A-5:
Medium A-I + 13 ml/Liter der Kulturbrühe de!
L-Glutaminsäure bildenden Stammes von Mediurr A-4 + 200 mg/Liter L-Leucin.
Jeweils 1 Liter der erhaltenen Einsaatkultur wird in K Liter der vorstehend beschriebenen 5 Medien in 30 Litei
fassenden Fermentern überimpft. Die Züchtung wird 4f Stunden bei 28° C, einer Belüftungsgeschwindigkeit vor
10 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit vor 400 U/min durchgeführt. Während der Züchtung wire
der pH-Wert des Mediums mit 22%iger wäßrigei Ammoniaklösung bei 6,8 gehalten. Nach beendete!
Züchtung werden die Kulturflüssigkeiten auf ihrer L-Lysingehalt analysiert Die Ergebnisse sind in Tabellf
III zusammengefaßt
Medium | Zusatz | Ausbeuten |
an L-Lysin | ||
g/l | ||
A-I | 40 | |
A-2 | Kulturflüssigkeit des L-Leucin | 55 |
produzierenden Stammes | ||
A-3 | L-Leucin | 44 |
A-4 | Kulturflüssigkeit des L-Glut | 40 |
aminsäure produzierenden | ||
Stammes | ||
A-5 | Kulturflüssigkeit + L-Leucin | 46 |
MgSO4 · 7 H2O
150 g/l
(als Glucose) 03 g/l
(als Glucose) 03 g/l
60
65 Die Kulturbrühe des L-Leucin und L-Glutaminsäure
bildenden Stammes wird folgendermaßen hergestellt:
a) Herstellung der Kulturbrühe des L-Leucin
bildenden Stammes
bildenden Stammes
Brevibacterium lactofermentum NRRL B-Il 134 (ein
L-Leucin bildender Stamm) wird in 3 Liter eines Einsaatmediums in einem 5 Liter fassenden Fermenter
überimpft und 18 Stunden bei 300C, einer Belüftungsgeschwindigkeit
von 3 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 600 U/min gezüchtet Das Einsaatmedium
hat folgende Zusammensetzung:
ίο
D-Glucose 50 g/l
Pepton 10 g/l
Hefeextrakt 10 g/l
Maisquellwasser 5 g/i
NaCl 2,5 g/l
Harnstoff 3 g/l
Biotin 50 γ/\
Der pH-Wert des Einsaatmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,2. 1 Liter der erhaltenen Einsaatkultur
wird in 10 Liter eines Hauptfermentationsmediums in einem 30 Liter fassenden Fermenter überimpft. Das
Hauptfermentationsmedium hat folgende Zusammensetzung:
Schütteln gezüchtet. Das Einsaatmedium hat folgende Zusammensetzung:
Natriumacetat
Pepton
Pepton
Fleischextrakt
NaCI
NaCI
10 g/l
10 g/l
5 g/l
2,5 g/l
10 g/l
5 g/l
2,5 g/l
Der pH-Wert des Einsaatmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,0. 300 ml der erhaltenen Einsaatkultur
werden in 3 Liter eines Hauptfermentationsmediums in einem 5 Liter fassenden Fermenter überimpft. Das
Hauptfermentationsmedium hat folgende Zusammensetzung:
Ammoniumacetat | 15 g/I | 15 | Ammoniumacetat | 20 g/l |
KH2PO4 | 2,0 g/l | (als Essigsäure) | ||
MgSO4 · 7 H2O | 0,5 g/l | KH2PO4 | lg/1 | |
FeSO4 · 7 H2O | 0,1 g/l | K2HPO4 | lg/1 | |
MnSO4 · 4 H2O | 0,01 g/l | MgSO4 · 7 H2O | 0,5 g/l | |
Biotin | 50y/\ | 20 | MnSO4 · 4 H2O | 10 mg/1 |
Thiamin · hydrochlorid | 100 mg/1 | FeSO4 ■ 7 H2O | 10 mg/1 | |
Thiamin · Hydrochlorid | 5y/l | |||
Der pH-Wert des Hauptfermentationsmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,4. Die Züchtung wird 60
Stunden bei 300C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 400
U/min durchgeführt. Der pH-Wert wird mit 60%iger wäßriger Essigsäure auf 6,8 eingestellt 7 Stunden nach
Beginn der Züchtung werden dem Medium stündlich während 50 Stunden jeweils 70-ml-Anteile einer
wäßrigen Lösung zugegeben, die 11 g Ammoniumacetat enthält Während der Züchtung wird die Essigsäurekonzentration
im Medium auf einen Wert von 1,2 bis 18 g gehalten. Nach beendeter Züchtung beträgt die
L-Leucinkonzentration in der Kulturbrühe 15,0 g/Liter.
b) Herstellung der Kulturbrühe des L-Glutaminsäure bildenden Stammes
Arthrobacter paraffineus ATCC 15591 (ein L-Glutaminsäure bildender Stamm) wird in 300 ml eines
Einsaatmediums in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyerkolben überimpft und 24 Stunden bei 30" C unter
Der pH-Wert des Hauptfermentationsmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,0. Die Züchtung wird 3
Tage bei 30°C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 3
Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 600 U/min durchgeführt. Während der Züchtung wird das
Medium mit 1 Liter einer wäßrigen Lösung versetzt, die durch Zusatz von 3 Gewichtsteilen Wasser zu einem
Gemisch von 70 Gewichtsteilen Eisessig und 27 Gewichtsteilen 22%iger wäßriger Ammoniaklösung
hergestellt wurde. Der pH-Wert des Mediums wird auf einen Wert von 4 bis 9 eingestellt Die Zufuhr der
wäßrigen Lösung ist 2 Stunden vor Beendigung der Züchtung beendet Nach Beendigung der Züchtung
haben sich in der Kulturbrühe 60 g/Liter L-Glutaminsäure angesammelt
Das vorstehend verwendete Medium A-2 enthält Aminosäuren aus der Kulturbrühe, ein Säurehydrolysat
von Sojabohnenprotein und Zuckerrübenmelasse in den in Tabelle IV angegebenen Mengen.
Aminosäure | Mengen der Aminosäure, mg/1 | Aus Säurehydrolysat von | Aus Zucker |
Aus der Kulturbrühe | Sojabohnenprotein hergestellt | rübenmelasse | |
des L-Leucin produ | hergestellt | ||
zierenden Stammes | |||
hergestellt | 176 | 99,0 | |
Alanin | 6,37 | 967 | 278 |
Asparaginsäure | - | 546 | 7,5 (als |
Arginin | - | Hydro | |
chlorid) | |||
- | 3,0 | ||
Cystin | - | 332 | 7,5 |
Glycin | 4,81 | 1570 | 9,0 |
Glutaminsäure | 12,6 | 242 | 13,5 (als |
Histidin | Hydro | ||
chlorid) | |||
284 | — | ||
Isoleucin | 5,85 | 586 | — |
Leucin | 195 | 550 | — |
Lysin | 5,2 | 98 | — |
Methionin | — |
Fortsetzung
Aminosäure Mengen der Aminosäure, mg/1
Aus der Kulturbrühe Aus Säurehydrolysat von Aus Zucker-
des L-Leucin produ- Sojabohnenprotein hergestellt rübenmelasse
zierenden Stammes hergestellt
hergestellt
Phenylalanin -
Prolin
Serin -
Threonin -
Tryptophan -
Tyrosin -
Valin
Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die in der Kulturbrühe des L-Leucin bildenden Stammes enthaltenen
Aminosäuremengen sehr gering sind im Vergleich zu den Mengen Aminosäuren, die im Säurehydrolysat
von Sojabohnenprotein oder Zuckerrübenmelasse enthalten sind. Daraus ist ersichtlich, daß die in der
Kulturbrühe der L-Leucin bildenden Mutante enthaltenen Aminosäuren keine zusätzlichen Wirkungen bei der
Bildung von L-Lysin entfalten. Die Versuche lassen den Schluß zu, daß die Wirkung des Zusatzes d( r
Kulturbrühe des L-Leucin bildenden Stammes nicht auf seinem Gehalt an Aminosäuren beruht.
In diesem Beispiel werden vier verschiedene Nährmedien
folgender Zusammensetzung hergestellt:
Medium B-I:
D-Glucose
(NH4J2SO4
KH2PO4
MgSO4 · 7 H2O
FeSO4 · 7 H2O
MnSO4 · 4 H2O
Biotin
Thiamin · Hydrochlorid
Säurehydrolysat von
Sojabohnenprotein
CaCO3
L-Threonin
DL-Methionin
150 g/l
40 g/l
lg/I
0,4 g/l
0,01 g/l
6 mg/1
40 g/l
lg/I
0,4 g/l
0,01 g/l
6 mg/1
300 yl\
200 y/1
lg/1
5 g/l
60OyMl
200 ylm\ 340
460
376
362
60OyMl
200 ylm\ 340
460
376
362
208
310
310
12,0
52,5 52,5 7,5 13,5 48
kolben überimpft und 110 Stunden bei 80° C unter
Schütteln gezüchtet. Nach beendeter Züchtung wird die L-Lysinkonzentration bestimmt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle V angegeben.
Der pH-Wert des Mediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,4.
Medium B-2:
Medium B-I +20 ml/Liter der gemäß Versuchsbeispiel
1 hergestellten Kuturbrühe mit 15,6 g/Liter L-Leucin.
Medium B-3:
Medium B-I +320 mg/Liter L-Leucin
Medium B-4:
Medium B-4:
Medium B-I+ 1 g/Liter Säurehydrolysat von Sojabohnenprotein.
Brevibacterium NRRL B-11127 (ein L-Lysin bildender
Stamm) wird in ΙΟ-mi-Anteilen in die vorstehend,
beschriebenen Medien in 250 ml fassenden Erlenmeyer-
Tabelle V | Zusatz | Ausbeute |
Medium | an L-Lysin, | |
mg/1 | ||
- | 32 | |
B-I | Kulturbrühe des L-Leucin | 60 |
B-2 | produzierenden Stammes | |
L-Leucin | 35 | |
B-3 | Säurehvdrolysat von Soja- | 46 |
B4 | ||
bohnenprotein
In diesem Beispiel werden als L-Lysin bildende Stämme Corynebacterium glutamicum NRRL B-Il 148,
Brevibacterium flavum NRRL B-51 128 und Corynebacterium
glutamicum NRRL B-Il 150 verwendet Diese Stämme werden in jeweils 40 ml eines Einsaatmediums
in 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben überimpft und 24 Stunden bei 28° C unter Schütteln gezüchtet
Das Einsaatmedium hat folgende Zusammensetzung:
D-Glucose | 50 g/l | folgender Zusammenset- |
NaCl | 24 g/l | |
Harnstoff | 3 g/l | |
Pepton | 10 g/l | 100 g/l |
Hefeextrakt | 10 g/l | (als Glucose) |
Maisquellwasser | 5 g/I | 0.5 g/l |
Biotin | 50 γΙ\ | 0,5 g/l |
Der pH-Wert des Einsaatmediums beträgt vor dem | 33 g/l | |
Sterilisieren 7,2. | ||
Es werden 3 Nährmedien | 20 g/l | |
zung hergestellt: | ||
Medium C-I: | ||
Zuckerrübenmelasse | ||
KH2PO4 | ||
MgSO4 (Anhydrid) | ||
(NH-O2SO4 | ||
Säurehydrolysat von | ||
Sojabohnenprotein | ||
Der pH-Wert des Mediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,4.
Medium C-2:
Medium C-I+ml/Liter der gemäß Beispiel 1 hergestellten Kuturbrühe mit 15,0 g/Liter L-Leucin.
Medium C-3:
Medium C-I +300 mg/Liter L-Leucin.
Die Versuchsbedingungen und die Ergebnisse der Züchtung in diesen Medien sind in Tabelle Vl
zusammengefaßt.
Stamm
Medium Zusatz
L-Lysin-Ausbeute
g/Liter
C-I | — | 27,0 | |
Corynebacterium glutamicum NRRL B-Il 148 |
C-2 | Kulturbrühe des L-Leucin produzie renden Stammes |
32,0 |
L C-3 | L-Leucin | 27,2 | |
C-I | - | 26,1 | |
Brevibacterium flavum NRRL B-Il 128 |
C-2 | Kulturbrühe des L-Leucin produzie renden Stammes |
28,7 |
C-3 | L-Leucin | 26,0 |
Corynebacterium
glutamicum
NRRL B-Il 150
glutamicum
NRRL B-Il 150
C-I
C-2
C-3
Gemäß Beispie! 1 wird Corynebacterium glutamicum NRRL B-11 145 (ein L-Lysin bildender Stamm) in einer
Einsaatkultur gezüchtet.
Es werden 3 verschiedene Nährmedien folgender Zusammensetzung hergestellt:
Medium E-1:
wie Medium A-I.
Medium E-2:
Medium E-I + 13 ml/Liter einer Kulturbrühe mit 15,8 g/Liter L-Leucin.
Medium E-3:
Medium E-I +200 mg/Liter L-Leucin.
Jeweils 1 Liter der Einsaatkultur wird in 10 Liter der vorgenannten 3 Medien in einem 30 Liter fassenden
Fermenter übenmpft Die Züchtung wird 48 Stunden bei 28° C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 Liter/min
und einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min durchgeführt Während der Züchtung wird der pH-Wert des
Mediums mit 22%iger wäßriger Ammoniaklösung bei 6,8 gehalten. Nach beendeter Züchtung wird die
L-Lysinkonzentration bestimmt Die Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengefaßt
Kulturbrühe des
L-Leucin produzierenden Stammes
L-Leucin produzierenden Stammes
L-Leucin
Tabelle VII
Tabelle VII
Medium Zusatz
27,8
30,5
26,8
L-Lysinkonzentration
g/Liter
E-I keiner 41
E-2 Kulturbrühe des L-Leucin 57
bildenden Stammes
E-3 L-Leucin 46
Die Kuturbrühe des L-Leucin bildenden Stammes wird folgendermaßen hergestellt:
Brevibacterium lactofermentum NRRL B-Il 134 (ein L-Leucin bildender Stamm) wird gemäß Beispiel 1
angezüchtet 1 Liter der Anzuchtkultur wird in 10 Liter
eines Hauptfermentationsmediums in einem 30 Liter fassenden Fermenter überimpft Das Hauptfermentationsmedium
hat folgende Zusammensetzung:
Zuckerrübenmelasse 150 g/l
(als Glucose)
MgSO4-7 H2O 03 g/l
KH2PO4 0,7 g/l
(NH4J2SO4 20 g/l
Die Züchtung wird 30 Stunden bei 300C, einer
Belüftungsgeschwindigkeit von 10 Liter/min und einer
Rührgeschwindigkeit von 400 U/min durchgeführt Der
pH-Wert des Mediums wird mit 22%iger wäßriger Ammoniaklösung auf 6,8 eingestellt Nach beendeter
Züchtung beträgt die L-Leuoinkonzentration 15,8 g/Liter.
Beispiel 1 wird mit Corynebacterium glutamicum NRRL B-Il 145 (ein L-Lysin bildender Stamm) wiederholt
Es werden 3 verschiedene Nährmedien folgender Zusammensetzung hergestellt:
Medium F-I: | 15 g/l |
Ammoniumacetat | 2,0 g/l |
KH2PO4 | 0,5 g/l |
MgSO4 · 7 H2O | 0,1 g/l |
FeSO4 - 7 H2O | 0,01 g/l |
MnSO4 · 4 H2O | 50y/l |
Biotin | lOOmg/I |
Thiamin · hydrochlorid | |
Säurehydrolysat von | 20 g/l |
Sojabohnenprotein | |
Der pH-Wert des Mediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,4.
Medium F-2:
Medium F-I+ 13 ml/Liter der gemäß Beispiel 5 hergestellten Kulturbrühe mit 15,8 g/Liter L-Leucin
Medium F-3:
Medium F-I +200 mg/Liter L-Leucin.
Jeweils 1 Liter der Anzuchtkultur wird in 10 Liter der
vorgenannten 3 Nährmedien in einem 30 Liter fassenden Fermenter überimpft. Die Züchtung wird 62
Stunden bei 28° C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von
400 U/min durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums wird mit 60%iger wäßriger Essigsäure bei 6,8 gehalten.
10 Stunden nach Beginn der Züchtung werden stündlich
50mal jeweils 70-mI-Anteile einer wäßrigen Lösung zugegeben, die 13 g Ammoniumacetat enthält. Während
der Züchtung wird die Essigsäurekonzentration im Medium auf einem Wert von 0,5 bis 15 g/Liter gehalten.
Nach beendeter Züchtung wird die L-Lysinkonzentration bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII
zusammengefaßt.
Tabelle | VIII | L-Lysin- konzen tration |
Medium | Zusatz | g/Liter |
32 | ||
F-I | keiner | 48 |
F-2 | Kulturbrühe des L-Leucin bildenden Stammes |
35 |
F-3 | L-Leucin | |
ίο
Beispiel 5 wiederholt, jedoch wird die gemäß Beispiel 1 hergestellte Kulturbrühe des L-Leucin bildenden
Stammes eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengefaßt.
Zusatz
L-Lysinkonzentration
g/Liter
Keiner 30
Kulturbrühe des L-Leucin bildenden 49
Stammes
L-Leucin 34
Die in den US-PS 37 08 395, 37 07 441 und 36 16 218 beschriebenen Verfahren zur Herstellung von L-Lysin
verwenden Mutanten mit speziellen Eigenschaften. Deshalb wird das erfindungsgemäße Verfahren mit den
in den US-PS beschriebenen Verfahren so verglichen, daß die in den US-PS beschriebenen Mutanten in einem
Basalmedium gezüchtet und dieses Medium durch die Kulturbrühe einer L-Leucin bildenden Mutante ergänzt
wird. Sodann wird die Produktivität der Bildung von L-Lysin in beiden Medien verglichen. Zum Vergleich
wird auch ein Basalmedium verwendet, das durch L-Leucin ergänzt ist
In dem in der US-PS 36 87 809 beschriebenen Verfahren zur Herstellung von L-Lysin wird ein
Nährmedium verwendet das durch L-Asparaginsäure ergänzt ist Deshalb wird das erfindungsgemäße
Verfahren mit dem aus der US-PS 36 87 809 beschriebenen Verfahren so verglichen, daß eine L-Lysin bildende
Mutante in einem Basalmedium gezüchtet wird, das durch L-Asparaginsäure ergänzt ist, und das Basalmedium
durch die Kulturbrühe einer L-Leucin bildenden Mutante ergänzt ist, und die Produktivität der Bildung
von L-Lyin in diesen Medien verglichen wird. Zum Vergleich wird die Fermentation in einem Basalmedium
ohne irgendwelche Zusätze durchgeführt.
1. US-PS 37 08 395
1.1 Es werden folgende Mutanten verwendet:
Corynebacterium glutamicum
sowie
Brevibacterium flavum
ATCC 21526,
ATCC 21543 und NRRL B-Il 149
ATCC 21543 und NRRL B-Il 149
NRRLB-Il 129
1.2 Herstellung der Impfkultur
Eine Platinöse jeder Mutante aus einem Schrägagar wird in 10 ml des Irnpfmediunis der nachstehend
angegebenen Zusammensetzung in einem 50 ml fassenden
Reagenzglas überimpft. Die Impfkultur wird durch 24stündiges Schütteln bei 30° C durchgeführt
Zusammensetzung des Einsaatmediums:
Glucose 4 g/dl
Polypepton 2 g/dl
KH2PO4 0,15 g/dl
MgSO4 ■ 7 H2O 0,05 g/dl
Biotin 50 y/1
Biotin 50 y/1
Harnstoff 0,3 g/dl
b5 Hefeextrakt 0,5 g/dl
Der pH-Wert des Impfmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,2.
SOS 584/320
13 Hauptkultur
13.1 Hauptfermentationsmedium: A-I Basalmedium
Zusammensetzung:
(als Glucose)
KH2PO4 0,07 g/dl
MgSO4-7 H2O 0,05 g/dl
(NH4J2SO4 0,5 g/dl
CaCO3 3 g/dl
Der pH-Wert vor dem Sterilisieren beträgt 7,5.
A-2 Basalmedium+200 mg/1 L-Leucin
A-3 Basalmedium+12 ml/1 der Kulturbrühe einer
L-Leucin bildenden Mutante.
13.2 Verfahren der Hauptzüchtung
1 ml der Impfkultur werden in 20 ml eines Hauptfermentationsmediums in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben überimpft und 96 Stunden bei 30° C unter
Schütteln inkubiert
133 Herstellung der Kuturbrühe einer L-Leucin bildenden Mutante
Es wird die gleiche Kulturbrühe der L-Leucin bildenden Mutante als Vergleich mit den in den US-PS
beschriebenen Verfahren verwendet
Corynebacterium glutamicum NRRL B-Il 151 (eine L-Leucin bildende Mutante) wird in 40 ml eines
Impfmediums in einem 250 ml fassenden Kolben überimpft und 24 Stunden bei 280C inkubiert
Pepton 1 g/dl
NaCl 0,25 g/dl
Biotin 50 y/1
6 ml der Impfkultur werden in 3 Liter eines Impfmediums der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung in einem 5 Liter fassenden Fermenter
überimpft und 18 Stunden bei 300C bei einer Lufteinleitungsgeschwindigkeit von 3 l/min und einer
Rührgeschwindigkeit von 600 U/min inkubiert. 1 Liter der erhaltenen Eirssaatkultur wird in 10 Liter eines
Hauptfermentationsmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung in einem 30 Liter fassenden
Fermenter überimpft.
Zusammensetzung des Hauptfermentationsmediums: | 0.5 g/dl |
Ammoniumacetat | 0,2 g/dl |
KH2PO4 | 0,05 g/dl |
MgSO4 · 7 H2O | 0,01 g/dl |
FeSO4 · 7 H2O | 0,001 g/dl |
MnSO4 · 4 H2O | 50y/l |
Biotin | 100 mg/1 |
Thiamin · HCl |
Die Züchtung wird 60 Stunden bei 30°C und einer Lufteinleitungsgeschwindigkeit von 10 l/min und einer
Rührgeschwindigkeit von 400 U/min durchgeführt Der pH-Wert der Kulturbrühe wird mit 60prozentiger
Essigsäure auf 6,8 eingestellt Während der 3. bis 56. Stunde nach Beginn der Züchtung werden insgesamt 10
Liter einer wäßrigen Lösung kontinuierlich eingespeist, die 71 g/l Ammoniumacetat und 380 g/l Essigsäure
enthält Nach beendeter Züchtung sind in der Kulturbrühe 17,6 g/I L-Leucin enthalten.
Z US-PS 37 07 441 Zl Es werden folgende Mutanten verwendet:
NRRLB-Il 130 ATCC 21 491
Brevibacterium flavum
Corynebacterium aceto-
glutamicum
Microbacterium ammonia-
philum
Micrococus glutamicus
ATCC 21 490 ATCC 21492
2.2 Herstellung der Impfkultur
Die Züchtung wird in gleicher Weise wie vorstehend unter 1.2 beschrieben durchgeführt.
23 Hauptkultur | 40 | Rohrzuckermelasse | 13 g/dl |
(als Glucose) | 5.5 g/dl | ||
j5 2.3.1 Hauptfermentationsmedium | (NH4J2SO4 | 25 ml/1 | |
B-I Basalmedium | Sojabohnenproteinhydrolysat | 0,1 ml/dl | |
Zusammensetzung: | 45 Antischaummittel | 7,5 g/dl | |
CaCO3 | |||
pH-Wert vor dem Sterilisieren 8,0. B-2 Basalmedium + 200 mg/1 L-Leucin
B-3 Basalmedium + 12 ml/1 der Kulturbrühe einer L-Leucin bildenden Mutante
2.3.2 Verfahren der Hauptzüchtung
Die Züchtung wird in gleicher Weise wie vorstehend bei 1.3.2 durchgeführt
3. US-PS 36 16 218 3.1 Es werden folgende Mutanten verwendet:
Brevibacterium flavum
Brevibacterium flavum
Brevibacterium flavum
NRRLB-Il 131 NRRLB-Il 132
ATCC 21 129
25 31 | 19 | 1 | ATCC 21526 | 5 | 999 | 20 |
32 Herstellung der Impf kultur | if | 4. US-PS 36 87 809 | ||||
Die Züchtung wird auf die gleiche Weise wie | I | 4.1 Als Mutante wird Brevibacterium flavum NRRL | ||||
vorstehend unter 1.2 beschrieben durchgeführt | 1 | NRRLB-Il 149 | 10 | B-Il 130 als eine der im erfindungsgemäßen Verfahren | ||
eingesetzten L-Lysin bildenden Mutanten ausgewählt | ||||||
33 Hauptkultur | 42 Herstellung der Impfkultur | |||||
33.1 Hauptfermentationsmedium | 15 | Die Züchtung wird auf die gleiche Weise wie unter \2 | ||||
C-I Basalmedium | ATCC 21543 | beschrieben durchgeführt | ||||
Zusammensetzung: | ||||||
43 Hauptkultur | ||||||
Glucose 10 g/dl (NH4J2SO4 4 g/dl |
NRRLB-Il 129 | 43.1 Hauptfermentationsmedium | ||||
KH2PO4 0,1 g/dl | 20 | D-I Basalmedium | ||||
MgSO4 · 7 H2O 0,04 g'dl | ||||||
Biotin 300 y/1 | Zusammensetzung: | |||||
Thiamin-HCl 200 γ/1 | ||||||
FeSO4 · 7 H2O 10 mg/1 | Rohrzuckermelasse | |||||
MnSO4 -4H2O 8 mg/1 | 25 | (als Glucose) 10 g/dl | ||||
CaCO3 5 g/dl | KH2PO4 0,05 g/dl | |||||
MgSO4 · 7 H2O 0,05 g/dl | ||||||
Deir pH-Wert beträgt vor dem Sterilisieren 7,5. | (NH4J2SO4 0,33 g/dl | |||||
Sojabohnenproteinhydrolysat 100 ml/l | ||||||
Bei der Züchtung des ATCC-Stammes 21 128 werden | JO | CaCO3 3 g/dl | ||||
dem Nährmedium ferner 0,6 mg/ml L-Threonin zuge | ||||||
setzt, während bei der Züchtung des ATCC-Stammi s | pH-Wert vor dem Sterilisieren 7,4. | |||||
21 129 0,2 mg/ml L-Methionin und 2 ml/1 Sojabohnen- | ||||||
proteinhydrolysat einverleibt werden. | J5 | D-2 Basalmedium +1 g/dl L-Asparaginsäure | ||||
C-2 Basalmedium+ 200 mg/1 L-Leucin | D-3 Basalmedium+ 12 mi/1 Kulturbrühe einer L-Leucin | |||||
bildenden Mutante. | ||||||
C-3 Basalmedium+ 12 m!/l Kulturbrühe einer L-Leucin | ||||||
bildenden Mutante. | 40 | |||||
4.3.2 Verfahren der Hauptzüchtung | ||||||
33.2 Verfahren der Hauptzüchtung | Die Züchtung wird wie vorstehend unter 1.3.2 | |||||
beschrieben durchgeführt. | ||||||
Die Züchtung wird auf die gleiche Weise wie unter | Nachstehend sind in Tabelle X die Mengen an | |||||
1.3.2 beschrieben durchgeführt, jedoch beträgt die | L-Lysin-HCl angegeben, die sich nach beendeter | |||||
Züchtungsdauer 72 Stunden. | Züchtung in der Kulturbrühe angereichert haben. | |||||
Tabelle X | ||||||
US-PS Mutante | Medium Menge an entstan- | |||||
entstandenem | ||||||
L-Lysin · HCl | ||||||
g/l | ||||||
A-I 27,3 | ||||||
A-2 28,0 | ||||||
A-3 30,9 | ||||||
A-I 31,8 | ||||||
A-2 31,2 | ||||||
A-3 34,6 | ||||||
3708 395 | ||||||
A-I 25,1 | ||||||
A-2 26,2 | ||||||
A-3 29,4 | ||||||
A-I 28,7 | ||||||
A-2 27,0 | ||||||
A-3 31.7 |
21
Fortsetzung 22
US-PS
Mutante | Medium | Menge an entstan entstandenem L-Lvsin · HCi |
g/l | ||
NRRLB 11130 | B-I B-2 B-3 |
28,8 29,9 33,1 |
ATCC 21491 | B-I B-2 B-3 |
22,6 22,9 24,1 |
ATCC 21490 | B-I B-2 B-3 |
15,7 14,9 18,6 |
ATCC 21492 | B-I B-2 B-3 |
8,6 8,5 11,2 |
NRRL B-Il 131 | C-I C-2 C-3 |
16,9 16,4 25,7 |
NRRLB-Il 132 | C-I C-2 C-3 |
28,6 27,9 33,4 |
ATCC 21129 | C-I C-2 C-3 |
27,0 28,6 34,1 |
NRRL B-Il 130 | D-I D-2 D-3 |
20,8 22,1 24,6 |
3707441 3616218
36 87 809
Anm.: A-3, B-3, C-3 und D-3 sind erfindungsgemäß verwendete Nährmedien.
Aus Tabelle X ist ersichtlich, daß im erfindungsgemäßen Verfahren die Menge an erzeugtem L-Lysin größer
ist als bei den bekannten Verfahren.
Claims (4)
1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin durch Züchtung einer L-Lysin bildenden
Mutante von coryneformen, Glutaminsäure bildenden Bakterien in einem Nährmedium, dadurch
gekennzeichnet, daß man als L-Lysin bildende Mutante einen Mikroorganismus der Art
Brevibacterium aminogenes,
Brevibacterium divaricatum,
Brevibacterium flavum,
Brevibacterium lactofermentum,
Brevibacterium roseum,
Brevibacterium saccharolyticum,
Brevibacterium immariphilium,
Corynebacterium acetoacidophilum,
Corynebacterium glutamicum,
Corynebacterim herculis,
Corynebacterium lilium,
Corynebacterium caliunae,
Microbacterium ammoniaphilum oder
Arthrobacter sp.
Brevibacterium divaricatum,
Brevibacterium flavum,
Brevibacterium lactofermentum,
Brevibacterium roseum,
Brevibacterium saccharolyticum,
Brevibacterium immariphilium,
Corynebacterium acetoacidophilum,
Corynebacterium glutamicum,
Corynebacterim herculis,
Corynebacterium lilium,
Corynebacterium caliunae,
Microbacterium ammoniaphilum oder
Arthrobacter sp.
in einem ersten Nährmedium züchtet das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie 2 bis
ml/Liter einer Kulturbrühe A enthält, die bei der Züchtung eines L-Leucin bildenden Mikroorganismus
der Art
Brevibacterium aminogenes,
Brevibacterium divaricatum,
Brevibacterium flavum,
Brevibacterium lactofermentum,
Brevibacterium roseum,
Brevibacterium saccharolyticum,
Brevibacterium immariophilium,
Corynebacterium acetoacidophilum,
Corynebacterium glutamicum,
Corynebacterium herculis,
Corynebacterium lilium,
Corynebacterium caliunae,
Microbacterium ammoniaphilum
oder Arthrobacter sp.
Brevibacterium divaricatum,
Brevibacterium flavum,
Brevibacterium lactofermentum,
Brevibacterium roseum,
Brevibacterium saccharolyticum,
Brevibacterium immariophilium,
Corynebacterium acetoacidophilum,
Corynebacterium glutamicum,
Corynebacterium herculis,
Corynebacterium lilium,
Corynebacterium caliunae,
Microbacterium ammoniaphilum
oder Arthrobacter sp.
in einem zweiten Nährmedium erhalten worden ist
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung der L-Lysin
bildenden Mutanten bei Temperaturen von 25 bis 400C und einen pH-Wert von 6 bis 8,5 durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dem ersten Nährmedium die
Kulturbrühe A in Anteilen zusetzt und die gesamte Kulturbrühe A bis zum Ende der log-Phase zufügt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet da3 man als Kohlenstoffquelle Melasse,
Zuckerrübenmelasse, Glucose, Essigsäure oder ein Gemisch aus mindestens zwei dieser Stoffe verwendet.
L-Lysin ist eine essentielle Aminosäure, für die in der Nahrungsmittelindustrie und Futtermittelindustrie ein
großer Bedarf besteht. Die Herstellung von L-Lysin auf biotechnischem Wege ist bekannt. Im allgemeinen
werden dabei Mutanten von coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien, beispielsweise Corynebacterium
glutamicum, eingesetzt
Die coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien sind bekannt Es handelt sich um elliptische
kugelförmige bis runde Stäbchen, die gram-positiv, nicht spurulierend und unbeweglich sind. Biotin benötigen
und große Mengen an. L-Glutaminsäure bilden.
Eine Anzahl von coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien ist aus der Literatur bekannt Sie
werden je nach der Ansicht der Taxonomcn, die die Untersuchungen an den Bakterien durchführten, folgendermaßen
klassifiziert:
Corynebacterium glutamicum,
Brevibacterium aminogenes,
Brevibacterium divaricatum,
Brevibacterium flavum,
Brevibacterium lactofermentum,
Brevibacterium roseum,
Brevibacterium saccharolyticum,
Brevibacterium immariphilium,
Corynebacterium acetoacidophilum,
Corynebacterium herculis,
Corynebacterium lilium,
Corynebacterium caliunae,
Microbacterium ammoniaphilum und
Arthrobacter sp.
Brevibacterium aminogenes,
Brevibacterium divaricatum,
Brevibacterium flavum,
Brevibacterium lactofermentum,
Brevibacterium roseum,
Brevibacterium saccharolyticum,
Brevibacterium immariphilium,
Corynebacterium acetoacidophilum,
Corynebacterium herculis,
Corynebacterium lilium,
Corynebacterium caliunae,
Microbacterium ammoniaphilum und
Arthrobacter sp.
Nach A b e et al, J. General and Applied Microbiology,
Bd. 13 (1967), S. 279-301, sind diese Mikroorganismen taxonomisch sehr nahe miteinander verwandt. Die
coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien werden durch Corynebacterium glutamicum dargestellt.
Die L-Lysin bildenden Mutanten der coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien sind im allgemeinen
dadurch gekennzeichnet daß sie mindestens eine der nachstehend aufgeführten beiden Eigenschaften haben,
die von einer Genmutation herrühren.
Eine dieser Eigenschaften ist die vollständige oder unvollständige Blockade des biosynthetischen Weges
zur Bildung verwandter Aminosäuren. Diese Eigenschaft wird erkannt als Bedarf für verwandte Aminosäuren,
wie L-Homoserin, L-Threonin, L-Methionin, L-Leucin oder L-Isoleucin, oder als Empfindlichkeit gegenüber
L-Threonin oder L-Methionin. Die andere Eigenschaft ist die vollständige oder unvollständige
Abweichung der Rückkopplungssteuerungen durch verwandte Aminosäuren. Diese Eigenschaft wird
erkannt als Beständigkeit gegenüber verwandten Aminosäuren, wie L-Lysin oder L-Threonin, oder ihren
Analogen, wie S-(2-Aminoäthyl)-L-cystein.
Die Produktivität der L-Lysin bildenden Mutanten mit den vorgenannten Eigenschaften wird durch
Vereinigung weiterer genetischer Mutationen verbessert, beispielsweise hinsichtlich des Bedarfs an Aminosäuren,
wie L-Valin, L-Tyrosin, oder Vitaminen, wie Thiamin oder Vitamin B12, und Purinbasen, wie Adenin
oder Guanin.
Die Produktivität dieser Mutanten zur Bildung von L-Lysin wird ebenfalls verbessert durch Vereinigung
anderer als der vorgenannten genetischen Mutationen, beispielsweise hinsichtlich der Resistenz gegenüber
Aminosäuren, wie L-Isoleucin, oder ihrer Analogen, wie 2-Amino-3-methylthiobuttersäure, und Ant.ibiotica, wie
Penicillin G oder Polymixin B.
Spezielle Beispiele für bevorzugte L-Lysin bildende Mutanten sind folgende bei der ARS Kultursammlung
hinterlegte Mikroorganismen:
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