DE2159179C3 - Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von L-IsoleucinInfo
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Description
L-Isolcucin ist eine eier essentiellen Aminosäuren
und wurde als aktiver Bestandteil für medizinische Präparationen und als Zusatzstoff zu Lebensmitteln
bzw. Futter verwendet. Die bekannte chemische Synthsse dieser Aminosäure weist den Nachteil auf, daß
vier Stereoisomere von Isoleucin während der Reaktioncn gebildet werden und daß komplizierte Arbeitsweisen
zur Abtrennung des biologisch aktiven L-Isoleucins
von dem Gemisch der Isomeren notwendig sind. Aus diesem Grunde wurde erkannt, daß eine
fermentative Methode bei der industriellen Herstellung von L-Isoleucin am vorteilhaftesten und praktischsten
ist.
Es sind bereits drei Methoden zur fermentativen Herstellung von L-Isoleucin bekannt, diese Methoden
benötigen jedoch unbedingt die Anwendung einer Vorliiaferverbiridung bei der Fermentierung. Die bekannten
Methoden können in zwei Gruppen eingeteilt werden. Eine Methode ist in der bekanntgemachten
japanischen Patentanmeldung 6 593/1963 beschrieben, wobei die Züchtung eines Stammes von
Pseudomonas oder Serratia in einem D-Threonin enthaltenden Nähnmedium angewandt wird. Die andere
Methode ist in den bekanntgemachten japanischen Patentanmeldungen 18 511/1961 und 5 167/1962 beschrieben,
wobei die Züchtung eines Stammes von Bacillus oder Pseudomonas in einem DL-.*-Aminobuttersäure
enthaltenden Nährmedium angewandt wird. Ferner kann L-Threonin nicht als Vorläuferverbindung
bei der Methode der erstgenannten Gruppe, d. h. bei der bekanntgemachten japanischen
Patentanmeldung 6 593/1963, angewandt werden.
Es wurde nunmehr gefunden, daß die gegenüber Isoleucin-Hydroxamat und >\-Aminohuttersäure resistente
Mutante von Serratia marcescens: Serratia marcescens ATCC 21 740, oder die gegenüber Isoleucin-Hydroxamat
resistente Mutante von Serratia marcescens: Serratia marcescens ATCC 21 741, eine ausgezeichnete
Ausbeute an L-Isoleucin aus einer normalen Kohlenstoffquelle ergibt. Ferner wurde gefunden,
daß die Ergiebigkeit dieser Mutanten dadurch erheblich gesteigert werden kann, daß man die Fermenüerung
in Anwesenheit von 0,05 bis 5 Gew./ Vol.-°/o L-Threonin, L-Homoserin oder L-Asparaginsäure
durchführt.
Die Erfindung betrifft demgemäß die in den Ansprüchen definierten Verfahren.
Die Fermentierung dieser beiden Mutanten von Serratia marcescens kann entweder durch Schüttelkultivierung
oder Tauchfermentierung unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden. Die Fermentierung
wird bevorzugt bei 25 bis 37° C und bei einem pH-Wert von 6 bis 9 durchgeführt. Kalziumcarbonat
und Ammoniak können zur Einstellung des pH-Wertes des Mediums eingesetzt werden. Das Fermentierungsmedium
enthält eine Kohlenstoff quelle, eine Stickstoffquelle und andere Elemente. Geeignete
Kohlenstoffquellen für die Fermentierung schließen Glucose, Stärkehydrolysat, Fumarsäure, Zitronensäure
und Glycerin ein. Beispiele geeigneter Stickstoffquellen sind Harnstoff, Ammoniumsalze von
organischen Säuren, z. B. Ammoniumacetat, Ammonimnoxalat und Ammoniumsalze von anorganischen
Säuren, z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat. Bevorzugte Mengen der Kohlenstoffquelle und
der Stickstoffquelle in dem Medium liegen innerhalb des Bereiches von 2 bis 15 Gew.A'oI.-°/o bzw. 0,5 bis
2 Gew./Vol.-%. Darüber hinaus können organische Nährstoffe, z. B. Maisquellwasser, Pepton, Hefeextrakte
und/oder anorganische Elemente, z. B. Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, dem Medium zugesetzt
werden.
Bei der Durchführung der Fermentierung gemäß der Erfindung kann die L-Isoleucinergiebigkeit der
obengenannten zwei Mutanten weiter durch Zugabe von etwa 0,05 bis 5 Gew./Vol.-°/o L-Threonin,
L-Homoserin oder L-Asparaginsäure gesteigert werden. Die erfindungsgemäße Fermentierung kann in
etwa 24 bis 96 Stunden durchgeführt werden. In der Fermentierungsbrühe wird L-Isoleucin angesammelt
Nach Abschluß der Fermentierung werden Zellen und andere feste Kulturbestandteile aus der Fermentierungsbrühe
durch übliche Arbeitsweisen, z. B. durch Erhitzen gefolgt von Filtration oder Zentrifugierung,
abgetrennt. Bekannte Arbeitsweisen können bei der Gewinnung und/oder Reinigung von L-Isoleucin
aus dem Filtrat oder der überstehenden Lösung angewandt werden. Beispielsweise wird die filtrierte
Fermentierungsbrühe durch ein Harz eine« starken Kationenaustauschers durchgeschickt oder
hiermit behandelt. Dann wird das Harz mit einer verdünnten, alkalischen Lösung wie wäßrigem Ammoniak:
eluiert. Die L-Isoleucin enthaltenden Eluate werden vereinigt und konzentriert. Zu der konzentrierten Lösung wird ein Alkanol wie Methanol oder Äthanol
zugesetzt. Die ausgefällten Kristalle werden aus einem wäßrigen Alkanol wie wäßrigem Methanol und wäßrigem
Äthanol umkristallisiert, um reine Kristalle von L-Isoleucin zu erhalten.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Die isoleucinhydroxamat-resistente Mutante ATCC Nr. 21741 von Serratia marcescens und die isoleucinhydroxamat-
und a-iminobuttersäure-resistent« Mn-
ι &yi
tante ATCC Nr. 21740 von Serratia marcescens
wurden jeweils 48 Stunden bei 30° C in einem Nährmedium (pH-Wert = 7,0; Bestandteile: Glucose
= 2 Gew./Vol.-o/o; Dextrin = 7 Gew./Vol.-%; Harnstoff
0,5 Gew./VoL-0Zo; Maisquellwasser - 0,35 Gew./
Vol.-0/o; dibasisches Kaliumphosphat = 0,1 Gew./
VoL-1Vo; Magnesiumsulfat = 0,5 Gew./Vol.-°/o; Kalziumcarbonat
= 2 Gew./Vol.-0/o) oder in einem Nährmedium (pH-Wert = 7,0), das die zuvor genannten
Bestandteile und l,OGew./Vol.-<VoL-Threonin,L-Homoserin
oder L-Asparaginsäure enthielt, kultiviert. Die in dem Medium angesammelten Mengen an
L-Isoleucin sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.
Menge von in dem Medium angesammeltem
L-Isoleucin (mg/ml)
L-Isoleucin (mg/ml)
leucin erhalten, [*]? = +40,1° (C = I, 6N-Chlorwasserstoffsäure).
Es wird ein wäßriges Nährmedium hergestellt, welches folgende Bestandteile enthält:
Gew./Vol.-Vo
Glucose 5
Ammoniumfumarat 2
Harnstoff 0,5
Dibasisches Kaüumphosphat 0,1
Magnesiumsulfat 0,05
Zugesetzte Aminosäure
Stämme
ATCC
Nr. 21741
ATCC
Nr. 21741
ATCC
Nr. 21740
Nr. 21740
| Kein Zusatz | 0,1 | 2,5 |
| L-Threonin | 4,0 | 7,0 |
| L-Homoserin | 2,0 | 5,0 |
| L-Asparaginsäure | 1,5 | 3,5 |
| Beispiel 2 |
Ein wäßriges Nährmedium wurde hergestellt, welches folgende Bestandteile umfaßt:
Gew./Vol.-°/o
L-Threonin 2
Glucose 2
Dextrin 10
Harnstoff 0,5
Dibasisches Kaliumphosphat 0,1
Magnesiumsulfat 0,05
Kalziumcarbonat 2
Kaliumcarbonat
Das zuvor genannte Medium wird auf pH = 7,0 eingestellt. 15 ml des Mediums werden in eine
500-ml-Schüttelflasche gegeben und in deren Bestandteile
durch Autoklavbehandlung sterilisiert. Der Inhalt der Schleife einer Impfnadel an isoleucinhydroxamat-resistentcr
Mutante ATCC Nr. 21 741 von Serratia marcescens wird unter aseptischen Bedingungen
in das Medium eingeimpft. Dann wird das Medium 48 Stunden bei 30° C unter Schütteln kultiviert. Das
auf diese Weise erhaltene Fermentierungsmedium enthält 7 mg/ml L-Isoleucin.
1000 ml desFermentierungsmediums werden 10 Minuten
auf 100°C erhitzt und dann filtriert. Das FiI-trat wird in eine Säule (3 cm X 45 cm) eines starken
Kationenaustauscherharzes in der Η-Form eingeführt. Nach dem Waschen mit Wasser wird die Säule mit
5°/oigem wäßrigem Ammoniak eluiert. Die L-lsoleucin
enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck auf etwa 80 ml eingeengt.
100 ml wäßriges Methanol werden zu der Lösung hinzugesetzt. Die ausfallenden Kristalle werden
durch Filtration gesammelt und dann aus wäßrigem Methanol umkristallisiert. Es werden 5 g L-lso-Das
oben beschriebene Medium wird auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. 15 ml des Mediums werden
ao in eine SOO-ml-Schüttelflasche eingegeben, und deren
Inhalt wird durch Autoklavbehandlung sterilisiert. Der Inhalt der Schleife einer Impfnadel der isoleucinhydroxamat-
und a-aminobultersäure-rcsistenten Mutante ATCC Nr. 21 740 von Serratia marcescens
»5 wird aseptisch in das Medium eingeimpft. Dann wird
das Medium in derselben Weise wie in Beispiel 2 beschrieben kultiviert. Das so erhaltene Fermcntierungsnvidium
enthält 2,5 mg/ml L-Isoleucin.
B e i s ρ i e 1 4
15 ml des Nährmediums, welches dieselben Bestandteile, wie im Beispiel 2 beschrieben, mit der Ausnahme
enthält, daß 4 Gew./Vol.-°/o DL-Threonin an Stelle von L-Threonin vorliegen, werden hergestellt.
Nach der Sterilisierung wird der Inhalt der Schleife einer Impfnadel an isoleucinhydroxamat-resistenter
Mutante ATCC Nr. 21741 von Serratia marcescens aseptisch in das Medium eingeimpft. Dann wird das
Medium 72 Stunden bei 300C unter Schütteln kultiviert.
Das so erhaltene Fermentierungsmcdium enthält 13 mg/ml L-Isoleucin.
15 ml Nährmedium wird hergestellt, welches dieselben Bestandteile, wie im Beispiel 4 beschrieben,
enthält. Nach der Sterilisierung wird der Inhalt der Schleife einer Impfnadel der isoleucinhydroxamat-
und (x-aminobuttersäure-resistenten Mulante ATCC Nr. 21 740 von Serratia marcescens aseptisch in das
Medium eingeimpft. Dann wird das Medium in derselben Weise, wie im Beispiel 2 beschrieben, kultiviert.
Das so erhaltene Fermentierungsmedium enthält 25 mg/ml L-Isoleucin.
Es wird ein wäßriges Nährmedium hergestellt, welches folgende Bestandteile enthält:
Gew./Vol.-Vo
L-Homoserin 1
Sorbit 8
Quellwasser von pulverförmigem Mais 0,35
Harnstoff 0,5
6S Dibasisches Kaliumphosphat 0,1
Magnesiumsulfat 0,05
Kalziumcarbonat 2
Das oben beschriebene Medium wird auf pH = 7,0
eingestellt. 15 ml des Mediums werden in eine 500-ml-Schüttelflasche
eingegeben, und deren Inhalt wird durch Autoklavbehandlung sterilisiert. Der Inhalt
einer Schleife einer Impfnade] der isolcucinhydroxamat-
und rv-amiinobuttersäure-resistenten Mutante ATCC Nr. 21 740 von Serratia marcescens wird aseptisch
in das Medium eingegeben. Dann wh\i das Medium ip. derselben Weise, wie im Beispiel 2 beschrieben,
kultiviert. Das so erhaltene Fermcnticrungsmedium enthält 4,5 mg/mil L-Isoleucin.
Es wird ein wäßriges Nährmedium hergestellt, welches
folgende Bestandteile enthält:
Gew./Vol.-Vo
Glucose 5
Glycerin 1
Ouellwasscrvon piulverförmigem Mais 0,35
Harnstoff 0,5
Dibasisches Kaliumphosphal 0,1
Magnesiumsulfat 0,05
Kaliumcarbonat 2
15 ml eines Nährmediums werden hergestellt, welches dieselben Bestandteile, wie im Beispiel 2 beschrieben,
enthält. Nach der Sterilisierung wird der Inhalt einer Schleife einer Implnadel der isoleucinhydroxamat
und ^-amincbuttersäure-resislcnten Mutante ATCC Nr. 21 740 von Serratia marcescens
aseptisch in das Medium eingeimpft. Dann wird das ίο Medium in derselben Weise, wie im Beispiel 2 beschrieben,
kultiviert. Das so erhaltene Fermentierungsmedium enthält 15 mg/ml an L-Isoleucin.
ilOOO ml des Fermentierungsmediums werden in
derselben Weise, wie im Beispiel 2 beschrieben, behandelt. Es werden 12 g L-Isoleucin erhalten.
Mi* = +40,5° (C = 4,6 N-Chlorwasserstoffsäure).
Ein wäßriges Nährmedium, das die folgenden Zusätze enthält, wird hergestellt:
Gew./Vol.-11/« Glucose 4
Dextrin 10
Harnstoff 1
Sekundäres Kaliumphosphat 0,1
Magnesiumsulfat 0,05
Das oben beschriebene Medium wird auf pH = 7,0 eingestellt. 15 ml des Mediums werden in einer 500-ml-Schüttelflasche
eingegeben, und deren Inhalt wird durch Autoklavbehandlung sterilisiert. Der Inhalt
einer Schleife einer Impfnadel der isoleucinhydroxamat- und <\-aminobuttersäurc-rcsistenten Mutante
ATCC Nr. 21 740 von Scrratia marcescens wird ascptisch in das Medium eingeimpft. Dann wird das Medium
72 Stunden bei 300C unter Schütteln kultiviert.
Das so erhaltene Fermentierungsmedium enthält 2,0 mg/ml L-Isoleucin.
Kaliumcarbonat
Dieses Nährmedium wird auf pH = 7,0 eingestellt. 15 ml des Mediums werden in eine 500-nil-Schültelflaschc
eingebracht, und der Inhalt wird im Autoklav sterilisiert. Ein Löffel voll der isoleucinhydroxamat-
und Λ-aminobuttersäure-resisteriten Mutante ATCC
Nr. 21 740 von Scrratia marcescens wird aseptisch in das Medium eingebracht, das dann 48 Stunden unter
Schütteln bei 30° C gezüchtet wird. Das so erhaltene Fermentalionsmedium enthält 3.8 mg/ml L-Isoleucin.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin
durch aerobes Züchten eines Serratia-marcescens-Stainmes
in einem Nährmedium und durch Isolierung des L-Isoleucins aus der Fermentationsbrühe, dadurch geke η η zeichnet, daß
man die gegenüber Isoleucinhydroxamat- und Λ-Aminobuttersäure resistente Mutante von Serratia
marcescens: Serratia marcescens ATCC Nr. 21 740 oder die gegenüber Isoleucinhydroxamat
resistente Mutante von Serratia marcescens: Serratia marcescens ATCC Nr. 21 741 einsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Kultivierung in Anwesenheit von zusätzlich noch 0,05 bis 5 Gew./Vol.-°/o
L-Threonin, L-Homoserin ode- L-Asparaginsäure durchgeführt wird.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10560570A JPS5230593B1 (de) | 1970-11-30 | 1970-11-30 | |
| JP10560570 | 1970-11-30 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2159179A1 DE2159179A1 (de) | 1972-06-22 |
| DE2159179B2 DE2159179B2 (de) | 1977-01-20 |
| DE2159179C3 true DE2159179C3 (de) | 1977-09-08 |
Family
ID=
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