JP2817157B2 - 発酵法によるｌ‐アミノ酸の製造法 - Google Patents

発酵法によるｌ‐アミノ酸の製造法

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は発酵法によるＬ−アミノ酸の製造に関する。
Ｌ−アミノ酸は調味料，医薬，飼料添加物，化成品及び
試薬等に広く利用されている。
〔従来の技術〕
発酵法により工業的に生産されるＬ−アミノ酸類とし
ては、Ｌ−グルタミン酸,L−リジン,L−グルタミン,L−
アルギニン,L−フェニルアラニン,L−アラニン,L−スレ
オニン,L−イソロイシン,L−ヒスチジン,L−プロリン,L
−バリン,L−セリン,L−オルニチン,L−シトルリン,L−
チロシン,L−トリプトファンおよびＬ−ロイシン等が有
り、利用される微生物としては、ブレビバクテリウム
属，コリネバクテリウム属，バチルス属，エセリヒア
属，セラチア属，ブロビデンシア属，アースロバクター
属等に属する微生物がある。
これらの各種微生物を利用して、工業的にＬ−アミノ
酸を安価に生産する方法として、微生物の育種改良法が
多用されてきた。即ち、野性株そのもののＬ−アミノ酸
生産能は極めて少ない場合が多いので、人工突然変異に
より、栄養要求性を付与したり、アナログ耐性を付与し
たり栄養要求性とアナログ耐性を組み合せる方法、更に
はアミノ酸生合成等の遺伝子を遺伝子組換え法により増
強する方法等が知られている。
〔解決しようとする問題点〕
Ｌ−アミノ酸の発酵収率及び蓄積を向上させることに
より工業的に安価に生産することは、重要な問題であ
る。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明者らはＬ−アミノ酸の発酵収率をさらに向上さ
せ、工業的に有利な発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法
を開発すべく鋭意研究した結果、グルタミン酸又はアス
パラギン酸を含有するペプチド（ｘ−Glu,Glu−x,x−As
p,Asp−x;xはアミノ酸）に耐性を有する菌株を育種する
ことにより目的とするＬ−アミノ酸の収率が向上するこ
とを世界に先がけて見出した。本発明はこの知見に基づ
いて更に研究を行った結果なされたものである。
本発明でいうＬ−アミノ酸とは、Ｌ−グルタミン酸,L
−グルタミン,L−リジン,L−アルギニン,L−フェニルア
ラニン,L−スレオニン,L−イソロイシン,L−ヒスチジ
ン,L−プロリン,L−バリン,L−セリン,L−オルニチン,L
−シトルリン,L−チロシン,L−トリプトファンおよびＬ
−ロイシンなどのＬ−アミノ酸であり、ここに例示した
Ｌ−アミノ酸以外でも発酵法により生産されるＬ−アミ
ノ酸であれば本発明の適用の範囲に入る。
即ち、本発明のポイントは、ブレビバクテリウム属又
はコリネバクテリウム属に属し、ｘ−Glu,Glu−x,x−As
p又はAsp−ｘの構造を有するペプチドに耐性を有し、且
つＬ−アミノ酸生産能を有する微生物を液体培地中で培
養し、培地中に生成蓄積したＬ−アミノ酸を採取するこ
とを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法に関する。
本発明のペプチドとしては、Tyr−Glu,Ala−Glu,Val
−Glu,Trp−Glu,Met−Glu,Gly−Glu,Glu−Gly,Glu−Le
u,Glu−His,Gly−Asp,Ala−Asp,Asp−Gly等であり、こ
れらの少くとも一種に耐性を有する菌株を本発明に於て
ペプチド耐性菌と言う。
本発明において用いられる微生物はブレビバクテリウ
ム属又はコリネバクテリウム属に属し、上記のペプチド
耐性を有し、且つＬ−アミノ酸生産能を有する変異株で
ある。
本発明の変異株を得るには、下記に示す親株より上記
ペプチド耐性を誘導してもよいし、Ｌ−アミノ酸の生産
能を有する変異株からペプチド耐性株を誘導してもよ
い。
本変異株の親株となる野性株は、ブレビバクテリウム
属又はコリネバクテリウム属等のコリネホルム型のＬ−
グルタミン酸生産菌として知られているものであり、例
えば以下のものがある。
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 14067 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ATCC 1
3869 ブレビバクテリウム・デイバリカタム ATCC 14020 ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC 140
66 コリネバクテリウム・グラタミクム ATCC 13032 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC 1
3870 これらの親株又は変異株から、本発明のペプチド耐性株
Ｎ−メチル−N'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処理
する等の通常の変異誘導方法が適用できる。変異処理し
た菌液から本発明の変異株を分離する方法はペプチドを
含む培地で成育するような菌株を採取することによって
行われる。
本発明の変異株の具体的な変異誘導方法とペプチド濃
度と菌株の生育度の関係を以下に示す。
〔変異誘導方法〕
ブイヨン寒天スラント上に30℃で24時間生育させたブ
レビバクテリウム・フラバム ATCC 14067の菌体を M/3
0リン酸緩衝液に懸濁し菌体濃度109/mlの菌体懸濁液に2
00μg/mlのＮ−メチル−N'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジンを加え０℃に20分間保持した。次いで遠心分離し
た後、第１表に示した組成の培地に播菌し、31.5℃で２
〜10日間培養した。
寒天培地に育成してきたTyr−Glu耐性株20株の中か
ら、Ｌ−グルタミン生産能の高い菌株として、ブレビバ
クテリウム・フラバム AJ 12418（FERM BP−2205）を得
た。
同様の変異処理方法を用いることにより、各種のアミ
ノ酸生産菌株を元株として、よりアミノ酸生産能の向上
した菌株を得る事が出来た。第２表に代表例を示す。
第２表に例示したグルタミン，リジン，アルギニン，
グルタミン酸，ヒスチジン，プロリン、イソロイシン等
の生産菌の改良の他にも、フェニルアラニン，スレオニ
ン，バリン，オルニチン，トリプトファン，シトルリ
ン，ロイシン，チロシン，セリンに於ても有効であっ
た。
このようにして得られた変異株のペプチド耐性度を親
株と比較した。
グルコース0.5g/dl,尿素0.2g/dl,硫安0.15g/dl,KH2PO
40.3g/dl,K2HPO40.1g/dl,MgSO4・7H2O 0.01g/dl,CaCl2
・2H2O 0.1mg/dl,ビオチン100μg/，サイアミン・HCl
100μg/,FeSO4・7H2O 0.002g/dl,MnSO4・7H2O 0.002g
/dlおよび第３表に示した量のペプチドを含み、pH7.0に
調節した液体培地に天然培地（ペプトン1g/dl,酵母エキ
ス1g/dl,NaCl0.5g/dl,pH 7.0）スラント上で24時間培養
した菌体を殺菌水に懸濁して接種し、24時間培養して菌
の生育による濁度を測定し、相対生育度（％）で示し
た。（第３表〜第９表） 〔作 用〕 このような変異株を培養する際に用いる培地は、炭素
源，窒素源，無機イオン，栄養要求性を満足させるべき
物質及び必要に応じビタミン等その他の有機微量栄養素
を含有する通常の培地である。炭素源としては、グルコ
ース，シュークロース等の炭水化物，酢酸等の有機酸等
が、窒素源としては、アンモニア水，アンモニアガス，
アンモニウム塩等が好適である。無機イオンとしてはカ
リウムイオン，ナトリウムイオン，マグネシウムイオ
ン，リン酸イオンその他が必要に応じ適宜培地に添加さ
れる。培養は好気的条件が望ましく、培養の間、培地の
pHを４ないし８に温度を25℃ないし37℃に調節しつつ行
えばより好ましい結果が得られる。かくして１ないし７
日間も培養すれば培地中に著量のＬ−アミノ酸が生成蓄
積するので、次のイオン交換樹脂による方法等によりＬ
−アミノ酸の結晶を取得することができる。
以下実地例にて説明する。
実施例１ グルコース10％，硫酸アンモニウム１％，リン酸第一
カリ0.25％，硫酸マグネシウム0.04％，硫酸第一鉄0.00
1％，サイアミン塩酸塩350μg/，ビオチンμg/，味
液（登録商標）0.5ml/dl,pH 7.0の組成からなる水溶液
培地を小型ガラス製ジャーファーメンターに300ml宛分
注し、常法により殺菌した後、あらかじめ30℃で24時間
ブイヨンスラント上で生育させたところの第10表に示し
た各種のＬ−グルタミン生産菌株を接種した。次いでそ
のpHをアンモニアガスで6.5に維持しながら31.5℃に120
0rpm,通気毎分1/4容にて30時間培養した。発酵終了液中
に生成蓄積されたＬ−グルタミンの対重量グルコース収
率を第10表に示した。
ブレビバクテリウム・フラバム AJ12418を使用した
発酵終了液１から遠心分離によって菌対を除去して上
清液を得、これからイオン交換樹脂をもちいる常法にし
たがってＬ−グルタミンを分離し、Ｌ−グルタミンの結
晶19.0gを得た。
実施例２ グルコース10％，硫酸アンモニウム２％，リン酸第一
カリ0.1％，硫酸マグネシウム0.04％，硫酸第一鉄0.001
％，硫酸マンガン0.001％，サイアミン・塩酸塩200μg/
，ビオチン500μg/，味液（登録商標）5ml/dl,ニコ
チン酸アミド1mg/dl,DL−アラニン0.1％,pH7.0の組成か
らなる水溶液培地を小型ガラス製ジャーファーメンター
に300ml宛分注し、常法により殺菌した後、あらかじめ3
0℃で48時間ブイヨンスラント上で生育させたところの
第11表に示した各種のＬ−リジン生産菌株を接種した。
次いでそのpHをアンモニアガスで7.0に維持しつつ31.5
℃にて1200rpm,通気毎分1/2容にて48時間培養した。発
酵終了液中に生成蓄積されたＬ−リジンの対重量グルコ
ース収率を第11表に示した。
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムAJ12420
を使用した発酵終了液１から遠心分離によって菌体を
除去して上清液を得、これからイオン交換樹脂をもちい
る常法によって、Ｌ−リジンを分離し、Ｌ−リジンの結
晶19.2gを得た。
実施例３ グルコース10％，硫酸アンモニウム４％，リン酸第一
が0.1％，硫酸マグネシウム0.04％，硫酸第一鉄0.001
％，硫酸マンガン0.001％，サイアミン・塩酸塩100μg/
，ビオチン100μg/，味液（登録商標）5ml/dl,酵母
エキス0.2％pH 7.0の組成からなる水溶液培地を小型ガ
ラス製ジャーファーメンターに300ml宛分注し、常法に
より殺菌した後、あらかじめ30℃で24時間ブイヨンスラ
ント上で生育させところの第12表に示した各種のＬ−ア
ルギニン生産菌株を接種した。次いでそのpHをアンモニ
アガスで7.0に維持しつつ31.5℃にて1200rpm,通気毎分1
/2容にて48時間培養した。発酵終了液中に生成蓄積され
たＬ−アルギンの対重量グルコース収率を第12表に示し
た。
コリネバクテリウム・グルタミウムAJ12422を使用し
た発酵終了液１から遠心分離によって菌体を除去して
上清液を得、これから弱酸性イオン交換樹脂を用いる常
法によって、Ｌ−アルギニンを単離精製し、Ｌ−アルギ
ニンの結晶17.3gを得た。
実施例４ グルコース10％，リン酸第一カリ0.2％，硫酸マグネ
シウム0.1％，硫酸第一鉄0.001％，硫酸マンガン0.001
％，サイアミン・塩酸塩500μg/，ビオチン５μg/
，味液（登録商標）1ml/dl,pH7.2の組成からなる水溶
液培地を小型ガラス製ジャーファーメンターに300ml宛
分注し、オートクレーブにて殺菌した後、あらかじめ30
℃で24時間ブイヨンスラント上で生育させたところの第
13表に示した各種のＬ−グルタミン酸生産菌株を接種し
た。次いでそのpHをアンモニアガスでpH 7.2に維持しつ
つ、31.5℃にて1200rpm,1/2容にて48時間培養した。発
酵終了液中に生成蓄積されたＬ−グルタミン酸の対重量
グルコース収率を第13表に示した。
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムAJ12423
を使用した発酵終了液１から、遠心分離によって菌体
を除去して上清液を得、これからイオン交換樹脂を用い
る常法によってＬ−グルタミン酸を単離精製し、Ｌ−グ
ルタミン酸の結晶35.5gを得た。
実施例５ グルコース10％，硫酸アンモニウム0.5％，リン酸第
一カリ0.15％，硫酸マグネシウム0.1％，硫酸第一鉄0.0
01％，硫酸マンガン0.001％，サイアミン・塩酸塩300μ
g/，ビオチン350μg/，味液（登録商標）5ml/dl,酢
酸アンモニウム0.5％,pH7.0の組成からなる水溶液培地
を小型ガラス製ジャーファーメンターに300ml宛分注
し、オートクレーブにて殺菌した後、あらかじめ30℃で
24時間ブイヨンスラント上で生育させた第14表に示した
各種のＬ−ヒスチジン生産菌株を接種した。次いで、そ
のpHをアンモニアガスで7.0に維持しつつ、31.5℃にて1
200rpm,通気毎分1/2容にて48時間培養した。発酵終了液
中に生成蓄積されたＬ−ヒスチジンの対重量グルコース
収率は第14表の如くであった。
コリネバクテリウム・グルタミクムAJ12425を使用し
た発酵終了液１から遠心分離によって菌対を除去して
上清液を得、これからイオン交換樹脂を用いる常法によ
ってＬ−ヒスチジンを単離・精製し、Ｌ−ヒスチジンの
結晶4.7gを得た。
実施例６ グルコース10％，硫酸アンモニウム４％，リン酸第一
カリ0.1％，硫酸マグネシウム0.5％，硫酸第一鉄0.001
％，硫酸マンガン0.001％，サイアミン・塩酸塩100μg/
，ビオチン350μg/，味液（登録商標）1ml/dl,L−
イソロイシン35mg/dl,pH7.0の組成からなる水溶液培地
を小型ガラス製ジャーファーメンターに300ml宛分注
し、常法により殺菌した後、あらかじめ30℃で24時間ブ
イヨンスラント上で生育させた第15表に示した各種のＬ
−プロリン生産菌株を接種した。次いでそのpHをアンモ
ニアガスで7.0に維持しつつ、31.5℃にて1200rpm,通気
毎分1/2容にて48時間培養した。発酵終了液中に生成蓄
積されたＬ−プロリンの対重量グルコース収率を第15表
に示した。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12427を使用した発
酵終了液１から遠心分離によって菌体を除去して上清
液を得、これからイオン交換樹脂を用いる常法によって
Ｌ−プロリンを単離精製し、Ｌ−プロリンの結晶17.5g
を得た。
実施例７ グルコース10％，硫酸アンモニウム１％，リン酸第一
カリ0.1％，硫酸マグネシウム0.04％，硫酸第一鉄0.001
％，硫酸マンガン0.001％，サイアミン・塩酸塩100μg/
，ビオチン100μg/，味液（登録商標）2ml/dl,pH
7.0の組成からなる水溶液培地を小型ガラス製ジャーフ
ァーメンターに300ml宛分注し、常法により殺菌した
後、あらかじめ30℃で24時間ブイヨンスラント上で生育
させた第16表に示した各種のＬ−イソロイシン生産菌株
を接種した。次いでそのpHをアンモニアガスで7.3に維
持しつつ、31.5℃にて、1200rpm,通気毎分1/2容にて48
時間培養した。発酵終了液中に生成蓄積されたＬ−イソ
ロイシンの対重量グルコース収率を第16表に示した。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ（12428）を使用し
た発酵終了液１から遠心分離によって菌体を除去して
上清液を得、これからイオン交換樹脂を用いる常法によ
ってＬ−イソロイシンを単離精製し、Ｌ−イソロイシン
の結晶6.5gを得た。
〔発明の効果〕
本発明により、各種のＬ−アミノ酸を収率よく得るこ
とができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:15） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２２１５ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 13/00 - 13/24 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリ
    ウム属に属しグルタミン酸又はアスパラギン酸を含有す
    るペプタイドに耐性を有し、且つＬ−アミノ酸生産能を
    有する微生物を液体培地で培養し、培地中に生成蓄積し
    たＬ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ
    酸の製造法。
  2. 【請求項２】グルタミン酸又はアスパラギン酸を含有す
    るペプチドがｘ−Glu,Glu−x,x−Asp又はAsp−ｘである
    第１請求項記載のＬ−アミノ酸の製造法。 但し、ｘはGly,Ala,Val,Leu,Ile,Arg,Asp,Cit,Cys,Lys,
    Glu,Gln,His,Met,Orn,Pro,OH−Pro,Phe,Tyr,Trp,Ser又
    はThrを示す。
  3. 【請求項３】ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリ
    ウム属に属し、グルタミン酸又はアスパラギン酸を含有
    するペプチドに耐性を有する微生物。
  4. 【請求項４】グルタミン酸又はアスパラギン酸を含有す
    るペプチドがｘ−Glu,Glu−x,x−Asp又はAsp−ｘである
    第３請求項記載の微生物。 但しｘはGly,Ala,Val,Leu,Arg,Asp,Cit,Cys,Lys,Glu,Gl
    n,His,Met,Orn,Pro,OH−Pro,Phe,Tyr,Trp,Ser又はThrを
    示す。
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