DE1517823A1

DE1517823A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentierung

Info

Publication number: DE1517823A1
Application number: DE19661517823
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Hagino; Kiyoshi Nakayama; Haruo Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1966-03-14
Filing date: 1966-07-08
Publication date: 1969-05-14
Also published as: CH481217A; US3700557A; SE316737B; NL6609694A; ES328928A1; DK112441B; BE683933A; GB1118719A

Description

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Dr.-lng. HANS RUSCHKE " 8, O

DipWng. HEiNZ AGULAR 1517823

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Kyowa Hakko Kogyo Co., Limited, Tokyo/Japan

Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentierung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, insbesondere zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentierung. Besonders betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentierung mit Mikroorganismen, die spezielle Nährstofferfordernisse besitzen»

L-Lysin, die 2,6-Diaminohexancarbonsäure, ist eine bekannte essentielle Aminosäure. Sie wird auf dem Gebiet der Nahrungsmittelanreicherung verwendet, wobei die Ergänzung von Nahrungsstoffen auf Getreidebasis mit Lysin deren Proteinqualität verbessert, so daß sich ein verbessertes Wachstum und eine verbesserte Gewebesynthese ergibt. Die Verbindung wird auch medizinisch als Nährstoff verwendet. Ein Verfahren

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zur Herstellung dieser Verbindung, das wirtschaftlich im großtechnischen Maßstab mit leicht zugänglichen billigen Ausgangsmaterialien durchgeführt werden kann, ist deshalb von erheblicher Bedeutung.

Ein Gegenstand der Erfindung besteht in einem verbesserten Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, bei dem die Nachteile und Mangel der bisherigen Verfahren beseitigt werden. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in einem Verfahren, zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentierung, das in v/irksamer und einfacher Weise ausgeführt werden kann.

Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Blerstellung von L-Lysin durch Fermentierung, bei dem das Produkt in hoher Reinheit und guter Ausbeute erhalten wird. Weiterhin läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft im großtechnischen Maßstab mit niedrigen Kosten aus billigen und leicht zugänglichen Ausgangsmaterialien durchführen, wobei eine hohe Produktausbeute erhalten wird.

Diese und weitere Ziele und Vorteile der Erfindung ergeben sich im einzelnen aus der nachfolgenden Beschreibung .

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Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß bemerkenswert große Mengen an L-Lysin in der Fermentierflüssigkeit gebildet werden, falls die Fermentierung oder Kultivierung mit Bakterienstämmen, die zu den Genera Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter und Microbacterium gehören und spezielle Nährstoffanfordernisse besitzen, durchgeführt wird. Insbesondere erwiesen sich Stämme, die Threonin, Methionin, Arginin, Histidin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Cystin oder Cystein für ihr Wachstum benötigen, als besonders vorteilhaft beim erfindungsgemäßen Verfahren? Zusätzlich können entsprechende Stämme, die komplexe Nährstofferfordernisse haben, wozu sie mehr als eine der vorstehend aufgeführten Aminosäuren für ihr Wachstum benötigen, ebenfalls gemäß der Erfindung verwendet v/erden.

Stämme mit dem vorstehend aufgeführten IJährstoffbedarf können durch Mutierbehandlung von Ausgangsstämmen mittels Bestrahlung, chemischer Ilittel und dergleichen erhalten werden, die keine derartigen llährstoffbedürfnisse haben. Beispielsweise können Mutantstämme mit den vorstehend aufgeführten Nährstoffbeuürfnissen durch Bestrahlung von Brevibacterium ainmoniageneses, Corynebacterium rathayi, Arthrobacter globiformis oder Microbacterium flavum mit Ultraviolettstrahlung erhalten werden.

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In gewissem Umfang ist es vorstellbar, daß Stämme, die Threonin, Methionin oder Isoleucin für ihr Wachstum benötigen, L-Lysin in einem Fermentiermedium ansammeln können, wenn man die Wechselbeziehungen bei der Biosynthese von Lysin, Threonin, Methionin, Isoleucin und Leucin bei Escherichia CoIi und anderen Mikro-Organismen in Betracht zieht. Jedoch ist der Mechanismus dieser Ansammlung nicht einleuchtend. Insbesondere ist jedoch der Mechanismus, durch den große Mengen von Lysin durch Stämme angesammelt werden, die Arginin, Histidin, Cystin oder Cystein für ihr Wachstum benötigen, vollständig unklar und muß als völlig überraschend und unerwartet bezeichnet werden. Es wurde jedoch gefunden, daß Stämme mit den vorstehend aufgeführten Nährstofferfordernissen ganz allgemein L-Lysin anhäufen, wenn auch Unterschiedlichkeiten zwischen den speziell angewandten Genera bestehen können. Deshalb wird angenommen, daß eine enge Beziehung zwischen dem Nährstoffbedarf und der Fähigkeit des speziellen Stammes zur Ansammlung von L-Lysin besteht.

Als Kulturmedium können sowohl synthetische als auch natürliche organische Kulturmedien für das Wachstum und die Fermentierung der Mikroorganismen verwendet werden, solange sie die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum des speziell angewandten Mikroorganismus enthalten. Zu derartigen Nährstoffen gehören eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle,

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anorganische Substanzen und dergleichen in geeigneten Mengen.

Als Kohlenstoffquelle kommen verschiedene Kohlehydrate, wie Glucose, Glycerin, Fructose, Rohrzucker, Maltose, Mannose, Mannit, Xylose, Galactose, Stärke, Stärkehydrolysatlösungen, Melassen und dergleichen im Kulturmedium zur Anwendung. Deren Konzentration liegt üblicherweise zwischen zwei und fünfzehn Gewichts-%, berechnet als Glucose, im Kulturmedium. Verschiedene organische Säuren, wie Asparaginsäure, Apfelsäure, Fumarsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Essigsäure, Brenztraubensäure, Oxalessigsäure, Gluconsäure, a-Ketoglutarsäure und dergleichen können ebenfalls angewandt werden.

Als Stickstoffquelle kommen verschiedene anorganische oder organische Salze und Verbindungen in Betracht, wie z.B. Ammoniak und Ammoniumsalze, beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat und dergleichen, Harnstoff, natürliche, auf proteolytischem Weg erhaltene organische Substanzen wie Pepton, Kaseinhydrolysate, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit, N-Z-Amin (Bezeichnung für eine Reihe von Kaseinhydrolysaten), Fischmehl oder digerierte Produkte davon, entfettete Sojabohnenabfälle oder die digerierten Produkte oder Hydrolysate davon und ähnliche

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Produkte sowie nicht-proteolytische organische Substanzen, wie Asparagensäure, Glutaminsäure, Threonin, Methionin und dergleichen. Es ist günstig, mindestens eine der vorstehend aufgeführten proteolytisch spaltbaren organischen Substanzen zusammen mit einer synthetischen, stickstoffhaltigen Verbindung, wie Harnstoff, Ammoniumsalzen und dergleichen, zu verwenden.

Als anorganische Substanzen können Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen-II-Sulfat, Mangansulfat, Calciumcarbonat und dergleichen verwendet werden.

Die beim erfindungsgemäßen Verfahren angewandten Mikroorganismen erfordern die vorstehend aufgeführten Nährstoffe für ihr Wachstum. Deshalb muß der speziell erforderliche Nährstoff zu dem Kulturmedium in geeigneten Mengen zugegeben werden. Jedoch sind diese üblicherweise in den vorstehend als Stickstoffquellen aufgeführten organischen Proteinsubstanzen enthalten. Deshalb sind derartige Substanzen im allgemeinen ausreichend, um eine geeignete

Menge derartiger Nährstoffe zu ergeben. Jedoch ist es nicht stets notwendig, die vorstehend aufgeführten organischen Proteinsubstanzen in dem speziell angewandten Kulturmedium zu verwenden, und es reicht aus, die spezielle, als Nährstoff benötigte Aminosäure oder eine Substanz, die diese

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enthält, zu dem Kulturmedium zuzugeben.

Die Fermentierung wird unter aeroben Bedingungen, beispielsweise aerobem Schütteln der Kultur, oder durch Rühren einer Submerskultur unter Einführung von Luft bei einer Temperatur zwischen etwa 24 und 37°C durchgeführt. Die geeignete Einstellung des pH-Wertes des Kulturmediums ist äußerst wichtig während der Kultivierung beim erfindungsgemäßen Fermentierverfahren. Der pH-Wert des Kulturmediums zeigt eine Neigung unterhalb 7,0 abzufallen, wenn die Fermentierung fortschreitet, weshalb es notwendig ist, den pH-Wert des Kulturmediums innerhalb eines Bereiches von 5,1 bis 8,5 mit geeigneten Neutralisiermitteln während der Kultivierung einzustellen, um eine hohe Ausbeute an L-Lysin zu erhalten. Zu Neutralisiermitteln, die zu diesem Zweck eingesetzt werden können, gehören Ammoniak, kaustische Alkalien, wie Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd und dergleichen, Ammoniumcarbonat, Calciumcarbonat, Calciumhydroxyd und ähnliche Verbindungen.

Die Kultivierung wird im allgemeinen während 2 bis 5 Tagen durchgeführt, wobei große Mengen an L-Lysin in der Fermentierflüssigkeit angesammelt werden. Das L-Lysin wird aus der Kulturflüssigkeit nach Entfernung der Zellkörper auf übliche Weise gewonnen, wozu z.B. eine Ionenaustauschbehandlung,wie in Beispiel 1 beschrieben^nach beendeter

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Kultivierung oder andere Ionenaustauschbehandlungen, wie sie üblich sind, oder eine Behandlung mit Picrinsäure oder durch Behandlung mit Benzolsulfonsäure und dergleichen zur Anwendung kommen können.

Die folgenden Beispiele dienen lediglich zur Erläuterung der Erfindung, ohne diese zu begrenzen. Falls nichts anderes angegeben ist, sind die angegebenen Prozentsätze auf das Gewicht bezogen..

Beispiel 1

Der Threonin erfordernde Stamm Brevibacterium ammoniagenes Nr. 4948 ATCC 19350 wurde als Impfbakterium verwendet. Dieser Stamm wurde in 250 ml eines Impfmediums aus 2% Glucose, 1% Pepton, 1% Hefeextrakt und 0,2% Natriumchlorid inoculiert und bei 30⁰C während 24 Stunden incubiert. Das dabei erhaltene Impfbakterium wurde in einer Menge von 10 Vol.-% in einen konischen Kolben von 250 ml inoculiert, der 30 ml des folgenden Fermentiermediums enthielt:

7,5% Glucose

1,5& Ammoniumsulfat

0,05% K₃HPO₄

0,05% KH₃PO₄

0,025% MgSO₄.7H₂O

0,5% N-Z-Amine

30 Mikrogramm/1 Biotin

2% CaCO₃ .

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Der pH-Wert des Fermentiermediums betrug 7,0.

Das aerobe Schütteln der Kultur wurde bei 30°C während 4 Tagen durchgeführt. Hierbei hatten sich 7,2 mg/ml L-Lysin in der Kulturflüssigkeit angesammelt.

2 Liter des nach der Entfernung der Zellkörper von der Fermentierflüssigkeit erhaltenen Filtrates wurden durch ein schwachbasisches Ionenaustauschharz (Amberlite IRC-50) gegeben, welches vorhergehend auf einen pH von 7,0 mit o,5-m-Pufferlösung eingestellt worden war. Die Harzkolonne wurde mit Wasser gewaschen und mit 0,15 n-Ammoniakwasser eluiert. Die Eluate, die L-Lysin enthielten, wurden vereinigt und eingeengt. Anschließend wurde die konzentrierte Lösung sauer (pH 4,0) eingestellt und weiter eingeengt. Dabei wurden 10,5 g Rohkristalle von L-Lysin-1-hydrochlorid erhalten.

Beispiel 2

Die Kultivierung wurde in der gleichen Weise und unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt mit der Ausnahme, daß das Fermentiermedium 7,5% Fructose und 0,5% Fleischextrakt anstelle von Glukose und N-Z-Amin nach Beispiel 1 enthielt. Dabei wurden 6,1 mg/ml L-Lysin in der Kulturflüssigkeit gebildet.

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Beispiel 3

Die Kultivierung wurde wie in Beispiel 1 ausgeführt mit dem Unterschied, daß große Reagenzgläser, die XO ml Fermentiermedium enthielten, bei der Fermentierung verwendet wurden. Die in dem Kulturmedium bei Verwendung von verschiedenen Stämmen von Brevibacterium ammoniageneses angesammelten L-Lysin-Mengen sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

Verwendeter Stamm Menge an gebildetem L-Lysin (mg/ml)

Brevibacterium ammoniagenesee 6,5

Nr. 4948 ATCC 19350 (Ihreonin/erfordernder Stamm)

Brevibacterium ainmoniagenese» 4,2

Nr. 5118 ATCC 19351 (Phenylalanin erford. Stamm)

Brevibacterium ammoniagenes»» 3,1

Nr. 5130 ATCC 19352 (Histidin erford,, Stamm)

Brevibacterium ammoniagenes««· 4,3

Nr. 5366 ATCC 19353 (Methionin erford. Stamm)

Brevibacterium ammoniagenesee- 2,1

Nr. 5313 ATCC 19354 (Cystein erford. Stamm)

Brevibacterium ammoniagenesÄe- 2,1

Nr. 5328 ATCC 19355 (Leucin erford. Stamm)

Brevibacterium ammoniagenes-ee- 1,5

Nr. 5134 ATCC 19356 (Isoleucin erford. Stamm)

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Beispiel 4

Es wurde das gleiche Kultivierverfahren wie in Beispiel 1 angewandt, jedoch mit den Threonin-, Met^ioniny, Arginin-, Histidin-, Leucin-, Isoleucin-, Phenylalanin-, Cystin- oder Cystein- erfordernden Stämmen von Corynebacterium rathayi, Arthrobacter globiformis und Microbacterium flavum als Mikroorganismen. Dabei wurden Mengen an L-Lysin zwischen 1 und 10 mg/ml in der Kulturflüssigkeit jeweils gebildet.

Die Erfindung wurde im vorstehenden anhand bevorzugter Ausführungsformen beschrieben, kann jedoch vielseitig abgewandelt werden.

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Claims

- 12 - DipUfng. HEINZ AGULAR 8 Mü*»d»«w.27, Pi

1. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, dadurch gekennzeichnet, daß ein Threonin, Methionin, Arginin, Histidin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Cystin oder Cystein erfordernder Stamm eines Mikroorganismus eines der Genera Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter und Microbacterium in einem wässrigen Nährmedium, das eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthält, unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von 5,1 bis 8,5 kultiviert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einer Temperatur zwischen etwa 24 und 37°C durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoffquelle ein Kohlehydrat verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das L-Lysin aus der Fermentierflüssigkeit durch eine Ionenaustauschharzbehandlung gewonnen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Brevibacterium ammoniageneses verwendet wird.

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6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Corynebacterium rathayi verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Arthrobacter globiformis verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Microbacterium flavum verwendet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Threonin, Methionin, Arginin, Histidin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Cystin oder Cystein erfordernder Stamm eines Mikroorganismus der Genera Brevibacterium ammoniageneses, Corynebacterium rathayi, Arthrobacter globiformis und Microbacterium flavum in einem wässrigen Nährmedium, das eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthält, unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von etwa 5,1 bis 8,5 und bei einer Temperatur von etwa 24 bis 37°C kultiviert wird und das dabei gebildete Lysin aus der Fermentierflüssigkeit durch eine Ionenaustauschbehandlung gewonnen wird.

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