DE3486168T2

DE3486168T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation und dabei zu verwendende mutante Mikroorganismen.

Info

Publication number: DE3486168T2
Application number: DE89115776T
Authority: DE
Inventors: Kiyoji Hattori; Kuniki C O Patent Departm Kino; Yukinobu C O Patent Dep Kotani
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1983-02-25
Filing date: 1984-02-24
Publication date: 1994-01-13
Anticipated expiration: 2004-02-25
Also published as: EP0350971B1; EP0117740A2; EP0117740A3; US4729952A; DE3484206D1; CA1215338A; EP0350971A1; EP0350970A1; EP0117740B1; DE3486168D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation und die dabei zu verwendenden Mikroorganismen.
L-Glutaminsäure ist eine wichtige Aminosäure, die kommerziell als Nahrungszusatz geeignet ist.
Es sind Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation bekannt, die Stämme verschiedener Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium und Brevibacterium, insbesondere Stämme, die einen Nahrungsbedarf an verschiedenen Verbindungen oder eine Empfindlichkeit oder Resistenz gegenüber verschiedenen Chemikalien aufweisen, verwenden. Die Ausbeuten dieser bekannten Verfahren sind vergleichsweise gering, und es besteht ein Bedarf an Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure mit höheren Ausbeuten bei niedrigen Kosten.
Als Ergebnis verschiedener Untersuchungen zum Erhalt von Stämmen mit einer erhöhten L-Glutaminsäure-Produktivität wurde festgestellt, daß L-Glutaminsäure produzierende Mikroorganismenstämme der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, die eine Resistenz gegenüber p-Hydroxycinnamat oder seinem Fluorid aufweisen, eine deutlich verbesserte Fähigkeit zur Herstellung von L-Glutaminsäure besitzen.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure bereit, umfassend die Züchtung eines Mutanten, der die Fähigkeit zur Herstellung von L-Glutaminsäure aufweist, in einem Nährmedium, bis sich L-Glutaminsäure in der erhaltenen Kulturflüssigkeit anreichert, und Gewinnung der L-Glutaminsäure daraus, wobei ein zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörender Mutant mit einer Resistenz gegenüber p-Hydroxycinnamat (p- Coumarat) oder seinem Fluorid verwendet wird.
In einem zweiten Gesichtspunkt erstreckt sich die Erfindung auch auf biologisch reine Kulturen der Mikroorganismen an sich, einschließlich Subkulturen und Mutanten davon, die noch die grundlegenden Eigenschaften des Elternstamms aufweisen, nämlich eine Resistenz gegenüber p-Hydroxycinnamat und seinem Fluorid und die Fähigkeit zur Herstellung von L-Glutaminsäure bei Züchtung.
Geeignete Mutanten zur erfindungsgemäßen Verwendung können erhalten werden, indem man einen Mutanten, der an sich die Fähigkeit zur Herstellung von L-Glutaminsäure aufweist, oder einen verbesserten Mutanten davon, als Elternstamm verwendet und diesem die angegebene Resistenz verleiht.
In einer anderen Ausführungsform kann ein geeigneter Mutant durch ein umgekehrtes Verfahren hergestellt werden, d. h. indem man einem Mutanten, der bereits die angegebene Resistenz aufweist, die vorstehende Fähigkeit zur Herstellung von L-Glutaminsäure verleiht.
Die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung geeigneten Mutantenmikroorganismen können durch herkömmliche Mutationsverfahren unter Verwendung von zum Beispiel Mutagenen, wie Bestrahlung mit ultraviolettem Licht, Röntgenbestrahlung, radioaktive Bestrahlung und eine Behandlung mit chemischen Mutagenen, erhalten werden. Eine Behandlung mit N-Nitro-N'-methyl-N-nitrosoguanidin (nachstehend als NTG bezeichnet) stellt das bevorzugte Verfahren dar.
Zusätzlich können die bei der Erfindung verwendeten Mutanten durchaus andere bestimmte Eigenschaften zusätzlich zur bereits angegebenen Resistenz haben oder damit versehen werden, wie einen bestimmten Nahrungsbedarf, Arzneimittelresistenz, Arzneimittelempfindlichkeit und Arzneimittelabhängigkeit. Vorzugsweise weist der erfindungsgemäße Mutant zusätzlich zu einer Resistenz gegenüber p-Hydroxycinnamat oder seinem Fluorid, die (eine) Vorstufe(n) bei der Biosynthese von Ubichinon sind, auch eine Resistenz gegenüber α-Naphthochinolin und/oder eine Resistenz gegenüber einem Energiestoffwechselinhibitor auf.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "Antibiotika, die den Energiestoffwechsel hemmen", daß die Antibiotika Einfluß auf den Elektronentransport der Atmungskette oder die oxidative Phosphorylierung haben. Beispiele solcher Antibiotika schließen Inhibitoren des Elektronentransportsystems, wie Antimycin A, Entkopplungsmittel, die ein Fortsetzen des Elektronentransports erlauben, aber die Phosphorylierung von ADP zu ATP verhindern, wie Gramicidin S, Valinomycin etc., und Inhibitoren der oxidativen Phosphorylierung ein, die den ATP-bildenden Mechanismus durch Verwendung der hochenergetischen Zwischenstufe oder des durch Elektronentransport erzeugten Zustands verhindern, z. B. Antibiotika, wie Oligomycin, Rutamycin etc.
Die wie vorstehend mutierten Stämme werden durch Züchtung in einem Nährmedium überprüft und ein Stamm, mit der Fähigkeit L-Glutaminsäure mit größeren Ausbeuten herzustellen als der Elternstamm, wird ausgewählt und bei der Erfindung verwendet. Ein besonderes Beispiel des Verfahrens zum Erhalt eines geeigneten Stamms ist in der folgenden Beschreibung aufgeführt.

Verfahren

Corynebacterium glutamicum ATCC-13032 oder Brevibacterium lactofermentum ATCC-13869 wird in einer 1/20 m Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,0) suspendiert. Zur Suspension werden 200 ug/ml NTG gegeben und das Gemisch 30 Minuten lang bei 30ºC gehalten. Die behandelten Mutanten werden abgetrennt und mit der gleichen Pufferlösung gewaschen. Dann werden die Mutanten in einem Medium (pH-Wert 6,8), umfassend 3% Glucose, 0,2% Harnstoff, 10 ppm jeweils von Fe-, Mn- und Cu-Ionen, 1 mg/l Thiaminhydrochlorid, 50 ug/l Biotin und 2% Agar, das weiter 2 mg/ml p-Hydroxycinnamat enthält, ausgesät. Die Züchtung wird 2 bis 20 Tage lang bei 30ºC durchgeführt. Von diesen Mutanten werden jene mit einer deutlich verbesserten Fähigkeit zur Herstellung von L-Glutaminsäure abgetrennt. Typische Beispiele der gegenüber p-Hydroxycinnamat resistenten Stämme sind Corynebacterium glutamicum CPC-8 (nachstehend als CPC-8 bezeichnet) (FERM BP-430) und Brevibacterium lactofermentum BPC-106 (nachstehend als BPC-106 bezeichnet) (FERM BP-431).
Die Stämme CPC-8 und BPC-106 wurden am 19. Februar 1983 außerhalb des Budapester Vertrags am Fermentation Research Institute, the Agency of Industrial Science and Technology, Japan, als die nachstehenden FERM P-Nummern hinterlegt. Die Hinterlegungen wurden in Hinterlegungen gemäß dem Budapester Vertrag umgewandelt, und die entsprechenden internationalen Hinterlegungsnummern sind nachstehend aufgeführt.
Stamm FERM P Nr. FEPN BP Nr.
CPC-8 6923 430
BPC-106 6924 431
Entweder ein synthetisches oder natürliches Medium kann als Medium für die vorliegende Erfindung verwendet werden, sofern es geeigneterweise eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Substanzen und andere notwendige Nährstoffe enthält, die vom verwendeten Stamm assimilierbar sind.
Als Kohlenstoffquelle können verschiedene Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Maltose, Mannose, Glycerol, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysat und Melassen, Zuckeralkohole, wie Glycerol und Sorbit, organische Säuren, wie Essigsäure, Fumarsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Gluconsäure, Ameisensäure, Butansäure und Äpfelsäure, niederkettige Alkohole, wie Ethanol und Methanol, und Kohlenwasserstoffe etc. verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können Ammoniak, anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat, Harnstoff, Amine, andere stickstoffhaltige Verbindungen, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Cornsteep-Lösung, Caseinhydrolysat, Säurehydrolysat von Sojabohnenmehl, verschiedene Mikrobenzellen, Verdauungsprodukte von Mikrobenzellen, etc. verwendet werden.
Als anorganische Substanzen werden Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat, Kupfersulfat, Calciumcarbonat etc. verwendet. Erfordert der bei der vorliegenden Erfindung zu verwendende Mikroorganismus bestimmte Nährstoffe für das Wachstum, wird eine passende Menge der Nährstoffe zum Medium gegeben. In einigen Fällen werden diese Nährstoffe als Bestandteile der als Beispiel für die Stickstoffquelle veranschaulichten natürlichen Substanzen zugegeben.
Weiter kann die Produktivität der L-Glutaminsäure durch einen erfindungsgemäßen Mikroorganismus in einigen Fällen durch Zugabe anderer Zusätze, zum Beispiel verschiedener Antibiotika, wie Streptomycin, Penicillin G und Rifampicin, eines Antioxidationsmittels, wie α-Tocopherol, grenzflächenaktiver Stoffe, wie Polyoxyethylen-Sorbitanmonopalmitat, Aminosäuren, wie Methionin, Lysin, Cystein und Asparaginsäure, Biotin, Essigsäure, Ölsäure, Adenin etc., zum Medium erhöht werden.
Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, zum Beispiel Schüttelkultur, submers gerührte Kultur etc. Die Temperatur für die Züchtung beträgt im allgemeinen 20-40ºC und der pH-Wert des Mediums liegt im Bereich von 3 bis 9, und wird vorzugsweise um den Neutralwert gehalten, aber eine Züchtung kann unter Bedingungen durchgeführt werden, die außerhalb dieses Bereichs liegen, sofern der verwendete Mikroorganismus wachsen kann. Der pH-Wert des Mediums wird mit Calciumcarbonat, saurer oder alkalischer Lösung, Ammoniak, pH-Puffermittel etc. eingestellt. Üblicherweise ist nach Züchtung über 1 bis 4 Tage L-Glutaminsäure gebildet und in der entstandenen Kulturlösung angesammelt.
Nach vollständiger Züchtung werden Niederschläge, wie Zellen, von der Kulturlösung abgetrennt, und die L-Glutaminsäure kann aus der Kulturlösung unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, wie Behandlung mit Ionenaustauscherharz, Konzentration, Adsorption und Aussalzen in einer Kombination, gewonnen werden.
Eine praktische Durchführung der bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist durch die folgenden typischen Beispiele veranschaulicht.

Beispiel 1

Als Saatstämme werden vier Stämme der Corynebacterium glutamicum ATCC-13032 und CPC-8 und Brevibacterium lactofermentum ATCC-13869 und BPC-106 verwendet.
Als Saatmedium wird ein Medium (pH-Wert 7,2) mit einer Zusammensetzung von 4% Glucose, 2% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,15% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% K&sub2;HPO&sub4;, 0,05% MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 100 ug/l Biotin und 0,3% Harnstoff, das 10 Minuten lang bei 120ºC sterilisiert wurde, verwendet. Die vorstehend beschriebenen Stämme werden 24 Stunden lang unter Schütteln bei 30ºC gezüchtet. Dann wird 1 ml der Kulturlösung in 20 ml eines nachstehend beschriebenen Fermentationsmediums eingebracht, das sich in einem 300 ml-Erlenmeyerkolben befindet. Die Züchtung wird 3 Tage lang unter Schütteln bei 30ºC durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Zusammensetzung des Fermentationsmediums

10% Glucose, 0,5% Fleischextrakt, 3% Ammoniumsulfat, 0,15% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% K&sub2;HPO&sub4;, 0,05% MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 500 ug/l Thiaminhydrochlorid, 10 mg/l FeSO&sub4;·7H&sub2;O, 10 mg/l MnSO&sub4;·4-6H&sub2;O, 1 mg/l CuSO&sub4;·5H&sub2;O, 0,5% Harnstoff, 3% CaCO&sub3; (pH-Wert 7,2), 10 Minuten lang bei 120ºC sterilisiert.

Tabelle 1

Stamm L-Glutaminsäure (g/l) Ausbeute, bezogen auf Zucker
ATCC-13032 49 49
CPC-8 58
ATCC-13869 45 45
BPC-106 53 53

Beispiel 2

Die gleichen Verfahren, wie im Beispiel 1 beschrieben, werden wiederholt, außer daß 10% (berechnet als Glucose) Melassen statt Glucose im Beispiel 1 als Fermentationsmedium verwendet werden, und eine Penicillin-G-Lösung mit einer Endkonzentration von 5 E/ml bei Beginn der Züchtung zugegeben wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2

Stamm L-Glutaminsäure (g/l) Ausbeute, bezogen auf Zucker
ATCC-13032 46 46
CPC-8 54 54
ATCC-13869 41 41
BPC-106 49 49

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure, umfassend die Züchtung eines L-Glutaminsäure produzierenden Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium in einem Nährmedium, bis L-Glutaminsäure sich in der erhaltenen Kulturflüssigkeit anreichert, und Gewinnung der L-Glutaminsäure daraus, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Mikroorganismus eine Resistenz gegenüber p-Hydroxycinnamat (p-Coumarat) oder seinem Fluorid aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Mikroorganismus ein Stamm der Art Corynebacterium glutamicum oder Brevibacterium lactofermentum ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum CPC-8, FERM BP-430, oder Brevibacterium lactofermentum BPC-106, FERM BP-431, ist.

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung bei 20 bis 40ºC für 1 bis 4 Tage erfolgt.

5. Biologisch reine Kulturen der Mikroorganismen Corynebacterium glutamicum FERM BP-430 und Brevibacterium lactofermentum FERM BP-431, einschließlich Subkulturen und L- Glutaminsäure produzierenden Mutanten davon, wobei die Subkulturen und Mutanten die spezifischen Eigenschaften des Elternstammes behalten, nämlich eine Resistenz gegenüber p-Hydroxycinnamat oder seinem Fluorid und die Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure in einem Kulturmedium.