DE202014011287U1

DE202014011287U1 - SC-ß Zellen und Zusammensetzungen zur Erzeugung der Zellen

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Publication number: DE202014011287U1
Application number: DE202014011287.8U
Authority: DE
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 2013-06-11
Filing date: 2014-06-11
Publication date: 2019-02-06
Anticipated expiration: 2024-06-12
Also published as: AU2023237028A1; EP3008168A2; KR102640729B1; SG11201510176VA; KR20210034688A; US11162078B2; KR102580225B1; US20240124847A1; RU2016100433A; WO2015002724A3; AU2014284677A1; CA2915091A1; US20240101963A1; GB2549822A; DE112014002780T5; RU2019108582A; AU2014278178B2; KR102205234B1; AU2020289721B2; US10030229B2

Abstract

Einrichtung, welche eine Einrichtung mit einer Population nicht-nativer Pankreas-ß-Zellen umfasst, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen eine in vitro Glucose-stimulierte Insulin-Sekretion-Antwort auf einen Glucose-Test zeigen, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen mindestens eines von Somatostatin und Glucagon nicht exprimieren, und worin die Einrichtung ausgestaltet ist, Insulin zu produzieren und sezernieren, wenn in einem Individuum implantiert.

Description

Die vorliegende Anmeldung beansprucht die Priorität der US Provisional Application No. 61 / 833.898 , am 1. Juni 1 2013 eingereicht wurde, und US Provisional Application No. 61 / 972.212 , am 28. März 2014 eingereicht wurde, deren Inhalt hiermit einbezogen durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Forschung auf dem neuesten Stand ist nur ein anormales Verhalten Insulin-exprimierenden Zellen, die entsprechenden Mengen an Insulin absondern als Reaktion auf abwechslungsreiche Zuckerspiegel oder Pankreas-Vorläuferzellen, die nur in funktionierende Insulin-exprimierenden Zellen nach 3 Monaten reifen können sequentiell erzeugt der Transplantation in einen Mäusewirt (Cheng et al 2012; D'Amour et al, 2005; D'Amour et al, 2006; Kroon et al, 2008; Nostro et al, 201 1; Rezania et al 2012; Schulz et al 2012; Xie et al, 2013). Im Gegensatz zu normalen Inseln oder dispergiert erwachsenen β-Zellen, die hohe Konzentrationen an Insulin in Antwort auf hohe Konzentrationen von Glukose im „Glucose stimulierte Insulinsekretion“ (GSIS) -Test frei und kann dies wiederholt, HPSC abgeleitete Insulin-exprimierenden Zellen generiert durch die bestehenden Methoden nicht auf Insulin in geeigneter Weise in Reaktion auf die Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von Glucose sekretieren. Dementsprechend besteht ein Bedarf für ein Verfahren zum Ableiten von Zellen aus hPSCs, die einen Phänotyp normalen Inseln oder β-Zellen reifen Erwachsenen aufweisen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung ein Stammzellen abgeleiteten β Zelle (SC-β) bereit.
In einigen Ausführungsformen ist die Zelle zu reifen. In einigen Ausführungsformen weist die Zelle eine in vitro Glucose stimulierte Insulinsekretion (GSIS) Antwort auf. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle weist eine iv vivo GSIS Antwort. In einigen Ausführungsformen die Zelle weist in vitro und in vivo Glucose Insulinsekretion (GSIS) Antworten. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle weist eine GSIS Reaktion auf mindestens eine Glucoseprovokation. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle weist eine GSIS Antwort auf mindestens zwei aufeinanderfolgenden Glucose Herausforderungen. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle weist eine GSIS Reaktion auf mindestens drei aufeinanderfolgenden Glucose Herausforderungen. In einigen Ausführungsformen wird die GSIS Reaktion unmittelbar nach dem Umpflanzen der Zelle in einem Menschen oder Tier beobachtet. In einigen Ausführungsformen wird die GSIS Reaktion innerhalb von etwa 24 Stunden nach Transplantation, die Zelle in einem Menschen oder Tier beobachtet. In einigen Ausführungsformen wird die GSIS Antwort innerhalb etwa zwei Wochen der Transplantation der Zelle in einem Menschen oder Tier beobachtet.
In einigen Ausführungsformen der Stimulationsindex der Zelle durch das Verhältnis von Insulin in Reaktion auf die hohen Glucosekonzentrationen sezerniert Vergleich zu geringen Glucose-Konzentrationen ähnelt der Stimulationsindex eines endogenen reifen β Pankreaszelle. In einigen Ausführungsformen ist der Stimulationsindex grßer als oder gleich 1 ist, oder größer als oder gleich 1,1 oder größer als oder gleich 1 .3, oder größer als oder gleich 2 ist, oder größer als oder gleich 2,3, oder größer als oder gleich 2,6. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle aufweist Zytokin-induzierte Apoptose in Reaktion auf ein Cytokin ist. In einigen Ausführungsformen das Cytokin aus der Gruppe, bestehend aus Interleukin ḯ β (IL-ß), Interferon-γ (INF-γ), Tumornekrosefaktor-a (TNF-a) und Kombinationen davon ausgewählt ist. In einigen Ausführungsformen wird die Insulinsekretion aus der Zelle in Reaktion auf ein Antidiabetikum verbessert. In einigen Ausführungsformen umfasst das antidiabetische Mittel ein Sekretagogum, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Inkretin Mimetikum, einem Sulfonylharnstoff, einem Meglitinid, und Kombinationen davon. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle monohormonal. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle weist eine Morphologie auf, die Morphologie eines endogenen reifen β Pankreaszelle ähnelt.
In einigen Ausführungsformen weist die Zelle eingekapselte kristalline Insulingranula unter Elektronenmikroskopie, die Insulin-Granulat eines endogenen reife Pankreas β Zelle ähneln. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle eine niedrige Rate der Replikation. In einigen Ausführungsformen die Zelle weist eine Glucose stimulierte Ca2+ Fluss (GSCF), die die GSCF ähnelt einer endogenen reifen β Pankreaszelle. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle weist eine GSCF Reaktion auf mindestens eine Glucoseprovokation. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle weist eine GSCF Reaktion auf mindestens zwei Glucose Herausforderungen. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle weist eine GSCF Reaktion auf mindestens drei Glucose Herausforderungen. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle einen erhöhten Calciumfluss. In einigen Ausführungsformen umfasst die erhöhte Calciumfluss einen erhöhten Zufluss oder ein Verhältnis von Zulauf zu niedrig im Vergleich zu hohen Glukosekonzentrationen. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle zumindest eine Markierung Charakteristik eines endogenen reife Pankreas β Zelle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Insulin, C-Peptid, PDX 1 MAFA NKX6-1, PAX6, NEUROD1 Glucokinase (GCK), SLC2A ausdrückt 1, PCSK 1, KC J 1 1, ABCC8, SLC30A8, SNAP25, RAB3A, GAD2, PTPRN, NKX2-2, Pax4.
In einigen Ausführungsformen ist die Zelle nicht mindestens ein Marker ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus a) ein Hormon, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus i) Glucagon (GCG) zu exprimieren, und ii) Somatostatin (SST); oder b) eine Azinuszelltumoren Marker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) Amylase und ii) carboxypeptdase A (CPA 1); c) einen a-Zellmarker ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus i) GCG, ii) Arx, iii) Irx1 und IRX2; undd) eine duktale Zellmarker ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus i) CFTR und ii) Sox9. In einigen Ausführungsformen wird die Zelle in vitro aus einem Insulin-positiven endokrinen Zelle differenziert oder eine Vorstufe davon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Nkx6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzelle, einer Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzelle und eine pluripotente Stammzelle . In einigen Ausführungsformen die pluripotente Stammzelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer embryonalen Stammzelle und pluripotenten Stammzellen. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle menschlich. In einigen Ausführungsformen wird die Zelle, die nicht genetisch modifiziert ist.
In einigen Ausführungsformen wird die Zelle gentechnisch verändert. In einigen Ausführungsformen ist die pro Zelle produzierte Insulin zwischen 0,5 und 10 µIU pro 1000 Zellen pro 30-minütigen Inkubation bei hoher Glukosekonzentration. In einigen Ausführungsformen ist die pro Zelle produzierte Insulin etwa 2,5 µḯὕ je 1 000 Zellen pro 30-minütigen Inkubation bei hoher Glukosekonzentration. In einigen Ausführungsformen erfolgt die Inkubation ex vivo.
In einigen Aspekten stellt die Erfindung ein Zelllinie, die eine SC-β-Zelle. In einigen Ausführungsformen ist die Zelllinie stabil exprimiert Insulin. In einigen Ausführungsformen können die Zellen eingefroren, aufgetaut und mit einer Verdopplungszeit von zwischen etwa 24 und 44 Stunden ohne signifikante morphologische Veränderungen, bis mindestens 30 Passagen amplifiziert.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung ein Verfahren zur Erzeugung eines SC-β-Zelle von Insulin-positiven endokrinen Zellen, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer Population von CEI! s aufweist Insulin-positiven endokrinen Zellen unter Bedingungen, die Zellklumpen mit mindestens zwei β Zellreifungsfaktoren, umfassend a) einen transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β) Signalweg-Inhibitor und b) einem Schilddrüsenhormon-Signalweg Aktivator zu fördern, zu induzieren die in vitro-Reifung von mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle in der Population in eine SC-β-Zelle.
In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle weist eine Antwort auf mindestens eine Glucoseprovokation. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle weist eine Antwort auf mindestens zwei aufeinanderfolgenden Glucose Herausforderungen. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle weist eine Antwort auf mindestens drei aufeinanderfolgenden Glucose Herausforderungen. In einigen Ausführungsformen ist die Morphologie des SC-β-Zelle ähnelt die Morphologie eines endogenen reifen β-Zelle. In einigen Ausführungsformen die SC-Zelle weist β in vitro und / oder in vivo-Insulinsekretion (GSIS) Antworten. In einigen Ausführungsformen die GSIS Antwort unmittelbar nach der Transplantation des SC-β-Zelle in einem Subjekt beobachtet. In einigen Ausführungsformen die GSIS Reaktion innerhalb von etwa 24 Stunden nach der Transplantation des SC-β-Zelle in einem Subjekt beobachtet. In einigen Ausführungsformen wird die GSIS Antwort innerhalb etwa zwei Wochen nach der Transplantation der SC-β-Zelle in einem Subjekt beobachtet. 100 µM - in einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von zwischen 100 nm in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 10 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalwegs umfasst TGF-β-Rezeptor Typ I-Kinase-Signalweg.
In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors umfasst ALK5 Inhibitor II. In einigen Ausführungsformen umfasst der TGF-β-Signalweg-Inhibitor ein Analogon oder Derivat von ALK5 Inhibitor II. 10 µM - in einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von zwischen 0,1 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 1 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen das Schilddrüsenhormon-Signalweg Aktivator Trijodthyronin (T3). In einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation gegebenenfalls mit einem Proteinkinaseinhibitor in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen wird die Population von Zellen, nicht mit dem Proteinkinaseinhibitor in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem Proteinkinaseinhibitor in Kontakt gebracht. 1 µM - in einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem Proteinkinaseinhibitor in einer Konzentration von zwischen 10 nm kontaktiert. In einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem Proteinkinaseinhibitor in einer Konzentration von] 00 n in Kontakt gebracht.
In einigen Ausführungsformen umfasst das Protein-Kinase-Inhibitor Staurosporin. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Inkontaktbringen der Population von Zellen mit mindestens einer zusätzlichen β-Zellreifungsfaktor. In einigen Ausführungsformen umfasst die zumindest eine zusätzliche β-Zellreifungsfaktor einen Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) -Inhibitor. 100 µM - in einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem CFTR-Inhibitor in einer Konzentration von zwischen 100 nm in Kontakt gebracht. 10 µM - in einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem CFTR-Inhibitor in einer Konzentration von zwischen 10 nm kontaktiert. In einigen Ausführungsformen umfasst das CFTR-Inhibitor Gly-H O 11. In einigen Ausführungsformen umfasst die zumindest eine zusätzliche β-Zellreifungsfaktor einen O-GlcNAcase Inhibitor. 100 µM - in einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem O-GlcNAcase Inhibitor in einer Konzentration von 100 nM in Kontakt gebracht. 10 µM - in einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem O-GlcNAcase Inhibitor in einer Konzentration von 10 nM in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen ist der Inhibitor von O- GlcNAcase umfasst Thiamet G. In einigen Ausführungsformen ist die Population von Zellen in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert.
In einigen Ausführungsformen umfasst das geeignete Kulturmedium Connought Medical Research Laboratories 1066 ergänzt islet Medien (CMRLS) oder eine Komponente CMRLS. In einigen Ausführungsformen wird die CMRLS supplementiert mit Serum. In einigen Ausführungsformen wird die CMRLS mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt. In einigen Ausführungsformen sind die Bedingungen, die das Zell aggregierende umfassen ein Suspensionskultur. In einigen Ausführungsformen wird die Population von Zellen in einer Suspensionskultur für einen Zeitraum, der ausreicht, um die in vitro-Reifung von zumindest einem der Insulin-positiven endokrinen Zellen in der Zellpopulation in mindestens einen SC-β-Zelle induzieren beibehalten . In einigen Ausführungsformen kann die Zeitdauer mindestens 7 Tagen. In einigen Ausführungsformen umfasst die Zeitdauer von 7 Tagen bis 21 Tagen. In einigen Ausführungsformen kann die Zeitdauer umfasst, zwischen 7 und 14 Tagen. In einigen Ausführungsformen kann die Zeitdauer zwischen 10 und 14 Tagen. In einigen Ausführungsformen kann die Zeitdauer umfasst 14 Tage.
In einigen Ausführungsformen werden die β Zellreifungsfaktoren alle zwei Tage erneuert. In einigen Ausführungsformen zumindest 1 % der Insulin-positiven Zellen in der endokrinen Population von Zellen veranlaßt werden, in die SC-β-Zellen zu reifen. In einigen Ausführungsformen mindestens 99% der insulin positive endokrinen Zellen in der Population induziert in SC-β-Zellen zu reifen. In einigen Ausführungsformen wenigstens 30% der erhaltenen Zellen in der Population umfassen SC-β-Zellen. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zellen exprimieren C-Peptid, Insulin, NKX6- 1 Pdxl und koexprimieren NKX6-1 und C-Peptid. In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen exprimieren auch Pdxl und NKX6-! . In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen aus einer Population von pluripotenten Stammzellen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus embryonalen Stammzellen und pluripotenten Stammzellen produziert. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zellen umfassen menschliche Zellen. In einigen Ausführungsformen ist die Erzeugung eines SC-β-Zellen in vitro skalierbar.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung eine isolierte Population von SC-β-Zellen gemäß den hierin beschriebenen Verfahren hergestellt.
In einigen Aspekten stellt die Erfindung ein Mikrokapsel, umfassend eine isolierte Population von SC-β-Zellen darin eingekapselt.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung eine Zusammensetzung, umfassend eine Population von SC-β-Zellen gemäß einem hierin beschriebenen Verfahren hergestellt.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung eines Assays, umfassend eine isolierte Population von SC-β-Zellen gemäß einem hierin beschriebenen Verfahren hergestellt.
In einigen Ausführungsformen ist der Assay zur Verwendung bei der Identifizierung von einer oder mehreren Kandidaten-Mittel, die zu fördern oder zu hemmen, eine β Zellschicksal, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus β-Zellproliferation, β Zellreplikation, β Zelltod, β-Zellfunktion, β Zell Anfälligkeit für Immunangriff oder β-Zelle Anfälligkeit Entdifferenzierung oder Differenzierung. In einigen Ausführungsformen ist der Assay zur Verwendung bei der Identifizierung von einer oder mehreren Kandidaten-Mittel, die die Differenzierung von mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon in mindestens einen SC-β-Zelle zu fördern.
In einigen Aspekten stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der dessen bedarf, wobei das Verfahren die Verabreichung an ein Subjekt eine Zusammensetzung, umfassend eine isolierte Population von SC-β-Zellen gemäß einem hierin beschriebenen Verfahren hergestellt. In einigen Ausführungsformen sind die SC-β-Zellen in einer Mikrokapsel eingekapselt ist. In einigen Ausführungsformen sind die SC-β-Zellen aus einer Population von pluripotenten Stammzellen, die aus dem gleichen Thema, dass die SC-β-Zellen, die verabreicht erhalten produziert. In einigen Ausführungsformen sind die SC-β-Zellen aus einer Population von iPS, wobei die iPS-Zellen von einer Zelle von dem gleichen Gegenstand, die die SC-β-Zellen, die verabreicht abgeleitet worden produziert. In einigen Ausführungsformen weist der Gegenstand oder ein erhöhtes Risiko der Entwicklung von Diabetes. In einigen Ausführungsformen ist der Diabetes aus der Gruppe von Typ-I-Diabetes, Typ-II-Diabetes, Typ-1-Diabetes und .5 Prädiabetes ausgewählt. In einigen Ausführungsformen weist der Gegenstand oder ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer Stoffwechselstörung.
In einigen Aspekten betrifft die Erfindung die Verwendung einer isolierten Population von SC-β-Zellen durch die Verfahren hergestellt nach einem der Ansprüche 41 bis 102 zur Verabreichung an einen Patienten, der dessen bedarf.
In einigen Ausführungsformen kann das isolierte Population von SC-Zellen fi wird dem Subjekt in Mikrokapseln verabreicht. In einigen Ausführungsformen weist der Gegenstand oder ein erhöhtes Risiko der Entwicklung von Diabetes. In einigen Ausführungsformen ist der Diabetes aus der Gruppe von Typ-I-Diabetes, Typ-II-Diabetes, Typ-1-Diabetes und .5 Prädiabetes ausgewählt. In einigen Ausführungsformen weist der Gegenstand oder ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer Stoffwechselstörung.
In einigen Aspekten stellt die Erfindung ein Kulturmedium, umfassend a) ALK5 Inhibitor, b) Trijodthyronin (T3), gegebenenfalls c) Staurosporin und gegebenenfalls d) CMRLS oder eine Komponente CMRLS.
In einigen Aspekten der Offenbarung beinhaltet die Verwendung des Kulturmediums von den in vitro-Reifung von Insulin-positiven endokrinen Zellen in SC-β-Zellen zu induzieren, wobei die SC-β-Zellen weisen sowohl eine in vitro und / oder in vivo GSIS Antwort.
In einigen Aspekten stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines NKX6- 1 - positiven Pankreas-Vorläuferzelle aus einer Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, umfassend das Inkontaktbringen einer Population von Zellen, umfassend Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen unter Bedingungen, die das Zell Förderung Clustering mit mindestens zwei β Zellreifungsfaktoren, enthaltend a) mindestens einem Wachstumsfaktor aus der Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) -Familie, b) einem Sonic-Hedgehog-Signalweg-Inhibitor und gegebenenfalls c) eine geringe Konzentration eines Retinsäure (RA) Signalweg Aktivator für einen Zeitraum von mindestens fünf Tagen, um die Differenzierung von zumindest einem Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in der Population in NKX6- 1 - positiven Pankreas-Vorläuferzellen, wobei die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen exprimieren induzieren NKX6- 1.
100 ng / mL -
In einigen Ausführungsformen kann die Population von Zellen mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration von 1 ng / ml in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen wird die Population von Zellen, die mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration von 50 ng / ml in Kontakt gebracht, in einigen
Ausführungsformen umfasst die zumindest eine Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF). In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie aus der Gruppe bestehend aus FGF2, FGF8b, FGF10, FGF21, und ausgewählt ist. In einigen Ausführungsformen wird die Population von Zellen mit dem RA-Signalweg-Aktivator in Kontakt gebracht. 1 .0 µM - in einigen Ausführungsformen wird die Population von Zellen mit dem RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von zwischen 0,01 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen wird die Population von Zellen mit dem RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 0,1 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen umfasst das RA Signalweg Aktivator RA. In einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem SHH-Pathway-Inhibitor in einer Konzentration von zwischen 0 und 0,5 1 µM µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem SHH-Pathway-Inhibitor in einer Konzentration von 0,25 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen umfasst der SHH-Pathway-Inhibitor Santl.
In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Aussetzen der Population von Zellen, um wenigstens eine zusätzliche β-Zellreifungsfaktor. In einigen Ausführungsformen umfasst die zumindest eine zusätzliche β-Zellreifungsfaktor mindestens einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF. 200 ng ml - in einigen Ausführungsformen wird die Population von Zellen zu dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF mit einer Konzentration von 2 ng / ml ausgesetzt. In einigen Ausführungsformen wird die Population von Zellen zu dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF mit einer Konzentration von 20 ng / ml ausgesetzt. In einigen Ausführungsformen zumindest eine Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF aus der Gruppe bestehend aus EGF und Betacellulin ausgewählt ist. In einigen Ausführungsformen ist die Population von Zellen in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert. In einigen Ausführungsformen sind die Bedingungen, die das Zell aggregierende umfassen ein Suspensionskultur. In einigen Ausführungsformen sind die β-Zelle -maturation Faktoren, jeden zweiten Tag aufgefüllt. In einigen Ausführungsformen ein Aktivator der Proteinkinase C ist nicht auf die Suspensionskultur während 5 Tagen gegeben.
In einigen Ausführungsformen wird ein Aktivator der Proteinkinase C aus der Suspensionskultur vor den 5 Tagen entfernt. In einigen Ausführungsformen der Aktivator von Proteinkinase C umfasst PDBU. In einigen Ausführungsformen wird ein BMP-Signalweg-Inhibitors ist nicht auf die Suspensionskultur während 5 Tagen gegeben. In einigen Ausführungsformen wird ein BMP-Signalweg-Inhibitor aus der Suspensionskultur vor den 5 Tagen entfernt. In einigen Ausführungsformen ist die BMP-Signalweg-Inhibitors umfasst LDN193 1 89. In einigen Ausführungsformen mindestens 10% der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in der Population induziert in NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen zu differenzieren. In einigen Ausführungsformen wenigstens 95% der Pdxl - positiven Pankreas-Vorläuferzellen in der Population induziert in NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen zu differenzieren. In einigen Ausführungsformen, die NKX6- 1 - positive Pankreas-Vorläuferzellen exprimieren Pdxl, NKX6- 1, und Foxa2. In einigen Ausführungsformen werden die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen aus einer Population von pluripotenten Stammzellen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus embryonalen Stammzellen und pluripotenten Stammzellen produziert.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung eine isolierte Population von NKX6- 1 - positiven Pankreas-Vorläuferzellen durch ein hier beschriebenes Verfahren erhalten.
In einigen Ausführungsformen stellt die Offenbarung ein Mikrokapsel, umfassend die isolierte Population von NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen darin eingekapselt.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung eine Zusammensetzung, umfassend eine isolierte Population von N X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen nach einem hierin beschriebenen Verfahren hergestellt.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung eines Assays, umfassend eine isolierte Population von NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen nach einem hierin beschriebenen Verfahren hergestellt.
In einigen Ausführungsformen ist der Assay zur Verwendung bei der Identifizierung von einer oder mehreren Kandidaten-Mittel, die die Differenzierung von zumindest einem Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzelle oder eine Vorstufe davon in NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen zu fördern.
In einigen Aspekten stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der dessen bedarf, wobei das Verfahren die Verabreichung an ein Subjekt eine Zusammensetzung, umfassend eine isolierte Population von NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, hergestellt nach einem beschriebenen Verfahren hierin.
In einigen Ausführungsformen sind die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden aus einer Population von pluripotenten Stammzellen, die aus dem gleichen Gegenstand wie die N X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen zu verabreichen sind, erhalten produziert. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in einer Mikrokapsel eingekapselt ist. In einigen Ausführungsformen weist der Gegenstand oder ein erhöhtes Risiko der Entwicklung von Diabetes. In einigen Ausführungsformen ist der Diabetes aus der Gruppe von Typ-I-Diabetes, Typ-II-Diabetes, Typ-1-Diabetes und .5 Prädiabetes ausgewählt. In einigen Ausführungsformen weist der Gegenstand oder ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer Stoffwechselstörung.
In einigen Aspekten betrifft die Erfindung die Verwendung einer isolierten Population von NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen durch die Verfahren hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 13 142 zur Differenzierung in SC-β-Zellen.
In einigen Aspekten der Offenbarung beinhaltet die Verwendung einer isolierten Population von NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen durch ein hierin zur Verabreichung an einen Patienten, der dessen bedarf, beschriebenen Verfahren hergestellt.
In einigen Ausführungsformen kann das isolierte Population von NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen wird dem Subjekt in Mikrokapseln verabreicht. In einigen Ausführungsformen weist der Gegenstand oder ein erhöhtes Risiko der Entwicklung von Diabetes. In einigen Ausführungsformen ist der Diabetes aus der Gruppe von Typ-I-Diabetes, Typ-II-Diabetes, Typ-1-Diabetes und .5 Prädiabetes ausgewählt. In einigen Ausführungsformen weist der Gegenstand oder ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer Stoffwechselstörung.
In einigen Aspekten stellt die Erfindung ein Kulturmedium, umfassend a) KGF, b) SANT1) und gegebenenfalls c) RA, wobei das Kulturmedium im Wesentlichen frei von PDBu und LDN 1931 89. In einigen Ausführungsformen, wobei die Offenbarung die Verwendung des Kulturmediums nach Anspruch 160, die in vitro Differenzierung von Pankreas-Vorläufer Pdxl -positiven cel ls in NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen zu induzieren.
In einigen Aspekten stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Insulin-positiven endokrinen Zelle aus einem N X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, umfassend das Inkontaktbringen einer Population von Zellen, umfassend NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen unter Bedingungen, fördern die Zell Clustering mit mindestens zwei β Zellreifungsfaktoren, umfassend a) einen TGF-β-Signalweg-Inhibitor und b) Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator, um die Differenzierung von zumindest einem NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzelle in dem veran Population in mindestens einen Insulin-positiven endokrinen Zelle, wobei das Insulin-positive pankreatische Vorläuferzelle Insulin exprimiert. 100 µM - in einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von zwischen 100 nm in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 10 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalwegs umfasst TGF-β-Rezeptor Typ I-Kinase-Signalweg.
In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors umfasst ALK5 Inhibitor II. 10 µM - in einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von zwischen 0,1 µ kontaktiert. In einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 1 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen das Schilddrüsenhormon-Signalweg Aktivator Trijodthyronin (T3). In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Inkontaktbringen der Population von Zellen mit mindestens einer zusätzlichen β-Zellreifungsfaktor. In einigen Ausführungsformen umfasst die zumindest eine zusätzliche β-Zellreifungsfaktor einen γ-Sekretase-Inhibitor. 10 µM - in einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit der γ-Sekretase-Inhibitor in einer Konzentration zwischen 0,1 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit der γ-Sekretase-Inhibitor in einer Konzentration von 1 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen umfasst die γ-Sekretase-Inhibitor XXL In einigen Ausführungsformen umfasst die γ-Sekretase-Inhibitor DAPT. In einigen Ausführungsformen umfasst die zumindest eine zusätzliche β-Zellreifungsfaktor mindestens einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF.
200 ng / mL - in einigen Ausführungsformen wird die Population von Zellen, die mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF mit einer Konzentration von 2 ng / ml in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit zumindest einem Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF mit einer Konzentration von 20 ng / ml in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF umfasst Betacellulin. In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF EGF umfasst. In einigen Ausführungsformen umfasst die zumindest eine zusätzliche β-Zellreifungsfaktor eine geringe Konzentration eines Retinsäure (RA) Signalweg Aktivator.
Bei einigen Ausführungsformen wird die Population von Zellen mit dem RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von zwischen 0,01 µM kontaktiert - 1 .0 µM In einigen Ausführungsformen wird die Population von Zellen mit dem RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 0,1 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen umfasst das RA Signalweg Aktivator RA. In einigen Ausführungsformen umfasst die zumindest eine zusätzliche β-Zellreifungsfaktor einen sonic hedgehog (SHH) pathway inhibitor. In einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem SHH-Pathway-Inhibitor in einer Konzentration von zwischen 0,1 und 0,5 µM µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem SHH-Pathway-Inhibitor in einer Konzentration von 0,25 µM in einigen Ausführungsformen kontaktiert, umfasst der SHH-Pathway-Inhibitor Sant 1. In einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation gegebenenfalls mit einem Proteinkinaseinhibitor in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen wird die Population von Zellen, nicht mit dem Proteinkinaseinhibitor in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem Proteinkinaseinhibitor in Kontakt gebracht.
1 µM - in einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem Proteinkinaseinhibitor in einer Konzentration von zwischen 10 nm kontaktiert. In einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem Proteinkinaseinhibitor in einer Konzentration von 100 nM in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen umfasst das Protein-Kinase-Inhibitor Staurosporin. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Aussetzen der Population von Zellen auf Glukose. In einigen Ausführungsformen wird die Population von Zellen ausgesetzt sind, um zu einer Konzentration von 1 mM Glucose - 50 mM. In einigen Ausführungsformen wird die Population von Zellen ausgesetzt bei einer Konzentration von 25 mM Glucose. In einigen Ausführungsformen sind die Bedingungen, die das Zell aggregierende umfassen ein Suspensionskultur. In einigen Ausführungsformen wird die Population von Zellen in Suspensionskultur für einen Zeitraum, der ausreicht, um die Differenzierung von zumindest einem der NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in der Population in einem Insulin-positiven endokrinen Zelle induzieren gehalten. In einigen Ausführungsformen ist der Zeitraum von mindestens 7 Tagen.
In einigen Ausführungsformen sind die β-Zellreifungsfaktoren Rep! enis ed in der Suspensionskultur jeden zweiten Tag. In einigen Ausführungsformen mindestens 15% der NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in der Population dazu gebracht werden, in Insulin-positiven endokrinen Zellen zu differenzieren. In einigen Ausführungsformen wenigstens 99% der NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in der Population dazu gebracht werden, in Insulin-positiven endokrinen Zellen zu differenzieren. In einigen Ausführungsformen sind die insulin positive endokrinen Zellen exprimieren Pdx l, NKX6- 1 NKX2-2, MAFB, glis3, Surl, Kir6.2, ZnT8, SLC2A 1, SLC2A3 und / oder Insulin. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen aus einer Population von pluripotenten Stammzellen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus embryonalen Stammzellen und pluripotenten Stammzellen produziert.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung eine isolierte Population von Insulin-positiven endokrinen Zellen gemäß einem hierin beschriebenen Verfahren hergestellt.
In einigen Aspekten stellt die Erfindung ein Mikrokapsel, umfassend die isolierte Population von Insulin-positiven endokrinen Zellen darin eingekapselt. In einigen Ausführungsformen stellt die Offenbarung eine Zusammensetzung, umfassend eine Population von Insulin positive endokrinen Zellen gemäß einem hierin beschriebenen Verfahren hergestellt.
In einigen Aspekten stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der dessen bedarf, wobei das Verfahren die Verabreichung an ein Subjekt eine Zusammensetzung, umfassend eine isolierte Population von Insulin-positiven Zellen endocrme gemäß einem hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde,
In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen werden aus einer Population von pluripotenten Stammzellen, die aus dem gleichen Individuum erhalten wurde, wie die insulin positive endokrinen Zellen verabreicht produziert. In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven Zellen in einem endokrinen Mikrokapsel eingekapselt ist. In einigen Ausführungsformen weist der Gegenstand oder ein erhöhtes Risiko der Entwicklung von Diabetes. In einigen Ausführungsformen ist der Diabetes aus der Gruppe von Typ-I-Diabetes, Typ-II-Diabetes, Typ-1-Diabetes und Prädiabetes, 5 ausgewählt ist. In einigen Ausführungsformen weist der Gegenstand oder ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer Stoffwechselstörung.
In einigen Aspekten der Offenbarung beinhaltet die Verwendung einer isolierten Population von Insulin-positiven endokrinen Zellen von einer hierin zur Differenzierung in SC-β-Zellen beschriebenen Verfahren hergestellt.
In einigen Aspekten der Offenbarung beinhaltet die Verwendung einer isolierten Population von Insulin-positiven endokrinen Zellen von einer hierin zur Verabreichung an einen Patienten, der dessen bedarf, beschriebenen Verfahren hergestellt.
In manchen Ausführungsformen ist die isolierte Population von Insulin-positiven endokrinen Zellen wird dem Subjekt in Mikrokapseln verabreicht. In einigen Ausführungsformen weist der Gegenstand oder ein erhöhtes Risiko der Entwicklung von Diabetes. In einigen Ausführungsformen ist der Diabetes aus der Gruppe von Typ-I-Diabetes, Typ-II-Diabetes, Typ-1-Diabetes und .5 Prädiabetes ausgewählt. In einigen Ausführungsformen weist der Gegenstand oder ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer Stoffwechselstörung.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung ein Kulturmedium, umfassend a) TGF-β-Signalweg-Inhibitor, b) einem TH-Weg-Aktivator und mindestens einer zusätzlichen β Zellreifungsfaktor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) XXI, ii) Betacellulin, Hallo) eine niedrige Konzentration eines RA Signalweg Aktivator und iv) einem SHH-Pathway-Inhibitor.
In einigen Aspekten der Offenbarung beinhaltet die Verwendung des Kulturmediums nach Anspruch 221, die in vitro Differenzierung von NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Insulin-positiven endokrinen Zellen zu induzieren.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Erzeugen von SC-β-Zellen, umfassend: Inkontaktbringen Pdxl -positive, N X6- 1 -positive, Insulin positive endokrinen Zellen unter Bedingungen, die das Zellclustern fördern i) einem transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β) Signalweg-Inhibitors, ii) ein Schilddrüsenhormon-Signalweg Aktivator und gegebenenfalls iii) ein Protein-Kinase-Inhibitor, um die in vitro-Reifung von zumindest einigen der Pdxl -positive, NKX6- 1 veran - positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen in SC-β-Zellen, wobei die SC-β Zellen eine GSIS Antwort in vitro und / oder in vivo.
In einigen Ausführungsformen die GSIS Reaktion beobachtet wird (i) unmittelbar nach der Transplantation des SC-β-Zelle in einem Subjekt; (ii) innerhalb von etwa 24 Stunden nach der Transplantation in einen Patienten; oder (iii) innerhalb von etwa zwei Wochen nach der Transplantation in einem Subjekt. In einigen Ausführungsformen die SC-β Zellen eine Antwort auf (i) mindestens eine Glucoseprovokation; (ii) mindestens zwei aufeinander Glucose Herausforderungen; oder (iii) mindestens drei aufeinanderfolgenden Glucose Herausforderungen. In einigen Ausführungsformen auch die Morphologie der SC-β-Zellen gleicht, die Morphologie von endogenen β-Zellen. In einigen Ausführungsformen die Pdxl - 100 µM - positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen werden mit dem TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von zwischen 100 nm in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, N X6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen werden mit dem TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 10 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalwegs umfasst TGF-β-Rezeptor Typ I-Kinase-Signalweg.
In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors umfasst ALK5 Inhibitor II. 10 µM - in einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen werden mit dem Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von zwischen 0 1 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen die Pd 1 -positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen werden mit dem Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 1 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen das Schilddrüsenhormon-Signalweg Aktivator Triiodthyronin (T3). In einigen Ausführungsformen die Pdx 1 -positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen werden nicht mit dem Proteinkinaseinhibitor in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen werden mit dem Proteinkinaseinhibitor in Kontakt gebracht. 1 µM - in einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, N X6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen werden mit der Proteinkinase-Inhibitor in einer Konzentration zwischen 10 nM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen die Pdxl - positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen werden mit dem Proteinkinaseinhibitor in einer Konzentration von 100 nM in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen umfasst das Protein-Kinase-Inhibitor Staurosporin. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Kontaktieren der Pdxl -positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen mit einem Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) -Inhibitor. In einigen Ausführungsformen die Pdxl - positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen werden mit dem CFTR-Inhibitor in einer Konzentration von zwischen 100 nm und 100 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, NKX6- 1 - positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen werden mit dem CFTR-Inhibitor in einer Konzentration von 10 nM und 10 & mgr; M in Berührung gebracht. In einigen Ausführungsformen umfasst das CFTR-Inhibitor Gly-Hl O1.
In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Kontaktieren des Pdx 1 -positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen mit einem O- GlcNAcase Inhibitor. In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen werden mit dem O-GlcNAcase Inhibitor in einer Konzentration von zwischen 100 nm und 100 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen werden mit dem O-GlcNAcase Inhibitor in einer Konzentration zwischen 10 nM und 10 & mgr; M in Berührung gebracht. In einigen Ausführungsformen der Inhibitor von O-GlcNAcase umfasst Thiamet G. in einigen Ausführungsformen die Pdxl - positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert. In einigen Ausführungsformen umfasst das geeignete Kulturmedium
Connought Medical Research Laboratories 1066 ergänzt Insel Medien (CMRLS) oder eine Komponente CMRLS. In einigen Ausführungsformen wird die CMRLS supplementiert mit Serum. ! r einige Ausführungsformen, die CMRLS wird mit 10% fötalem Rinderserum. In einigen Ausführungsformen sind die Bedingungen, die das Zell aggregierende umfassen Suspensionskultur. In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, N X6-1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen in einer Suspensionskultur für einen Zeitraum, der ausreicht, um die in vitro-Reifung von zumindest einigen der Pdxl -positive, N induzieren beibehalten X6- 1 -positiven, Insulin-positiven endokrinen Zellen in SC-β-Zellen. In einigen Ausführungsformen kann die Zeitdauer mindestens 7 Tagen. In einigen Ausführungsformen umfasst die Zeitdauer von 7 Tagen bis 21 Tagen. In einigen Ausführungsformen kann die Zeitdauer umfasst, zwischen 7 und 14 Tagen. In einigen Ausführungsformen kann die Zeitdauer umfasst 14 Tage. In einigen Ausführungsformen wird die Suspensionskultur jeden zweiten Tag erneuert. In einigen Ausführungsformen mindestens 30% der Zellen erzeugten umfassen SC-β-Zellen.
In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zellen exprimieren C-Peptid, Insulin, NKX6- 1 Pdxl und koexprimieren NKX6- 1 und C-Peptid. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zellen umfassen menschliche Zellen. In einigen Ausführungsformen ist die Erzeugung der SC-β-Zellen in vitro skalierbar.
In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven, endokrinen Zellen durch Inkontaktbringen Pdxl -positiven erhaltenen N X6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen unter Bedingungen, die Zellklumpen mit i) einer TGF-β-Signalweg-Inhibitor und ii Förderung) ein Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator, um die Differenzierung von zumindest einigen der Pdxl -positiven in Pdxl induzieren NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen - positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen, wobei die Pdxl -positiven, NKX6- 1 -positiven, Insulin-positiven endokrinen Zellen exprimieren Pdxl, N X6- 1, N X2-2, af, glis3, Surl, ir6.2, ZnT8, SLC2A 1, SLC2A3 und / oder Insulin.
100 µM -
In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, N X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von zwischen 100 nm in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 10 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalwegs umfasst TGF-β-Rezeptor Typ I-Kinase-Signalweg. In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors umfasst ALK5 Inhibitor II. 10 µM - in einigen Ausführungsformen die Pd l -positive, NKX6- 1 - positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von zwischen 0,1 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen die Pdx l -positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 1 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen das Schilddrüsenhormon-Signalweg Aktivator Trijodthyronin (T3).
In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Kontaktieren der Pdxl -positiven NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit mindestens einem von i) einem SHH-Pathway-Inhibitor, ii) eine RA Signalweg Aktivator iii) einer γ-Sekretase-Inhibitor, iv) mindestens einen Wachstumsfaktor aus epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) Familie und gegebenenfalls v) einem Proteinkinase-Inhibitor. In einigen Ausführungsformen die Pdxl - positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem SHH-Pathway-Inhibitor in einer Konzentration von zwischen 0,1 µ und 0,5 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit einem SHH-Pathway-Inhibitor in einer Konzentration von 0,25 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen umfasst der SHH-Pathway-Inhibitor Sant 1. 1,0 µM - in einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von zwischen 0,01 µ kontaktiert. In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 0,1 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen umfasst das RA Signalweg Aktivator RA. 10 µM - in einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem γ- Sekretase-Inhibitor in einer Konzentration von zwischen 0,1 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem γ- Sekretase-Inhibitor in einer Konzentration von 1 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen umfasst die γ-Sekretase-Inhibitor XXI. In einigen Ausführungsformen umfasst die γ-Sekretase-Inhibitor DAPT. 200 ng / mL - in einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF mit einer Konzentration von 2 ng / ml in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen die Pdxl - positive, N X6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF mit einer Konzentration von 20 ng / ml in Kontakt gebracht. Bei einigen
Ausführungsformen, die zumindest eine Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF umfasst Betacellulin. In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF EGF umfasst. In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, NKX6-1 - positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden nicht mit dem Proteinkinaseinhibitor in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen die Pdxl - positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem Proteinkinaseinhibitor in Kontakt gebracht. 1 µM - in einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, N X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit der Proteinkinase-Inhibitor in einer Konzentration zwischen 10 nM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, N X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem Proteinkinaseinhibitor in einer Konzentration von 100 nM in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen umfasst das Protein-Kinase-Inhibitor Staurosporin. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Aussetzen der Population von Zellen auf Glukose. In einigen Ausführungsformen wird die Population von Zellen ausgesetzt sind, um zu einer Konzentration von 1 mM Glucose - 50 mM. In einigen Ausführungsformen wird die Population von Zellen ausgesetzt bei einer Konzentration von 25 mM Glucose. In einigen Ausführungsformen sind die Bedingungen, die das Zell aggregierende umfassen Suspensionskultur.
In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in einer Suspensionskultur für einen Zeitraum, der ausreichend gehalten, um die Differenzierung von zumindest einigen der Pdxl -positiven induzieren NKX6- 1 - positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pdxl -positive, NKX6- 1 - positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen. In einigen Ausführungsformen ist der Zeitraum von mindestens 7 Tagen. In einigen Ausführungsformen wird die Suspensionskultur jeden zweiten Tag erneuert. In einigen Ausführungsformen wenigstens 15% des Pdxl -positiven werden NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen induziert in Pdxl -positive, NKX6- 1 unterscheiden - positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen. In einigen Ausführungsformen wenigstens 99% des Pdxl -positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen induziert werden, um in Pdxl - positive, NKX6-1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen zu differenzieren.
In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden durch Kontaktieren Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen unter Bedingungen erhalten wird, die Zellklumpen mit i) mindestens einem Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie zu fördern, ii) wenigstens ein SHH-Pathway-Inhibitor und gegebenenfalls iii) geringe Konzentrationen eines RA Signalweg Aktivator für einen Zeitraum von fünf Tagen, die Differenzierung von zumindest einigen der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pdxl -positive, NKX6- induzieren 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, wobei die Pdxl -positive, NKX6- 1 - positive Pankreas-Vorläuferzellen exprimiert Pdxl und NKX6- 1.
100 ng / mL -
In einigen Ausführungsformen sind die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration von 1 ng mL kontaktiert. In einigen Ausführungsformen sind die Pdxl - positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit dem mindestens einen Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration von 50 ng / mL in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen weist der zumindest eine Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie Keratinozyten-Wachstumsfaktor (GF). In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie aus der Gruppe bestehend aus FGF2, FGF8b, FGF10, FGF21, und ausgewählt ist. In einigen Ausführungsformen werden die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit der mindestens einen SHH-Pathway-Inhibitor in einer Konzentration von zwischen 0,1 und 0,5 µM µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen werden die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit der mindestens einen SHH-Pathway-Inhibitor in einer Konzentration von 0,25 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen umfasst die zumindest eine SHH pathway inhibitor Sant 1.
1 .0 µM - in einigen Ausführungsformen werden die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit der RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von zwischen 0,01 µ kontaktiert. In einigen Ausführungsformen werden die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit der RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 0,1 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen umfasst das RA Signalweg Aktivator RA. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Kontaktieren der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit mindestens einem Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF. 200 ng / mL - in einigen Ausführungsformen werden die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF mit einer Konzentration von 2 ng / ml in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen werden die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF mit einer Konzentration von 20 ng / ml in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF umfasst Betacellulin. In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF EGF umfasst. Bei einigen
Ausführungsformen werden die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert. In einigen Ausführungsformen sind die Bedingungen, die das Zell aggregierende umfassen Suspensionskultur. In einigen Ausführungsformen wird die Suspensionskultur jeden zweiten Tag erneuert. In einigen Ausführungsformen ein Aktivator der Proteinkinase C ist nicht auf die Suspensionskultur während 5 Tagen gegeben. In einigen Ausführungsformen wird ein Aktivator der Proteinkinase C aus der Suspensionskultur vor den 5 Tagen entfernt. In einigen Ausführungsformen der Aktivator von Proteinkinase C umfasst PDBU. In einigen Ausführungsformen wird ein BMP-Signalweg-Inhibitors ist nicht auf die Suspensionskultur während 5 Tagen gegeben. In einigen Ausführungsformen wird ein BMP-Signalweg-Inhibitor aus der Suspensionskultur vor den 5 Tagen entfernt. In einigen Ausführungsformen umfasst das BMP-Signalweg-Inhibitors LD 1931 89. In einigen Ausführungsformen mindestens 10% der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in der Population induziert in Pdxl -positive, NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen zu differenzieren.
In einigen Ausführungsformen wenigstens 95% der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen induziert werden, um in Pdxl -positiven Differenzierung NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Erzeugen von SC-β-Zellen von pluripotenten Zellen, wobei das Verfahren umfasst: a) Differen pluripotenten Stammzellen in einer Population in Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen; b) Differenzieren zumindest einige der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pd 1 - positive, NKX6- 1 - bv positive Pankreas-Vorläuferzellen ist ein Verfahren des Contactin die Pdxl -nositive Pankreas-Vorläuferzellen unter Bedingungen, die das Zellclustern zu fördern i) mindestens einem Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie, ii) mindestens einem SHH-Pathway-Inhibitor und gegebenenfalls iii) eine RA Signalweg Aktivator, jeden zweiten Tag über einen Zeitraum von fünf Tagen, um die Differenzierung von zumindest einigen der zu induzieren Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in der Population in NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, wobei die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen exprimiert Pdxl und NKX6- 1; c) Differenzieren zumindest eines Teils des Pdxl -positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pdxl -positive, N X6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen durch ein Verfahren des Kontaktierens der Pdxl -positive, NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen unter Bedingungen, die das Zellclustern i) einen TGF-β-Signalweg-Inhibitor, b) einem TH-Signalwegs Aktivator und gegebenenfalls c) mindestens einem SHH-Pathway-Inhibitor, ii) eine RA Signalweg Aktivator zu fördern, iii) einen y-Sekretase-Inhibitor, und vi) mindestens einem Wachstumsfaktor aus der (EGF) Familie des epidermalen Wachstumsfaktors, jeden zweiten Tag über einen Zeitraum von fünf bis sieben Tage, um die Differenzierung von zumindest einigen der Pdxl induzieren - positive , NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pd 1 -positive, NKX6- 1, Insulin-positiven endokrinen Zellen, wobei die Pdxl -positive, NKX6-1, Insulin-positiven endokrinen Zellen exprimieren Pdxl, NKX6- 1, NKX2-2 , MAFB, glis3, Surl, Kir6.2, ZnT8, SLC2A 1, SLC2A3 und / oder Insulin; und d) Differenzieren zumindest eines Teils des Pdxl - positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen in SC-β-Zellen durch ein Verfahren des Kontaktierens des Pdxl -positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen unter Bedingungen, die das Zellclustern i fördern) einen transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β) Signalweg-Inhibitors, ii) ein Schilddrüsenhormon-Signalweg Aktivator und gegebenenfalls iii) ein Protein-Kinase-Inhibitor, jeden zweiten Tag über einen Zeitraum von sieben und 14 Tagen, um die in vitro-Reifung von zumindest einigen der Pdxl -positiven induzieren NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen in SC-β-Zellen, wobei die SC-β Zellen eine GSIS Antwort in vitro und / oder in vivo.
In einigen Ausführungsformen stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Erzeugen von SC- β-Zellen von pluripotenten Zellen, wobei das Verfahren umfasst: a) Differenzieren zumindest einige pluripotenten Zellen in einer Population in Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen; b) Differenzieren zumindest einige der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pdxl - positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen durch ein Verfahren des Kontaktierens der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen unter Bedingungen, die das Zell aggregierende mit i) KGF, ii) Santl und gegebenenfalls iii) geringe Konzentrationen von RA, jeden zweiten Tag über einen Zeitraum von fünf Tagen, um die Differenzierung von zumindest einer Pdx 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in der Population in NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen zu induzieren, wobei die NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen exprimiert Pdxl und NKX6- 1; c) Differenzieren zumindest eines Teils des Pdxl -positive, NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pdxl -positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen durch ein Verfahren des Kontaktierens des Pdxl -positive, NKX6-1 - positive Pankreas-Vorläuferzellen, die mit i) ALK5 Inhibitor II, II) T3, und gegebenenfalls iii) Santl, iv) RA, v) XXI und vi) Betacellulin, jeden zweiten Tag über einen Zeitraum von fünf bis sieben Tage, um die Differenzierung zu induzieren wenigstens einiger OFTHE Pdxl -positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pdxl - positive, NKX6- 1, Insulin-positiven endokrinen Zellen, wobei die Pdxl -positive, N X6- 1, Insulin-positiven endokrinen Zellen exprimieren Pdxl , NKX6- 1, NKX2-2, MAFB, glis3, Sur l, Kir6.2, ZnT8, SLC2A 1, SLC2A3 und / oder Insulin; und d) Differenzieren zumindest eines Teils des Pdxl -positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen in SC-β-Zellen durch ein Verfahren des Kontaktierens des Pdxl -positive, N X6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen unter Bedingungen, die das Zell aggregierende mit i) ALK5 Inhibitor II, II) T3, und gegebenenfalls iii) Staurosporin, jeden zweiten Tag über einen Zeitraum von sieben bis 14 Tagen, um die in vitro-Reifung von zumindest einigen der Pdxl induzieren - positive, N X6- 1 -positive, insulinproduzierenden endokrinen Zellen in SC-β-Zellen, wobei die SC-β Zellen eine GSIS Antwort in vitro und / oder in vivo.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung eine künstliche Insel aus SC-β-Zellen di fferentiated in vitro aus pluripotenten Stammzellen.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung ein künstliches Pankreas, das SC-β-Zellen in vitro aus pluripotenten Stammzellen differenziert.
Die Praxis der vorliegenden Erfindung werden typischerweise, wenn nichts anderes angegeben ist, herkömmliche Techniken der Zellbiologie, Zellkultur, Molekularbiologie, transgenen Biologie, Mikrobiologie, rekombinante Nukleinsäure (zB DNA) -Technologie, der Immunologie und der RNA-Interferenz (RNAi), die innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns liegen. Ausubel, F., et al, (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols in Immunology, Current Protocols in Protein Science und Current Protocols:. Nicht einschränkende Beschreibungen bestimmter dieser Techniken sind in den folgenden Veröffentlichungen in Cell Biology, alle John Wiley & Sons, NY, Ausgabe vom Dezember 2008; Sambrook, Russell, und Sambrook, Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, 3. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001; Harlow, E. und Lane, D., Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988; Freshney, RI, „Culture of Animal Cells, ein Handbuch der Grundtechnik", 5. Aufl., John Wiley & Sons, Hoboken, NJ 2005.
Nicht einschränkende Informationen über therapeutische Mittel und menschliche Krankheiten in Goodman und Gilman ist die pharmakologische Basis of Therapeutics Treffer 1 1 th Ed., McGraw Hill, 2005 Katzung, B. (Hrsg. ) Basic and Clinical Pharmacology, McGraw-Hill / Appleton & Lange; 1 0. ed. (2006) oder 1 1 th Ausgabe (Juli 2009). Nicht einschränkende Informationen über Gene und genetischen Störungen in McKusick, VA gefunden: in Man Mendelschen Vererbung. Ein Katalog der menschlichen Gene und genetischen Störungen. Baltimore: Johns Hopkins University Press, 1 98 (12. Auflage) oder der neueren Online-Datenbank: Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM ™. McKusick- Nathans Institut für Genetische Medizin, Johns Hopkins University (Baltimore, MD) und National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, MD), als der 1. Mai 2010, World Wide Web URL: http: // www .ncbi.nlm.nih.gov / MIM / und in Online Mendelian Inheritance in Tiere (OMIA), einer Datenbank von Genen, Erbkrankheiten und Charakterzüge in Tierarten (mit Ausnahme von Mensch und Maus), an http://omia.angis.org.au/contact.shtml. Alle Patente, Patentanmeldungen und andere Publikationen (zB wissenschaftliche Artikel, Bücher, Websites und Datenbanken) die hier erwähnt werden durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen. Im Falle eines Konflikts zwischen der Spezifikation und einer der einbezogenen Referenzen, die Spezifikation (einschließlich aller Änderungen davon, die an einem eingebauten Referenz basieren kann), Vorrang. Standard Kunst- anerkannten Bedeutungen der Begriffe hierin verwendet, sofern nicht anders angegeben. Standardabkürzungen für die verschiedenen Begriffe werden hier verwendet.
Figurenliste
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1A und 1B zeigen Vergleiche zwischen einem zuvor veröffentlichten Steuerdifferenzierung Verfahren und eine neue gerichteten Differenzierung Methode. FEIGE. 1 A zeigt eine schematische Vergleichen eines Ausführungs gerichtete Differenzierung Verfahren der Offenbarung zum Erzeugen INS + -Zellen aus HPSC Vergleich zu einer früher veröffentlichten Steuerunterscheidungsverfahren. FEIGE. I B zeigt histologische Schnitte von HUES8 undifferenzierten (oben), DE (Mitte) unterschieden, und differenziert, um PP 1 (unten) und gefärbt mit OCT4, SOX 17 und PDX 1, jeweils mit einem zuvor veröffentlichten Steuerdifferenzierungsmethode. Maßstabsbalken = 100 ^ iM. In den 2A, 2B und 2C zeigen, dass Stammzellen abgeleiteten β (SC-β-Zellen) in vitro generiert sekretieren Insulin in Reaktion auf mehrere aufeinander hohen Glucose Herausforderungen wie primäre menschliche β-Zellen. FEIGE. 2A, 2B und 2C sind Diagramme, die ELISA-Messungen an sezerniertem menschlichen Insulins aus SC-β (2A), primäre β-Zellen (2B) und PH-Zellen (2C) in Frage nacheinander mit 2, 20, 2 , 20, 2 und 20 mM Glucose. Nach aufeinanderfolgenden hohen / niedrigen Glukose Herausforderungen wurden die Zellen mit 30 mM KC1 depolarisiert.
3A, 3B und 3C zeigen, zusätzliche biologische Replikaten in vrtro abgeleiteten SC-β-Zellen, die Insulin als Reaktion auf mehrere aufeinander hohen Glucose Herausforderungen wie primäre β-Zellen sezernieren. Die linken Platten sind die gleichen wie in 2. Zellen SC-β-Zellen (SC-β, 3A), primäre β-Zellen (1 & deg; β, 3B) und PH-Zellen (3C) wurden nacheinander mit gefordert 2, 20, 2, 20, 2, und 20 mM Glucose und 30 mM KC1 und Humaninsulin mit ELISA gemessen.
4A, 4B, 4C, 4D und 4E zeigen, dass SC-β-Zellen Fluss cytosolischen Ca2+ in Reaktion auf mehrere aufeinanderfolgende hohe Glukose Herausforderungen wie primäre β-Zellen. FEIGE. 4A ist eine schematische Darstellung der Bevölkerungsebene und Einzelzellebene Nachweis von cytosolischen Ca2+ mit Fluo-4.00-Färbung. Bevölkerungsebene Messungen wurden an einzelnen ganzen Cluster (von großen roten Kreis in schema markiert), und einzelne Zellen innerhalb intakten Cluster (durch kleine rote Kreise markiert) wurden für die Einzelzellanalyse analysiert gemacht. FEIGE. 4B ist eine graphische Darstellung Population Messungen der dynamischen normalisierten Fluo-4 Fluoreszenzintensität für SC-β-Zellen, primäre β-Zellen und PH Zellen inokuliert nacheinander mit 2, 20, 2, 20, 2 und 20 mM Glucose und 30 mM KC1. FEIGE. 4C zeigt Fluoreszenzbilder von Fluo-4.00-Färbung in Einzelzellanalyse eingesetzt. FEIGE. 4D zeigt repräsentative Bilder der Lage der einzelnen Zellen, die 3 (gelb) reagiert, 2 (orange), 1 (blau) und 0 (rot) Glukose Herausforderungen. FEIGE. 4E zeigt grafische Quantifizierung der Frequenz SC-β-Zellen (n = 156), primäre β-Zellen (n = 114) und PH-Zellen (n = 138), die mit 20 mM Glucose reagiert. Maßstabsbalken = 100 µιτι.
5A, 5B, 5C, 5D, 5E und 5F zeigen, dass SC-β menschlichen β Zellmarker an Protein und Genexpressionsebene auszudrücken. FEIGE. 5A zeigt die Immunhistochemie Bilder von Zellen für das C-Peptid (grün) angefärbt, N X6- 1 (rot) und Somatostatin (grau). FEIGE. 5B zeigt die Immunhistochemie Bilder von Zellen für das C-Peptid (grün) und PDX1 (rot) gefärbt. FEIGE. 5C zeigt die Immunhistochemie Bilder von Zellen für das C-Peptid (grün) und Glucagon (rot) mit dem entsprechenden DAPI-Färbung (blau) gefärbt. FEIGE. 5D zeigt repräsentative Durchflusszytometrie Dot-Plots und Bevölkerungsprozentsätze von Zellen für die C- Peptid und NKX6- 1 gefärbt. FEIGE. 5E zeigt hierarchische Clusteranalyse auf der Grundlage aller von Microarray von undifferenzierten HUES8, PH cel ls, fötalen β-Zellen und Erwachsenen primäre β-Zellen, sortiert nach INS (Daten aus Hrvatin et al Gene. ( Hrvatins et al., 2014)), und SC-β-Zellen (SC-β) sortiert für INS und NKX6-1. FEIGE. 5F zeigt einen Wärmekarte der 100 Gene mit den meisten Varianz in allen Proben. CP = C-Peptid, Somatostatin SST =, GCG = Glucagon. Maßstabsbalken = 100 µιη.
6 zeigt die Histologie eines SC-β Zellcluster für DAPI (blau), Insulin (grün), C-Peptid (rot) gefärbt. Maßstabsbalken = 100 µιτι.
7A, 7B und 7C veranschaulichen zusätzliche histologische Anfärbung SC- β-Zellen. FEIGE. 7A veranschaulicht Färbung für C-Peptid (grün) und ISL 1 (rot). FEIGE. 7B veranschaulicht Färbung für C-Peptid (grün) und MAFA (rot). FEIGE. 7C zeigt Färbung für das C-Peptid (grün) und MAFB (rot). Maßstabsbalken = 100 µιη.
8A, 8B und 8C zeigen repräsentative tlow Zytometrie Punktplots und Bevölkerungsprozentsätze der SC-β-Zellen und PH Zellen für C-Peptid und SST (8A), C-Peptid und GCG (8B) und SST und GCG gefärbten (8C).
9A, 9B und 9C zeigen, dass SC-β-Zelle Granulate sind strukturell ähnlich primären humanen β-Zelle Granulate. FEIGE. 9A zeigt elektronenmikroskopische Bilder von Granulaten Hervorhebung Vertreter kristallisiert Insulin Granulate (rot), frühe InsulinGranula (gelb), und gemischte endokrinen Granula (blau). Maßstabsbalken = 500 nm. FEIGE. 9B zeigt Bilder mit höherer Vergrößerung des Granulats in (9A) hervorgehoben. Maßstabsbalken = 500 nm. FEIGE. 9C zeigt elektronenmikroskopische Aufnahmen von Zellen mit Immungoldfärbung, die Granulate, die Insulin (kleiner 5 nm schwarze Punkte) und / oder Glucagon (größer 15 nm schwarze Punkte) enthalten beschriftet. Repräsentative Immungoldpartikel mit roten Pfeilen (Insulin) und blaue Pfeile (Glukagon) hervorgehoben. Maßstabsbalken = 100 nm.
10A und 10B zeigen, dass die Stammzellen abgeleiteten β (SC-β-Zellen) aus hiPSC erzeugt in vitro zu sezernieren Insulin in Reaktion auf mehrere aufeinander hohen Glucose Herausforderungen wie primäre menschliche β-Zellen. FEIGE. 10A und 10B sind Graphen, die ELISA-Messungen an sezerniertem menschlichen Insulins aus SC-β von nichtdiabetischen Zellen erzeugt (10A) und Typ-1-Diabetes-Zellen (10B) herausgefordert nacheinander mit 2, 20, 2, 20, 2, und 20 mM Glucose.
11A, 11B, 11C, 11D, 11E und 11F zeigen repräsentative Durchflusszytometrie Dot-Plots und Bevölkerungsprozentsätze von Zellen, die für C-Peptid-gefärbt und NKX6- 1 aus mehreren hiPSC Linien. 11A, 11B und 11C zeigen repräsentative Durchflusscytometrie-Dot-Plots und Bevölkerungsprozentsätze von Zellen, die für das C-Peptid und N X6- 1 gefärbt aus nicht diabetischen hiPSC Leitungen. 11D, 11E und 11F zeigen repräsentative Fluss c trie Dot-Plots und Bevölkerungsprozentsätze von Zellen, die für C-Peptid-gefärbt und NKX6- 1 vom Typ 1 Diabetiker hiPSC Linien.
12A, 12B, 12C und 12D zeigen, dass transplantierte SC-β-Zellen schnell funktionieren auch in vivo. FEIGE. 12A ist ein Diagramm, ELISA-Messungen von menschlichem Insulin aus dem Serum von einzelnen Mäusen, die mit SC-β-Zellen (in der letzten Stufe in vitro für 1 Woche kultiviert) transplantiert, primäre menschliche β-Zellen (β) oder PH-Zellen. Messungen wurden vor (weiße Balken) und 30 Minuten nach (schwarze Balken) einem Glucose-Injektion von Mäusen zwei Wochen nach der Transplantation entnommen. FEIGE. 12B zeigt die Immunhistochemie Bilder der Zellen in (12A) transplantiert mit C-Peptid (grün) und PDX 1 (rot) gefärbt, um die Anwesenheit des Transplantats zu bestätigen. FEIGE. 12C ist ein Diagramm, ELISA-Messungen von menschlichem Insulin aus dem Serum von einzelnen Mäusen, die mit Pankreas-Vorläuferzellen transplantiert. Messungen wurden vor (weiße Balken) und 30 Minuten nach (schwarze Balken) einem Glucose-Injektion von Mäusen zwei Wochen nach der Transplantation entnommen. FEIGE. 12D ist ein Diagramm, ELISA-Messungen von menschlichem Insulin aus dem Serum von einzelnen Mäusen, die mit SC-β-Zellen in der letzten Stufe in vitro für 2 Wochen kultiviert transplantiert. Messungen wurden 30 min nach (schwarze Balken) eine Glucose-Injektion von Mäusen zwei Wochen nach der Transplantation entnommen. nb = nicht bestimmt, Maßstab = 100 µm.
13A und 13B veranschaulichen zusätzliche histologische Schnitte von SC-β-Zellen und PH-Zellen in Mäuse 2 wk vor transplantiert. FEIGE. 13A zeigt geringer Vergrößerung Bilder von Transplantaten für DAPI (blau), C-Peptid (grün) und GCG (rot) gefärbt. Maßstabsbalken = 200 & mgr; M. FEIGE. 13B zeigt Bilder mit höherer Vergrößerung von Transplantaten für C-Peptid (grün) und GCG (rot) gefärbt. Maßstabsbalken = 100 & mgr; M.
14A, 14B und 14C zeigen die Verwendung von Medien bei der letzten Stufe der Differenzierung zu ermöglichen SC-β-Zellen, mehr Insulin in vivo zu sezernieren. FEIGE. 14A zeigt eine schematische Darstellung der Verwendung der verschiedenen Medien in den verschiedenen Schritten des Differenzierungsprozesses. FEIGE. 14B zeigt, dass zusätzliche Faktoren, wie Santl, XXI und SSP zur CMRL Medien bei der letzten Stufe der Differenzierung erzeugt eine bessere Glucose stimulierte Insulinsekretion (GSIS) Reaktion von SC-β-Zellen, wie durch Stimulationsindex zwischen hohen und gemessenen niedrige Glukose Herausforderungen. FEIGE. 14C zeigt, dass zusätzliche Faktoren, wie Santl, XXI und SSP zur CMRL Medien bei der letzten Stufe der Differenzierung erzeugt eine bessere Glucose stimulierte Insulinsekretion (GSIS) Reaktion von SC-β-Zellen, wie durch die Menge an Insulin freigesetzt gemessenen .
15A, 15B, 15C 15D, 15E, 15F, 15G, 15H und 15I demonstrieren Modifikationen des Protokolls, das Überleben und die Qualität der SC-β-Zellen erzeugt verbessern können. Figur ist 15A eine schematische Darstellung des Protokoll, 15B zeigt, wie reiner NKX6.1 + endokrine Cluster können unter Verwendung der modifizierten Protokoll erzeugt (1 5B) werden. FEIGE. 15C zeigt, wie die Verwendung eines Rock-Inhibitor in den Schritten 3-5 kann das Überleben der Zelle zu verbessern. FEIGE. 15D zeigt, wie die Verwendung von Activin A mit Nicotinamid kann SOX2 herunterregulieren und verbessern das Überleben der Zelle. FEIGE. 15E zeigt, dass SOX2 und NKX6- 1 gegenseitig ausschließen. FEIGE. 15F zeigt, wie die Verwendung von staurospaurine in Schritt 6 ein in der Nähe von reinen endokrine Bevölkerung und 1 5G veranschaulicht die Verwendung von staurospaurine in Schritt 6 einen höheren Prozentsatz NKX6- 1 / C-Peptid + Zellen. FEIGE. 15I zeigt, wie die Verwendung von XXI in Kombination mit Alk5i und T3 in den Schritten 5-6 erhöht die NeuroD + Population im Vergleich zur Verwendung von nur Alk5i und T3 (15H).
16A, 16B, 16C, 16D, 16E, 16F, 16G, 16H und 16I zeigen, klinischen Nutzen der SC-β-Zellen als Diabetestherapie oder Wirkstoffforschungsplattform. FEIGE. 16A ist eine schematische Darstellung der Nützlichkeit der SC-β-Zellen zur Behandlung von Diabetes oder zum Screenen Medikamenten zur Funktion oder Replikation zu verbessern. FEIGE. 16B ist eine Tabelle, diabetischen Medikamente untersucht und ihre allgemeine therapeutische Kategorie. FEIGE. 16C ist ein Diagramm, ELIS A Messungen von sekretierten menschlichen Insulins aus beschichtetem SC-β-Zellen mit den angegebenen Drogen in 2 und 20 mM Glukose behandelt. Angegebenen p-Werte zu vergleichen, die Insulin-Wert in 20 m Glukose zwischen dem Medikament und der Steuerung. FEIGE. 16D ist eine Immunfluoreszenzbild von dispergierten und plattiert SC-β-Zellen mit DAPI (blau), C-Peptid (Grün) und Ki67 (rot) ohne Behandlung gefärbt. FEIGE. 16E ist eine Immunfluoreszenzbild von dispergierten und plattiert SC-β-Zellen mit DAPI (blau), C-Peptid (Grün) und Ki67 (rot) mit Prolaktin für 48 Stunden behandelt gefärbt. FEIGE. 16F zeigt eine graphische Quantifizierung der Fraktion von Zellen, die C-Peptid und Ki67-coexprimieren. * p <0,05. FEIGE. 16G ist ein Diagramm, Nüchtern-Blutzuckerwerten von Akita Mäusen mit SC-β-Zellen transplantierten (n = 6) oder PH-Zellen (n = 6). * p <0,05 Vergleich der beiden Zellgruppen am selben Tag, 16H ist ein Diagramm, das Blutzuckermessungen von progressiv diabetischen Akita Mäusen mit SC-β-Zellen oder PH-Zellen transplantiert. Messungen wurden vor (weiße Balken) und 20 Minuten nach (schwarze Balken) eine Glucose-Injektion von Mäusen transplantiert 2 Wochen vor genommen. Zuckermessungen wurden bei 550 mg / dl gesättigt. * p <0,05 Vergleich der beiden Zellgruppen gleichzeitig senden Glucose-Injektion. FEIGE. 16I ist ein Diagramm, ELISA-Messungen von menschlichem Insulin aus dem Serum von Akita Mäusen 20 Minuten nach der Glucoseinjektion. Die Mäuse wurden mit Glucose 2 Wochen nach der Transplantation in Frage gestellt. * p <0,05 Vergleich der beiden Zellgruppen. Maßstabsbalken = 50 µιτι.
17 ist ein Diagramm, das Körpergewicht von Akita Mäusen mit SC-β-Zellen transplantierten (n = 6) oder PH-Zellen (n = 6). * p <0.05 Vergleich der beiden Zellgruppen an der 18 und 28 d Zeitpunkt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Aspekte der Offenbarung beziehen sich auf Zusammensetzungen, Verfahren, Kits und Mittel zum Erzeugen von Stammzellen abgeleiteten β (SC-β) Zellen (zB reife Pankreas-β-Zellen) aus mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einer Vorläufer davon (zB, iPS-Zellen, HES, definitive Entodermzellen, Urdarm Schlauchzellen, Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, Pdxl -positive, N X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, Ngn3-positive endokrine Vorläuferzellen, etc.), und SC-β-Zellen von diesen Zusammensetzungen, Verfahren, Kits und Mittel zur Verwendung bei Zelltherapien Assays (zB Arzneimittel-Screening) und verschiedene Behandlungsmethoden hergestellt.
Darüber hinaus Aspekte der Offenbarung beziehen sich auf Verfahren zur Identifizierung der SC-β-Zellen, basierend auf morphologischen Kriterien nachweisbar sind, ohne die Notwendigkeit, einen selektierbaren Marker sowie die funktionellen Eigenschaften, wie die Fähigkeit zur Insulin exprimieren beschäftigen , Insulin absondern als Reaktion auf eine oder mehrere Zucker Herausforderungen, zeigen eine reife GSIS Antwort und organisiert in kleinen Inseln in der Bauchspeicheldrüse in vivo, und haben in der Regel kleine Spindel ähnliche Zellen von etwa 9 - 15 µm Durchmesser.
Darüber hinaus Aspekte der Offenbarung beziehen sich auf Verfahren zum Identifizieren von β-Zellreifunsfaktoren. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird bewusst sein, oder werden ohne weiteres in der Lage, festzustellen, ob eine bestimmte β-Zellreifung Faktor ist funktional in der Technik bekannte Verwendung von Tests zu sein. Beispielsweise die Fähigkeit eines β-Zellreifung Faktor konvertiert mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon auf eine SC-β-Zelle kann unter Verwendung der Assays, wie hierin offenbart bewertet. Anderen geeigneten Tests umfassen das Messen der Fähigkeit, die Transkription eines Reporterkonstrukts, das ein β-Zellmarker-Bindungsstelle operabel an eine Nukleinsäuresequenz eine nachweisbare Marker codiert, wie Luciferase gebunden zu aktivieren. Einem Assay beinhaltet die Bestimmung, ob das Kandidaten β-Zellreifung Faktor induziert mindestens ein Insulin-positiven endokrinen Zelle zu einer SC-β-Zelle zu exprimieren oder Marker einer Zelle oder β aufweisen funktionellen Eigenschaften eines reifen β-Zelle, wie hierin offenbart. Bestimmung solcher Ausdruck β Zellmarker können mit jedem geeigneten Verfahren, beispielsweise Immunoblotting bestimmt werden.
Solche Assays können leicht angepasst werden, um zu identifizieren oder zu bestätigen Aktivität von Mitteln, die direkt an einen SC-β-Zelle konvertiert mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder ein Vorläufer davon ist.
Die in v / <> / ro gereifte, SC-β-Zellen (dh Pankreas β-Zellen) gemäß den hierin beschriebenen demonstrieren viele Vorteile, beispielsweise führen sie Glucose stimulierten Insulinsekretion in vitro erfindungsgemäßen Verfahren erzeugt wird, ähneln menschlichen Insel β-Zellen durch Genexpression und Ultra sekretieren Humaninsulin und verbessern Hyperglykämie, wenn sie in Mäuse transplantiert, eine neue Plattform für die Zelltherapie (zB Transplantation in einen Patienten, der Bedarf an zusätzlichen und / oder funktionelle β-Zellen), Arzneimittel-Screening (zB für die Insulin-Produktion / Sekretion, überleben, Dedifferenzierung, etc.), Forschung (zB Bestimmung der Unterschiede in der Funktion zwischen der normalen und diabetischen β-Zellen) und Gewebetechnik (beispielsweise unter Verwendung der SC-β-Zellen, wie die erste Zelle Geben Sie bei der Rekonstruktion eine kleine Insel).
DEFINITIONEN
Der Bequemlichkeit halber hier verwendet bestimmte Begriffe, die in der Beschreibung, den Beispielen und den beigefügten Ansprüchen wird aufgefangen. Wenn nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hierin verwendet werden, haben die gleiche Bedeutung wie sie üblicherweise von einem Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird.
Der Begriff „differenzierte Zelle“ ist jede Primärzelle, die nicht gemeint ist, in seiner nativen Form wird pluripotenter als dieser Begriff hierin definiert ist. Anders ausgedrückt, der Begriff „differenzierte Zelle“ bezeichnet eine Zelle eines spezialisierteren Zelltyp aus einer Zelle eines weniger spezialisierten Zelltyp abgeleitet (beispielsweise eine Stammzelle wie einer pluripotenten Stammzelle) in einem zellulären Differenzierungsprozess. Ohne sich auf die Theorie beschränkt ist, kann eine pluripotente Stammzelle im Verlauf der normalen Ontogenese zuerst einer Endoderm Zelle, die zur Bildung von Pankreaszellen und anderen Zelltypen Endoderm zu differenzieren. Weitere Differenzierung eines Endoderm Zelle zu dem Pankreaswegs, wobei ~ 98% der Zellen zu exokrinen, ductularen oder Matrixzellen und ~ 2% werden endokrinen Zellen. Frühe endokrine Zellen sind Inselvorläuferzellen, die dann weiter zu differenzieren ist in Insulin-produzierende Zellen (zB funktionale endokrinen Zellen), die Insulin, Glukagon, Somatostatin oder Pankreas-Polypeptid sekretieren. Entodermzellen auch differenzieren sich in anderen Zellen endodermalen Ursprungs sein, zB Lunge, Leber, Darm, Thymus, etc.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „somatische Zelle“ bezieht sich auf alle Zellen, welche den Körper eines Organismus, im Vergleich mit der Keimbahn-Zellen. Bei Säugetieren Keimbahnzellen (auch als „Keimzellen“ genannt) sind die Spermien und Eizellen, die Sicherung bei der Befruchtung, um eine Zelle Zygote, bei denen der ganze Säugetier Embryo zu erzeugen. Jede andere Zelltyp in der Säugetier-Körper-abgesehen von der Spermien und Eizellen, die Zellen, aus denen sie hergestellt sind (Gametozyten) und undifferenzierte Stammzellen cells- ist eine somatische Zell: inneren Organe, Haut, Knochen, Blut und Bindegewebe sind alle up von somatischen Zellen. In einigen Ausführungsformen die somatische Zelle ist eine „nicht-embryonale somatische Zelle“, die von dem eine somatische Zelle, die nicht in oder aus einem Embryo erhalten wird und nicht von Proliferation einer solchen Zelle in vitro führen soll. In einigen Ausführungsformen die somatische Zelle eine „erwachsene somatische Zelle“, worunter man eine Zelle, die in oder aus einem anderen als einem Embryo oder eines Fötus oder Ergebnisse aus Proliferation einer solchen Zelle in vitro Organismus erhalten wird, gemeint.
Mangels anderer Verfahren zur Umwandlung mindestens einer Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon auf eine Insulin-produzierenden, Glucose ansprechenden Zelle kann sowohl in vivo als auch in vitro (in dem in vivo ist, wenn mindestens ein Insulin positive endokrine praktiziert erfolgen deutet Zelle oder Vorläufer davon vorhanden sind, in einem Thema, und in dem in vitro unter Verwendung eines isolierten mindestens einem Insulin-positive endokrine Zelle oder einer Vorstufe davon in Kultur gehalten praktiziert).
Der hier verwendete Begriff „adult Zelle“ bezeichnet eine Zelle, durch den Körper, nachdem die embryonale Entwicklung gefunden.
Der Begriff „Endoderm Zelle“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Zelle, die von einer der drei Primärkeimzellschichten in dem sehr frühen Embryo (die anderen beiden Keimblätter sind die Mesoderm und Ektoderm) ist. Endoderm ist die innerste der drei Schichten. Ein Endoderm Zelle unterscheidet den Aufstieg Erste, der embryonalen Darm und dann zu den Verkleidungen der Atemwege und des Verdauungstraktes (zB Darm), der Leber und der Bauchspeicheldrüse zu geben.
Der Begriff „eine Zelle endodermen Ursprungs“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf Zellen, die entwickelt oder die sich von einer endodermen Zelle differenziert hat. Zum Beispiel enthält eine Zelle endodermen Ursprungs Zellen der Leber, Lunge, Pankreas, Thymus, Darm, Magen und Schilddrüse. Ohne an die Theorie, Leber und Pankreas-Vorläufer gebunden zu sein (auch als Pankreas-Vorläuferzellen bezeichnet) werden aus Entodermzellen Entwicklung im embryonalen Vorderdarm. Kurz nach ihrer Spezifikation, Leber und Pankreas-Vorläufern schnell zu erwerben deutlich unterschiedliche zelluläre Funktionen und Regenerationsfähigkeit. Diese Veränderungen werden durch induktive Signale und genetische regulatorische Faktoren, die stark unter Wirbeltieren konserviert sind, hervorgerufen wird. Interesse an der Entwicklung und Regeneration der Organe durch die intensives Bedürfnis nach Hepatocyten und Pankreas β ceils bei der therapeutischen Behandlung von Leberversagen und Diabetes Typ 1 heizt. Studien in verschiedenen Modellorganismen und Menschen haben evolutionär konservierte induktive Signale und Transkriptionsfaktor-Netzwerke, die die Differenzierung von Leber und Pankreas-Zellen hervorzurufen und geben Hinweise, wie Sie Hepatozyten und β-Zell-Differenzierung aus verschiedenen Stamm- und Vorläuferzelltypen fördern enthüllt.
Der Begriff „definitiven Endoderms“, wie hierin verwendet, betrifft eine Zelle von einem Endoderm Zelle und die in eine SC-β-Zelle (zB eine Pankreaszelle β) unterschieden werden können differenziert. Eine endgültige Endoderm Zelle exprimiert den Marker Soxl 7. Andere Marker charakteristisch definitive Entoderm Zellen umfassen, sind jedoch nicht auf MIXL2, GATA4, HNF3b, GSC, FGF 17, VWF, CALCR, FOXQ 1, CXCR4, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99, CMKOR 1 und CRIP1 begrenzt. Insbesondere definitive Entodermzellen hierin exprimieren Soxl 7 und in einigen Ausführungs Soxl 7 und HNF3 B und keinen nennenswerten Anteil der GATA4, SPARC, APF oder DAB auszudrücken. Definitive Entodermzellen nicht positiv für den Marker Pdxl (zB sind sie Pdxl -negative). Definitive Entodermzellen haben die Fähigkeit, in Zellen, einschließlich der Leber, Lunge, Pankreas, Thymus, Darm, Magen und Schilddrüsen unterscheiden. Der Ausdruck Soxl 7 und anderen Markern der definitiven Endoderms kann durch jede dem Fachmann wie Immunochemie zB bekannte Verfahren bewertet werden, unter Verwendung eines Anti-Sox 1 7-Antikörper oder quantitative RT-PCR.
Der Begriff „pankreatischen Endoderms“ bezeichnet eine Zelle, Endoderm Ursprungs, die zur Differenzierung zu mehreren Pankreasabstammungslinien, einschließlich Pankreas-β-Zellen, aber nicht mehr die Fähigkeit, sich in nicht-pankreatischen Linien unterscheiden.
Der Begriff „Urdarm Rohrzelle“ oder „gut Rohrzelle“, wie hierin verwendet, betrifft eine Zelle aus einem Zellen Endoderm und das differenziert in eine SC-β-Zelle (zB eine Pankreaszelle β) unterscheiden. A Urdarm Rohrzelle drückt mindestens eine der folgenden Marker: HNF 1 -β, NP3-β oder HNF4-a. Urdarm Schlauchzellen haben die Fähigkeit, in Zellen, einschließlich der Lunge, der Leber, der Bauchspeicheldrüse, des Magens und des Darms zu unterscheiden. Die Expression von HNF 1 -β und anderen Markern der Urdarm Rohr kann durch jedes dem Fachmann bekannte Verfahren, wie Immunchemie, zB Verfahren bewertet werden, unter Verwendung eines Anti-HNF 1 -β-Antikörper.
Der Begriff „Pankreas-Vorläufer“, „pankreatischen endokrinen Vorläufer“, „Pankreas-Vorläufer“ oder „pankreatischen endokrinen Vorläufer“ werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf eine Stammzelle, die in der Lage ist zu einem Hormon der Bauchspeicheldrüse Zellen, die zur Bildung der Bauchspeicheldrüse zu exprimieren endokrinen Zellen, die exokrine Pankreaszellen oder Pankreasgang-Zellen. Diese Zellen werden auf die Unterscheidung gegenüber zumindest einem Typ von Pankreaszellen, zB begangen Beta-Zellen, die Insulin produzieren; Alpha-Zellen, die Glucagon zu produzieren; Delta-Zellen (oder D-Zellen), die Somatostatin zu erzeugen; und / oder F-Zellen, die Pankreas-Polypeptid zu produzieren. Ngn3, NKX2.2, NeuroD, ISL- 1, Pax4, Pax6 oder ARX: Solche Zellen können mindestens eine der folgenden Markierungen auszudrücken.
Der Begriff „pdxl -positiven Pankreas-Vorläufer“, wie hierin verwendet, betrifft eine Zelle, die ein Pankreas Endoderm (PE) Zelle, die die Fähigkeit, sich in SC-β-Zellen, wie Pankreas-β-Zellen zu unterscheiden hat, ist. Ein Pdxl -positiven Pankreas-Vorläufer drückt die Markierung Pdxl. Andere Marker umfassen, sind aber nicht auf Cdcpl oder Ptfl einem oder HNF6 oder NRx2.2 beschränkt. Der Ausdruck Pdxl kann durch jedes Verfahren nach dem Fachmann bekannt, wie beispielsweise Immun Verwendung eines Anti-Antikörpers oder Pdxl quantitative RT-PCR untersucht werden.
Der Begriff „pdxl -positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläufer“, wie hierin verwendet, betrifft eine Zelle, die ein Pankreas Endoderm (PE) Zelle, die die Fähigkeit, in Insulin-produzierende Zellen, wie Pankreas-β unterscheiden muss, ist Zellen. Ein pdxl - positive, NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläufer drückt die Marker Pdxl und NKX6- 1. Andere Marker umfassen, sind aber nicht auf CDCP 1 oder Ptfl einem oder HNF6 oder NRx2.2 beschränkt. Der Ausdruck NKX6- 1 kann durch jedes Verfahren durch den Fachmann bekannte Verfahren, wie Immunchemie unter Verwendung eines Anti-NKX6-1 Antikörper oder quantitative RT-PCR untersucht werden.
Der Begriff „Ngn3 positive endokrine Vorläufer“ wie hierin verwendet bezieht sich auf Vorläufer von endokrinen Pankreaszellen des Transkriptionsfaktors Neurogenin-3 (Ngn3) exprimieren. Vorläuferzellen sind differenzierter als multipotenten Stammzellen und kann in nur wenigen Zelltypen differenzieren. Insbesondere für Ngn3 positive endokrine Vorläuferzellen haben die Fähigkeit, in die fünf endokrinen Pankreaszelltypen (α, β, δ, ε und PP). Der Ausdruck Ngn3 kann durch jedes Verfahren nach dem Fachmann bekannt, wie beispielsweise Immun Verwendung eines Anti-Antikörpers oder Ngn3 quantitative RT-PCR untersucht werden.
Die Begriffe „NeuroD“ und „NeuroD 1“ werden austauschbar verwendet und ein Protein in pankreatischen endokrinen Vorläuferzellen und die dafür kodierende Gen exprimiert zu identifizieren.
Die Begriffe „Insulin-positiven β-like cell“ und „Insulin-positiven endokrinen Zelle“ bezieht sich auf Zellen (zB endokrinen Pankreaszellen), die zumindest eine Markierung, das einen Pankreas β Zelle zeigt und drückt auch Insulin aber Mangel a GSIS Ansprechcharakteristik eines endogenen β-Zelle.
Ein „Vorläufer davon, wie der Begriff bezieht sich auf eine Insulin-positiven endokrinen Zelle bezieht sich auf jede Zelle, die zur Differenzierung zu einem Insulin-positiven endokrinen Zellen, einschließlich beispielsweise ist eine pluripotente Stammzelle, eine definitive Entoderm Zelle, eine Urdarm Rohrzelle, eine Pankreas-Vorläuferzelle oder endokrine Vorläuferzelle, wenn unter Bedingungen, die zur Differenzierung der Vorläuferzellen in den Insulin-positiven endokrinen Zellen kultiviert bl.
Der Begriff „Stammzellen abgeleiteten β-Zelle“, „SC-β-Zelle“, „funktionelle β-Zelle“, „Funktions pankreatischen β-Zelle“ und „reifer SC-β-Zelle“ beziehen sich auf Zellen (zB Pankreas-β-Zellen ), die Anzeige zumindest eine Markierung, das einen β Pankreaszelle (zB PDX-1 oder NKX6-1) drückt Insulin, und Anzeigen einer GSIS Ansprechcharakteristik eines endogenen reifen β-Zelle. In einigen Ausführungsformen der „SC-β Zelle“ umfasst eine reife Pankreas-β-Zellen. Es versteht sich, dass die SC-β-Zellen müssen nicht abgeleitet werden kann (beispielsweise direkt) von Stammzellen, wie die Verfahren der Offenbarung sind in der Lage Ableiten SC-β-Zellen von jedem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläufer davon mit irgend Zelle als ein Startpunkt (zum Beispiel einen embryonalen Stammzellen induziert-pluripotenten Stammzellen, Vorläuferzellen, die teilweise neu programmiert somatischen Zellen (Verwendung zB einer somatischen Zelle, wurde teilweise in einen Zwischenzustand zwischen einer pluripotenten Stammzelle umprogrammiert und die somatische Zelle, aus der sie abgeleitet wurde), multipotente Zellen, totipotente Zellen, eine transdifferenzierter Version keine der vorgenannten Zellen, usw., da die Erfindung nicht in dieser Weise beschränkt sein). In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zellen zeigen ein Ansprechen, um mehrere Glucose Herausforderungen (beispielsweise mindestens eine, mindestens zwei oder mindestens drei oder mehr aufeinanderfolgenden Glucose Herausforderungen). In einigen Ausführungsformen wird die Reaktion ähnelt die Reaktion des endogenen Inseln (zB menschliche Inselzellen), um mehrere Glucose Herausforderungen. In einigen Ausführungsformen ist die Morphologie des SC-β-Zelle ähnelt die Morphologie eines endogenen β-Zelle. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle weist eine in vitro GSIS Antwort, die die GSIS Antwort eines endogenen β-Zelle ähnelt. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle weist eine in vivo GSIS Antwort, die die GSIS Antwort eines endogenen β-Zelle ähnelt. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle weist sowohl eine in vitro- und in vivo GSIS Antwort, die die GSIS Antwort eines endogenen β-Zelle ähnelt. GSIS Antwort des SC-β-Zelle kann innerhalb von zwei Wochen nach der Transplantation des SC-β-Zelle in einem Wirt (zB ein Mensch oder Tier) zu beachten.
In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zellen Insulin in Paket sekretorischen Granula. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zellen aufweisen eingekapselte kristalline Insulin Granulate. In einigen Ausführungsformen die SC-β Zellen einen Stimulationsindex von größer als 1 ist. In einigen Ausführungsformen die SC-β Zellen einen Stimulationsindex von größer als 1 .1. In einigen Ausführungsformen die SC-β Zellen einen Stimulationsindex von größer als 2 ist. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zellen aufweisen Zytokin-induzierte Apoptose in Reaktion auf Cytokine. In einigen Ausführungsformen wird die Insulinsekretion der SC-β-Zellen in Reaktion auf bekannte Antidiabetika (zB Sekretagoga) verbessert. In einigen Ausführungsformen sind die SC-β-Zellen monohormonal. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zellen werden nicht abnormal koexprimieren andere Hormone, wie Glucagon, Somatostatin oder Polypeptid aus der Bauchspeicheldrüse. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zellen weisen eine niedrige Rate der Replikation. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zellen zu erhöhen intrazelluläres Ca2+ in Reaktion auf Glucose.
Der Begriff „exokrinen Zelle“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Zelle eines exokrine Drüse, also eine Kabelverschraubung, die ihre Sekretion über einen Kanal mündet. In besonderen Ausführungsformen betrifft eine exokrine Zellen in einen exokrinen Pankreaszelle, die eine Pankreaszelle, die Enzyme, die in den Dünndarm sezerniert werden produziert, ist. Diese Enzyme helfen, Nahrung zu verdauen, wie es durch den Verdauungstrakt gelangt. Exokrine Pankreaszellen werden auch als Langerhans-Inseln, die zwei Hormone, Insulin und Glucagon sekretieren bekannt. Eine exokrine Pankreaszelle einen von mehreren Zelltypen sein: alpha-2-Zellen (die das Hormon Glukagon produzieren); oder β-Zellen (die das Hormon Insulin produzieren); und alpha-1-Zellen (die das Regulierungsmittel Somatostatin zu produzieren). Nicht-Insulin-produzierenden Zellen exokriner wie hierin verwendet, bezieht sich auf alpha-2-Zellen oder alpha-1-Zellen. Beachten Sie, der Begriff exokrinen Pankreaszellen umfasst „pankreatischen endokrinen Zellen“, die zu einer Pankreaszelle, die Hormone produziert beziehen (zB Insulin (von β-Zellen produziert), Glukagon (von alpha-2-Zellen produziert), Somatostatin (von Delta-Zellen produziert) und Pankreas-Polypeptid, die in die Blutbahn sezerniert werden (mit F-Zellen produziert).
Der hier verwendete Ausdruck „Insulin-produzierende Zelle“ bezeichnet eine Zelle aus einem Pankreas-Vorläufer oder Vorläufer davon, die Insulin absondert differenziert. Eine Insulin-produzierenden Zelle Pankreas β-Zellen, wie dieser Begriff hierin beschrieben, sowie Pankreas β-ähnlichen Zellen (dh Insulin-positiven, endokrinen Zellen), welche (zu synthetisieren dh transkribieren Insulingens, übersetzen Proinsulins mRNA und enthält Ändern Sie den Pro-Insulin-mRNA in den Insulin-Protein), zum Ausdruck bringen (dh manifestieren die phänotypischen Merkmal durch die Insulin-Gen durchgeführt) oder sezernieren (Release Insulin in den extrazellulären Raum) Insulin in einer konstitutiven oder induzierbaren Weise. Eine Population von Insulin-produzierenden Zellen z.B. durch Differenzieren von Insulin-positiven, endokrine Zellen oder einer Vorstufe davon in SC-β-Zellen gemäß der Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, pankreatische β-Zellen oder β-ähnlichen Zellen sein (zB Zellen, die zumindest eine oder zumindest zwei davon mindestens zwei) charakteristisch für eine endogene β-Zelle und weisen eine GSIS Antwort, die ein endogenes Erwachsenen β-Zelle ähnelt.
Die Neuheit der vorliegenden Zusammensetzung und Verfahren ist nicht durch die Anwesenheit von Zellen in der Population, die Insulin auf natürliche (zB β-Zellen) zu produzieren negiert. Es wird auch erwogen, dass die Population von insulinproduzierenden Zellen, zB durch die Verfahren, wie hier offenbart, können reife Pankreas-β ceils oder SC-β-Zellen aufweisen, und können auch nicht-insulinproduzierenden Zellen (dh Zellen des β Zelle Phänotyp mit Ausnahme sie nicht produzieren oder sezernieren Insulin) hergestellt.
Wie hierin verwendet, werden die Begriffe „endogene β-Zelle“, „endogenen reife Pankreas β-Zelle“ oder „endogenen pankreatischen β-Zelle“ auf eine Insulin-produzierenden Zellen der Bauchspeicheldrüse oder einer Zelle eines pankreatischen β-Zelle (β-Zelle ) Phänotyp. Der Phänotyp einer pankreatischen β-Zelle auch Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt und umfassen beispielsweise die Sekretion von Insulin in Reaktion auf eine Erhöhung der Blutzuckerspiegel, die Expression von Markern, wie das C-Peptid, Pdxl Polypeptid und Glut 2 sowie verschiedene morphologische Merkmale wie in Inseln im Pankreas in vivo organisiert, und haben typischerweise kleine Spindel ähnliche Zellen von etwa 9 - 15 µm Durchmesser.
Der Begriff „SC-β-Zelle“, „Pankreas-β-ähnliche Zelle“ und „reife Pankreas β- wie“ wie hier verwendet beziehen sich auf Zellen durch die Verfahren hergestellt, wie hierin offenbart, die mindestens 15% der Menge ausdrückt Insulin durch eine endogene pankreatischen β Zelle exprimiert wird, oder zumindest etwa 20% oder zumindest etwa 30% oder zumindest etwa 40%, oder mindestens etwa 50%, oder mindestens etwa 60%, oder mindestens etwa 70% oder zumindest etwa 80%, oder mindestens etwa 90%, oder mindestens etwa 100% oder mehr als 100%, beispielsweise mindestens etwa 1, 5-fache, vorzugsweise mindestens das 2-fache, vorzugsweise mindestens 2,5-fache, vorzugsweise mindestens 3-fach, besonders bevorzugt mindestens 4-fachen oder mindestens etwa das 5-fache oder mehr als etwa 5-fach die Menge des Insulins durch eine endogene pankreatischen β-Zelle sezerniert wird, oder alternativ weist an mindestens eine oder mindestens zwei Charakteristiken eines endogenen pankreatischen β-Zelle, zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, die Sekretion von Insulin in Reaktion auf Glucose beschränkt, und die Expression von β Zellmarker, wie beispielsweise C-Peptid Pdxl und Schwemme -2.
In einer Ausführungsform ist die SC-β-Zelle nicht immortalisierte Zell (zB unbegrenzt proliferieren in Kultur). In einer Ausführungsform ist die SC-β-Zelle nicht eine transformierte Zelle, beispielsweise eine Zelle, die eine Transformation Eigenschaft, beispielsweise in Weichagar zu wachsen, oder die Abwesenheit der Kontaktinhibierung zeigt.
Der Begriff „β-Zell-Marker“ bezieht sich, ohne Einschränkung, Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Polymorphismus von Proteinen und Nukleinsäuren, Spleißvarianten, Fragmente von Proteinen oder Nukleinsäuren, die Elemente und andere Analyten, die spezifisch exprimiert werden, oder in pankreatischen β-Zellen vorhanden. Ausführungs β Zellmarker umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Pankreas- und Duodenal-Homeobox-1 (Pdxl) Polypeptid, Insulin, C-Peptid, Amylin, E- Cadherin Hηββ, PCI / 3, B2, Nkx2.2, NKX6- 1, GLUT2, PC2, ZnT-8, Isll, Pax6, Pax4, NeuroD, Hnflb, HNF-6, HNF-3 & beta; und MafA, und diejenigen, in Zhang et al., Diabetes beschrieben. 50 (10): 2231 6 (2001). In einigen Ausführungsformen ist die β-Zellmarker ein Atom 3- Zellmarker. In einigen Ausführungsformen ist die β-Zellmarker Pdxl oder PH3.
Der Begriff „endokrine Pankreas Marker“ bezieht sich auf ohne Einschränkung Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Polymorphismus von Proteinen und Nukleinsäuren, Spleißvarianten, Fragmente von Proteinen oder Nukleinsäuren, die Elemente und andere Analyten, die spezifisch exprimiert werden, oder präsent in pankreatischen endokrinen Zellen. Ausführungs endokrinen Pankreaszell-Marker umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Ngn-3, NeuroD und Islet- 1 beschränkt.
Der Begriff „nicht-Insulin-produzierenden Zelle“, wie er hier verwendet wird, eine beliebige Zelle des Endoderm Ursprungs, die nicht natürlich nicht synthetisieren, zum Ausdruck bringen, oder Insulin absondern konstitutive gemeint! y oder durch Induktion. Somit schließt der Begriff „nicht-Insulin-produzierenden Zellen“ wie hier verwendet schließt pankreatischen β-Zellen. Beispiele für nicht-Insulin-produzierenden Zellen, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen pankreatischen ηοη-β cel ls, wie Amylase produzierenden Zellen Azinuszellen, Zellen des duktalen Adenokarzinom-Zelllinien (zB CD18, CD1 1, und Capan-I-Zellen (siehe Busik et al "1997; Schaffert et al., 1997). Nichtpankreatische Zellen des Endoderms Ursprungs können ebenfalls verwendet werden, beispielsweise nicht-pankreatische Stammzellen und Zellen anderer endokrine oder exokrine Organe, wie beispielsweise Leberzellen, Tymus Zellen, Schilddrüsenzellen, Darmzellen, Lungenkrebszellen und Zellen der Hypophyse. In einigen Ausführungsformen kann die nicht-Insulin-produzierenden Entodermzellen Säugerzellen oder, noch genauer gesagt, menschliche Zellen sein. Beispiele für das vorliegende Verfahren unter Verwendung von Säugetier-Pankreas-Inselzellen nicht, Pankreas-Amylaseproduzierenden Zellen, pankreatischen Azinuszellen werden hierin bereitgestellt.
Der Begriff „Phänotyp“ bezieht sich auf einen oder eine Anzahl der gesamten biologischen Eigenschaften, die die Zelle oder den Organismus unter einem bestimmten Satz von Umweltbedingungen und Faktoren zu definieren, unabhängig von der tatsächlichen Genotyp.
Der Ausdruck „pluripotent“ bezieht sich hierin auf eine Zelle mit der Fähigkeit, unter verschiedenen Bedingungen, um mehr als einen differenzierten Zelltyp zu differenzieren, und vorzugsweise zu differenzieren, um Typen Merkmal aller drei Keimblätter Zelle. Pluripotenten Zellen werden in erster Linie durch ihre Fähigkeit, an mehr als einen Zelltyp zu differenzieren, vorzugsweise an allen drei Schichten, wobei dadurch, beispielsweise eine Nacktmaus Teratom Bildungstest. Pluripotenz wird auch durch die Expression von embryonalen Stammzellen (ES) Zell-Marker nachgewiesen, obwohl die bevorzugte Test für Pluripotenz ist die Demonstration der Fähigkeit, in Zellen von jedem der drei Keimschichten zu unterscheiden. Es sollte beachtet werden, dass einfach die Kultivierung solcher Zellen nicht, auf seine eigene, machen sie pluripotent werden. Umprogrammiert pluripotenten Zellen (zB iPS, wie dieser Begriff hierin definiert) haben ebenfalls die Eigenschaft, die Kapazität des erweiterten Passage ohne Verlust der Wachstumspotential, bezogen auf primäre Zell Eltern, die im allgemeinen Kapazität nur für eine begrenzte Anzahl von Teilungen in Kultur.
Wie hierin verwendet, werden die Begriffe „iPS Zelle“ und „induzierte pluripotente Stammzelle“ werden hier austauschbar verwendet und bezieht sich auf eine pluripotente Stammzelle künstlich abgeleitet (zB induzierten oder durch vollständige Umkehrung) aus einem nicht-pluripotenten Zelle, typischerweise eine adulte somatische Zelle, beispielsweise durch Induzieren eines erzwungenen Expression eines oder mehrerer Gene.
Der Begriff „Stammvater“ oder „Vorläufer“ Zelle werden hier austauschbar verwendet und beziehen sich auf Zellen, die eine zelluläre Phänotyp, primitiver ist zu haben (das heißt, in einem früheren Schritt auf einem Entwicklungsweg oder Progression als ein vollständig differenzierten Zellen ) relativ zu einer Zelle, die es begründen kann durch Differenzierung. Oft Vorläuferzellen haben auch erheblichen oder sehr hohe Proliferationspotential. Progenitorzellen Anlass zu mehreren verschiedenen differenzierten Zelltypen oder an denselben differenzierten Zelltyp ergeben kann, abhängig von der Entwicklungsverlauf und der Umgebung, in der die Zellen entwickeln und zu differenzieren.
Der Begriff „Stammzelle“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine undifferenzierte Zelle, welche in der Lage ist die Proliferation und was zu mehr Vorläuferzellen mit der Fähigkeit, eine große Anzahl von Mutterzellen, die wiederum hervorrufen können differenzierte erzeugen, oder differenzierbare Tochterzellen. Die Tochterzellen selbst induziert werden kann, zu vermehren und zu produzieren Nachkommen, die anschließend in einem oder mehreren reifen Zelltypen zu differenzieren, während auch eine oder mehrere Zellen mit elterlichen
Entwicklungspotenzial. Der Begriff „Stammzelle“ bezieht sich auf eine Teilmenge von Vorläuferzellen, die die Kapazität oder potentiell unter bestimmten Umständen zu haben, um eine spezialisiertere oder differenzierten Phänotyp zu differenzieren, und die die Fähigkeit beibehält, unter bestimmten Umständen, ohne wesentlich differen vermehren. In einer Ausführungsform wird der Begriff Stammzellen bezieht sich allgemein auf einem natürlich vorkommenden Mutterzelle, deren Nachkommen (Nachkommen) spezialisiert sind, häufig in verschiedenen Richtungen durch Differentiation, beispielsweise durch Erfassen vollständig einzelne Zeichen, wie in progressive Diversifizierung von embryonalen Zellen und Geweben auftritt. Zelldifferenzierung ist ein komplexer Prozess typischerweise über viele Zellteilungen hinweg auftritt. Eine differenzierte Zelle aus einer multipotenten Zelle, die sich von einer multipotenten Zelle abgeleitet ist, und so weiter abgeleitet werden. Während jedes dieser multipotenten Zellen können als Stammzellen, den Bereich von Zelltypen werden jeweils kann zu erheblich variieren zu geben. Manche differenzierte Zellen haben auch die Fähigkeit, Anlass zu Zellen von mehr Entwicklungspotential zu geben.
Eine solche Kapazität kann natürlich sein oder künstlich bei Behandlung mit verschiedenen Faktoren induziert werden. In vielen biologischen Fällen Stammzellen sind auch „multipotent“, weil sie Nachkommen der mehr als eine unterschiedliche Zelltyp erzeugen kann, aber dies ist nicht für die „Stamm-ness erforderlich. „Selbsterneuerung ist die andere klassischen Teil der Stammzelldefinition und es ist wesentlich, wie in diesem Dokument verwendet werden. In der Theorie kann die Selbsterneuerung von einer von zwei Hauptmechanismen auftreten. Stammzellen können asymmetrisch zu teilen, hat eine Tochter halten den Stamm Staat und die andere Tochter einige deutliche andere spezifische Funktion und Phänotyp exprimieren. Alternativ können einige der Stammzellen in einer Population, die symmetrisch in zwei Stämmen unterteilen, wodurch die Aufrechterhaltung eines gewissen Stammzellen der Population als Ganzes, während andere Zellen in der Population führen zu nur differenzierte Nachkommenschaft. Formal ist es möglich, dass Zellen, die als Stammzellen beginnen, zu einer differenzierten Phänotyp gehen könnte, aber dann „reverse“ und wieder drücken die Stammzell-Phänotyp, ein Begriff, der oft als „Entdifferenzierung“ oder „Anpassung“ oder „Retrodifferenzierung“ bezeichnet Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „pluripotente Stammzelle“ umfasst embryonalen Stammzellen, pluripotenten Stammzellen, Plazenta Stammzellen usw.
Im Zusammenhang mit der Zell Ontogenese, das Adjektiv „differenzierte“ oder „Differen“ ist ein relativer Begriff, bedeutet eine „differenzierte Zelle“ ist eine Zelle, die weiter unten in der Entwicklungsverlauf als die Zelle ist, die mit im Vergleich fortgeschritten ist. Somit können Stammzellen zu abstammungs begrenzten Vorläuferzellen (wie einer mesodermalen Stammzellen), die wiederum in andere Arten von Vorläuferzellen weiter unten in der Bahn (wie einem Kardiomyozyten-Vorläufer) unterscheiden kann, um eine Endzu unterscheiden, und dann Stufe differenzierten Zelle, die eine charakteristische Funktion in einem bestimmten Gewebetyp spielt, und er kann die Kapazität weiter zu vermehren, nicht beibehalten.
Der Begriff „embryonale Stammzelle“ wird verwendet, um den pluripotenten Stammzellen von der inneren Zellmasse des embryonalen Blastozyste beziehen (siehe US Pat. Nos. 5843780 , 6200806 ). Solche Zellen können in ähnlicher Weise aus der inneren Zellmasse von Blastocysten aus somatischen Zellkerntransfer abgeleitet erhalten werden (siehe beispielsweise US Pat. Nos. 5945577 , 5994619 , 6235970 ). Die kennzeichnenden Merkmale von einer embryonalen Stammzelle zu definieren, die einen embryonalen Stammzell-Phänotyp. Dementsprechend weist eine Zelle den Phenotyp einer embryonalen Stammzelle, wenn sie eine oder mehrere der einzigartigen Eigenschaften von einer embryonalen Stammzelle, so dass diese Zelle von anderen Zellen unterschieden werden, besitzt. Beispielhafte Unterscheidungs embryonalen Stammzelleigenschaften gehören, ohne Einschränkung, Genexpressionsprofil, proliferative Kapazität, Differenzierungsfähigkeit, Karyotyp, Reaktionsfähigkeit auf bestimmte Kulturbedingungen und dergleichen.
Der Begriff „adulte Stammzellen“ oder „ASC“ wird verwendet, um sich auf jede multipotente Stammzelle aus nicht-embryonalem Gewebe, einschließlich der fetalen, juvenile und erwachsene Gewebe gewonnen zu beziehen.
Stammzellen aus einer Vielzahl von adulten Geweben, einschließlich Blut, Knochenmark, Gehirn, Riechepithel, Haut, Bauchspeicheldrüse, Skelettmuskel und Herzmuskel isoliert. Jede dieser Stammzellen können anhand von Genexpression, Faktor Ansprechverhalten und Morphologie der Kultur charakterisiert. Ausführungs adulten Stammzellen umfassen neurale Stammzellen, Neuralleiste Stammzellen, mesenchymale Stammzellen, hämatopoetische Stammzellen und Bauchspeicheldrüsenstammzellen. Wie oben angegeben, Stammzellen wurden mit Wohnsitz in nahezu jedem Gewebe gefunden. Demzufolge schätzt die vorliegende Erfindung, dass Stammzellpopulationen können aus praktisch jeder tierischen Gewebe isoliert werden.
Der Begriff „Pankreas“ bezeichnet eine Drüsenorgan die Verdauungsenzyme und Hormone absondert. Beim Menschen ist die Bauchspeicheldrüse eine gelbliche Organ 7 in. (17,8 cm) lang und 1, 5 in. (3,8 cm) breit. Sie liegt unterhalb des Magens und des Dünndarms, Muskelschlauchförmigen Abschnitt des Gastrointestinaltraktes, der sich von dem unteren Ende des Magens (Pylorus) an die Afteröffnung verbunden ist. Die meisten der Pankreasgewebe aus grapelike Cluster von Zellen, die eine klare Flüssigkeit (Pankreassaft) zu erzeugen, die in den Zwölffingerdarm über einen gemeinsamen Kanal mit Galle aus der Leber fließt.
Pankreassaft enthält drei Verdauungsenzyme: Tryptase, Amylase und Lipase, dass, zusammen mit Darmenzyme, vervollständigen die Verdauung von Proteinen, Kohlenhydraten und Fetten sind. Verstreut unter den Enzym-produzierenden Zellen der Bauchspeicheldrüse sind kleine Gruppen von endokrinen Zellen, genannt Langerhans-Inseln, die zwei Hormone, Insulin und Glucagon sekretieren. Pankreasinseln enthalten verschiedene Typen von Zellen: alpha-2-Zellen, die das Hormon Glucagon zu erzeugen; β-Zellen (hierin auch als „Pankreas-β-Zellen“), die das Hormon Insulin herzustellen; und alpha-1-Zellen, die das Regelungsmittel Somatostatin zu produzieren. Diese Hormone werden in die Blutbahn sezerniert wird und zusammen regulieren sie den Glukosespiegel im Blut. Insulin erniedrigt den Blutzuckerspiegel und erhöht die Menge an Glykogen gespeichert (Kohlenhydrat) in der Leber; Glucagon hat die entgegengesetzte Wirkung. Versagen der insulinsezernierenden Zellen, um richtig funktionieren ergibt Diabetes oder Diabetes mellitus.
Der Begriff „Neuprogrammierung“ wie hierin verwendet bezieht sich auf den Prozess, ändert oder kehrt den Differenzierungszustand von einer somatischen Zelle. Die Zelle kann entweder teilweise oder terminal vor der Neuprogrammierung unterschieden werden. Neuprogrammierung umfasst komplette Umkehrung der Differenzierungszustand einer Körperzelle in eine pluripotente Zelle. Eine solche vollständige Umkehrung der Differenzierung erzeugt einen induzierten pluripotenten (iPS) Zelle. Reprogrammierung, wie er hier verwendet wird, umfasst auch Teil Reversion eines Zellen
Differenzierungszustand, beispielsweise zu einem multi Zustand oder in einer somatischen Zelle, die weder pluripotente oder multi ist, sondern ist eine Zelle, die eine oder mehrere spezifische Eigenschaften der differenzierten Zelle, aus der sie stammen, beispielsweise verloren hat, direkte Umprogrammierung einer differenzierten Zelle zu einem anderen Zelltyp. Umprogrammierung beinhaltet im Allgemeinen Veränderung, beispielsweise Umkehrung von mindestens einigen der heriMuster Nukleinsäure-Modifikation (zB Methylierung), Chromatinkondensation, epigenetischen Veränderungen, genomischem Imprinting usw., die während der Zelldifferenzierung treten als Zygote entwickelt sich ein Erwachsene.
Der wie hierin verwendete Begriff „Mittel“ bedeutet jede Verbindung oder Substanz, wie etwa, aber nicht beschränkt auf, ein kleines Molekül, eine Nukleinsäure, ein Polypeptid, ein Peptid, ein Arzneimittel, Ionen usw. beschränkt Ein „Agent“ kann jede chemische, Organisation oder Gruppierung sein, einschließlich und ohne Einschränkung synthetischen und natürlich vorkommenden proteinhaltigen und nicht-proteinartige Entitäten. In einigen Ausführungsformen ist ein Agent Nukleinsäure, Nukleinsäureanaloga, Proteinen, Antikörpern, Peptiden, Aptamere, Oligomer von Nukleinsäuren, Aminosäuren oder Kohlenhydrate, einschließlich und ohne Einschränkung Proteine, Oligonukleotide, Ribozyme, DNAzyme, Glycoproteine, siRNAs, Lipoproteine, Aptamere und Modifikationen und Kombinationen davon usw. In bestimmten Ausführungsformen sind Mittel, kleines Molekül, das eine chemische Einheit ist. Beispielsweise enthalten chemische Gruppen unsubstituierte oder substituierte Alkyl-, aromatische oder Heterocyclyl-Resten, einschließlich Makrolide, leptomycins und verwandter Naturstoffe oder deren Analoga. Verbindungen können bekannt sein, um eine gewünschte Aktivität und / oder Eigenschaft aufweisen, oder können aus einer Bibliothek diverser Verbindungen ausgewählt werden.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „Kontaktieren“ (dh das Kontaktieren mindestens eines Insulin-positive endokrinen Zelle oder ein Vorläufer davon mit einem β-Zellreifung Faktor oder eine Kombination von β-Zellreifunsfaktoren) soll das Inkubieren der zu zählen β-Zellreifung Faktor und die Zelle zusammen in vitro (zum Beispiel Hinzufügen der β-Zellreifunsfaktoren auf Zellen in Kultur). In einigen Ausführungsformen wird der Ausdruck „Kontaktieren“ nicht beabsichtigt, die in vivo Exposition von Zellen gegenüber den Verbindungen, wie hierin offenbart, die in einem Subjekt natürlich vorkommen können, umfassen (das heißt, die Exposition, die als Ergebnis eines natürlichen physiologischen Prozeß auftreten kann). Den Schritt des Kontaktierens mindestens eine Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einen Vorläufer davon mit einem β-Zellreifung Faktors, wie in den Ausführungsformen auf die Herstellung von SC-β-Zellen im Zusammenhang kann auf jede geeignete Weise durchgeführt werden. Beispielsweise können die Zellen in adhärenter Kultur behandelt werden oder in einer Suspensionskultur. In einigen Ausführungsformen werden die Zellen unter Bedingungen, die das Zell aggregierende behandelt.
Die Offenbarung beschäftigt alle Bedingungen, die die Zellclusterbildung zu fördern. Beispiele für Bedingungen, die Zellclusterbildung fördern beinhalten, ohne Einschränkung, Suspensionskultur in Niederbefestigungsgewebekulturplatten, Spinnerflaschen, aggrewell Platten. In einigen Ausführungsformen haben die Erfinder beobachtet, dass Cluster wurden in Medien, die 10% Serum stabil. In einigen Ausführungsformen, die Bedingungen, die Clusterbildung zu fördern gehören eine niedrige Serum-Medium.
Es versteht sich, dass die Zellen mit einem β-Zellreifung Faktor in Kontakt kann auch gleichzeitig oder anschließend mit einem anderen Mittel in Kontakt gebracht, wie beispielsweise einen Wachstumsfaktor oder andere Differenzierungsmittel oder Umgebungen zur Stabilisierung der Zellen oder die Zellen weiter zu differenzieren .
Ähnlich mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder ein Vorläufer davon kann mit mindestens einem β-Zellreifung Faktor in Kontakt gebracht werden und dann mit mindestens einem anderen β-Zellreifung Faktor in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen wird die Zelle mit mindestens einem β-Zellreifung Faktor in Kontakt gebracht, und der Kontakt wird zeitlich getrennt sind, und in einigen Ausführungsformen wird eine Zelle mit mindestens einer β-Zellreifung Faktor im Wesentlichen gleichzeitig in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen wird die Zelle mit mindestens zwei, mindestens drei, mindestens vier, mindestens fünf, mindestens sechs kontaktiert, mindestens sieben, mindestens acht, mindestens neun, oder mindestens 10 β-Zellreifunsfaktoren.
Der Begriff „Zellkulturmedium“ (hierin auch als ein „Kulturmedium“ oder „mittel“), wie hier angegeben ist, ein Medium zum Kultivieren von Zellen, das Nährstoffe enthält, die die Lebensfähigkeit der Zellen und Unterstützung Proliferation aufrechtzuerhalten. Das Zellkulturmedium kann mit einer der folgenden in einer geeigneten Kombination enthalten: Salz (e), Puffer (n), Aminosäuren, Glucose oder andere Zucker (n), Antibiotika, Serum oder Serumersatz und anderen Komponenten, wie beispielsweise Peptid-Wachstums Faktoren usw. Gewöhnlich für bestimmte Zelltypen verwendet werden, von Zellkulturmedien sind dem Fachmann in der Technik bekannt.
Der Begriff „Zelllinie“ auf eine Population von weitgehend oder im Wesentlichen identische Zellen, die in der Regel aus einer Vorfahrenzelle oder aus einem definierten und / oder im Wesentlichen identischen Population Ahnen Zellen abgeleitet wurde. Die Zelllinie kann worden sind oder der Lage ist, in der Kultur für einen längeren Zeitraum (zB, Monate, Jahre, für eine unbegrenzte Zeit) eingehalten werden. Es kann einen spontanen oder induzierten Transformationsprozess verleiht eine unbegrenzte Lebensdauer Kultur auf die Zellen durchlaufen haben. Zelllinien umfassen alle, die in der Technik als solche erkannt Zelllinien. Es versteht sich, dass Zellen erwerben Mutationen möglicherweise epigenetischen Veränderungen im Laufe der Zeit, so dass wenigstens einige Eigenschaften der einzelnen Zellen einer Zelllinie, können in Bezug zueinander unterscheiden. Bei einigen Ausführungsformen umfasst eine Zelllinie eines hierin beschriebenen SC-β-Zelle.
Der Begriff „exogen“ bezeichnet eine in einer Zelle oder eines Organismus vorliegen außerhalb seines natürlichen Quellsubstanz. Beispielsweise die Begriffe „exogene Nukleinsäure“ oder „exogenes Protein“ beziehen sich auf eine Nukleinsäure oder ein Protein, das durch ein Verfahren, das die Hand des Menschen in einem biologischen System wie einer Zelle oder eines Organismus eingeführt worden ist, in dem es normalerweise nicht gefunden wird oder in dem es in geringeren Mengen vorhanden. Eine Substanz wird als exogene werden, wenn es in eine Zelle oder ein Vorfahre der Zelle, die die Substanz erbt eingeführt. Im Gegensatz dazu bedeutet der Begriff „endogen“ bezeichnet eine Substanz, die ursprünglich aus dem biologischen System.
Der Begriff „Expression“ bezieht sich auf die zelluläre Prozesse in der Herstellung von RNA und Proteine und gegebenenfalls sezer Proteinen, gegebenenfalls aber nicht beschränkt auf, zum Beispiel die Transkription, Translation, Faltung, Modifizierung und Prozessierung beteiligt. „Expressionsprodukte“ enthalten RNA von einem Gen, und Polypeptide, die durch Translation von mRNA von einem Gen transkribiert erhalten transkribiert.
Der Begriff „genetisch modifiziert“ oder „behandelt“ Zelle, wie hierin verwendet, betrifft eine Zelle, in welche eine exogene Nukleinsäure von einem Verfahren, das die Hand des Menschen eingeführt (oder ein Abkömmling einer solchen Zelle, die geerbt hat mindestens ein Teil der Nukleinsäure). Die Nukleinsäure kann beispielsweise enthalten eine Sequenz, die exogen zu der Zelle kann es nativen Sequenzen enthalten (dh Sequenzen, die natürlicherweise in den Zellen gefunden werden), aber in einer nicht-natürlich vorkommenden Anordnung (beispielsweise eine kodierende Region mit einem Promotor aus verknüpften ein anderes Gen) oder veränderte Versionen der nativen Sequenzen usw. Der Prozess der Übertragung der Nucleinsäure in der Zelle kann durch jede geeignete Technik erreicht werden.
Geeignete Verfahren umfassen Calciumphosphat oder Lipid vermittelte Transfektion, Elektroporation und Transduktion oder Infektion mit einem viralen Vektor. In einigen Ausführungsformen das Polynucleotid oder ein Teil in das Genom der Zelle integriert. Die Nukleinsäure kann anschließend entfernt worden sind oder aus dem Genom herausgeschnitten werden, sofern diese die Entfernung oder Exzision zu einer nachweisbaren Veränderung in der Zelle relativ zu einem unmodifizierten aber ansonsten äquivalenten Zelle. Es sollte beachtet werden, dass der Begriff genetisch verändert ist, soll die Einführung eines modifizierten RNA direkt in eine Zelle (beispielsweise eine synthetische, modifizierte RNA) umfassen. Solche synthetischen modifizierten RNAs gehören Änderungen an schnellen Abbau durch Endo- und Exo-Nukleasen zu verhindern und zu vermeiden oder zu reduzieren oder angeborenen Immuninterferonantwort der Zelle an die RNA. Modifikationen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, zum Beispiel (a) Ende Modifikationen, zum Beispiel 5'- Ende Modifikationen (Phosphorylierung-Dephosphorylierung, Konjugation, invertiert Bindungen, etc.), 3'-Ende Modifikationen (Konjugation, DNA-Nukleotide, invertiertes Gestänge, etc.), (b) Basenmodifikationen, beispielsweise Ersatz mit modifizierten Basen, Stabilisierungs Basen destabilisieren Basen oder Basen, die als Paar mit einem erweiterten Repertoire Partner oder konjugierte Basen, (c) Zuckermodifikationen (zB Base, in der 2 Position oder 4-Position) oder Ersatz des Zuckers sowie (d) Internucleosidbindung Modifikationen, einschließlich der Modifikation oder der Austausch der Phosphodiesterbindungen.
In dem Ausmaß, dass derartige Modifikationen stören Übersetzung (dh zu einer Verringerung von 50% oder mehr in Translation in Bezug auf das Fehlen der modificationzB in einem Kaninchen-Retikulozyten-in vitro-Translationstest), ist nicht geeignet für die die Modifikation Verfahren und Zusammensetzungen hierin beschrieben. In einigen Ausführungsformen wird die SC-β-Zelle gentechnisch verändert, um Neurogenin 3 auszudrücken. In einigen Ausführungsformen genetische Veränderung des SC-β-Zelle das Einführen eines synthetischen modifizierten codierenden mRNA Neurogenin 3. Es wird angenommen, dass die genetische Modifikation von SC-β-Zellen mit synthetischen, modifizierte RNA, die für Neurogenin 3 erhöht die Produktion von Insulin zu bilden, die Zellen. Es wird erwartet, dass derartige genetische Modifikation von jeder Insulinproduzierende Zelle eine erhöhte Insulinproduktion in der Zelle erwartet.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung ein SC-β-Zelle gentechnisch verändert, um eine nachweisbare Markierung an der Insulin-Locus umfassen. In einigen Ausführungsformen wird die SC-β-Zelle modifiziert, um beide Allele des Insulin-Locus mit einem nachweisbaren Marker zu ersetzen. In einigen Ausführungsformen wird die SC-β-Zelle genetisch modifiziert, um den nachweisbaren Marker in die Insulin-Locus einzufügen, so dass es mit Insulin in der SC-β-Zelle in Reaktion auf eine Glucoseprovokation angegeben. In einigen Ausführungsformen wird die SC-β-Zelle genetisch modifiziert, um den nachweisbaren Marker in den Insulin Locus anstelle von Insulin einzufügen, so dass sie anstelle von Insulin in der SC-β-Zelle in Reaktion auf eine Glucoseprovokation angegeben. Es wird erwogen, dass jede nachweisbare Marker kann in die Insulin-Locus eingesetzt werden, einschließlich beispielsweise eine Nukleinsäure, die ein fluoreszierendes Protein kodiert (zB GFP). Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass solche genetisch modifizierten SC-β-Zellen können in verschiedenen Screening-Verfahren, beispielsweise verwendet werden, um Mittel, die Insulin-Expression und / oder Sekretion von β-Zellen zu stimulieren durch Testen auf das nachweisbare Marker als Antwort auf den Agenten identifizieren, .
Zum Beispiel ein SC-β-Zelle genetisch modifiziert, um das Insulin-Gen in beiden Allelen zu ersetzen (zB mit GFP) mit einem Testmittel und jene Mittel, die die SC-β-Zellen zum Fluoreszieren veranlassen aufgrund der Expression des GFP sind kontaktiert werden als Kandidatenmittel, die zur Aktivierung von Insulingenexpression in β-Zellen zu sein. In anderen Worten kann der nachweisbare Marker als Surrogatmarker für die Insulinexpression in genetisch veränderten SC-β-Zellen verwendet werden.
Der Begriff „Identität“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf das Ausmaß, in dem die Reihenfolge von zwei oder mehr Nukleinsäuren oder Polypeptide, die gleiche ist. Die prozentuale Identität zwischen einer Sequenz von Interesse und eine zweite Sequenz über ein Fenster von Auswertung, beispielsweise über die Länge der Sequenz von Interesse, kann durch Angleichung der Sequenzen, die Bestimmung der Anzahl der Reste (Nucleotide oder Aminosäuren), die innerhalb der berechnet werden Fenster der Auswertung, die entgegengesetzt sind identisch Rückstand, die die Einführung von Lücken, um die Identität zu maximieren, Dividieren durch die Gesamtanzahl der Reste der Sequenz von Interesse oder die zweite Sequenz (welches größer ist), die innerhalb des Fensters liegen, und mit 100 multipliziert. Bei der Berechnung der Anzahl von identischen Resten benötigt, um einen bestimmten Prozentidentität zu erreichen, sind Fraktionen auf die nächste ganze Zahl aufgerundet. Prozentuale Identität kann mit der Verwendung einer Vielzahl von Computerprogrammen in der Technik bekannt, berechnet werden. Zum Beispiel Computerprogramme wie BLAST2, BLASTN, BLASTP, Gapped BLAST usw. erzeugen Ausrichtungen und bieten prozentuale Identität zwischen Sequenzen von Interesse.
Der Algorithmus der arlin und Altschul (Karlin und Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 22264-2268, 1990) wie in Karlin und Altschul, Proc modifiziert. Natl. Acad. ScL USA 90: 5873-5877, 1993 ist in die NBLAST und XBLAST-Programme von Altschul et al eingebaut. ( Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). Um gapped Alignments zu Vergleichszwecken zu erhalten, wird Gapped BLAST verwendet werden, wie in Altschul et al. ( Altschul et al. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). Wenn BLAST und Gapped BLAST-Programme können die Standardparameter der jeweiligen Programme verwendet werden. Eine PAM250 oder BLOSUM62-Matrix verwendet werden. Software zur Durchführung BLAST-Analysen ist durch die National Center for Biotechnology Information (NCB I) öffentlich zugänglich. Siehe die Website mit URL-World Wide Web-Adresse: „ncbi.nlm nih.gov“ für diese Programme. In einer speziellen Ausführungsform wird die prozentuale Identität mit BLAST2 mit Standardparametern, wie von der NCBI, berechnet.
Der Begriff „isoliert“ oder „teilweise gereinigt“, wie hierin verwendet, bezieht sich, im Falle einer Nukleinsäure oder Polypeptid, an eine Nukleinsäure oder ein Polypeptid, das von mindestens einer anderen Komponente (zB Nukleinsäure oder Polypeptid) getrennt ist, dass ist mit der Nukleinsäure oder Polypeptid vorhanden als in seiner natürlichen Quelle gefunden und / oder dass er mit der Nukleinsäure oder Polypeptid nicht vorhanden wäre, wenn sie von einer Zelle exprimiert wird, oder im Fall von sekretierten Polypeptiden sekretiert. Eine chemisch synthetisierte Nukleinsäure oder das Polypeptid oder eine synthetisierte Verwendung von in vitro-Transkription / Translation wird als „isoliert“.
Der Begriff „Einzelzelle“, wie hierin verwendet, betrifft eine Zelle, die von einem Organismus, in dem es ursprünglich gefunden wird oder ein Nachkomme einer solchen Zelle entfernt wurde. Gegebenenfalls der Zelle wurde in vitro kultiviert werden, zB in Gegenwart von anderen Zellen. Gegebenenfalls die Zelle wird später in einen zweiten Organismus eingebracht oder in dem Organismus, aus dem sie (oder die Zelle, aus der sie abstammt) isoliert wurde, wieder eingeführt.
Der Begriff „isolierte Population“ bezüglich einer isolierten Population von Zellen, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Population von Zellen, die entfernt wurde, und aus einem gemischten oder heterogene Population von Zellen getrennt ist. In einigen Ausführungsformen ist eine isolierte Population eine im Wesentlichen reine Population von Zellen im Vergleich zu der heterogenen Population aus dem die Zellen isoliert oder angereichert.
Der Begriff „im Wesentlichen rein“ mit Bezug auf eine bestimmte Zellpopulation bezeichnet eine Population von Zellen, die mindestens etwa 75%, vorzugsweise mindestens etwa 85%, bevorzugter mindestens etwa 90% und am meisten bevorzugt mindestens etwa 95% rein, bezogen auf die Zellen sind, die eine Gesamtzellpopulation stellen. Angewandt bedeutet dies, dass die Begriffe „im Wesentlichen rein“ oder „im Wesentlichen gereinigt“ in Bezug auf eine Population von SC-β-Zellen, bezeichnet eine Population von Zellen, die weniger als etwa 20%, bevorzugter weniger als etwa 15%, 10%, 8%, 7%, am meisten bevorzugt weniger als etwa 5%, 4%, 3%, 2%, 1% oder weniger als 1% von Zellen, die nicht als durch die Begriffe hier definiert sind, SC-β-Zellen. In einigen Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren zum Erweitern einee Population von SC-β-Zellen, wobei die expandierte Population von SC-β-Zellen eine im Wesentlichen reine Population von SC-β-Zellen ist.
Auf ähnliche Weise bezieht sich im Hinblick auf eine „im Wesentlichen reine“ oder „im Wesentlichen gereinigte“ Population von Insulin-positiven endokrinen Zellen auf eine Population von Zellen, die weniger als etwa 20%, bevorzugter weniger als etwa 15%, 10%, 8%, 7%>, am meisten bevorzugt weniger als etwa 5%, 4%, 3%, 2%, 1%>, oder weniger als 1% der Zellen, die nicht insulin positive endokrine Zellen, wie durch die Ausdrücke hierin definiert. In einigen Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren, um eine Population von Insulin-positiven endokrinen Zellen, wobei die expandierte Population von Insulin-positiven endokrinen Zellen eine im Wesentlichen reine Population von Insulin-positiven endokrinen Zellen zu erweitern.
Auf ähnliche Weise bezeichnet im Hinblick auf eine „im Wesentlichen reine“ oder „im Wesentlichen gereinigte“ Population von Ngn3 -positiven endokrine Vorläuferzellen eine Population von Zellen, die weniger als etwa 20%, bevorzugter weniger als etwa 15%, 10% , 8%, 7%, am meisten bevorzugt weniger als etwa 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, oder weniger als 1% der Zellen, die nicht durch das definierte sind Ngn3 positive endokrine Vorläuferzellen oder deren Nachkommen Begriffe, die hier. In einigen Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren, um eine Population von Ngn3 positive endokrine Vorläuferzellen, wobei die expandierte Population der für Ngn3 positive endokrine Vorläuferzellen ist eine im Wesentlichen reine Population Ngn3 positive endokrine Vorläuferzellen zu erweitern.
Auf ähnliche Weise bezeichnet im Hinblick auf eine „im Wesentlichen reine“ oder „im Wesentlichen gereinigte“ Population von Pdxl -positive, NKX6-1 -positiven Bauchspeicheldrüsenvorläuferzellen eine Population von Zellen, die weniger als etwa 20%, mehr bevorzugt weniger als enthalten etwa 15%, 10%, 8%, 7%, am meisten bevorzugt weniger als etwa 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, oder weniger als 1% der Zellen, die nicht Pdxl - positive, NKX6- sind 1-positiven pankreatischen Vorläuferzellen oder deren Nachkommen, wie durch die Ausdrücke hierin definiert. In einigen Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren, um eine Bevölkerung von Pdxl -positive, N X6- 1-positiven Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse, bei der die erweiterten Bevölkerung Pdxl -positive, NKX6-1 erweitern - positive Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse ist eine im Wesentlichen reine Population von Pdxl -positiven, NKX6- 1-positiven Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse.
Auf ähnliche Weise bezieht im Hinblick auf eine „im Wesentlichen reine“ oder „im Wesentlichen gereinigte“ Population von Pankreas-Vorläuferzellen Pdxl -positiv, sich auf eine Population von Zellen, die weniger als etwa 20%, bevorzugter weniger als etwa 15%, 10% , 8%, 7%, am meisten bevorzugt weniger als etwa 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, oder weniger als 1% der Zellen, die nicht Pdxl -positiven Bauchspeicheldrüsenvorläuferzellen oder deren Nachkommenschaft, wie durch die definierte Begriffe, die hier. In einigen Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren, um eine Population von Pankreas-Vorläuferzellen Pdxl -positive, wobei die expandierte Population von Pankreas-Vorläuferzellen Pdxl -positiven ist eine im Wesentlichen reine Population von Pankreas-Vorläuferzellen Pdxl -positiven erweitern.
Auf ähnliche Weise bezeichnet im Hinblick auf eine „im Wesentlichen reine“ oder „im Wesentlichen gereinigte“ Population von Urdarm Schlauchzellen eine Population von Zellen, die weniger als etwa 20%, bevorzugter weniger als etwa 15%, 10%, 8%, 7%, am meisten bevorzugt weniger als etwa 5%, 4%, 3%, 2%, 1% oder weniger als 1% der Zellen, die nicht durch die Begriffe hier definiert sind Urdarm Schlauchzellen oder deren Nachkommen . In einigen Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren, um eine Population von Urdarm Schlauchzellen, wobei die expandierte Population Urdarm Schlauchzellen ist eine im Wesentlichen reine Population Urdarm Schlauchzellen zu erweitern.
Auf ähnliche Weise bezieht sich im Hinblick auf eine „im Wesentlichen reine“ oder „im Wesentlichen gereinigte“ Population von endgültigen Entodermzellen auf eine Population von Zellen, die weniger als etwa 20%, bevorzugter weniger als etwa 15%, 10%, 8 %, 7%, am meisten bevorzugt weniger als etwa 5%, 4%, 3%, 2%, 1% oder weniger als 1% der Zellen, die nicht durch die Begriffe hier definiert sind, definitive Entodermzellen oder deren Nachkommen. In einigen Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren, um eine Bevölkerung von endgültigen Entodermzellen, wobei die erweiterten Bevölkerung definitive Entodermzellen ist eine im Wesentlichen reine Population von endgültigen Entodermzellen erweitern.
Auf ähnliche Weise bezeichnet im Hinblick auf eine „im Wesentlichen reine“ oder „im Wesentlichen gereinigte“ Population von pluripotenten Zellen eine Population von Zellen, die weniger als etwa 20%, bevorzugter weniger als etwa 15%, 10%, 8% 7%, am meisten bevorzugt weniger als etwa 5%, 4%, 3%, 2%, 1% oder weniger als 1% der Zellen, die nicht durch die Begriffe hier definiert sind pluripotente Zellen oder deren Nachkommen. In einigen Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren, um eine Population von pluripotenten Zellen, wobei die expandierte Population von pluripotenten Zellen eine im Wesentlichen reine Population von pluripotenten Zellen zu erweitern.
Die Begriffe „bereichernd“ oder „angereichert“ werden hierin austauschbar verwendet und bedeuten, dass die Ausbeute (Fraktion) der Zellen eines Typs von mindestens 10% gegenüber dem Anteil der Zellen dieses Typs in der Ausgangskultur erhöht oder Vorbereitung.
Die Begriffe „Verlängerung“ oder „Selbsterneuerung“ oder „Proliferation“ werden hierin austauschbar verwendet werden, werden verwendet, um sich auf die Fähigkeit von Stammzellen, sich durch Teilen in der gleichen nicht-spezialisierten Zelltyp über lange Zeiträume zu verlängern beziehen, und / oder viele Monate bis Jahre. In manchen Fällen bezieht sich die Proliferation der Ausdehnung der Zellen durch die wiederholte Teilung der einzelnen Zellen in zwei identische Tochterzellen.
Der Begriff „Linien“, wie er hier verwendet wird, beschreibt eine Zelle mit einem gemeinsamen Vorfahren oder Zellen mit einem gemeinsamen Entwicklungsschicksal. Beispielsweise im Kontext einer Zelle, Endoderm Ursprungs ist oder „endodermalen linage“ Das heißt, die Zelle aus einer Endoderm Zelle abgeleitet und kann entlang der Endoderm Abstammung beschränkt Wege unterscheiden, beispielsweise eine oder mehrere Entwicklungslinienwege, die zu ergeben steigen, um definitive Entodermzellen, die wiederum in die Leberzellen, Thymus, Bauchspeicheldrüse, Lunge und Darm differenziert werden können.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „xenogen“ bezieht sich auf Zellen, die von verschiedenen Spezies abgeleitet sind.
Ein „Marker“, wie hierin verwendet, wird verwendet, um die Eigenschaften und / oder Phänotyp einer Zelle zu beschreiben. Marker für die Selektion von Zellen, die Eigenschaften von Interesse verwendet werden. Marker werden mit spezifischen Zellen variieren. Marker sind Merkmale, auch morphologischen, funktionellen oder biochemischen (enzymatischen) Eigenschaften der Zelle von einem bestimmten Zelltyp oder Moleküle durch den Zelltyp exprimiert wird. Vorzugsweise werden solche Marker Proteine, und mehr bevorzugt weisen ein Epitop für Antikörper oder andere bindende Moleküle in der Technik verfügbar. Jedoch kann eine Markierung eines Moleküls in einer Zelle, einschließlich gefunden bestehen, aber nicht beschränkt auf, Proteine (Peptide und Polypeptide), Lipide, Polysaccharide, Nukleinsäuren und Steroide beschränkt. Beispiele für morphologische Eigenschaften oder Merkmale umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Form, Größe und nuklearen zytoplasmatischen Verhältnis beschränkt.
Beispiele funktioneller Eigenschaften oder Merkmale umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die Fähigkeit, sich an bestimmten Substraten haften, Fähigkeit Flüssigkeit aufzunehmen oder auszuschließen insbesondere Farbstoffe, die Fähigkeit, unter bestimmten Bedingungen zu migrieren, und die Fähigkeit, entlang bestimmter 1 ineages unterscheiden beschränkt. Marker können durch jedes Verfahren zur Verfügung, um einem Fachmann auf dem Gebiet erkannt werden. Marker können auch das Fehlen einer morphologischen Eigenschaft oder Abwesenheit von Proteinen, Lipiden usw. sein Markierungen können eine Kombination aus einer Gruppe von einzigartigen Eigenschaften von der Gegenwart und Abwesenheit von Polypeptiden und anderen morphologischen Merkmale sind.
Der Begriff „modulieren“ wird konsequent mit seiner Verwendung in der Technik, dh verwendet, was bedeutet, zu verursachen oder zu erleichtern, eine qualitative oder quantitative Veränderung, Veränderung oder Modifikation in einem Prozess, bahn, oder Phänomen von Interesse. Ohne Einschränkung, können solche Veränderungen eine Zunahme, Abnahme oder Änderung der relativen Stärke oder Aktivität verschiedener Komponenten oder Niederlassungen des Prozesses, bahn, oder Phänomen. A „Modulator“ ist ein Agent, bewirkt oder erleichtert eine qualitative oder quantitative Veränderung, Veränderung oder Modifikation in einem Prozess, bahn, oder Phänomen von Interesse.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „DNA“ als Desoxyribonukleinsäure definiert.
Der Begriff „Polynukleotid“ wird hierin austauschbar mit „Nukleinsäure“ verwendet, um ein Polymer von Nukleosiden anzuzeigen. Typischerweise ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung ist aus Nukleosiden besteht, die natürlicherweise in DNA und RNA gefunden werden (beispielsweise Adenosin, Thymidin, Guanosin, Cytidin, Uridin, Desoxyadenosin, Desoxythymidin
Desoxyguanosin und Desoxycytidin) durch Phosphodiesterbindungen verbunden sind. Jedoch umfasst der Begriff Moleküle, Nukleoside oder Nukleosid-Analoga, die chemisch oder biologisch modifizierte Basen, modifizierte Hauptketten usw., auch in natürlich vorkommenden Nukleinsäuren gefunden, und solche Moleküle können für bestimmte Anwendungen bevorzugt sein. Wo dieser Anmeldung bezieht sich auf ein Polynucleotid, versteht es sich, dass sowohl DNA, RNA und jeweils Ein- und doppelsträngige Formen (und Komplemente voneinander einzelsträngiges Molekül) vorgesehen sind. „PolynukleotidSequenz“, wie hier verwendet, kann das Polynukleotid Material selbst und / oder auf der Sequenzinformation (dh die Abfolge der Buchstaben-Abkürzungen für Basen) beziehen, die biochemisch charakterisiert einen spezifischen Nukleinsäure. Polynukleotidsequenz, die hier präsentiert wird in einer 5 ‚zu 3‘-Richtung, sofern nichts anderes angegeben ist.
Die Begriffe „Polypeptid“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Polymer von Aminosäuren. Die Begriffe „Protein“ und „Polypeptid“ werden hier austauschbar verwendet. Ein Peptid ist ein relativ kurzes Polypeptid, typischerweise zwischen etwa 2 und 60 Aminosäuren lang. Polypeptide hierin typischerweise verwendet werden, enthalten Aminosäuren, wie den 20 L-Aminosäuren, die in Proteinen am häufigsten vorkommen. Jedoch können auch andere Aminosäuren und / oder Aminosäureanaloga in der Technik bekannt verwendet werden. Eine oder mehrere der Aminosäuren in einem Polypeptid kann modifiziert werden, beispielsweise durch Zugabe einer chemischen Einheit wie einer Kohlenhydratgruppe, einer Phosphatgruppe, einer Fettsäuregruppe, einen Linker für die Konjugation, Funktionalisierung usw. Ein Polypeptid, das eine nicht-Polypeptideinheit kovalent oder kovalent damit verbundenen nicht hat, wird immer noch als ein „Polypeptid“. Beispielhafte Modifikationen umfassen Glykosylierung und Palmitoylierung. Polypeptide können aus natürlichen Quellen unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie, durch chemische Synthese Mittel wie herkömmliche Festphasenpeptidsynthese etc., gereinigt werden hergestellt.
Der Begriff „Polypeptid-Sequenz“ oder „Aminosäuresequenz“, wie hier verwendet, kann das Polypeptid Material beziehen sich selbst und / oder der Sequenzinformation (dh die Abfolge von Buchstaben oder drei Buchstaben-Codes als Abkürzungen für die Aminosäurenamen) biochemisch kennzeichnet ein Polypeptid. Eine Polypeptidsequenz, die hier dargestellt sind in einer N-terminalen zu C-terminalen Richtung, sofern nichts anderes angegeben ist.
Der Begriff eine „Variante“ in Bezug auf ein Polypeptid sein könnte, zB ein Polypeptid zu mindestens 80%, 85%, 90%, 95%, 98% oder 99% identisch zu Polypeptid voller Länge. Die Variante könnte ein Fragment voller Länge Polypeptid sein. Die Variante kann eine natürlich vorkommende Spleißvariante ist. Die Variante könnte ein Polypeptid zu mindestens 80%, 85%, 90%, 95%, 98% oder 99% identisch ist mit einem Fragment des Polypeptids, wobei das Fragment zu mindestens 50%, 60%, 70%, 80 sein %, 85%, 90%, 95%, 98% oder 99% so lang wie die gesamte Länge Wildtyp-Polypeptids oder einer Domäne davon, die eine Aktivität von Interesse, wie beispielsweise die Fähigkeit, das Vorhandensein eines SC-β Zellenbeginnerkennungs- oder ein Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläufer davon, aus der das SC-β-Zelle abgeleitet ist. In einigen Ausführungsformen ist die Domäne mindestens 100, 200, 300 oder 400 Aminosäuren lang, beginnend bei irgendeiner der Aminosäureposition in der Sequenz ist und sich in Richtung des C-Terminus. Variationen in der Technik bekannt ist, zu beseitigen oder wesentlich zu reduzieren, die Aktivität des Proteins werden vorzugsweise vermieden.
In einigen Ausführungsformen fehlt die Variante ein N- und / oder C-terminalen Teil des Volllängen-Polypeptid, beispielsweise bis zu 10, 20 oder 50 Aminosäuren von jedem Terminus fehlt. In einigen Ausführungsformen hat das Polypeptid die Sequenz eines reifen (full length) Polypeptid ist, auf dem ein Polypeptid, das ein oder mehrere Bereiche, wie beispielsweise ein Signalpeptid während der normalen intrazelluläre proteolytische Verarbeitung (zB entfernt während cotranslationalen oder senden musste bedeutete - translational Verarbeitung). In einigen Ausführungsformen, wobei das Protein mit Ausnahme durch Reinigung aus Zellen, die natürlicherweise exprimieren es hergestellt wird, ist das Protein ein chimäres Polypeptid ist, womit gemeint ist, dass sie Teile von zwei oder mehr unterschiedliche Arten. In einigen Ausführungsformen, wobei ein Protein durch Reinigung aus Zellen, die natürlicherweise das andere erzeugt als ist das Protein ein Derivat, womit gemeint ist, dass das Protein die zusätzlichen Sequenzen, die nicht an das Protein solange diese Sequenzen nicht wesentlich verringern bezogenen die biologische Aktivität des Proteins.
Der Begriff „funktionelle Fragmente“, wie hierin verwendet, ist ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die kleiner als, aber im Wesentlichen homolog mit dem Polypeptid ist ein Fragment, und wobei das funktionelle Fragment Polypeptidsequenz zu mindestens 50 % oder 60% oder 70% oder 80% oder 90% oder 100% oder mehr als 100%, beispielsweise 1, 5-fach, 2-fach, 3-fach, 4-fach oder größer als 4-fach wirksamer biologische Wirkung wie das Polypeptid, von dem es ein Fragment. Funktionelles Fragment Polypeptide können zusätzliche Funktionen, die verringerte Antigenität umfassen können, erhöhte DNA-Bindung (wie in Transkriptionsfaktoren), oder veränderte RNA-Bindung (wie in der Regulation RNA-Stabilität oder Abbau).
Der Begriff „Vektor“ bezieht sich auf ein Trägermolekül DNA, in die eine DNA-Sequenz kann für die Einführung in eine Wirtszelle eingefügt werden. Bevorzugt sind solche Vektoren, die zur autonomen Replikation und / oder Expression von Nukleinsäuren, mit denen sie verbunden sind. Vektoren dazu fähig, die Expression von Genen, mit denen sie operativ verknüpft sind, werden hierin als „Expressionsvektoren“ bezeichnet. Somit ist ein „Expressionsvektor“ ein spezialisierter Vektor, der die notwendigen regulatorischen Bereiche für die Expression eines Gens von Interesse in einer Wirtszelle benötigt enthält. In einigen Ausführungsformen das Gen von Interesse operabel an eine andere Sequenz in den Vektor. Vektoren können virale Vektoren oder nicht-virale Vektoren sein. Sollte virale Vektoren verwendet werden, ist es bevorzugt, die viralen Vektoren replikationsdefekt, die beispielsweise durch Entfernen aller viraler Nukleinsäuren, die für die Replikation kodieren erreicht werden kann. Ein replikationsdefekten viralen Vektors weiterhin ihre infektiösen Eigenschaften beibehalten und in die Zellen auf eine ähnliche Weise wie eine replizierende adenovirale Vektor jedoch einmal in die Zelle ein replikationsdefekten viralen Vektor nicht reproduzieren oder mehrfach zugegeben.
Vektoren umfassen auch Liposomen und Nanopartikeln und andere Mittel zur DNA-Moleküls an eine Zelle zu liefern.
Der Begriff „operabel gebunden“, dass die regulatorischen Sequenzen für die Expression der kodierenden Sequenz notwendig sind, in dem DNA-Molekül in die entsprechenden Positionen relativ zu der codierenden Sequenz platziert ist, um die Expression der codierenden Sequenz zu bewirken. Dieses gleiche Definition wird manchmal auf die Anordnung der Kodierungssequenzen und Transkriptions-Kontrollelemente (zB Promotoren, Enhancer und Terminationssignale Elementen) in einem Expressionsvektor angewendet wird. Der Begriff „funktionell verbunden“ umfasst mit einer geeigneten Startsignals (zB ATG) vor der Polynucleotidsequenz, die exprimiert werden, und die Aufrechterhaltung des richtigen Leserahmens, um die Expression der Polynucleotidsequenz unter der Kontrolle der Expressionskontrollsequenz gestatten, und Produktion des gewünschten Polypeptids durch die Polynucleotid-Sequenz kodiert wird.
Der Begriff „virale Vektoren“ bezieht sich auf die Verwendung von Viren oder Virusassoziierte Vektoren, die als Träger einer Nukleinsäure in eine Zelle zu konstruieren. Konstrukte können integriert und in nicht-replizierenden, defekte Virusgenome wie Adenovirus, Adeno- assoziierten Virus (AAV) oder Herpes simplex-Virus (HSV) oder andere, einschließlich reteroviral und lentivirale Vektoren, zur Infektion oder Transduktion in Zellen verpackt werden. Der Vektor kann oder kann nicht in das Genom der Zelle integriert werden. Die Konstrukte können virale Sequenzen für die Transfektion umfassen, falls gewünscht. Alternativ kann das Konstrukt in Vektoren episomal replizierbares, zB EPV und EBV-Vektoren eingebaut werden.
Die Begriffe „regulatorische Sequenz“ und „Promotor“ verwendet werden, hierin austauschbar, und Nukleinsäuresequenzen, beispielsweise Initiationssignale, Enhancer und Promotoren, die auslösen oder steuern die Transkription von Protein-codierenden Sequenzen, mit denen sie operativ verknüpft sind, beziehen. In einigen Beispielen ist die Transkription eines rekombinanten Gens unter der Kontrolle einer Promotorsequenz (oder einer anderen transkriptionalen regulatorischen Sequenz), die die Expression des rekombinanten Gens in einem Zelltyp, in dem Expression soll steuert. Es versteht sich auch, dass das rekombinante Gen unter der Kontrolle von Transkriptionsregulationssequenzen, die die gleichen sind oder die sich von solchen Sequenzen, die die Transkription der natürlich vorkommenden Form des Proteins zu steuern sein kann. In einigen Fällen ist die Promotorsequenz durch die synthetischen Maschinerie der Zelle erkannt wird, eingeführt oder Synthesemaschinerie für die Transkription eines spezifischen Gens erforderlich.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „Transkriptionsfaktor“ bezieht sich auf ein Protein, das auf bestimmte Teile von DNA unter Verwendung von DNA-Bindungsdomänen bindet, und ist ein Teil des Systems, das die Übertragung (oder Transkription) der genetischen Information von der DNA zu RNA steuert. Wie hierin verwendet, „Proliferation“ und „Proliferation“, um eine Zunahme der Anzahl von Zellen in einer Population (Wachstum) mittels Zellteilung beziehen. Zellproliferation versteht man allgemein aus der koordinierten Aktivierung mehrerer Signaltransduktionswege in Reaktion auf die Umwelt, einschließlich der Wachstumsfaktoren und andere Mitogene führen. Die Zellproliferation kann auch durch Freisetzung aus den Handlungen von intra- oder extrazelluläre Signale und Mechanismen, die blockieren oder sich negativ auf die Zellproliferation gefördert werden.
Der Begriff „selektierbarer Marker“ bezieht sich auf ein Gen, RNA oder Protein, das exprimiert wird, verleiht Zellen einen selektierbaren Phänotyp, wie Beständigkeit gegenüber einem zytotoxischen oder zytostatischen Mittel (zB Antibiotikaresistenz), Nahrungs Prototrophie oder Expressions eines bestimmten Proteins, die als Basis verwendet werden kann, um Zellen, die das Protein aus den Zellen, die nicht zum Ausdruck zu unterscheiden. Proteine, dessen Expression leicht nachgewiesen werden, beispielsweise einem fluoreszierenden oder lumineszierendes Protein oder ein Enzym, das auf ein Substrat einwirkt, um ein farbiges, fluoreszierendes oder lumineszierenden Substanz zu erzeugen („detektierbare Marker“) bilden eine Teilmenge von auswählbaren Marker. Die Anwesenheit eines selektierbaren Markers, um Expressionskontrollelemente stammt aus einem Gen, das in der Regel selektiv oder ausschließlich in pluripotente Zellen exprimiert verbunden ermöglicht es, zu identifizieren und auszuwählen somatischen Zellen, die zu einem pluripotenten Zustand umprogrammiert wurden. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, wie etwa Neomycin-Resistenzgen (neo), Puromycin-Resistenzgen (puro), Guanin-Phosphoribosyltransferase (gpt), Dihydrofolatreduktase (DHFR), Adenosindeaminase (ADA), Puromycin-N-Acetyltransferase (PAC), Hygromycin-ResistenzGen (hyg), Multidrug-Resistenzgen (MDR), Thymidinkinase (TK), Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HPRT), und hisD-Gens.
Nachweisbaren Markern gehören das grün fluoreszierende Protein (GFP) blau, Saphir, gelb, rot, orange, und Cyan fluoreszierende Proteine und Varianten von einer dieser Punkte. Lumineszierende Proteine wie Luciferase (zB Glühwürmchen oder Renilla-Luciferase) sind ebenfalls von Nutzen. So ergeben sich für einen Fachmann in der Technik der Begriff „selektierbarer Marker“, wie hier verwendet, kann ein Gen oder ein Expressionsprodukt des Gens, zB eine kodierte Protein zu verweisen.
In einigen Ausführungsformen der selektierbare Marker verleiht eine Proliferation und / oder Überlebensvorteil für Zellen, die es in Bezug auf Zellen, die es nicht exprimieren, oder dass es ausdrücken zu deutlich niedrigeren Niveau auszudrücken. Solche Proliferation und / oder Überlebensvorteil tritt typischerweise auf, wenn die Zellen unter bestimmten Bedingungen, das heißt gehalten „selektiven Bedingungen. „Um eine effektive Auswahl zu gewährleisten, kann eine Population von Zellen für ein unter Bedingungen und für eine ausreichende Zeitdauer aufrechterhalten, so dass Zellen, die nicht den Marker exprimieren nicht vermehren und / oder nicht überleben und werden von der Bevölkerung eliminiert oder werden ihre Anzahl ist nur ein sehr kleiner Bruchteil der Bevölkerung verringert. Der Prozess der Auswahl von Zellen, die einen Marker, eine Proliferation und / oder Überlebensvorteil verleiht, indem eine Population von Zellen unter selektiven Bedingungen exprimieren, um weitgehend oder vollständig zu eliminieren Zellen, die den Marker exprimieren, wird hierin als „positive Selektion“ , und die Markierung wird als „nützlich für die positive Selektion“ zu sein.
Negativen Selektionsmarkern und nützlich für die negative Selektion sind auch von Interesse für bestimmte der hierin beschriebenen Methoden. Expression solcher Marker verleiht eine Proliferation und / oder Überlebensnachteil auf Zellen, die den Marker relativ zu Zellen, die nicht den Marker exprimieren oder ausdrücken zu deutlich niedrigeren Niveaus (oder, als ein weiterer Weg zum Ausdruck bringen, Zellen, die nicht den Marker exprimieren, haben eine Proliferation und / oder Überlebensvorteil in Bezug auf Zellen, die den Marker exprimieren). Zellen, die den Marker exprimieren kann somit weitgehend oder vollständig aus einer Population von Zellen eliminiert werden, wenn sie in selektiven Bedingungen für eine ausreichende Zeitdauer aufrechterhalten.
Ein „Reportergen“, wie hierin verwendet, umfasst jedes Gen, das gentechnisch in eine Zelle, die mit dem Phänotyp der Stammzellen fügt eingeführt. Reportergene, wie in dieser Erfindung offenbart werden soll fluoreszierende, lumineszierende, enzymatische und Resistenz-Gene, aber auch andere Gene, die leicht von Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet erkannt werden kann, zu umfassen. In einigen Ausführungsformen der Erfindung werden Reportergene als Marker für die Identifizierung bestimmter Stammzellen, kardiovaskuläre Stammzellen und ihre differenzierte Nachkommenschaft verwendet. Ein Reportergen ist allgemein operativ mit Sequenzen, die seine Expression in einer Weise abhängig von einem oder mehreren Zuständen, die durch das Messen der Expression des Reportergens überwacht regeln verbunden. In einigen Fällen kann die Expression des Reportergens in lebenden Zellen zu bestimmen. Bei denen lebende Zelle Reportergen-Assays verwendet werden, können die Reportergenexpression zu mehreren Zeitpunkten überwacht werden, beispielsweise 2, 3, 4, 5, 6, 8, oder 10 oder mehr Zeitpunkten.
In einigen Fällen, wo eine Lebendzellreporterassay verwendet wird, wird die Reportergenexpression mit einer Frequenz von mindestens etwa 10 Minuten bis etwa 24 Stunden, beispielsweise 20 Minuten, 1 Stunde, 2 Stunden, 3 Stunden, 4 Stunden, 5 überwacht Stunden, 6 Stunden, 7 Stunden, 8 Stunden, 9 Stunden, 10 Stunden, 12 Stunden, 18 Stunden oder einer anderen Frequenz aus jedem ganze Zahl zwischen etwa 10 Minuten bis etwa 24 Stunden.
Die Begriffe „Subjekt“ und „Individuum“ werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Tier, beispielsweise ein Mensch, von dem Zellen erhalten werden kann und / oder an die Behandlung, einschließlich Prophylaxe, mit den Zellen, wie beschrieben, Hierbei ist vorgesehen. Zur Behandlung solcher Infektionen, Zustände oder Krankheitszustände, die spezifisch für ein bestimmtes Tier sind, wie einem menschlichen Patienten, bezieht sich der Ausdruck unter diesem bestimmten Tier. Die „nichtmenschlichen Tiere“ und „nicht-menschliche Säuger“, wie hier austauschbar verwendet, schließt Säugetiere, wie Ratten, Mäuse, Kaninchen, Schafe, Katzen, Hunde, Kühe, Schweine und nicht-menschlichen Primaten. Der Begriff „Patient“ umfasst auch jede Wirbeltiere einschließlich, aber nicht zu den Säugetieren, Reptilien, Amphibien und Fische beschränkt. Vorteilhafterweise ist der Gegenstand jedoch ein Säugetier, wie einem Menschen oder einem anderen Säuger, wie einem domestizierten Säugetier, zB Hund, Katze, Pferd und dergleichen oder Produktions Säugetier, zB Kuh, Schaf, Schwein, und dergleichen.
Die Begriffe „Diabetes“ und „Diabetes mellitus“ werden hier austauschbar verwendet. Die Weltgesundheitsorganisation definiert den diagnostischen Wert der Nüchternblutzucker-Konzentration auf 7,0 mmol / 1 (126 mg / dl) und oben für Diabetes Mellitus (Vollblut 6,1 mmol / 1 oder 1 10 mg / dl), oder 2-Stunden-Blutzuckerspiegel 1 1 0,1 mmol / L oder höher (200 mg / dl oder höher). Andere Werte hindeuten oder Anzeige hohes Risiko für Diabetes mellitus, umfassen erhöhten arteriellen Blutdruck 140/90 mm Hg oder höher; erhöhte Plasmatriglyceride (1,7 mmol / L; 150 mg dl) und / oder niedriges HDL-Cholesterin (weniger als 0,9 mmol / 1, 35 mg / dl für Männer; weniger als 1,0 mmol / 1, 39 mg / dL Frauen); zentrale Fettleibigkeit (Männer: waist to hip ratio höher als 0,90; Frauen: waist to hip ratio höher als 0,85) und / oder Body Mass Index von mehr als 30 kg / m <2>; Mikroalbuminurie, wo die Harnalbuminausscheidungsrate 20 ng / min oder höher oder albuminxreatinine Verhältnis 30 mg / g oder höher). Der Begriff Diabetes encompases alle Formen von Diabetes, wie zB Typ I, Typ 11 und Typ 1 .5.
Die Begriffe „behandeln“, „Behandeln“, „Behandlung“, etc., wie zu einer isolierten Zelle angewendet wird, umfassen das Unterwerfen der Zelle, um jede Art von Prozeß oder der Zustand oder die Durchführung jeder Art der Manipulation oder die Prozedur auf die Zelle. Wie an einen Patienten angewendet, die Begriffe beziehen sich auf die medizinische oder chirurgische Aufmerksamkeit, Sorgfalt, oder Management auf einen einzelnen. Das Individuum ist in der Regel krank oder verletzt, oder ein erhöhtes Risiko, krank zu werden in Bezug auf eine durchschnittliche Mitglied der Bevölkerung und bei Bedarf einer solchen Aufmerksamkeit, Sorgfalt, oder Management.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Behandeln“ und „Behandlung“ bezieht sich auf die Verabreichung an ein Individuum einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, so dass der Gegenstand als eine Verringerung von mindestens einem Symptom der Krankheit oder einer Verbesserung der Krankheit, beispielsweise vorteilhafte oder erwünschte klinische Resultate. Für die Zwecke dieser Erfindung vorteilhafte oder erwünschte klinische Resultate, sind aber nicht beschränkt auf, Linderung von einem oder mehreren Symptomen, Verringerung des Ausmaß der Krankheit, stabilisiert (dh keine Verschlechterung) Zustand der Krankheit, Verzögerung oder Verlangsamung des Krankheitsfortschritts, Verbesserung oder Linderung des Krankheitszustands und Remission (ob teilweise oder vollständige), auch nachweisbar oder nicht nachweisbar. Die Behandlung kann auf Verlängerung des Überlebens beziehen sich im Vergleich zum erwarteten Überlebens wenn nicht in Behandlung. Somit wird ein Fachmann auf dem Gebiet erkennt, dass eine Behandlung, kann der Krankheitszustand zu verbessern, kann aber nicht eine vollständige Heilung der Krankheit zu sein. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Behandlung“ die Prophylaxe. Alternativ ist die Behandlung „wirksam“, wenn das Fortschreiten einer Krankheit reduziert oder gestoppt.
„Behandlung“ kann auch bedeuten, Verlängerung des Überlebens im Vergleich zur erwarteten Überlebens, wenn nicht in Behandlung. Diejenigen, die in einer Behandlung bedürfen umfassen jene, die bereits mit einem Herzleiden diagnostiziert, sowie diejenigen, wahrscheinlich eine Herzerkrankung zu entwickeln aufgrund genetischer Anfälligkeit oder anderen Faktoren wie Gewicht, Ernährung und Gesundheit.
Wie hier verwendet, werden die Begriffe „Verwalten“, „Einführung“ und „Transplan“ werden in Zusammenhang mit der Anordnung der Zellen β-Zellen der Erfindung in einen Patienten durch ein Verfahren oder eine Route, die in zumindest teilweise die Lokalisierung der eingesetzten Zellen an einer gewünschten Stelle führt, zB, SC). Die Zellen z.B. SC-β-Zellen (zB Pankreas-β-Zellen oder Bauchspeicheldrüsen β-ähnlichen Zellen) direkt an der Bauchspeicheldrüse implantiert werden, oder alternativ auf jedem geeigneten Weg, die Lieferung zu einem gewünschten Ort im Patienten führt, verabreicht werden, bei denen mindestens ein Teil die implantierten Zellen oder Bestandteile der Zellen lebensfähig bleiben. Der Zeitraum der Lebensfähigkeit der Zellen nach der Verabreichung an einen Patienten so kurz wie einige Stunden, beispielsweise um 24 Stunden, bis zu einigen Tagen, so lange wie mehrere Jahre. In einigen Fällen können die Zellen auch in einem nichtpankreatischen Ort (zB Mikrokapseln) die implantierten Zellen am Implantationsort zu pflegen und Migration der Vermeidung verabreicht werden, wie zum Beispiel in der Leber oder subkutan, beispielsweise in einer Kapsel, implantierten Zellen.
Die Ausdrücke „parenterale Verabreichung“ und „parenteral verabreicht“, wie er hier verwendet wird, bedeutet andere Verabreichungsarten als enterale und topische Verabreichung, gewöhnlich durch Injektion, und schließen ohne Einschränkung die intravenöse, intramuskuläre, intraarterielle, intrathekale, intraventrikuläre, intrakapsuläre, intraorbitale, intrakardiale, intradermale, intraperitoneale, transtracheale, subkutane, subkutanen, intraartikulären, sub Kapsel, subarachnoide, intraspinale, intracerebro spinal, und intrasternale Injektion und Infusion. Die Ausdrücke „systemische Verabreichung“, „systemisch verabreicht“, „periphere Verabreichung“ und „peripher verabreicht“, wie hier verwendet, bedeuten die Verabreichung von Herz-Kreislauf-Stammzellen und / oder deren Nachkommen und / oder Verbindung und / oder einem anderen Material aber nicht direkt in die Zentrales Nervensystem, so dass er das Tier System gelangt und somit unterliegt den Stoffwechsel und andere ähnliche Verfahren, beispielsweise die subkutane Verabreichung.
Der Begriff „Gewebe“ bezieht sich auf eine Gruppe oder Schicht von spezialisierten Zellen, die zusammen bestimmte spezielle Funktionen auszuführen. Der Begriff „Gewebespezifisch“ bezieht sich auf eine Quelle von Zellen, die aus einem bestimmten Gewebe.
Die Begriffe „Abfall“, „reduziert“, „Verringerung“, „Abfall“ oder „Sperre“ sind alle hier allgemein verwendet werden, um einen Rückgang von einem statistisch signifikanten Menge bedeuten. Jedoch jeden Zweifel zu vermeiden, „verringert“, „Verminderung“ oder „Abfall“ oder „Hemmung“ bedeutet eine Verminderung um mindestens 10% im Vergleich zu einem Referenzpegel, beispielsweise eine Verringerung um mindestens ungefähr 20%, oder mindestens etwa 30% oder zumindest etwa 40%, oder mindestens etwa 50%, oder mindestens etwa 60%, oder mindestens etwa 70%, oder mindestens etwa 80% oder zumindest etwa 90% oder bis einschließlich einer 100% Verringerung (dh abwesend Ebene im Vergleich zu einer Referenzprobe) oder irgendeine Abnahme zwischen 10- 100%, im Vergleich zu einem Referenzpegel.
Die Begriffe „erhöht“, „Anstieg“ oder „erhöhen“ oder „Aktivieren“ sind alle hier, um in der Regel verwendet werden, bedeuten eine Steigerung um eine statisch signifikante Menge; zur Vermeidung von Zweifeln werden die Ausdrücke „erhöht“, „erhöhen“ oder „erhöhen“ oder „Aktivieren“ bedeutet eine Zunahme von mindestens 10% im Vergleich zu einem Referenzwert, beispielsweise eine Erhöhung von mindestens etwa 20%, oder mindestens etwa 30% oder zumindest etwa 40%, oder mindestens etwa 50%, oder mindestens etwa 60%, oder mindestens etwa 70%, oder mindestens etwa 80% oder zumindest etwa 90% oder bis einschließlich einer Erhöhung 100% oder einem Anstieg zwischen 10- 100%) im Vergleich zu einem Referenzwert oder mindestens etwa 2-fach, vorzugsweise mindestens 3-fach, besonders bevorzugt mindestens einen 4-fachen, oder mindestens etwa 5-fachen oder mindestens etwa 10-fache Erhöhung oder Erhöhungen zwischen 2-fach und 10-fach oder mehr im Vergleich zu einem Referenzpegel.
Der Begriff „statistisch signifikant“ oder „wesentlich“ bezieht sich auf eine statistische Signifikanz, und bedeutet im allgemeinen einen zweiStandardAbweichung (2SD) unter den Normalwert oder niedriger Konzentration des Markers. Der Begriff bezieht sich auf statistische Daten, dass es einen Unterschied gibt. Es wird als die Wahrscheinlichkeit, dass sie eine Entscheidung, um die Nullhypothese ablehnen, wenn die Nullhypothese tatsächlich wahr ist definiert. Die Entscheidung wird oft mit der p-Wert vorgenommen.
Der hier verwendete Begriff „umfassend“ bzw. „enthält“ verwendet wird, in Bezug auf die Zusammensetzungen, Methoden und jeweiligen Komponente (n) davon, die für die Erfindung wesentlich sind, verwendet, aber offen für die Aufnahme von nicht angegebenen Elemente, auch wesentliche oder nicht.
Der hier verwendete Ausdruck „im Wesentlichen bestehend aus, bezieht sich auf jene Elemente für eine gegebene Ausführungsform nicht erforderlich. Der Ausdruck erlaubt die Anwesenheit von zusätzlichen Elementen, die sich nicht wesentlich auf die grundlegenden und neuartigen oder funktionelle Eigenschaft (en) dieser Ausführungsform der Erfindung.
Der Begriff „aus, bezieht sich auf Zusammensetzungen, Verfahren und entsprechenden Komponenten davon, wie hierin beschrieben, die abzüglich aller nicht in dieser Beschreibung der Ausführungsform angegeben sind.
Wie in dieser Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen verwendet, die Singularformen „ein“, „eine“ und „das“ auch die Pluralformen umfassen, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes. So kann beispielsweise Verweise auf „das Verfahren“ umfasst ein oder mehrere Verfahren und / oder die Schritte des Typs hierin beschrieben und / oder die sich ergeben sich für den Fachmann auf dem Gebiet beim Lesen dieser Offenbarung und so weiter.
Stammzellen
Stammzellen sind Zellen, die die Fähigkeit, sich durch mitotische Zellteilung erneuern und kann in eine breite Palette von spezialisierten Zelltypen differenzieren zu behalten. Die zwei große Arten von Säugetieren Stammzellen: embryonale Stammzellen (ES-Zellen), die in Blastozysten zu finden sind, und adulte Stammzellen, die in adulten Geweben zu finden sind. In einem sich entwickelnden Embryo, können Stammzellen in die betroffenen Fach embryonalem Gewebe unterscheiden. Bei erwachsenen Organismen, Stammzellen und Vorläuferzellen wirken als Reparatursystem für den Körper, Nachfüllen von spezialisierten Zellen, sondern auch pflegen die normale Umsatz von regenerativen Organe, wie Blut, Haut oder Darmgewebe. Pluripotenten Stammzellen in Zellen aus einem der drei Keimblätter abgeleitet unterscheiden.
Obwohl bestimmte Ausführungsformen werden nachfolgend in Bezugnahme auf die Verwendung von Stammzellen zur Herstellung von SC-β-Zellen beschrieben (zB reife Pankreas-β-Zellen oder β-ähnlichen Zellen) oder Vorstufen davon, können Keimzellen anstelle von verwendet werden, oder mit, die Stammzellen mindestens einen SC-β-Zelle bereitzustellen, die ähnliche Protokolle wie die hier beschriebenen veranschaulichenden Protokollen. Geeignete Keimzellen hergestellt werden, beispielsweise aus der Urkeimzellen in menschlichen fetalen Material vorhanden nach der letzten Regelblutung entnommen etwa 8- 1 1 Woche. Illustrative Keimzellherstellungsverfahren sind beispielsweise beschrieben in Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998 und US-P. No. 6.090.622 .
ES-Zellen, beispielsweise menschliche embryonale Stammzellen (hES) oder embryonale Stammzellen der Maus (mESCs) mit einer nahezu endlosen Replikationskapazität und dem Potential in den meisten Zelltypen vorhanden zu differenzieren, im Prinzip eine unbegrenzte Edukt erzeugen die differenzierten Zellen für die klinische Therapie
(http://stemcells.nih.gov/info/scireport/2006report.htm, 2006). Eine mögliche Anwendung von ES-Zellen ist es, neue pankreatischen β-Zellen für die Zellersatztherapie des Typ I-Diabetiker, indem zuerst Endoderm zB definitive Entoderm von zB hESCs und dann weitere Differenzierung der definitiven Endoderms in mindestens einen erzeugen Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläufer davon, und dann eine weitere Differenzierung der mindestens eine Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläufer davon in eine SC-β-Zelle.
hES-Zellen werden zum Beispiel durch Cowan et al. (N Engl. J. Med. 350: 1 353, 2004) und Thomson et al. ( Science 282: 1 145, 1998); embryonaler Stammzellen aus anderen Primaten, Rhesus Stammzellen (Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995), marmoset Stammzellen (Thomson et al. Biol. Reprod. 55: 254, 1996), und humanen embryonalen Keim (hEG) Zellen (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998), können ebenfalls in den hierin offenbarten Verfahren verwendet werden. mESCs, beschrieben werden, beispielsweise durch Tremml et al. ( Curr Protoc Stem Cell Biol. Kapitel 1: Einheit 1 C.4, 2008). Die Stammzellen können beispielsweise unipotent, totipotent multi oder pluripotent. In einigen Beispielen werden alle Zellen des Primaten-Ursprungs, die in der Lage ist, die Nachkommen Derivate mindestens eines Keimschicht oder aller drei Keimblätter sind, können in den hierin offenbarten Verfahren verwendet werden.
In bestimmten Beispielen können ES-Zellen isoliert werden, zum Beispiel, wie in Cowan et al. (N Engl. J. Med. 350: 1353 2004) und U.S. Pat. No. 5.843.780 und Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995. Beispielsweise kann hESCs Zellen aus menschlichen Blastozysten-Zellen unter Verwendung der von Thomson et al beschriebenen Techniken hergestellt werden. (Das US-Patent. No. 6.200.806 ; Science 282: 1 145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133 ff, 1998) und Reubinoff et al, Nature Biotech.. 18: 399, 2000. Äquivalenten Zelltypen hESCs umfassen ihre pluripotente Derivate wie primitive Ektoderm-like (EPL) Zellen, wie dargelegt, beispielsweise in der WO 01/51610 (BresaGen). hESCs kann auch aus menschlichen Präimplantationsembryonen erhalten werden. Alternativ können in vitro befruchtet (IVF) Embryonen können verwendet werden, oder ein Zell menschlichen Embryonen bis zum Blastozystenstadium erweitert werden (Bongso et al, Hum Reprod. 4: 706, 1989). Embryonen kultiviert werden bis zum Blastozystenstadium in G 10,2 und G2.2-Medium (Gardner et al., Fertil. Steril. 69:84, 1998).
Die Zona pellucida von Blastozysten entwickelt durch kurze Exposition entfernt, um (Sigma) Pronase. Die inneren Zellmassen kann durch Immunosurgery, wobei Blastozysten werden in einen 1 ausgesetzt isoliert werden: 50-Verdünnung von Kaninchen-anti-human-Milzzelle Antiserum für 30 min, dann 5 min dreimal in DMEM gewaschen und auf eine 1 ausgesetzt: 5 Verdünnung der Meerschweinchen-Komplement (Gibco) für 3 min (Solter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 5099, 1975). Nach zwei weiteren Waschungen in DMEM, lysiert Trophektoderm Zellen aus dem intakten inneren Zellmasse (ICM) durch vorsichtiges Pipettieren und der ICM auf MEF Feeder-Schichten überzogen entfernt. Nach 9 bis 15 Tagen inneren Zellmasse abgeleiteten Auswüchse kann in Klumpen entweder durch Einwirkung von Calcium- und Magnesium-freier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 1 mM EDTA durch Belichtung getrennt werden, um Dispase oder Trypsin, oder durch mechanische Dissoziation mit einer Mikropipette; und klicken Sie dann auf MEF in frischem Medium erneut plattiert. Wachsenden Kolonien mit undifferenzierte Morphologie kann individuell durch Mikro ausgewählt werden mechanisch in Klumpen dissoziiert und erneut ausplattiert. ES-ähnliche Morphologie wird als kompakte Kolonien mit scheinbar hohe Zellkern zu Zytoplasma-Verhältnis und prominenten Nukleolen gekennzeichnet. Resultierende hESCs kann dann routinemäßig aufgeteilt werden alle 1 bis 2 Wochen, beispielsweise durch kurze Trypsinierung, Kontakt mit Dulbeccos PBS (enthaltend 2 m EDTA), Exposition gegenüber IV Collagenase (200 U / ml; Gibco) -Typ oder durch Auswahl von Einzel Kolonien, die durch Mikropipette. In einigen Beispielen verklumpen Größen von etwa 50 bis 100 Zellen optimal. mESCs Zellen können von der Anwendung von zB Conner et al beschriebenen Techniken hergestellt werden. ( Curr. Prot. in Mol. Biol. Einheit 23.4, 2003).
Embryonale Stammzellen können aus Blastozysten von Mitgliedern der Primaten ( US-PS 5.843.780 isoliert werden; Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995). Humane embryonale Stammzellen (hES-Zellen) können aus menschlichen Blastozysten Zellen unter Verwendung der von Thomson et al beschriebenen Techniken hergestellt werden. ( Das US-Patent Nr. 6,200,806 ; Science 282: 1 145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133 ff, 1998) und Reubinoff et al, Nature Biotech.. 18: 399, 2000. Äquivalenten Zelltypen hES umfassen ihre pluripotente Derivate wie primitive Ektoderm-like (EPL) Zellen, wie in der WO 01/51610 (BresaGen) skizziert.
Alternativ kann in einigen Ausführungsformen hES-Zellen können aus menschlichen Präimplantationsembryonen erhalten werden. Alternativ können in vitro befruchtet (IVF) Embryonen können verwendet werden, oder ein Zell menschlichen Embryonen bis zum Blastozystenstadium erweitert werden (Bongso et al, Hum Reprod. 4: 706, 1989). Embryos kultiviert werden bis zum Blastozystenstadium in G 1 .2 und G2.2 Medium (Gardner et al., Fertil. Steril. 69:84, 1998). Die Zona pellucida von Blastozysten entwickelt durch kurze Exposition entfernt, um (Sigma) Pronase. Die inneren Zellmassen werden durch Immunosurgery, wobei Blastozysten werden in einen 1 ausgesetzt isoliert: 50 Verdünnung von Kaninchen-Anti-Human-Milz-Zellantiserum für 30 min, dann 5 min dreimal in DMEM gewaschen und auf eine 1 ausgesetzt: 5-Verdünnung von Meerschweinchen-Komplement (Gibco) für 3 min (Solter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 5099, 1975). Nach zwei weiteren Waschungen in DMEM, lysiert Trophektoderm Zellen aus dem intakten inneren Zellmasse (ICM) durch vorsichtiges Pipettieren und der ICM auf MEF Feeder-Schichten überzogen entfernt.
Nach MAI 9-1 Tagen inneren Zellmasse abgeleiteten Auswüchse in Klumpen entweder durch Einwirkung von Calcium- und Magnesium-freier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 1 mM EDTA durch Belichtung dissoziiert, um Dispase oder Trypsin oder durch mechanische Dissoziation mit einer Mikropipette; und klicken Sie dann auf MEF in frischem Medium erneut plattiert. Wachsende Kolonien mit undifferenzierte Morphologie werden individuell von Mikropipette ausgewählt, mechanisch in Klumpen dissoziiert und erneut plattiert. ES-ähnliche Morphologie wird als kompakte Kolonien mit scheinbar hohe Zellkern zu Zytoplasma-Verhältnis und prominenten Nukleolen gekennzeichnet. Resultierenden ES-Zellen werden dann routinemßig aufgeteilt alle 1 bis 2 Wochen durch kurze Trypsinierung, Kontakt mit Dulbeccos PBS (enthaltend 2 mM EDTA), Exposition gegenüber IV Co-Typ! lagenase 200 U / ml; Gibco) oder durch Selektion von einzelnen Kolonien von Mikropipette. Klumpen Größen von etwa 50 bis 100 Zellen optimal.
In einigen Ausführungsformen sind menschliche embryonale Keim (LIEG) Zellen pluripotente Stammzellen, die in den Verfahren verwendet werden können, wie hier offenbart, in primitive Endoderm Zellen differenzieren. hEG Zellen können verwendet werden von Urkeimzellen in menschlichen fetalen Material vorhanden vorbereitet werden über 8- 1 1 Wochen nach der letzten Regelblutung entnommen. Geeignete Herstellverfahren sind in Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998 und US-P. No. 6.090.622 , das hierin in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Kurz gesagt, Genitalleisten verarbeitet, um disaggregierten Zellen zu bilden. ZB Wachstumsmedium D EM, 4500 mg / 1 D-Glucose, 2200 mg / L m NaHC03; 15% ES qualifizierte fötalem Kälberserum (BRL); 2 mM Glutamin (BRL); 1 mM Natriumpyruvat (BRL); 1000- 2000 U / ml humanes rekombinantes Leukämiehemmfaktor (LIF, Genzyme); 1 -2 ng / ml humanes rekombinantes bFGF (Genzyme); und 10 µM Forskolin (in 10% DMSO). Sechsundneunzig Well-Gewebekulturplatten mit einem subkonfluente Schicht aus Feeder-Zellen (beispielsweise STO-Zellen, ATCC No. CRL 1503) für 3 Tage im modifizierten Beispiel Wachstumsmedium frei von LIF, bFGF oder Forskolin kultiviert, inaktiviert mit 5000 hergestellt rad γ-Bestrahlung ~ 0,2 ml primären Keimzelle (PGC) Suspension wird zu jeder der Vertiefungen gegeben. Der erste Durchgang ist nach 7-10 Tagen in EG Wachstumsmedium durchgeführt, die Übertragung zu jeder Vertiefung eine Vertiefung einer 24-Well-Kulturplatte zuvor mit bestrahlten STO-Mausfibroblasten vorbereitet. Die Zellen werden mit täglichen Austausch des Mediums, bis die Zellmorphologie, die mit EG-Zellen kultiviert beobachtet wird, typischerweise nach 7-30 Tagen oder 1 -4 Passagen.
Bei bestimmten Beispielen die Stammzellen (zB eine Zelle, die nicht auf eine bestimmte Zeilenzahl begangen) vor der Einwirkung von mindestens einem β-Zellreifung Faktor gemß den Verfahren wie hier offenbart undifferenziert sein, während in anderen Beispielen kann es sein, wünschenswert, die Stammzellen eine oder mehrere Zwischenzelltypen vor der Exposition des zumindest einen β-Zellreifung Faktor (s) hierin beschriebenen unterscheiden. Beispielsweise der Stammzellen kann morphologischen, biologischen oder physikalischen Eigenschaften von undifferenzierten Zellen, die verwendet werden können, um sie aus differenzierten Zellen des Embryo oder erwachsenen Ursprungs unterscheiden anzuzeigen. In einigen Beispielen kann undifferenzierte Zellen in den zwei Dimensionen einer mikroskopischen Ansicht in Kolonien von Zellen mit hoher Atom / Zytoplasma-Verhältnis und prominente Nucleoli angezeigt. Die Stammzellen können selbst sein (beispielsweise im Wesentlichen ohne irgendwelche undifferenzierten Zellen vorhanden ist), oder kann in der Gegenwart von differenzierten Zellen verwendet werden. In bestimmten Beispielen können die Stammzellen in Gegenwart von geeigneten Nährstoffen gezüchtet werden, und gegebenenfalls anderen Zellen, so dass die Stammzellen wachsen kann und gegebenenfalls zu unterscheiden.
Zum Beispiel können embryonale Fibroblasten oder Fibroblasten-ähnlichen Zellen in der Kultur vorhanden sein, um das Wachstum der Stammzellen zu unterstützen. Die Fibroblasten können in allen Phasen während einer Stufe des Stammzellwachstums vorhanden, aber nicht unbedingt sein. Zum Beispiel kann die Fibroblasten zugesetzt, um die Zellkulturen in einem ersten Kultivierungsstufe stammen und auf die Stammzellkulturen in einem oder mehreren nachfolgenden Kultivierungsstadien nicht hinzugefügt.
Stammzellen in allen Aspekten der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können beliebige Zellen, die aus jeder Art von Gewebe gewonnen werden (zum Beispiel von embryonalem Gewebe wie fötalem oder vorge fötalem Gewebe oder adultem Gewebe), die Stammzellen haben die Eigenschaft, unter geeigneten Bedingungen zur Herstellung von Nachkommen der verschiedenen Zelltypen, beispielsweise fähig Derivate der alle von zumindest einer der drei Keimschichten (Endoderm, Mesoderm und Ektoderm). Diese Zelltypen können in der Form einer etablierten Zelllinie zur Verfügung gestellt werden, oder sie können direkt aus einer primären embryonalen Gewebe erhalten und sofort zur Unterscheidung verwendet werden.
Enthalten sind Zellen in der NIH mit menschlichen embryonalen Stammzellen Registry aufgeführt, zB hESBGN- 01, hESBGN-02, hESBGN-03, hESBGN-04 (BresaGen, Inc. ); Hes- 1, HES-2, HES-3, HES-4, HES-5, HES-6 (ES Cell International); Miz-hES 1 (MizMedi Krankenhaus-Seoul National University); HSF- 1, HSF-6 (Universität von Kalifornien in San Francisco); und HALLO, H7, H9, HALLO 3, HALLO 4 (Wisconsin Alumni Research Foundation (WiCell Research Institute)). In einigen Ausführungsformen hat die Quelle der menschlichen Stammzellen oder pluripotenten Stammzellen chemisch induzierter Differenzierung in reife Insulin-positiven Zellen verwendet werden, nicht um die Zerstörung eines menschlichen Embryos.
In einer anderen Ausführungsform können die Stammzellen aus Gewebe, einschließlich festem Gewebe isoliert werden. In einigen Ausführungsformen ist das Gewebe, Haut, Fettgewebe (z Fettgewebe), Muskelgewebe, Herz oder Herzgewebe. In anderen Ausführungsformen ist das Gewebe, beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf, Nabelschnurblut, Plazenta, Knochenmark oder Knorpel beschränkt.
Stammzellen sich außerdem embryonalen Zellen von verschiedenen Arten von menschlichen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen), die von Thomson et al veranschaulicht. ( 1998) Science 282: 1 145; embryonaler Stammzellen aus anderen Primaten wie Rhesus Stammzellen (Thomson et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844); marmoset Stammzellen (Thomson et al. ( 1996) Biol. Reprod, 55: 254); und humanen embryonalen Keim (hEG) Zellen (Shambloft et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998). Ebenfalls von Interesse sind Linie verpflichtet Stammzellen wie mesodermalen Stammzellen und andere frühe kardiogenen Zellen (siehe Reyes et al. ( 2001) Blut 98: 2615-2625; Eisenberg & Bader (1996) Circ Res. 78 (2): 205- 16; etc. ) Die Stammzellen können aus allen Säugerspezies erhalten werden, zB Mensch, Pferd, Rind, Schwein, Hund, Katze, Nager, zB Mäuse, Ratten, Hamster, Primaten etc. In einigen Ausführungsformen wurde ein menschlicher Embryo nicht für die Quelle der pluripotenten Zelle in den Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden, wie hierin offenbart zerstört.
ES-Zellen werden als undifferenziert, wenn sie nicht auf eine spezifische Differenzierung Linie gebunden werden. Solche Zellen anzuzeigen morphologischen Eigenschaften, die sie von differenzierten Zellen des Embryos oder Erwachsener Herkunft zu unterscheiden. Undifferenzierten ES Zellen leicht von den Fachleuten auf dem Gebiet erkannt wird, und in der Regel werden in den zwei Dimensionen einer mikroskopischen Ansicht in Kolonien von Zellen mit hoher Atom / Zytoplasma-Verhältnis und prominente Nucleoli. Undifferenzierten ES-Zellen exprimieren Gene, die als Marker verwendet werden, um das Vorhandensein von undifferenzierten Zellen und deren Polypeptidprodukte können als Marker für die negative Selektion verwendet werden, zu detektieren sein können. Siehe zum Beispiel die US-Patentanmeldung Ser. No. 2003/022441 1 A1 ; Bhattacharya (2004) Blut 103 (8): 2956- 64; und Thomson (1998), supra., die jeweils durch Bezugnahme hierin aufgenommen. Menschliche ES-Zelllinien exprimieren Zelloberflächenmarker, die undifferenzierte ES menschlichen Primaten und humanen EC-Zellen, einschließlich phasenspezifische embryonale Antigen (SSEA) -3, SSEA-4, TRA-1 -60 charakterisieren TRA- 1 -81, und mit alkalischer Phosphatase .
Globo-Reihe Glykolipid GL7, die den SSEA-4 Epitop trägt, wird durch die Zugabe von Sialinsäure auf die Globo-Reihe Glykolipid GBS, die das SSEA-3-Epitop trägt, gebildet wird. So reagiert GL7 mit Antikörpern sowohl für SSEA-3 und SSEA-4. Die undifferenzierte humane ES-Zelllinien nicht für SSEA- 1 Fleck, aber differenzierten Zellen stark für SSEA-I gefärbt. Verfahren zur Vermehrung hES-Zellen im undifferenzierten Form sind in der WO 99/20741 , WO 01/51616 und WO 03/020920 .
Eine Mischung von Zellen, die von einer geeigneten Quelle für Endothelzellen, Muskel und / oder neurale Stammzellen können aus einem Säugetier-Donor durch in der Technik bekannte Verfahren gewonnen werden. Eine geeignete Quelle ist das hämatopoetische Mikroumgebung. ZB zirkulierenden peripheren Blut, vorzugsweise mobilisiert (dh rekrutiert) kann aus einem Subjekt entfernt werden. Alternativ kann Knochenmark von einem Säuger erhalten werden, beispielsweise einem menschlichen Patienten, der Einwirkung einer autologen Transplantation. In einigen Ausführungsformen können Stammzellen aus dem Probanden Fettgewebe gewonnen werden, beispielsweise unter Verwendung des Celution ™ System von Cytori, wie in US-Pat. Nrn. 7.390.484 und 7.429.488, die hierin in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
In einigen Ausführungsformen sind menschliche Nabelschnurblutzellen (HUCBC) in den Verfahren wie hier offenbart. UBC menschlichen Zellen als eine reiche Quelle von hämatopoetischen und mesenchymale Vorläuferzellen erkannt (Broxmeyer et al., 1992 Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 4109-41 13) Zuvor Nabelschnur und Plazenta-Blut wurden als ein Abfallprodukt in der Regel bei der Geburt eines Kindes verworfen. Nabelschnurblutzellen als einer Quelle von transplantierbaren Stamm- und Vorläuferzellen und als eine Quelle von Mark Repopulation Zellen für die Behandlung von malignen Erkrankungen (dh akute lymphatische Leukämie, akute myeloische Leukämie, chronische myeloische Leukämie, myelodysplastischem Syndrom und nueroblastoma) und Nicht verwendet -malignant Krankheiten wie Fanconi-Anämie und aplastischer Anämie (Kohli-Kumar et al., 1993 Br. J. Haematol. 85: 419-422; Wagner et al 1992, Blut 79. 1874- 1881; Lu et al., 1996 Crit. Rev. Oncol. Hematol 22:61 -78; . Lu et al 1995 Cell Transplantation 4: 493-503). Ein deutlicher Vorteil ist die unreif HUCBC Immunität dieser Zellen, die sehr ähnlich fötalen Zellen, was das Risiko für die Zurückweisung reduziert durch den Host (Taylor & Bryson, 1985J. Immunol ist. 134: 1493- 1497).
Menschlichen Nabelschnurblut enthält mesenchymale und hämatopoetische Vorläuferzellen und endothelialen Vorläuferzellen, die in Gewebekultur expandiert werden kann (Broxmeyer et al., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4109-41 13; Kohli-Kumar et al., 1993 Br. J. Haematol. 85: 419-422; Wagner et al 1992, Blut 79. 1874- 1881; Lu et al., 1996 Crit. Rev. Oncol. Hematol 22:61 -78; . Lu et al 1995 Cell Transplantation 4: 493-503; Taylor & Bryson, 1985J. Immunol. 134: 1493- 1497 Broxmeyer 1995 Transfusion 35: 694-702; Chen et al 2001 Stroke. 32: 2682-2688; Nieda et al., 1997 Br. J. Hämatologie 98: 775- 777; Erices et al., 2000 Br. J. Hämatologie 109: 235-242). Der Gesamtgehalt von hämatopoetischen Vorläuferzellen im Nabelschnurblut gleich oder größer als dem Knochenmark, und zusätzlich können die hochproliferative hämatopoetischen Zellen höher HUCBC als im Knochenmark achtfach und Express hämatopoetischen Marker wie CD14, CD34 und CD45 (Sanchez -. Ramos et al 2001 Exp. Neur. 171: 109- 1 15; . Bicknese et al, 2002 Cell Transplantation 1 1: 261 -264; Lu et al., 1993, J. Exp Med. 178: 2089-2096).
In einer weiteren Ausführungsform sind pluripotente Zellen Zellen in der hämatopoetischen Mikroumgebung, wie beispielsweise der zirkulierenden peripheren Blut, vorzugsweise aus der mononuklearen Fraktion von peripherem Blut, Nabelschnurblut, Knochenmark, fötaler Leber oder Dottersack eines Säugetiers . Die Stammzellen, besonders neuronale Stammzellen, können auch aus dem zentralen Nervensystem abgeleitet werden, einschließlich der Hirnhaut.
In einer anderen Ausführungsform pluripotenten Zellen in embryonale Körper vorhanden sind, werden durch Ernten ES-Zellen mit kurzen Proteaseverdau, und kleineren Klumpen von undifferenzierten humanen WSR in Suspensionskultur wachsen gebildet. Die Differenzierung wird durch Zurücknahme der konditionierten Medium induziert. Die resultierenden Embryoidkörpern werden auf halbfesten Substraten aufgebracht. Bildung von differenzierten Zellen können nach rund ungefähr 7 Tage, um ca. 4 Wochen beobachtet werden. Lebensfähige differenzierenden Zellen aus in vitro-Kulturen von Stammzellen werden durch teilweise Dissoziation Embryoidkörpern oder ähnliche Strukturen auf Zellaggregate liefern ausgewählt. Aggregate, die Zellen von Interesse sind, für phänotypische Merkmale mit Methoden, die die Zell-Zell-Kontakte in der Summe im Wesentlichen aufrechtzuerhalten ausgewählt.
In einer alternativen Ausführungsform können die Stammzellen umprogrammiert werden Stammzellen, wie Stammzellen aus somatischen oder differenzierten Zellen. In einer solchen Ausführungsform können die dedifferenzierten Stammzellen zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf neoplastische Zellen, Tumorzellen und Krebszellen oder alternativ induzierte umprogrammiert Zellen wie pluripotenten Stammzellen oder iPS beschränkt.
Die Klonierung und Zellkultur
Beispielhafte Verfahren zur molekularen Genetik und Gentechnologie, die in der hier beschriebenen Technologie verwendet werden können, finden sich beispielsweise in der aktuellen Ausgaben Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Sambrook et al., Cold Spring Harbor); Gentransfervektoren für Säugetierzellen (Miller & Calos eds.); und Current Protocols in Molecular Biology (FM Ausubel et al., Hrsg., Wiley & Sons). Zellbiologie, Proteinchemie und Antikörpertechniken gefunden werden kann, beispielsweise in Current Protocols in Protein Science (JE Colligan et al eds, Wiley & Sons..); Current Protocols in Zellbiologie (JS Bonifacino et al., Wiley & Sons) und Current Protocols in Immunologie (JE Colligan et al., Hrsg., Wiley & Sons.). Illustrative Reagenzien, Klonierungsvektoren und Kits zur genetischen Manipulation können kommerziell erhalten werden, beispielsweise von BioRad, Stratagene, Invitrogen, Clontech, und Sigma-Aldrich Co.
Als Zellkulturverfahren finden sich beispielsweise in Zellkulturverfahren sind allgemein in der aktuellen Ausgabe von Culture of Animal Cells beschrieben: a Manual of Basic-Technique (RI Freshney ed, Wiley & Sons.); Allgemeine Techniken der Zellkultur (MA Harrison & IF Rae, Cambridge Univ. Press) und embryonalen Stammzellen: Methoden und Protokolle (K. Turksen ed, Humana Press).. Geeignete Gewebekulturmaterial und Reagenzien sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von der Firma Gibco / BRL, Nalgene-Nunc International, Sigma Chemical Co., und ICN Biomedicals.
Pluripotente Stammzellen können von einem Fachmann auf dem Gebiet und kontinuierlich in Kultur vermehrt werden, unter Verwendung von Kulturbedingungen, die die Proliferation fördern, ohne die Förderung der Differenzierung. Ausführungs serumhaltigem ES-Medium mit 80% DMEM hergestellt (wie beispielsweise Knock-Out DMEM, Gibco), 20% entweder definiert fötalem Rinderserum (FBS, Hyclone) oder Serumersatz ( WO 98/30679 ), 1% nicht- essentielle Aminosäuren, 1 ffl L-Glutamin, und 0, 1 mM β-Mercaptoethanol. Unmittelbar vor der Verwendung, das Human-bFGF auf 4 ng / ml ( WO 99/20741 , Geron Corp.) zugegeben. Traditionell werden die ES-Zellen auf einer Schicht aus Feeder-Zellen kultiviert werden, typischerweise Fibroblasten von embryonalen oder fötalen Gewebe stammt.
Scienceler der Geron haben entdeckt, dass pluripotente SCs können in einem undifferenzierten Zustand gehalten werden, auch ohne Feeder-Zellen. Das Umfeld für Feeder-freien Kulturen enthält einen geeigneten Kultursubstrat, insbesondere eine extrazelluläre Matrix, wie Matrigel & reg; oder Laminin. Typischerweise wird enzymatische Verdauung angehalten, bevor die Zellen sich vollständig dispergiert (etwa ~ 5 min mit Collagenase IV). Klumpen von <"> 10 bis 2000 Zellen werden dann direkt auf das Substrat ohne weitere Ausbreitung plattiert.
Feeder-freien Kulturen werden durch ein Nährmedium, das Faktoren, die die Vermehrung der Zellen zu unterstützen, ohne Differenzierung unterstützt. Solche Faktoren können durch Kultivieren des Mediums mit Zellen, die von solchen Faktoren, wie beispielsweise bestrahlte (~ 4.000 rad) primären embryonalen Maus-Fibroblasten, Maus-Fibroblasten telomerisierte oder Fibroblasten-Zellen aus Iike pPS Zellen stammen in das Medium eingebracht werden. Medium kann durch Plattieren der Zubringer in einer Dichte von ~ 5-6 × 10⁴ ctrf ² in einem serumfreien Medium, wie KO DMEM mit 20% Serumersatz und 4 ng / ml bFGF supplementiert konditioniert werden. Medium, das für 1 -2 Tage konditioniert worden ist, wird mit weiteren bFGF ergänzt und verwendet, um pluripotente SC Kultur für 1 -2 Tagen unterstützen. Merkmale des Feeder-freien Kulturverfahren werden in der internationalen Patentveröffentlichung besprochen WO 01/51616 ; und Xu et al., Nat. Biotechnol. 19: 971 2001.
Unter dem Mikroskop erscheinen ES-Zellen mit hoher Kern / Zytoplasma-Verhältnis, prominenten Nukleolen und kompakte Koloniebildung mit schlecht erkennbaren Zellverbindungen. Primas ES-Zellen exprimieren stadienspezifischen embryonalen Antigene (SSEA) 3 und 4, und Marker nachweisbar mit benannten Tra- 1 -60 und Tra-1 -81 Antikörper (Thomson et al, Science 282:. 1 145, 1998). Maus-ES-Zellen als Positivkontrolle für SSEA-1 verwendet werden, und als negative Kontrolle für SSEA-4, Tra-1 -60 und Tra- 1 -81. SSEA -4 ist durchweg gegenwärtigen menschlichen embryonalen Karzinom (HEC) Zellen. Differenzierung pluripotenter SCs in vitro führt zu dem Verlust von SSEA-4, Tra- 1 -60 und Tra-1 -81-Expression und erhöhte Expression von SSEA- 1, die ebenfalls auf undifferenzierte hEG Zellen gefunden wird.
Stammzellen abgeleiteten β-Zelle (SC-β)
in einigen Aspekten stellt die Offenbarung ein Stammzellen abgeleiteten β-Zelle (SC-β). Der SC-β-Zellen hier offenbarten teilen viele Unterscheidungsmerkmale des nativen β-Zellen, sind aber in bestimmten Aspekten (zB Genexpressionsprofile) unterschiedlich. In einigen Ausführungsformen ist die SC-β-Zell-Non-native. Wie hierin verwendet, bedeutet „nicht-native“ bedeutet, dass die SC-β-Zellen deutlich verschieden in bestimmten Aspekten von ß-Zellen, die in der Natur vorkommen, also nativem β-Zellen sind. Es sollte jedoch erkannt werden, dass diese deutliche Unterschiede beziehen sich typischerweise auf strukturelle Merkmale, die in den SC-β-Zellen bestimmten funktionalen Unterschiede, beispiels aufweist führen kann, obwohl die Genexpressionsmuster von SC-β-Zellen unterscheidet sich vom nativen β-Zellen, die SC -β-Zellen verhalten sich in ähnlicher Weise auf native β-Zellen, aber bestimmte Funktionen verändert werden (zB verbesserte) im Vergleich zu nativen β-Zellen. Zum Beispiel, wie in gezeigt wird. 2E, eine höhere Frequenz von SC-β-Zellen reagieren auf 20 m Glukose im Vergleich zu der Frequenz des nativen β-Zellen.
Weitere Unterschiede zwischen den SC-β-Zellen und nativer β-Zellen offensichtlich sein für den Fachmann basierend auf den hierin offenbarten Daten.
Die SC-β-Zellen der Offenbarung haben viele charakteristische Merkmale der β-Zellen, die wichtig für die normale β-Zellfunktion sind. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle weist eine Glucose stimulierte Insulinsekretion (GSIS) response in vitro. In einigen Ausführungsformen die SC-Zelle weist eine β GSIS Antwort in vivo. In einigen Ausführungsformen die SC-Zelle weist β in vitro und in vivo GSIS Antworten. In einigen Ausführungsformen, die GSIS Reaktionen ähneln die GSIS Reaktionen eines endogenen reife Pankreas-β-Zelle. In einigen Ausführungsformen die SC-Zelle weist eine β GSIS Reaktion auf mindestens eine Glucoseprovokation. In einigen Ausführungsformen die SC-Zelle weist eine β GSIS Antwort auf mindestens zwei aufeinanderfolgenden Glucose Herausforderungen. In einigen Ausführungsformen die SC-Zelle weist eine β GSIS Reaktion auf mindestens drei aufeinanderfolgenden Glucose Herausforderungen. In einigen Ausführungsformen sind die GSIS Reaktionen ähneln die GSIS Reaktion des endogenen humanen Inselzellen, um mehrere Glucose Herausforderungen. In einigen Ausführungsformen wird die GSIS Reaktion unmittelbar nach dem Umpflanzen der Zelle in einem Menschen oder Tier beobachtet.
In einigen Ausführungsformen wird die GSIS Reaktion innerhalb von etwa 24 Stunden nach Transplantation, die Zelle in einem Menschen oder Tier beobachtet. In einigen Ausführungsformen wird die GSIS Antwort innerhalb etwa einer Woche der Transplantation der Zelle in einem Menschen oder Tier beobachtet. In einigen Ausführungsformen wird die GSIS Antwort innerhalb etwa zwei Wochen der Transplantation der Zelle in einem Menschen oder Tier beobachtet. In einigen Ausführungsformen ist der Stimulationsindex der Zelle, definiert durch das Verhältnis von Insulin in Reaktion auf hohe Glucosekonzentrationen im Vergleich zu niedrigen Glucose-Konzentrationen sekretiert ähnlich der Stimulationsindex eines endogenen reifen β Pankreaszelle. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle weist einen Stimulationsindex von größer als 1 ist. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle weist einen Stimulationsindex von größer oder gleich 1 ist. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle weist einen Stimulationsindex von größer als 1 .1. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle weist einen Stimulationsindex von größer als oder gleich 1 .1.
In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle weist einen Stimulationsindex von größer als 2 ist. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle weist einen Stimulationsindex von größer als oder gleich 2 ist. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle weist einen Stimulationsindex von zumindest 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 oder 5.0 oder höher.
In einigen Ausführungsformen weist die SC- β Zelle Zytokin-induzierte Apoptose als Reaktion auf Cytokine auf. In einigen Ausführungsformen die SC-β cel 1 aufweist Zytokin-induzierte Apoptose in Reaktion auf ein Cytokin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Interleukin-ΐ β (IL-β), Interferon-y (INF-γ), Tumor-Nekrose-Faktor-a (TNF-a), und Kombinationen davon.
In einigen Ausführungsformen wird die Insulinsekretion der SC-β-Zelle in Reaktion auf bekannte Antidiabetika (zB anti-diabetischen Arzneimitteln, die auf β-Zellen ex vivo oder in vitro wirken und / oder anti-diabetischen Arzneimitteln verbesserte im allgemeinen in vivo). Die Offenbarung beschäftigt sich jedes bekannte Antidiabetikum. In einigen Ausführungsformen wird die Insulinsekretion der SC-β-Zelle in Reaktion auf ein Sekretagogum verbessert. In einigen Ausführungsformen die Sekretagogum aus der Gruppe, bestehend aus einem Inkretin Mimetikum, einem Sulfonylharnstoff, einem Meglitinid, und Kombinationen davon ausgewählt ist.
In einigen Ausführungsformen ist die SC-β-Zelle monohormonal. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle weist eine Morphologie auf, die Morphologie eines endogenen reifen β Pankreaszelle ähnelt. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle einkapselt kristallines Insulin Granulate. In einigen Ausführungsformen die SC-Zelle weist β eingekapselte kristalline Insulingranula unter Elektronenmikroskopie, die Insulin-Granulat eines endogenen reife Pankreas β Zelle ähneln. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle eine geringe Replikationsrate. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle eine geringe Replikationsrate. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle weist eine geringe, aber erhöhten Replikationsrate durch Färbung auf C-Peptid und i67 in Reaktion auf die Behandlung mit Prolaktin gemessen.
In einigen Ausführungsformen erhöht die SC-Zelle β intrazelluläres Ca²⁺ als Reaktion auf Glucose. In einigen Ausführungsformen weist die SC- β Zelle einen Glucose stimulierten Ca²⁺ Fluss (GSCF) auf, der dem GSCF einer endogenen reifen Pankreas β-Zelle ähnelt. In einigen Ausführungsformen weist die SC- β Zelle eine GSCF Reaktion auf mindestens drei aufeinanderfolgende Glucose Herausforderungen in einer Weise auf, die der GSCF Antwort eines endogenen reife Pankreas β Zelle verschmolzen Glucose Herausforderungen ähnelt.
In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle mindestens ein Marker-Charakteristik eines endogenen reife Pankreas β Zelle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Insulin exprimiert, C-Peptid, PDX 1, M AFA, N X6- 1 PAX6, NeuroD 1, Glucokinase (GCK), SLC2A 1, PCSK 1, KCNJ 1 1, ABCC8, SLC30A8, SNAP25, RAB3A, GAD2 und PTPRN.
In einigen Ausführungsformen die SC-β Zelle nicht zumindest eine Markierung (beispielsweise eine Markierung nicht durch endogene reife Pankreas-β-Zellen exprimiert) exprimieren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus a) ein Hormon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) Glucagon (GCG) und ii) Somatostatin (SST); b) eine Azinuszelltumoren Marker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) Amylase und ii) carboxypeptdase A (CPA 1), c) einen einen Zellmarker ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus i) GCG Arx, Irx1 und IRX2, d ) eine duktale Zellmarker ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus i) CFTR und ii) Sox9.
Die SC-β-Zellen in vitro von einem beliebigen Ausgangszelle differenziert, da die Erfindung nicht beabsichtigt ist, durch die Ausgangszelle aus dem die SC-β-Zellen abgeleitet sind begrenzt. Exemplarische Ausgangszellen umfassen, ohne Einschränkung, Insulin-positiven endokrinen Zellen oder einer Vorstufe davon, wie einem Nkx6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzelle, einer Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzelle und eine pluripotente Stammzelle, eine embryonale Stammzelle, und induzierte pluripotente Stammzelle ist. In einigen Ausführungsformen sind die SC-β-Zellen in vitro von einer umprogrammierten Zelle, einer teilweise neu programmiert Zelle (dh, einer somatischen Zelle, beispielsweise eine Fibroblasten die teilweise zwischen einer induzierten Pluripotenz umprogrammiert worden ist, dass sie in einem Zwischenzustand zwischen differenzierter Zelle und somatischer Zelle existiert, aus dem es abgeleitet wurde), einer transdifferenzierten Zelle.
In einigen Ausführungsformen können die SC-β-Zellen hierin offenbarten in vitro aus einem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einem Vorläufer davon unterschieden werden. In einigen Ausführungsformen wird die SC-β-Zelle in vitro aus einem Vorläufer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Nkx6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzelle, einer Pdx 1 - positiven Pankreas-Vorläuferzelle und eine pluripotente Stammzelle differenziert. In einigen Ausführungsformen die pluripotente Stammzelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer embryonalen Stammzelle und pluripotenten Stammzellen. In einigen Ausführungsformen stammt die SC-β Zelle oder die pluripotente Stammzelle aus dem die SC-β Zelle abgeleitet ist, von einem Menschen. In einigen Ausführungsformen ist die SC-β Zelle menschlich.
In einigen Ausführungsformen wird die SC-β-Zelle nicht gentechnisch verändert. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle erhält die Eigenschaften teilt gemeinsam mit nativer β-Zellen in der Abwesenheit einer genetischen Modifikation von Zellen. In einigen Ausführungsformen wird die SC-β-Zelle gentechnisch verändert.
In einigen Ausführungsformen ist die pro SC-β-Zelle Insulin produziert mindestens 0,5 µIU pro 1000 Zellen pro 30 Minuten Inkubation (zB ex vivo) bei hoher Glukosekonzentration.
In einigen Ausführungsformen ist die pro SC-β-Zelle Insulin produziert ist mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4 mindestens 5 mindestens 6, mindestens 7 mindestens 8 oder mindestens 9 µIU per 1000 Zellen pro 30-minütigen Inkubation bei hoher Glukosekonzentration. In einigen Ausführungsformen die SC-β pro Zelle produzierten Insulins zwischen 0,5 und 10 µIU je 1 000 Zellen pro 30-minütigen Inkubation bei hoher Glukosekonzentration. Bei einigen
Ausführungsformen ist die pro SC-β-Zelle Insulin produziert etwa 2,5 µíϋ̈ pro 1000 Zellen pro 30-minütigen Inkubation bei hoher Glukosekonzentration.
In einigen Aspekten stellt die Erfindung ein Zelllinie, umfassend ein hierin beschriebenen SC-β-Zelle. In einigen Ausführungsformen die SC-β cel ls stabil exprimieren Insulin. In einigen Ausführungsformen kann der SC-β-Zelle eingefroren, aufgetaut und mit einer Verdopplungszeit von 24 bis 44 Stunden ohne signifikante morphologische Veränderungen, bis mindestens 30 Passagen amplifiziert.
Die Erzeugung SC-β-Zellen
Aspekte der Offenbarung beziehen sich auf die Erzeugung von SC-β-Zellen (zB Pankreas-β-Zellen). Im Allgemeinen gemäß den hierin offenbart sind, ein Gemisch oder eine Kombination von verschiedenen Zellen, zB, zum Beispiel einer Mischung von Zellen, wie beispielsweise einem Pdxl umfassen Verfahren hergestellten mindestens einen SC-β-Zelle oder Vorläufer davon, zum Beispiel Pankreas-Vorläuferzellen - positive pankreatische Vorläuferzellen, Bauchspeicheldrüsenvorläufer Coexpression Pdx 1 und N X6- 1 eine für Ngn3 positive endokrine Vorläuferzelle, ein Insulin-positiven endokrinen Zelle (zB ein β-ähnlichen Zellen) und eines Insulin-positiven endokrinen Zelle, und / oder andere pluripotente oder Stammzellen.
Die mindestens eine SC-β-Zelle oder Vorläufer davon können nach einem beliebigen geeigneten Kultivierungs Protokoll, um eine Stammzelle oder pluripotente Zelle in einem gewünschten Stadium der Differenzierung unterscheiden hergestellt werden. In einigen Ausführungsformen die mindestens eine SC-β-Zelle oder die Vorstufe davon durch Kultivieren von mindestens einer pluripotenten Zelle für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die für die mindestens eine pluripotente Zelle, in der zumindest einen SCunterscheiden erzeugten β-Zelle oder des Vorläufers davon ist.
In einigen Ausführungsformen der mindestens eine SC-β-Zelle oder eine Vorstufe davon ist eine im Wesentlichen reine Population von SC-β-Zellen oder Vorläufer davon. In einigen Ausführungsformen, eine Bevölkerung von SC-β-Zellen oder Vorläufer davon aus einer Mischung von pluripotenten Zellen oder differenzierten Zellen. In einigen Ausführungsformen einer Bevölkerung SC-β-Zellen oder Vorstufen davon sind im Wesentlichen frei oder frei von embryonalen Stammzellen oder pluripotenten Zellen oder iPS-Zellen.
In einigen Ausführungsformen einer somatischen Zelle, beispielsweise Fibroblasten aus einem Patienten isoliert werden, beispielsweise als Gewebeprobe, wie zum Beispiel eine Hautbiopsie und in einen pluripotenten Stammzellen zur weiteren Differenzierung umprogrammiert erzeugen des mindestens einen SC-β-Zelle oder eines Vorläufers davon zur Verwendung in den hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren. In einigen Ausführungsformen wird eine somatische Zelle, zB Fibroblasten in Kultur durch von einem Fachmann auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren erhalten und in einigen Ausführungsformen, ausgebreitet, bevor sie in SC-β-Zellen durch Verfahren umgewandelt werden, wie hier offenbart.
In einigen Ausführungsformen der mindestens eine SC-β-Zelle oder Vorläufer davon sind in Kultur durch von einem Fachmann auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren erhalten und in einigen Ausführungsformen, ausgebreitet, bevor sie in SC-β-Zellen umgewandelt durch die Verfahren, wie hier offenbart.
Des Weiteren mindestens einen SC-β-Zelle oder Vorläufer davon, zum Beispiel Pankreas-Vorläufer können aus allen Säugerspezies sein, wobei nicht-einschränkende Beispiele schließen eine murine, Rind, Affen, Schweine, Pferde, Schafe oder menschliche Zelle ist. Aus Gründen der Klarheit und Einfachheit der Beschreibung der Verfahren, die hierin bezieht sich auf einen Säuger mindestens eine SC-β-Zelle oder Vorläufer davon, aber es versteht sich, dass alle der hier beschriebenen Verfahren können leicht an andere Zelltypen des mindestens einen SC angewendet werden kann -β Zelle oder Vorläufer davon. In einigen Ausführungsformen die mindestens eine SC-β-Zelle oder eine Vorstufe davon ist von einem menschlichen Individuum stammt.
Induktion der Differenzierung pluripotenter Stammzellen zu Definitive Entodermzellen
Aspekte der Offenbarung beinhalten definitive Entodermzellen. Definitive Entodermzellen der Verwendung hierin kann von jeder Quelle stammen oder in Übereinstimmung mit einem beliebigen geeigneten Protokolls erzeugt werden. In einigen Aspekten pluripotenten Stammzellen, beispielsweise iPSCs oder HES, werden differenziert, um Zellen Entoderm. Gemäß einigen Aspekten sind die Entodermzellen weiter differenziert, zB um Urdarm Schlauchzellen, Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, NKX6-! -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, Ngn3-positive endokrine Vorläuferzellen oder Insulin-positiven endokrinen Zellen, gefolgt von Induktion oder Reifung zu SC-β-Zellen.
In einigen Ausführungsformen können die Stammzellen auf ein neues Substrat plattiert werden oder das Medium ausgetauscht, um die extrazelluläre Matrix oder lösliche Faktoren, die die Differenzierung inhibieren entfernen. Dies wird manchmal als die „direkte Unterscheidungsverfahren“ bezeichnet und wird allgemein in der internationalen Patentveröffentlichung WO 01/51616 beschrieben ist, und US-Patentveröffentlichung 2002/0019046, die hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Es wird normalerweise in der direkten Unterscheidungsverfahren mit einem Feeder-freien Kultur von Stammzellen zu beginnen, um so mögliche Komplikationen im Differenzierungsprozess durch Restfeederzellen zu vermeiden, bevorzugt. Ein anderer Ansatz ist es, undifferenzierten Stammzellen in Suspensionskultur, die häufig bewirken, dass sie Aggregate differenzierte und undifferenzierte Zellen bilden gefügt. Zum Beispiel können Stammzellen durch kurze Kollagenaseverdau geerntet, dissoziiert in Cluster und in nicht-adhärenten Zellkulturplatten passagiert. Die Aggregate können alle paar Tage 4-8 Tage zugeführt werden, und dann geerntet nach einem geeigneten Zeitraum, in der Regel.
Abhängig von den Bedingungen, Aggregate beginnen im Allgemeinen durch die Bildung einer heterogenen Population von Zelltypen, einschließlich einer beträchtlichen Frequenz Entodermzellen. Die Aggregate können dann verteilt und für die nächste Stufe in dem Differenzierungsprozess auf Substraten wie Laminin oder Fibronectin replattiert werden; oder mit beispielsweise nicht-haftenden Platten, und ein geeignetes Medium in Suspensionskultur passagiert.
Die direkte Unterscheidung oder Differenzierung in Aggregate können auf die Anwesenheit von Entodermzellen mit geeigneten Markern, wie sie in US-Patent No. überwacht werden. No. 7.326.572. In einigen bevorzugten Ausführungsformen kann die Differenzierung für das Vorhandensein von Entodermzellen die Marker wie Sox1 7 überwacht werden. Sobald ein ausreichender Anteil Endoderm erhalten wird, können die Zellen erneut plattiert oder anderweitig manipuliert werden, um eine weitere Differenzierungsstadium beginnen. Unter bestimmten Umständen kann die Differenzierung oder Erhaltung von Zellen gesteigert werden, wenn die Zellen in Mikromasse-Cluster (beispielsweise 50 bis 5000 Zellen) gehalten werden. Zusätzliche Stufen der Differenzierung durch die Offenbarung in Erwägung gezogen werden in gezeigt. 1.
In einigen Ausführungsformen sind definitive Entodermzellen durch Kontaktieren (zB Kultivierung) eine pluripotente Stammzelle mit einer Verbindung der Formel (I), wie in der US-A beschrieben, hergestellt. No. 8.507.274 („das '274-Patent“), durch Bezugnahme hierin aufgenommen. Verbindung mit der Formel (I) wie in dem '274-Patent beschrieben sind zellpermeablen kleinen Molekülen und können zelluläre Prozesse durch Modulieren Signaltransduktionswege, die Genexpression oder den Stoffwechsel und sind wirksam in der Differenzierung der Stammzellen Protokolle steuern. Kleine Moleküle können in hoher Menge und Reinheit hergestellt werden, sowie bequem zu- oder abgeführt, indem sie ihnen ein großes Potenzial für therapeutische Anwendungen zu sein. Hochdurchsatz-Screens durchgeführt wurden, um neuartige kleine Moleküle, die die Selbsterneuerung von ES-Zellen (Chen et al unterstützen identifizieren können., 2006;
Durch Desbordes et al., 2008), cardio Spezifikation der Maus-ES-Zellen (Wu et al., 2004) oder neuralen Vorläuferzellen (Diamandis et al., 2007) sowie spezifische Zelltypen, insbesondere neuronale und Muskelzellen induzieren (Bewertung (Ding und Schultz, 2004). Es wird erwartet, dass Verbindungen der Formel (I) aus dem '274-Patent verwendet werden, um eine pluripotente Stammzelle, um eine endgültige Zell Endoderm zu differenzieren.
In einigen Ausführungsformen wird die Verbindung der Formel (I) aus dem '274-Patent umfasst:
, wobei:

R1 und R2 sind unabhängig H, Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Aryl, Heteroaryl, Cyclyl oder Cyclyl, von denen jedes gegebenenfalls substituiert sein und / oder kann in der Hauptkette mit einer unterbrochenen oder mehrere aus O, N, S, S (O) und C (O);
R3 und R4, unabhängig voneinander H, Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkoxy, Aryl, Heteroaryl, Cyclyl oder Cyclyl, von denen jedes gegebenenfalls substituiert sein, oder R3 und R4, zusammen mit dem Kohlenstoff, mit dem sie aus einem gegebenenfalls substituierten Heterocyclyl Cyclyl von gebunden ist; und
L ist C1-C10 Alkylenyl, C2-C10 Alkenylenyl oder C2-C10 Alkynylenyl, von denen jedes gegebenenfalls substituiert sein und / oder kann in der Hauptkette mit einem oder mehreren aus O, N, S, S (unterbrochen O) und C (O).

in einigen Ausführungsformen umfasst die Verbindung der Formel (I) aus dem '274-Patent IDE1:
In einigen Ausführungsformen umfasst die Verbindung der Formel (I) aus dem '274-Patent IDE2:
Das '274 Patent beschreibt Verfahren zur Feststellung der Identität der auf diese Weise abgeleitet sind, wie auch Verfahren zum Isolieren und speichert, Erweiterung und eine weitere Differenzierung der endgültigen Endoderm definitiven Endoderms Zelle, die alle mit den hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren verwendet werden können, wird, wie vom Fachmann erkannt werden.
In einigen Ausführungsformen definitive Entodermzellen kann durch Differenzieren zumindest einige pluripotenten Zellen in einer Population in endgültige Entodermzellen, zB erhalten werden durch Inkontaktbringen einer Population von pluripotenten Zellen mit i) mindestens einem Wachstumsfaktor aus der TGF-β Superfamilie ist, und ii) einem Wnt-Signalweg-Aktivator, um die Differenzierung von zumindest einigen der pluripotenten Zellen in endgültige Entodermzellen, wobei die endgültige Entodermzellen exprimieren zumindest eine Markierung charakteristisch endgültige Endoderm induzieren.
Die Erfindung zieht die Verwendung jeder Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie, die die pluripotenten Stammzellen induziert, um in endgültige Entodermzellen (beispielsweise allein oder in Kombination mit einem Wnt-Signalweg Aktivator) unterscheiden. In einigen Ausführungsformen die mindestens einen Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie umfasst Activin A. In einigen Ausführungsformen, die mindestens einen Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie umfasst Wachstumsdifferenzierungsfaktor 8 (GDF8).
Die Erfindung zieht die Verwendung jeder Wnt-Signalweg Aktivator, der pluripotenten Stammzellen induziert, um in endgültige Entodermzellen (beispielsweise allein oder in Kombination mit einem Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Überfamilie) zu unterscheiden. In einigen Ausführungsformen der Wnt-Signalweg Aktivator CHIR99021. In einigen Ausführungsformen der Wnt-Signalweg Aktivator Wnt3a rekombinantes Protein ist.
Der Fachmann wird erkennen, dass die Konzentrationen der Mittel (zB Wachstumsfaktoren) verwendet werden, können variieren. 1000 ng / mL - in einigen Ausführungsformen werden die pluripotenten Zellen mit dem mindestens einen Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie in einer Konzentration von 10 ng / ml in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen werden die pluripotenten Zellen mit dem mindestens einen Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie in einer Konzentration von 100 ng / ml in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen werden die pluripotenten Zellen mit dem mindestens einen Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie in einer Konzentration von 20 ng / ml, 30 ng / ml, 40 ng / ml, 50 ng / ml, 60 ng / mL in Berührung 70 ng / ml, 80 ng / ml oder 90 ng / mL. In einigen Ausführungsformen werden die pluripotenten Zellen mit dem mindestens einen Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie in einer Konzentration von 91 ng / ml, 92 ng / ml, 93 ng / ml, 94 ng ml, 95 ng / ml in Kontakt gebracht, 96 ng / ml, 97 ng / ml, 98 ng / ml oder 99 ng / mL. In einigen Ausführungsformen werden die pluripotenten Zellen mit dem mindestens einen Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie in einer Konzentration von 1 bis 10 ng / ml, 120 ng / ml, 130 ng / ml, 140 ng / ml kontaktiert wird, 150 ng / ml, 160 ng / ml, 170 ng / ml, 180 ng / ml oder 190 ng / mL. In einigen Ausführungsformen werden die pluripotenten Zellen mit dem mindestens einen Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie in einer Konzentration von 101 ng / ml, 102 ng / ml, 103 ng / ml, 104 ng / ml, 105 ng / ml kontaktiert, 106 ng / ml, 107 ng / ml, 108 ng / ml oder 109 ng / mL.
In einigen Ausführungsformen werden die pluripotenten Zellen mit der Wnt-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 1,4 µg/ml in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen werden die pluripotenten Zellen mit der Wnt-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 14 µg/ml in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen werden die pluripotenten Zellen mit dem Wnt-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 2 µg/ml, 3 µg/ml, 4 µg/ml, 5 µg/ml, 6 µg/ml, 7 µg/ml, 8 µg/ml, 9 µg/ml, 10 µg/ml, 11 µg/ml, 12 oder 13 µg / mL in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen werden die pluripotenten Zellen mit dem Wnt-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 15 µg/ml, 16 µg/ml, 17 µg/ml, 18 µg/ml, 19 µg/ml, 20 µg/ml, 21 µg/ml, 22 µg/ml, 23 µg/ml, 24 µg/ml, 25 µg/ml, 26 µg/ml , 27 µg/ml, 28 µg/ml, 29 µg/ml bzw. 30 µg/ml in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen werden die pluripotenten Zellen mit der Wnt-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 13, 1 µg/ml, 13,2 µg/ml, 13,3 µg/ml, 13,4 µg/ml, 13,5 µg/ml, 13,6 µg/ml, 13,7 µg/ml, 13,8 µg/ml oder 13,9 µg/ml in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen werden die pluripotenten Zellen mit dem Wnt-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 14,1 µg/ml, 14,2 µg/ml, 14,3 µg/ml, 14,4 µg/ml, 14,5 µg/ml, 14,6 µg/ml, 14,7 µg/ml, 14,8 µg/ml bzw. 14,9 µg/ml in Kontakt gebracht.
Im Allgemeinen werden die pluripotenten Zellen werden in geeigneten Kulturmedium (zB Suspensionskultur) für einen Zeitraum, der ausreicht, um die Differenzierung von zumindest einigen der pluripotenten Zellen in endgültige Entodermzellen induzieren gehalten. Ein beispielhaftes geeignetes Kulturmedium ist in Tabelle 1 unten gezeigt. Tabelle 1

Agenz Menge

MCDB131 11

Glukose 0,44

NaHCO3 2,46 g

FAF-BSA 20 g

IST-X 20 µl

Glutamax 10 ml

Vitamin C 0.044 g

Heparin 0 g

P/S 10 ml
In einigen Ausführungsformen kann ein geeignetes Kulturmedium zur Differenzierung von pluripotenten Zellen in endgültige Entodermzellen umfasst SI Medien.
In einigen Ausführungsformen Kontaktieren der pluripotenten Zellen in Suspensionskultur durchgeführt wird. In einigen Ausführungsformen wird die Suspensionskultur in einer Spinner-Flasche gehalten. In einigen Ausführungsformen ist der Zeitraum von 3 Tagen. In einigen Ausführungsformen werden die mindestens einen Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie und Wnt-Signalwegs Aktivators die Suspensionskultur am ersten Tag zugegeben. In einigen Ausführungsformen ist der zumindest eine Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie in der Suspensionskultur am zweiten Tag nachgefüllt. In einigen Ausführungsformen der Wnt-Signalweg-Aktivator ist in der Suspensionskultur am zweiten Tag nachgefüllt. In einigen Ausführungsformen wird der Wnt-Signalweg Aktivator aus der Suspensionskultur am zweiten Tag entfernt. In einigen Ausführungsformen ist der zumindest eine Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie in der Suspensionskultur am zweiten Tag nachgefüllt und Wnt-Signalwegs Aktivator aus der Suspensionskultur gezogen bzw. nicht in der Suspensionskultur am zweiten Tag nachgefüllt. In einigen Ausführungsbeispielen werden weder der mindestens einen Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie oder der Wnt-Signalweg-Aktivator in der Suspensionskultur am dritten Tag nachgefüllt. In einigen Ausführungsformen werden sowohl der mindestens einen Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie und Wnt-Signalwegs Aktivator aus der Suspensionskultur am dritten Tag entfernt.
Die Verfahren sind zur Induktion der Differenzierung von mindestens einer pluripotenten Zelle in einer Population von Zellen in eine endgültige Endoderm Zelle. Im allgemeinen kann jedes pluripotenten Zelle in eine endgültige Endoderm Zelle unter Verwendung eines hierin beschriebenen Verfahrens unterschieden werden. In einigen Ausführungsformen die pluripotenten Zellen umfassen pluripotenten Stammzellen. In einigen Ausführungsformen die pluripotenten Zellen umfassen embryonalen Stammzellen. In einigen Ausführungsformen die pluripotenten Zellen humane Zellen umfassen.
In einigen Ausführungsformen Differen mindestens einige pluripotenten Zellen in einer Population in endgültige Entodermzellen wird durch ein Verfahren des Kontaktierens einer Population von pluripotenten Zellen mit i) Activin A erreicht, und ii) CHIR99021, um die Differenzierung zu induzieren mindestens einige der pluripotenten Zellen in der Population in endgültige Entodermzellen, wobei die definitive Entoderm Zellen exprimieren mindestens ein Marker charakteristisch definitive Entoderm.
Weitere Verfahren zur Herstellung von endgültigen Entodermzellen sind in der Technik bekannt sind, einschließlich beispielsweise die Methoden, die weiter in dem US-Anmeldungsveröffentlichung US2006 / 0.003.446 bis G. Keller, et al .; sind US2006 / 0.003.313 K. D'Amour et al " US2005 / 0.158.853 K. D'Amour et al., Und US2005 / 0.260.749 von Jon Odorico, et al., Relevante Abschnitte hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.
In einigen Ausführungsformen kann eine durch die Verfahren hergestellt, wie offenbart definitiven Endoderms Zelle hierin mindestens einem Marker, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus ausdrückt: Nodal, TMPRSS2, Tmem30b, Stl 4 Spink3, Sh3gl2, Ripk4, Rabl5, NPNT, Clic6, Cldn8, Cacnal b, Bnipl, Anxa4, EMB FOXA 1, Soxl 7 und Rbm35a, wobei die Expression von mindestens einem Marker wird durch eine statistisch signifikante Menge im endgültigen Endoderm Zelle relativ zum pluripotente Stammzelle aus hochreguliert dem er abgeleitet wurde. In einigen Ausführungsformen wird ein durch die Verfahren hergestellt endgültige Endoderm Zelle, wie hierin offenbart ist, nicht durch eine statistisch signifikante Menge mindestens eines Markers, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ausdrücken: Gata4, SPARC, AFP und DAB2 relativ zu der pluripotenten Stammzelle, aus der es abgeleitet. In einigen Ausführungsformen wird ein durch die Verfahren hergestellt endgültige Endoderm Zelle, wie hierin offenbart ist, nicht durch eine statistisch signifikante Menge mindestens eines Markers, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ausdrücken: Ziel, Pax6, Flkl und CD31 relativ zu der pluripotenten Stammzelle, aus der es abgeleitet.
In einigen Ausführungsformen hat ein durch die Verfahren hergestellt endgültige Endoderm Zelle wie hierin offenbart einen höheren Grad der Phosphorylierung von Smad2 durch eine statistisch signifikante Menge gegenüber der pluripotenten Stammzelle, aus der sie abgeleitet wurde. In einigen Ausführungsformen wird ein durch die Verfahren hergestellt endgültige Endoderm Zelle wie hierin beschrieben die Fähigkeit hat, gut Rohr in vivo zu bilden. In einigen Ausführungsformen, wie hier offenbart, ein durch die Verfahren hergestellt endgültige Endoderm Zelle in eine Zelle mit charakteristische Morphologie einer Darmzelle zu differenzieren, und wobei eine Zelle mit charakteristische Morphologie einer Darmzelle FOXA2 und / oder Claudin6 ausdrückt. In einigen Ausführungsformen kann eine durch die Verfahren, wie hier offenbart hergestellten endgültigen Endoderm Zelle ferner in eine Zelle Endoderm Herkunft unterschieden werden.
In einigen Ausführungsformen wird eine Population von pluripotenten Stammzellen in Gegenwart von mindestens einem β-Zellreifung Faktor vor einer Differenzierung oder während der ersten Stufe der Differenzierung kultiviert. Man jede pluripotente Stammzelle zu verwenden, wie etwa einem Menschen pluripotente Stammzelle oder einer menschlichen iPS Zelle oder einem der pluripotenten Stammzelle, wie sie hier oder andere geeignete pluripotenten Stammzellen diskutiert. In einigen Ausführungsformen kann ein β-Zellreifung Faktor, wie hierin beschrieben in dem Kulturmedium von einer Population von pluripotenten Stammzellen vorliegen oder im Bolus oder periodisch während des Wachstums (zB Replikation oder Ausbreitung) der Population von pluripotenten Stammzellen zugesetzt werden. Bei bestimmten Beispielen kann eine Population von pluripotenten Stammzellen mindestens einem β-Zellreifung Faktor vor einer Differenzierung ausgesetzt werden. In anderen Beispielen kann eine Population von pluripotenten Stammzellen mindestens einem β-Zellreifung Faktors während der ersten Stufe der Differentiation ausgesetzt werden.
Induktion der Differenzierung von Definitive Entodermzellen zu Urdarm Schlauchzellen
Aspekte der Offenbarung beinhalten Urdarm Schlauchzellen. Urdarm Schlauchzellen des diesbezüglichen Gebrauch können aus jeder Quelle stammen oder in Übereinstimmung mit einem beliebigen geeigneten Protokolls erzeugt werden. In einigen Aspekten sind definitive Entoderm Zellen Urdarm Schlauchzellen differenziert. Gemäß einigen Aspekten sind die Urdarm Schlauchzellen weiter differenziert, zB nach PDX1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, Ngn3-positive endokrine Vorläuferzellen, Insulin-positiven endokrinen Zellen, gefolgt von Induktion oder Reifung auf SC-β-Zellen.
In einigen Ausführungsformen Urdarm Schlauchzellen kann durch Differenzieren zumindest einige definitive Entoderm Zellen in einer Population in Urdarm Schlauchzellen, beispielsweise erhalten werden durch Kontaktieren definitiven Endoderms Zellen mit mindestens einem Wachstumsfaktor aus der Fibroblastenwachstumsfaktor ( FGF) -Familie, die Differenzierung von zumindest einigen der endgültigen Entodermzellen in Urdarm Schlauchzellen, wobei die Urdarm Schlauchzellen exprimieren zumindest eine Markierung charakteristisch Urdarm Schlauchzellen induzieren.
Die Erfindung sieht die Verwendung jeglicher Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie, die endgültige Entodermzellen induziert in Urdarm Schlauchzellen (beispielsweise allein oder in Kombination mit anderen Faktoren) zu differenzieren. In einigen Ausführungsformen weist der zumindest eine Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF). In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie umfasst FGF2. In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie umfasst FGF8b. In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie umfasst FGF10. In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie umfasst FGF21.
Der Fachmann wird erkennen, dass die Konzentrationen an Wachstumsfaktor verwendet wird, kann variieren. 500 ng / mL - in einigen Ausführungsformen werden die endgültigen Entodermzellen mit dem mindestens einem Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration zwischen 5 ng / ml in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen werden die endgültigen Entodermzellen mit dem mindestens einem Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration von 10 ng / ml, 1 5 ng / ml, 20 ng / ml, 25 ng / ml, 30 ng / ml kontaktiert, 35 ng / ml oder 40 ng / mL. In einigen Ausführungsformen werden die endgültigen Entodermzellen mit dem mindestens einem Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration von 60 ng / ml, 65 ng / ml, 70 ng / ml, 75 ng / ml, 80 ng / ml in Kontakt gebracht, 85 ng / ml, 90 ng / ml, 95 ng / ml oder 100 ng / mL. In einigen Ausführungsformen werden die endgültigen Entodermzellen mit dem mindestens einem Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration von 41 ng / ml, 42 ng / ml, 43 ng / ml, 44 ng / ml, 45 ng / ml in Kontakt gebracht, 46 ng / ml, 47 ng / ml, 48 ng / ml oder 49 ng / mL. In einigen Ausführungsformen werden die endgültigen Entodermzellen mit dem mindestens einem Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration von 51 ng / ml, 52 ng / ml, 53 ng / ml, 54 ng / ml, 55 ng / ml in Kontakt gebracht, 56 ng / ml, 57 ng / ml, 58 ng / ml oder 59 ng / mL. In einigen Ausführungsformen werden die endgültigen Entodermzellen mit dem mindestens einem Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration von 50 ng / ml in Kontakt gebracht.
In einigen Ausführungsformen werden die endgültigen Entodermzellen in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert.
Im Allgemeinen werden die definitiven Endoderms Zellen werden in einem geeigneten Kulturmedium (zB Suspensionskultur) für einen Zeitraum, der ausreicht, um die Differenzierung von zumindest einigen der endgültigen Entodermzellen in Urdarm Schlauchzellen induzieren gehalten. Ein beispielhaftes geeignetes Kulturmedium ist in Tabelle 2 unten gezeigt. Tabelle 2

Agenz Menge

MCDB131 11

Glukose 0,44 g

NaHCO3 1,23 g

FAF-BSA 20 g

IST-X 20 µl

Glutamax 10 ml

Vitamin C 0.044 g

Heparin 0 g

P/S 10 ml
In einigen Ausführungsformen kann ein geeignetes Kulturmedium für die Differenzierung definitive Entodermzellen in Urdarm Schlauchzellen umfasst S2 Medien.
In einigen Ausführungsformen Kontaktieren der definitiven Endoderms Zellen in Suspensionskultur durchgeführt wird. In einigen Ausführungsformen wird die Suspensionskultur in einer Spinner-Flasche gehalten. In einigen Ausführungsformen ist die Zeitdauer zwischen 2 Tagen und 5 Tagen. In einigen Ausführungsformen ist der Zeitraum von 3 Tagen. In einigen Ausführungsformen wird die Suspensionskultur jeden zweiten Tag erneuert.
In einigen Ausführungsformen definitive Entodermzellen kann durch Differenzieren zumindest ein Teil der endgültigen Endoderm Zellen in einer Population in Urdarm Schlauchzellen, beispielsweise erhalten werden, indem man die definitive Entodermzellen mit KGF, um die Differenzierung zu induzieren mindestens einige der endgültigen Entodermzellen in Urdarm Schlauchzellen, wobei die Urdarm Schlauchzellen exprimieren zumindest eine Markierung charakteristisch definitive Entoderm.
Induktion der Differenzierung von Urdarm Schlauchzellen zu -positiven Pankreas-Vorläuferzellen Pdxl
Aspekte der Offenbarung beinhalten Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen. Pdxl - positiven Pankreas-Vorläuferzellen der Verwendung hierin kann von jeder Quelle stammen oder in Übereinstimmung mit einem beliebigen geeigneten Protokolls erzeugt werden. In einigen Aspekten sind Urdarm Schlauchzellen differenziert -positiven Pankreas-Vorläuferzellen Pdxl. In einigen Aspekten sind die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen weiter differenziert, zB NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, Ngn3 positive endokrine Vorläuferzellen, Insulin-positiven endokrinen Zellen, gefolgt von Induktion oder Reifung SC-β-Zellen.
In einigen Aspekten Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen kann durch Differenzieren zumindest einige Urdarm Schlauchzellen in einer Population in Pdxl - positiven Pankreas-Vorläuferzellen, beispielsweise mit zumindest einem i erhalten werden, durch Kontaktieren Urdarm Schlauchzellen) Knochenmorphogeneseprotein (BMP) Signalweg-Inhibitors, ii) mindestens einem Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie, iii) mindestens einem SHH-Pathway-Inhibitor, iv) mindestens ein-Retinsäure (RA) Signalweg Aktivator; und v) mindestens einem Proteinkinase-C-Aktivator, um die Differenzierung von zumindest einigen der Urdarm Schlauchzellen in Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, wobei die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen exprimieren Pdxl induzieren.
Die Erfindung zieht die Verwendung jeder BMP-Signalweg-Inhibitor, Urdarm Schlauchzellen induziert in Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen zu differenzieren (beispielsweise allein oder mit einer beliebigen Kombination von mindestens einem Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie zumin mindestens einem SHH-Hemmstoff, mindestens ein Retinsäure Signalweg Aktivator und zumindest ein Proteinkinase C-Aktivator). In einigen Ausführungsformen umfasst das BMP-Signalweg-Inhibitors LDN 193 1 89.
Die Erfindung zieht die Verwendung jeder Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie, die Urdarm Schlauchzellen induziert in Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen zu differenzieren (beispielsweise allein oder mit einer beliebigen Kombination von mindestens einem BMP-Signalweg-Inhibitors, um mindestens einem SHH-Hemmstoff, mindestens ein Retinsäure Signalweg Aktivator und zumindest ein Proteinkinase C-Aktivator). In einigen Ausführungsformen weist der zumindest eine Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie Keratinozyten-Wachstumsfaktor (GF). In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie aus der Gruppe bestehend aus FGF2, FGF8b, FGF10, FGF21, und ausgewählt ist.
Die Erfindung zieht die Verwendung jeder SHH-Pathway-Inhibitor, der Urdarm Schlauchzellen induziert in Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen (beispielsweise allein oder mit einer beliebigen Kombination von mindestens einem BMP-Signalweg-Inhibitor, mindestens einen Wachstumsdifferen Faktor aus der FGF-Familie, wobei mindestens eine Retinsäure Signalweg Aktivator und zumindest ein Proteinkinase C-Aktivator). In einigen Ausführungsformen umfasst das SFIH pathway inhibitor Santl.
Die Erfindung zieht die Verwendung jeder RA Signalweg Aktivator, Urdarm Schlauchzellen induziert in Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen (beispielsweise allein oder mit einer beliebigen Kombination von mindestens einem BMP-Signalweg-Inhibitor, mindestens einen differen Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie, mindestens einem SHH-Pathway-Inhibitor und mindestens einem Proteinkinase-C-Aktivator). In einigen Ausführungsformen umfasst das RA-Signalweg Aktivator Retinsäure.
Die Erfindung zieht die Verwendung jeder PKC-Aktivator, Urdarm Schlauchzellen induziert in Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen (beispielsweise allein oder mit einer beliebigen Kombination von mindestens einem BMP-Signalweg-Inhibitor, mindestens einen Wachstumsfaktor differen von der FGF-Familie, mindestens einem SHH-Pathway-Inhibitor, und mindestens eine RA Signalweg Aktivator). In einigen Ausführungsformen umfasst die PKC-Aktivator PDBU. In einigen Ausführungsformen umfasst die PKC-Aktivator TPB.
Der Fachmann wird erkennen, dass die Konzentrationen der Mittel (zB Wachstumsfaktoren) verwendet werden, können variieren. 2000 nm - in einigen Ausführungsformen werden die Urdarm Schlauchzellen mit dem BMP-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 20 nM in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen werden die Urdarm Schlauchzellen mit dem BMP-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 30 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, HO nM, 120 nM, 130 kontaktiert nM, 140 nM, 1 50 nM, 160 nM, 170 nM, 180 nM oder 190 nM. In einigen Ausführungsformen werden die Urdarm Schlauchzellen mit dem BMP-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 191 nM, 192 nM, 193 nM, 194 nM, 195 nM, 196 nM, 197 nM, 198 nM oder 199 nM in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen werden die Urdarm Schlauchzellen mit dem BMP-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 300 nM, 400 nM, 500 nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM, 900 nM, 1000 nM, H OO nM, 1200 kontaktiert nM, 1300 nM, 1400 nM, 1500 nM, 1600 nM, 1700 nM, 1 800 nm oder 1900 nM. In einigen Ausführungsformen werden die Urdarm Schlauchzellen mit dem BMP-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 210 nM, 220 nM, 230 nM, 240 nM, 250 nM, 260 nM, 270 nM, 280 nM oder 290 nM in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen werden die Urdarm Schlauchzellen mit dem BMP-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 200 nM in Kontakt gebracht.
In einigen Ausführungsformen Urdarms Schlauchzellen werden mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration in Kontakt zwischen 5 ng / ml - 500 ng / mL. In einigen Ausführungsformen sind die primitiven Darmröhre Zellen mit dem mindestens einen Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration von 10 ng / ml, 15 ng / ml, 20 ng / ml, 25 ng / ml kontaktiert wird, 30 ng / ml, 35 ng / ml oder 40 ng / mL. In einigen Ausführungsformen sind die primitiven Darmröhre Zellen mit dem mindestens einen Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration von 60 ng / ml, 65 ng / ml, 70 ng / ml, 75 ng / ml, 80 ng / mL in Berührung 85 ng / ml, 90 ng / ml, 95 ng / ml oder 100 ng / mL. In einigen Ausführungsformen sind die primitiven Darmröhre Zellen mit dem mindestens einen Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration von 41 ng / ml, 42 ng / ml, 43 ng / ml, 44 ng / ml, 45 ng / ml kontaktiert, 46 ng / ml, 47 ng / ml, 48 ng / ml oder 49 ng / mL. In einigen Ausführungsformen sind die primitiven Darmröhre Zellen mit dem mindestens einen Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration von 5 1 ng / ml, 52 ng / ml, 53 ng / ml, 54 ng / ml kontaktiert wird, 55 ng / ml, 56 ng / ml, 57 ngmiL, 58 ng / ml oder 59 ng / mL. In einigen Ausführungsformen werden die Urdarm Rohr Zellen mit dem mindestens einen Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration von 50 ng / ml in Kontakt gebracht.
In einigen Ausführungsformen Urdarms Schlauchzellen werden mit dem zumindest einen SHH-Pathway-Inhibitor in einer Konzentration von zwischen 0,1 µ und 0,5 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen werden die Urdarm Rohr Zellen mit dem mindestens einen SHH-Pathway-Inhibitor in einer Konzentration von 0 1 1 µM, 0,12 µM, 0,13 µM, 0,14 µM, 0,15 µM, 0,16 µM, 0,17 µM, 0,18 µM kontaktiert, 0,19 µM, 0,2 µM, 0,21 µM, 0,22 µM, 0,23 µM oder 0,24 µM. In einigen Ausführungsformen sind die primitiven Darmröhre Zellen mit dem mindestens einen SHH-Pathway-Inhibitor in einer Konzentration von 0,26 µM, 0,27 µM, 0,28 µM, 0,29 µM, 0,30 µM, 0,31 µM, 0,32 µM, 0,33 µM, 0,34 µM kontaktiert, 0,35 µM, 0,36 µM, 0,37 µM, 0,38 µM, 0,39 µM, 0,40 µM, 0,41 µM, 0,42 µM, 0,43 µM, 0,44 µM, 0,45 µM, 0,46 µM, 0,47 µM, 0,48 µM, 0,49 µM. In einigen Ausführungsformen werden die Urdarm Rohr Zellen mit dem mindestens einen SHH-Pathway-Inhibitor in einer Konzentration von 0,25 µM kontaktiert.
In einigen Ausführungsformen werden die Urdarm Rohr Zellen mit dem RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von zwischen 0,01 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen werden die Urdarm Rohr Zellen mit dem RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 0,02 µM, 0,03 µM, 0,04 µM, 0,05 µM, 0,06 µM, 0,07 µM, 0,08 µM oder 0,09 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen werden die Urdarm Rohr Zellen mit dem RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 0,20 µM, 0,30 µM, 0,40 µM, 0. 05 µM, 0,60 µM, 0,70 µM, 0,80 µM oder 0,90 µM kontaktiert. Bei einigen Ausführungsformen werden die Urdarm Rohr Zellen mit dem RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 0,1 µM kontaktiert.
In einigen Ausführungsformen werden die Urdarm Schlauchzellen mit PKC-Aktivator in einer Konzentration von 50 nM in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen werden die Urdarm Schlauchzellen mit der PKC-Aktivator in einer Konzentration von 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 460 nM, 470 nM, 480 kontaktiert nM oder 490 nM. In einigen Ausführungsformen werden die Urdarm Schlauchzellen mit der PKC-Aktivator in einer Konzentration von 491 nM, 492 nM, 493 nM, 494 nM, 495 nM, 496 nM, 497 nM, 498 nM oder 499 nM in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen werden die Urdarm Schlauchzellen mit der PKC-Aktivator in einer Konzentration von 600 nM in Kontakt gebracht. 700 nm, 800 nm, 900 nm, 1000 nm, 1 100 nm, 1200 nm, 1300 nm, 1400 nm, 1500 nm, 1600 nm, 1700 nm, 1800 nm, 1900 nm oder 2000 nm. In einigen Ausführungsformen werden die Urdarm Schlauchzellen mit der PKC-Aktivator in einer Konzentration von 501 nM, 502 nM, 503 nM, 504 nM, 505 nM, 506 nM, 507 nM, 508 nM oder 509 nM, 510 nM in Kontakt gebracht, 520 nM, 530 nM, 540 nM, 550 nM, 560 nM, 570 nM, 580 nM bzw. 590 nM. In einigen Ausführungsformen werden die Urdarm Schlauchzellen mit der PKC-Aktivator in einer Konzentration von 500 nM in Kontakt gebracht.
Im Allgemeinen werden die Urdarm Schlauchzellen werden in einem geeigneten Kulturmedium für einen Zeitraum, der ausreicht, um die Differenzierung von zumindest einigen der Urdarm Schlauchzellen in Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen zu induzieren gehalten (zB Suspensionskultur) . Ein beispielhaftes geeignetes Kulturmedium ist in Tabelle 3 unten gezeigt. Tabelle 3

Agenz Menge

MCDB131 1 l

Glukose 0,44

NaHCO3 1,23

FAF-BSA 20 g

IST-X 5 ml

Glutamax 10 ml

Vitamin C 0.044 g

Heparin 0 g

P/S 10 ml
In einigen Ausführungsformen kann S3 Medien als einem geeigneten Kulturmedium zur Differenzierung Urdarm Rohr Zellen in Pankreas-Vorläuferzellen verwendet werden.
In einigen Ausführungsformen Inkontaktbringen Urdarms Schlauchzellen in Suspensionskultur durchgeführt wird. In einigen Ausführungsformen wird die Suspensionskultur in einer Spinner-Flasche gehalten. In einigen Ausführungsformen ist der Zeitraum mindestens 2 Tage. In einigen Ausführungsformen wird die Suspensionskultur täglich nachgefüllt.
In einigen Ausführungsformen Urdarm Schlauchzellen kann durch Differenzieren zumindest einige der Urdarm Rohr Zellen in einer Population in Pdxl erhalten werden - positive Pankreas-Vorläuferzellen, beispielsweise durch Kontaktieren der Urdarm Schlauchzellen mit i) LDN 193 189, ii) KGF, iii) Santl; iv) RA; und iv) PDBu, die Differenzierung von zumindest einigen der Urdarms Rohr ce induzieren !! s in Pdxl - positiven Pankreas-Vorläuferzellen, wobei die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen exprimieren Pdxl.
Induktion der Differenzierung von Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen zu NKX6-1 + Pankreas-Vorläuferzellen
Aspekte der Offenbarung beinhalten NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen. NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen der Verwendung hierin kann von jeder Quelle stammen oder in Übereinstimmung mit einem beliebigen geeigneten Protokolls erzeugt werden. In einigen Aspekten Pdxl - positive Pankreas-Vorläuferzellen differenziert sind, um 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen NKX6-. In einigen Aspekten sind die NKX6- 1 - positiven Pankreas-Vorläuferzellen weiter differenziert, um beispielsweise für Ngn3 positive endokrine Vorläuferzellen oder Insulin-positiven endokrinen Zellen, gefolgt von Induktion oder Reifung SC-β-Zellen.
In einigen Aspekten wird ein Verfahren zur Herstellung eines NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzelle aus einer Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen umfasst das Inkontaktbringen einer Population von Zellen (zB unter Bedingungen, die Zellklumpen zu fördern), umfassend Pdxl - positive Pankreas-Vorläufer Zellen, die mit mindestens zwei β Zellreifungsfaktoren, enthaltend a) mindestens einem Wachstumsfaktor aus der Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) -Familie, b) einem Sonic-Hedgehog-Signalweg-Inhibitor und gegebenenfalls c) eine geringe Konzentration eines Retinsäure (RA) positive Pankreas-Vorläuferzellen, wobei die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen exprimiert - Signalweg Aktivator für einen Zeitraum von mindestens fünf Tagen, um die Differenzierung von zumindest einem Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in der Population in NKX6- 1 veran NKX6- 1.
In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden durch Kontaktieren Pdx 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen unter Bedingungen, die Zellklumpen mit i) mindestens einem Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie zu fördern, erhalten, ii) mindestens einem SHH-Pathway-Inhibitor und gegebenenfalls iii) geringe Konzentrationen eines RA Signalweg Aktivator für einen Zeitraum von fünf Tagen, die Differenzierung von zumindest einigen der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pdxl -positiven induzieren NKX6 -1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, wobei die Pdxl -positive, NKX6- 1 - positive Pankreas-Vorläuferzellen exprimiert Pdxl und N X6- 1.
In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, N X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden durch Kontaktieren Pdx 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit i) mindestens einem Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie erhalten wird, ii) mindestens ein SHH-Pathway-Inhibitor und iii) eine RA-Signalweg-Aktivator, um die Differenzierung von zumindest einigen der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pdxl -positiven induzieren NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, wobei die Pdxl -positive, NKX6 - 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen exprimiert Pdxl und NKX6- 1.
In einigen Ausführungsformen sind die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden aus einer Population von pluripotenten Zellen. In einigen Ausführungsformen sind die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen aus einer Population von iPS-Zellen produziert. In einigen Ausführungsformen sind die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen aus einer Population von ESC-Zellen produziert. In einigen Ausführungsformen sind die Pdxl - positiven Pankreas-Vorläuferzellen aus einer Population von definitiven Endoderm Zellen produziert. In einigen Ausführungsformen sind die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen aus einer Population von primitiven Darmrohr-Zellen produziert,
Die Erfindung zieht die Verwendung jeder Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie, die Pdxl induziert -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen (beispielsweise unterscheiden, allein oder mit einer beliebigen Kombination von mindestens einem SHH Weg Inhibitor oder gegebenenfalls mindestens ein Retinsäure Signalweg Aktivator). In einigen Ausführungsformen weist der zumindest eine Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF). In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie aus der Gruppe bestehend aus FGF2, FGF8b, FGF10, FGF21, und ausgewählt ist.
Die Erfindung zieht die Verwendung jeder SHH-Pathway-Inhibitor, der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen (Differenzierung induziert beispielsweise allein oder mit einer beliebigen Kombination von mindestens einem Wachstumsfaktor aus der FGF Familie oder mindestens eine Retinsäure Signalweg Aktivator). In einigen Ausführungsformen umfasst der SHH-Pathway-Inhibitor Santl.
Die Erfindung zieht die Verwendung jeder RA Signalweg Aktivator, Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen dazu veranlaßt, in N X6- unterscheiden 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen (beispielsweise allein oder mit einer beliebigen Kombination von mindestens einem Wachstumsfaktor aus FGF-Familie, und mindestens einem SHH-Pathway-Inhibitor). In einigen Ausführungsformen umfasst das RA-Signalweg Aktivator Retinsäure.
In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Kontaktieren der Population von Zellen (zB Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen) mit zumindest einer zusätzlichen β Zellreifungsfaktor. In einigen Ausführungsformen umfasst die zumindest eine zusätzliche β-Zellreifungsfaktor mindestens einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Kontaktieren der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit mindestens einem Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF. Die Offenbarung sieht die Verwendung von beliebigen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF, die die Differenzierung von Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in N X6-1 - positiven Pankreas-Vorläuferzellen (beispielsweise ermöglicht, zusammen mit einer beliebigen Kombination von mindestens einem Wachstumsfaktor aus der FGF Familie, mindestens einem SHH-Pathway-Inhibitor und gegebenenfalls mindestens ein RA Signalweg Aktivator). In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF umfasst Betacellulin. In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF umfasst.
Der Fachmann wird erkennen, dass die Konzentrationen der Mittel (zB Wachstumsfaktoren) verwendet werden, können variieren. 100 ng / mL - in einigen Ausführungsformen werden die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration von 1 ng / ml in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen die Pdxl - positive Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration von 5 ng / ml, 10 ng / ml, 15 ng / ml, 20 ng / ml, 25 ng kontaktiert / ml, 30 ng / ml, 35 ng / ml oder 40 ng / mL. In einigen Ausführungsformen werden die Pdxl - positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration von 60 ng / ml, 65 ng / ml, 70 ng / ml, 75 ng / ml, 80 ng kontaktiert / ml, 85 ng / ml, 90 ng / ml, 95 ng / ml oder 100 ng / mL. In einigen Ausführungsformen werden die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration von 41 ng / ml, 42 ng / ml, 43 ng / ml, 44 ng / ml, 45 ng kontaktiert / ml, 46 ng / ml, 47 ng / ml, 48 ng / ml oder 49 ng / mL. In einigen Ausführungsformen werden die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration von 51 ng / ml, 52 ng / ml, 53 ng / ml, 54 ng / ml, 55 ng kontaktiert / ml, 56 ng / ml, 57 ng / ml, 58 ng / ml oder 59 ng / mL. In einigen Ausführungsformen sind die Pdxl-positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit dem mindestens einen Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie in einer Konzentration von 50 ng / mL in Kontakt gebracht.
In einigen Ausführungsformen sind die p Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem zumindest einen SHH-Pathway-Inhibitor in einer Konzentration von zwischen 0,1 und 0,5 µM µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen werden die Pdxl-positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit der mindestens einen SHH-Pathway-Inhibitor in einer Konzentration von 0,1 1 µM, 0,12 µM, 0,13 µM, 0,14 µM, 0,15 µM, 0,16 µM, 0,17 µM, 0,18 µM kontaktiert, 0,19 µM, 0,2 µM, 0,21 µM, 0,22 µM, 0,23 µM oder 0,24 µM. In einigen Ausführungsformen werden die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit der mindestens einen SHH-Pathway-Inhibitor in einer Konzentration von 0,26 µM, 0,27 µM, 0,28 µM, 0,29 µM, 0,30 µM, 0,31 µM, 0,32 µM, 0,33 µM, 0,34 kontaktiert µM, 0,35 µM, 0,36 µM, 0,37 µM, 0,38 µM, 0,39 µM, 0,40 µM, 0,41 µM, 0,42 µM, 0,43 µM, 0,44 µM, 0,45 µM, 0,46 µM, 0,47 µM, 0,48 µM, 0,49 µM. In einigen Ausführungsformen werden die Pdxl - positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit der mindestens einen SHH-Pathway-Inhibitor in einer Konzentration von 0,25 µM kontaktiert.
In einigen Ausführungsformen werden die Pd 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit der RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von zwischen 0,01 µ kontaktiert. In einigen Ausführungsformen werden die Pdx 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit der RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 0,02 µM, 0,03 µM, 0,04 µM, 0,05 µM, 0,06 µM, 0,07 µ, 0,08 µM oder 0,09 µM kontaktiert. Bei einigen Ausführungsformen werden die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit der RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 0,20 µ kontaktiert, 0,30 µM, 0,40 µM, 0. 05 µ, 0,60 µM, 0,70 µM, 0,80 µM oder 0,90 µM. In einigen Ausführungsformen werden die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit der RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 0,1 µM kontaktiert.
In einigen Ausführungsformen werden die Pdx l -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF mit einer Konzentration von kontaktiert zwischen 2 ng / ml - 200 ng / mL. In einigen Ausführungsformen werden die Pd l -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF mit einer Konzentration von 3 ng / ml, 4 ng / ml, 5 ng / ml, 6 ng / ml, 7 kontaktiert ng / ml, 8 ng / ml, 9 ng / ml, 10 ng / ml, 1 1 ng / ml, 12 ng / ml, 13 ng / ml, 14 ng / ml, 16 ng / ml, 17 ng / ml, 1 8 ng / ml oder 19 ng / mL. In einigen Ausführungsformen werden die Pdx l -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF mit einer Konzentration von 30 ng / ml, 35 ng / ml, 40 ng / ml, 45 ng / ml, 50 kontaktiert ng / ml, 55 ng / ml, 60 ng / ml, 65 ng / ml, 70 ng / ml, 75 ng / ml, 80 ng / ml, 85 ng / ml, 90 ng / ml, 95 ng / ml, oder 100 ng / mL. In einigen Ausführungsformen werden die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF mit einer Konzentration von 21 ng / ml, 22 ng / ml, 23 ng / ml, 24 ng / ml, 25 ng kontaktiert / ml, 26 ng / ml, 27 ng / ml, 28 ng / ml oder 29 ng / mL. In einigen Ausführungsformen werden die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF mit einer Konzentration von 20 ng / ml in Kontakt gebracht.
Im Allgemeinen werden die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in einem geeigneten Kulturmedium für einen Zeitraum, der ausreicht, um die Differenzierung von zumindest einigen der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in der Population in Pdx l induzieren gehalten - positiv, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen. Ein beispielhaftes geeignetes Kulturmedium ist in Tabelle 3 oben gezeigt. In einigen Ausführungsformen, die Bedingungen, die das Zell aggregierende umfassen ein Suspensionskultur. In einigen Ausführungsformen wird die Suspensionskultur in einer Spinner-Flasche gehalten. In einigen Ausführungsformen ist der Zeitraum von mindestens 5 Tagen. In einigen Ausführungsformen wird die Suspensionskultur jeden zweiten Tag erneuert. In einigen Ausführungsformen werden die β-Zellreifungsfaktoren alle zwei Tage erneuert.
In einigen Ausführungsformen ein Aktivator der Proteinkinase C ist nicht auf die Suspensionskultur während 5 Tagen gegeben. In einigen Ausführungsformen wird ein Aktivator der Proteinkinase C aus der Suspensionskultur vor den 5 Tagen entfernt. In einigen Ausführungsformen der Aktivator von Proteinkinase C umfasst PDBU. In einigen Ausführungsformen wird ein BMP-Signalweg-Inhibitors ist nicht auf die Suspensionskultur während 5 Tagen gegeben. In einigen Ausführungsformen wird ein BMP-Signalweg-Inhibitor aus der Suspensionskultur vor den 5 Tagen entfernt. In einigen Ausführungsformen umfasst das BMP-Signalweg-Inhibitors LDN 193189.
In einigen Ausführungsformen mindestens 10% der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in der Population induziert in Pd l -positiven Differenzierung NKX6- 1 - positiven Pankreas-Vorläuferzellen. In einigen Ausführungsformen wenigstens 95% des Pdx l - positive Pankreas-Vorläuferzellen induziert werden, um in Pdxl -positiven Differenzierung NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen.
Im allgemeinen kann jede Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in eine Pdxl - positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen differenziert werden. In einigen Ausführungsformen sind die NK.X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen exprimieren Pdxl, NKX6- 1 und / oder FOXA2.
In einigen Ausführungsformen kann die Pd l -positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden durch Kontaktieren Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen unter Bedingungen, die Zellklumpen mit i) mindestens einem Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie zu fördern, erhalten, ii) mindestens einem SHH-Pathway-Inhibitor und gegebenenfalls iii) geringe Konzentrationen eines RA Signalweg Aktivator für einen Zeitraum von fünf Tagen, die Differenzierung von zumindest einigen der Pdx l -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pdxl -positiven zu induzieren, NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, wobei die Pdx l -positive, NKX6- 1 - positive Pankreas-Vorläuferzellen exprimiert Pdxl und NKX6- 1.
In einigen Ausführungsformen NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen kann durch Differenzieren zumindest einige der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pdxl - positiven erhalten werden NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen durch ein Verfahren des Kontaktierens der PDX l -positiven Pankreas-Vorläuferzellen unter Bedingungen, die Zellklumpen von der FGF-Familie zu fördern mit i) mindestens einem Wachstumsfaktor, ii) mindestens einem SHH-Pathway-Inhibitor und gegebenenfalls iii) eine RA Signalweg Aktivator, jeden zweiten Tag für eine Zeitraum von fünf Tagen, die Differenzierung von zumindest einigen der Pdx l in der Population in NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, wobei die N X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen exprimiert Pdxl und NKX6- induzieren -positiven Pankreas-Vorläuferzellen 1.
In einigen Ausführungsformen N X6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen kann durch Differenzieren zumindest einige der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in einer Population in Pdxl -positiven erhalten werden NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, zB durch Kontaktieren des Pdx l -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit i) mindestens einem Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie, ii) mindestens einem SHH-Pathway-Inhibitor und gegebenenfalls iii) eine RA-Signalweg-Aktivator, um die Differenzierung zu induzieren mindestens einige der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in der Population in N X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, wobei die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen exprimiert Pdxl und NKX6- 1.
Induktion der Differenzierung ofNKX6-1 + Pankreas-Vorläuferzellen auf Insulin + endokrinen Zellen
Aspekte der Offenbarung beinhalten Insulin-positiven endokrinen Zellen. Insulin-positive Zellen des endokrinen Verwendung hierin kann von jeder Quelle stammen oder in Übereinstimmung mit einem beliebigen geeigneten Protokolls erzeugt werden. In einigen Aspekten sind NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen auf Insulin-positiven endokrinen Zellen differenziert. In einigen Aspekten sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen weiter differenziert, beispielsweise durch Induktion oder Reifung SC-β-Zellen.
In einigen Aspekten ein Verfahren zur Herstellung eines Insulin-positiven endokrinen Zelle aus einem NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen umfasst das Inkontaktbringen einer Population von Zellen (zB unter Bedingungen, die Zellklumpen zu fördern), umfassend NKX6- 1 -positiven Pankreas Vorläuferzellen mit mindestens zwei β-Zellreifungsfaktoren, umfassend a) einen TGF-β-Signalweg-Inhibitor und b) einem Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator, um die Differenzierung von zumindest einem NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzelle in dem veran Bevölkerung in eine Insulin-positiven endokrinen Zellen, wobei das Insulin-positive Pankreas-Vorläuferzellen Insulin zum Ausdruck bringt.
Die Erfindung zieht die Verwendung jeder TGF-β-Signalweg-Inhibitor, der die Differenzierung von NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen dazu veranlaßt, in Insulin-positiven endokrinen Zellen (differen zB alleine oder in Kombination mit anderen β zellReifungsfaktoren, beispielsweise ein Thyroidhormon Signalweg Aktivator). In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalwegs umfasst TGF-β-Rezeptor Typ I-Kinase-Signalweg. In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors umfasst ALK5 Inhibitor II.
Die Erfindung zieht die Verwendung jeder Thyroidhormon-Signalweg-Aktivator, der die Differenzierung von NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen dazu veranlaßt, in Insulin-positiven endokrinen Zellen (differen zB alleine oder in Kombination mit anderen β-Zellreifunsfaktoren, beispielsweise ein TGF-β-Signalweg-Inhibitor). In einigen Ausführungsformen das Schilddrüsenhormon-Signalweg Aktivator Trijodthyronin (T3).
In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Kontaktieren der Population von Zellen (zB NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen) mit zumindest einer zusätzlichen β-Zellreifungsfaktor. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Kontaktieren der Pdxl -positiven NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit mindestens einem von i) einem SHH-Pathway-Inhibitor, ii) eine RA Signalweg Aktivator iii) einer γ-Sekretase-Inhibitor, iv) mindestens einen Wachstumsfaktor aus epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) Familie und gegebenenfalls v) einem Proteinkinase-Inhibitor.
In einigen Ausführungsformen ist die mindestens eine zusätzliche β-Zelle -maturation Faktor umfasst einen y-Sekretase-Inhibitor. Die Offenbarung sieht die Verwendung jeglicher γ-Sekretase-Hemmer, der zur Induktion der Differenzierung von NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in einer Population in Insulin-positiven endokrinen Zellen (beispielsweise allein oder in Kombination mit einer beliebigen TGF- ist β-Signalweg-Inhibitors und / oder einen Schilddrüsenhormon Signalweg Aktivator). In einigen Ausführungsformen umfasst die γ-Sekretase-Inhibitor XXI. In einigen Ausführungsformen umfasst die γ-Sekretase-Inhibitor DAPT.
In manchen Ausführungsformen umfasst die zumindest eine zusätzliche β-Zellreifungsfaktor mindestens einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF. Die Offenbarung sieht die Verwendung von beliebigen Wachstumsfaktor aus der EGF Familie, die zur Induktion der Differenzierung von N X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in einer Population in Insulin-positiven endokrinen Zellen (beispielsweise allein oder in Kombination mit irgendeinem der ist eine TGF-β-Signalweg-Inhibitor und / oder einen Schilddrüsenhormon Signalweg Aktivator). In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF umfasst Betacellulin. In einigen Ausführungsformen zumindest eine Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF umfasst.
In manchen Ausführungsformen umfasst die zumindest eine zusätzliche β-Zellreifungsfaktor eine geringe Konzentration eines Retinsäure (RA) Signalweg Aktivator. Die Offenbarung sieht die Verwendung jedes RA Signalweg-Aktivator, der die Differenzierung von NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen dazu veranlaßt, in Insulin-positiven endokrinen Zellen (differen zB alleine oder in Kombination mit beliebigen einer TGF-β-Signalweg-Inhibitors und / oder einen Schilddrüsenhormon Signalweg Aktivator). In einigen Ausführungsformen umfasst das RA Signalweg Aktivator RA.
In manchen Ausführungsformen umfasst die zumindest eine zusätzliche β-Zellreifungsfaktor einen sonic hedgehog (SHH) pathway inhibitor. Die Offenbarung sieht die Verwendung jeglicher SHH-Hemmstoff, der die Differenzierung von NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen dazu veranlaßt, in Insulin-positiven endokrinen Zellen (beispielsweise allein oder in Kombination mit beliebigen einer TGF-β-Signalweg-Inhibitors und differenzieren / oder eine Schilddrüsenhormon-Signalweg Aktivator). In einigen Ausführungsformen umfasst der SHH-Pathway-Inhibitor Santl.
In einigen Ausführungsformen wird die Population von Zellen (zB NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen), um Glukose ausgesetzt.
In einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation gegebenenfalls mit einem Proteinkinaseinhibitor in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen wird die Population von Zellen, nicht mit dem Proteinkinaseinhibitor in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen wird die Zellpopulation mit dem Proteinkinaseinhibitor in Kontakt gebracht. Die Offenbarung betrachten die Verwendung von Protein-Kinase-Inhibitor, der zur Induktion der Differenzierung von Pankreas-Vorläufer NKX6-1 -positiven Zellen in einer Population in Insulin-positiven endokrinen Zellen (beispielsweise allein oder in Kombination mit beliebigen einer TGF-β ist, Signalweg-Inhibitors und / oder einen Schilddrüsenhormon Signalweg Aktivator). In einigen Ausführungsformen umfasst das Protein-Kinase-Inhibitor Staurosporin.
In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen werden durch Kontaktieren Pdx l -positiven -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit i erhaltenen NKX6- 1) mindestens einem SHH-Pathway-Inhibitor, ii) eine RA Signalweg Aktivator iii) eine y-Sekretase-Inhibitor, iv) ein TGF-β) Signalweg-Inhibitors, v) einem TH-Signalwegs Aktivator und vi) mindestens einem Wachstumsfaktor aus der (EGF) Familie des epidermalen Wachstumsfaktors, um die Differenzierung zu induzieren mindestens einige der Pdxl -positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pdxl -positive, NKX6-1, Insulin-positiven endokrinen Zellen, wobei die Pdxl -positive, NKX6- 1, Insulin-positiven endokrinen Zellen exprimieren Pdxl, NKX6- 1, NKX2- 2, MAFB, glis3, Surl, ir6.2, ZnT8, SLC2A 1, SLC2A3 und / oder Insulin.
Der Fachmann wird erkennen, dass die Konzentrationen der verwendeten Mittel (zB Wachstumsfaktoren) variieren können.
In einigen Ausführungsformen sind die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem zumindest einen TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von zwischen 100 nm kontaktiert - 100 µM. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit der mindestens einen TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 10 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit der mindestens einen TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 100 nM, 200 nM, 300 nM, 400 nM, 500 nM, 600 nM, 700 nM kontaktiert, 800 nm oder 900 nm. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit der mindestens einen TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 2 µM, 3 µM, 4 µM 5 µM, 6 µM, 7 µM, 8 µM kontaktiert oder 9 µM. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 - positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit der mindestens einen TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 9,1 µM, 9,2 µM, 9,3 µM, 9,4 µM, 9,5 µM, 9,6 µM, 9,7 µM kontaktiert, 9.8 oder 9.9 µM µM. In einigen Ausführungsformen sind die N X6- 1 - positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit der mindestens einen TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 1 1 µM, 12 µM, 13 µM, 14 µM, 15 µM, 16 µM kontaktiert, 17 µM, 18 µM oder 19 µM. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit der mindestens einen TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 10,1 µM kontaktiert, 10,2 µM, 10,3 µM, 10,4 µM, 10,5 µM, 10,6 µM 10,7 µM , 10,8 µM oder 1 0,9 µM.
In einigen Ausführungsformen sind die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von zwischen 0,1 µM kontaktiert - 10 µM. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 - positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit dem Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 1 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit dem Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 0,2 µM, 0,3 µM, 0,4 µM 0,5 µM, 0,6 µM 0,7 µM, 0,8 µM oder 0,9 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit der γ Thyroidhormon-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 1 .1 µM kontaktiert, 1 .2 µM 1,3 µM, 1 .4 µM 1,5 µM 1,6 µM , 1,7 µ, 1,8 µM oder 1 0,9 µM. Bei einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit dem Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 2 µM, 3 µM, 4 µM 5 µM, 6 µM, 7 µM, 8 µM oder 9 µM kontaktiert.
In einigen Ausführungsformen sind die N X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit der γ-Sekretase-Inhibitor in einer Konzentration zwischen 0 1 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen die NKX6-! -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit der γ-Sekretase-Inhibitor in einer Konzentration von 1 µM kontaktiert. Bei einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit der γ-Sekretase-Inhibitor in einer Konzentration von 0,2 µM kontaktiert, 0,3 µM, 0,4 µM 0,5 µM 0,6 µM 0,7 µM, 0,8 µM oder 0,9 µM. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 - positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit der γ-Sekretase-Inhibitor in einer Konzentration von 1, 1 µ kontaktiert, 1 .2 µM, 1 .3 µM, 1 .4 µM, 1 .5 µM, 1.6 µM, 1 0,7 µM, 1 0,8 µM oder 1 0,9 µM. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit der γ- Sekretase-Inhibitor in einer Konzentration von 2 µM, 3 µM, 4 µM 5 µM, 6 µM, 7 µM, 8 µM oder 9 µM kontaktiert.
In einigen Ausführungsformen sind die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF mit einer Konzentration von 2 ng kontaktiert / ml - 200 ng / mL. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF mit einer Konzentration von 3 ng / ml, 4 ng / ml, 5 ng / ml, 6 ng / ml in Kontakt gebracht, 7 ng / ml, 8 ng / ml, 9 ng / ml, 10 ng / ml, 1 1 ng / ml, 12 ng / ml, 13 ng / ml, 14 ng / ml, 16 ng / ml, 17 ng / ml 1 8 ng / ml oder 19 ng / mL. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF mit einer Konzentration von 30 ng / ml, 35 ng / ml, 40 ng / ml, 45 ng / ml in Kontakt gebracht, 50 ng / ml, 55 ng / ml, 60 ng / ml, 65 ng / ml, 70 ng / ml, 75 ng / ml, 80 ng / ml, 85 ng / ml, 90 ng / ml, 95 ng / ml, oder 100 ng / mL. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF mit einer Konzentration von 21 ng / ml, 22 ng / ml, 23 ng / ml, 24 ng / ml in Kontakt gebracht, 25 ng / ml, 26 ng / ml, 27 ng / ml, 28 ng / ml oder 29 ng / mL. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit dem zumindest einen Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF mit einer Konzentration von 20 ng / ml in Kontakt gebracht.
In einigen Ausführungsformen kann die N X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von zwischen 0,01 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit der RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 0,02 µM, kontaktiert 0,03 µ , 0,04 µM, 0,05 µM, 0,06 µM, 0,07 µM, 0,08 µM oder 0,09 µM. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit der RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 0,20 µM, 0,30 µ, 0,40 µM, 0. 05 µM, 0,60 µM, 0,70 µM, 0,80 µM oder 0,90 kontaktiert µM. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit der RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 0,1 µM kontaktiert.
In einigen Ausführungsformen sind die N X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit einer niedrigen Konzentration eines RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von zwischen 0,01 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen die NKX6- 1 - positive Pankreas-Vorläuferzellen mit einer niedrigen Konzentration des RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 0,02 µM, 0,03 µM, 0,04 µM, 0,05 µM, 0,06 µM, 0,07 µM, 0,08 µM kontaktiert, oder 0,09 µM. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit der niedrigen Konzentration eines RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 0,20 µM, 0,30 µM, 0,40 µM, 0. 05 µM, 0,60 µM, 0,70 µM, 0,80 kontaktiert µM oder 0,90 µM. In einigen Ausführungsformen sind die N X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit einer niedrigen Konzentration des RA-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 0,1 µM kontaktiert.
In einigen Ausführungsformen sind die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit dem zumindest einen SHH-Pathway-Inhibitor in einer Konzentration von zwischen 0,1 und 0,5 µM µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit der mindestens einen SHH-Pathway-Inhibitor in einer Konzentration von 0,1 1 µM, 0,12 µM, 0,13 µM, 0,14 µM, 0,1 5 µM, 0,16 µM, 0,17 µM kontaktiert, 0,18 µM, 0,19 µM, 0,2 µM, 0,21 µM, 0,22 µM, 0,23 µM oder 0,24 µM. In einigen Ausführungsformen sind die NKX6-1 - sind positive Pankreas-Vorläuferzellen, die mit der mindestens einen SHH-Pathway-Inhibitor in einer Konzentration von 0,26 µM, 0,27 µM, 0,28 µM, 0,29 µM, 0,30 µM, 0,3 1 µM, 0,32 µM, 0,33 kontaktiert µM, 0,34 µM, 0,35 µM, 0,36 µM, 0,37 µM, 0,38 µM, 0,39 µM, 0,40 µM, 0,41 µM, 0,42 µM, 0,43 µM, 0,44 µM, 0,45 µM, 0,46 µM, 0,47 µM, 0,48 µM, 0,49 µM. In einigen Ausführungsformen sind die N X6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit der mindestens einen SHH-Pathway-Inhibitor in einer Konzentration von 0,25 µM kontaktiert.
In einigen Ausführungsformen sind die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen werden mit der Proteinkinase-Inhibitor in einer Konzentration zwischen 10 nM kontaktiert - 1 µM. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit dem Protein-Kinase-Inhibitor in einer Konzentration von 100 nM in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen sind die N X6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit dem Protein-Kinase-Inhibitor in einer Konzentration von 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM oder 90 nM in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen sind die N X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen mit dem Protein-Kinase-Inhibitor in einer Konzentration von 1 bis 10 nM, 120 nM, 130 nM, 140 nM, 150 nM, 160 nM, 170 nM, 180 nM oder kontaktiert 190 nM. In einigen Ausführungsformen die NKX6-! -positiven Pankreas-Vorläuferzellen sind, die Protein-Kinase-Inhibitor in einer Konzentration von 200 nM, 300 nM, 400 nM, 500 nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM oder 900 nM in Kontakt gebracht.
In einigen Ausführungsformen kann die N X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen sind mit Glukose bei einer Konzentration von 1 mM in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen werden die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit Glucose bei einer Konzentration von 25 mM in Kontakt gebracht.
In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen kann durch Differenzieren zumindest eines Teils des Pdxl -positive, N X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pdxl -positiven erhalten werden NKX6- 1 -positive, insulin positive endokrinen Zellen durch ein Verfahren des Kontaktierens des Pdxl -positive, NKX6- 1-positiven Pankreas-Vorläuferzellen unter Bedingungen, die das Zellclustern i) einen TGF-β-Signalweg-Inhibitor, b) einem TH-Signalwegs Aktivator und gegebenenfalls c fördern) mindestens einem SHH-Pathway-Inhibitor, ii) eine RA Signalweg Aktivator iii) einer γ-Sekretase-Inhibitor und vi) mindestens einem Wachstumsfaktor aus epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) Familie, jeden zweiten Tag über einen Zeitraum von fünf und sieben Tage, um die Differenzierung von zumindest einigen der Pdxl -positive, N X6- 1-positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pdxl -positive, NKX6- 1, Insulin-positiven endokrinen Zellen, zu induzieren, wobei das Pdxl -positive, NKX6- 1 , Insulin-positiven endokrinen Zellen exprimieren Pdxl, N X6-1, NKX2-2, MAFB, glis3, Surl, ir6.2, ZnT8, SLC2A 1, SLC2A3 und / oder Insulin.
In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen kann durch Differenzieren zumindest eines Teils des Pdxl -positiven in einer Population in Pdxl-positiven erhalten werden NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, NKX6- 1 -positive, Insulin -positiven endokrinen Zellen, zB durch Kontaktieren des Pdxl -positive, NKX6- 1-positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit i) mindestens einem SHH-Pathway-Inhibitor, ii) eine RA Signalweg Aktivator iii) einer γ-Sekretase-Inhibitor, iv) ein TGF-β) Signalweg-Inhibitors, v) einem TH-Signalwegs Aktivator und vi) mindestens einem Wachstumsfaktor aus der (EGF) Familie des epidermalen Wachstumsfaktors, um die Differenzierung von zumindest einigen der Pdxl -positive, NKX6 induzieren - 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pdxl -positive, NKX6- 1, insulin positiven endokrinen Zellen, bei dem Pdxl -positive, N X6-1, Insulin-positiven endokrinen Zellen exprimieren Pdxl, N X6- 1, NKX2-2, MAFB, glis3, Surl, Kir6.2, ZnT8, SLC2A 1, SLC2A3 und / oder Insulin.
Im Allgemeinen wird die Population von Zellen in einem geeigneten Kulturmedium für einen Zeitraum, der ausreichend gehalten, um die Differenzierung von zumindest einer der N X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in der Population in einem Insulin-positiven endokrinen induzieren Zelle. Eine beispielhafte Kulturmedium ist in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4

Agenz Konzentration

MCDB131 1 l

Glukose 3,6 g

NaHCO3 1,754 g

FAF-BSA 20 g

IST-X 5 ml

Glutamax 10 ml

Vitamin C 0.044 g

Heparin 10 mg

P/S 10 ml
In einigen Ausführungsformen kann BE5 Medien als einem geeigneten Kulturmedium zur Differenzierung NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Insulin-positive endokrine Zellen verwendet werden. In einigen Ausführungsformen wird ein geeignetes Kulturmedium in Tabelle 5 gezeigt.
In einigen Ausführungsformen, die Bedingungen, die das Zell aggregierende umfassen ein Suspensionskultur. In einigen Ausführungsformen kann die Zeitdauer einen Zeitraum, der ausreicht, um die Anzahl der Zellen zu maximieren, umfasst Coexpression C-Peptid und Nkx6- 1. In einigen Ausführungsformen ist der Zeitraum von mindestens 5 Tagen. In einigen Ausführungsformen ist die Zeitspanne zwischen 5 und 7 Tagen. In einigen Ausführungsformen ist der Zeitraum von mindestens 7 Tagen. In einigen Ausführungsformen wird die Suspensionskultur täglich nachgefüllt (zB mit β Zellreifungsfaktoren). In einigen Ausführungsformen eine Zeitdauer zwischen 5 und 7 Tagen maximiert die Anzahl der Zellen zur Co-Expression C-Peptid und Nkx6-1.
In einigen Ausführungsformen mindestens 15% der NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in der Population dazu gebracht werden, in Insulin-positiven endokrinen Zellen zu differenzieren.
In einigen Ausführungsformen mindestens 99% der NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in der Population dazu gebracht werden, in Insulin-positiven endokrinen Zellen zu differenzieren.
Die Induktion der Reifung von Insulin + endokrinen Zellen in SC-β-Zellen
Aspekte der Offenbarung beinhalten SC-β-Zellen. SC-β-Zellen der Verwendung hierin kann von jeder Quelle stammen oder in Übereinstimmung mit einem beliebigen geeigneten Protokolls erzeugt werden. In einigen Aspekten sind Insulin-positiven endokrinen Zellen induziert, um in den SC-β-Zellen zu reifen.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung ein Verfahren zur Erzeugung von reifen, Glucose ansprechende β-Zellen von Insulin-positiven endokrinen Zellen, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer Population von Zellen (zB unter Bedingungen, die Zellklumpen zu fördern), die Insulin-positiven endokrinen Zellen, die mit mindestens zwei β-Zellreifunsfaktoren, enthaltend a) einen transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β) Signalweg-Inhibitors, b) ein Schilddrüsenhormon (TH) Signalweg Aktivator, um die in vitro-Reifung von mindestens einem Insulin induzieren -positiven endokrinen Zellen in der Bevölkerung in eine SC-β-Zelle.
Aspekte der Offenbarung beinhalten Erzeugung SC-β-Zellen, die endogene reifen β-Zellen in Form und Funktion ähneln, aber dennoch unterscheiden sich von nativem β-Zellen. Der SC-β-Zellen können eine Antwort auf mindestens eine Glucoseprovokation aufweisen. In einigen Ausführungsformen die SC-β Zellen eine Antwort auf mindestens zwei aufeinanderfolgenden Glucose Herausforderungen. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zellen zeigen eine Reaktion auf zumindest drei aufeinanderfolgenden Glucose Herausforderungen. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle weist eine Antwort auf mehrere (zB sequentiell) Glucose Herausforderungen, die die Antwort des endogenen humanen Inselzellen, um mehrere Glucose Herausforderungen ähnelt. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zellen sind, die zur Freisetzung oder Absonderung von Insulin in Reaktion auf zwei aufeinanderfolgenden Glucose Herausforderungen. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zellen sind, die zur Freisetzung oder Absonderung von Insulin in Reaktion auf drei aufeinanderfolgenden Glucose Herausforderungen. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zellen sind, die zur Freisetzung oder Absonderung von Insulin in Reaktion auf die vier aufeinanderfolgenden Glucose Herausforderungen.
In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zellen sind, die zur Freisetzung oder Absonderung von Insulin in Reaktion auf fünf aufeinanderfolgenden Glucose Herausforderungen. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zellen freizusetzen oder zu sekretieren Insulin in Reaktion auf die aufeinander folgenden fortwährenden Glucose Herausforderungen. In einigen Ausführungsformen können die Zellen untersucht, um festzustellen, ob sie auf sequenzielle Glucose Herausforderungen zu reagieren durch Bestimmen, ob sie mehrfach erhöhen intrazelluläres Ca²⁺, wie in den Beispielen hierin beschrieben.
In einigen Ausführungsformen kann die Morphologie der SC-β-Zellen gleicht, die Morphologie von endogenen β-Zellen. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle weist eine Glucose stimulierte Insulinsekretion (GSIS) response in vitro. In einigen Ausführungsformen die SC-Zelle weist eine β GSIS Antwort in vivo. In einigen Ausführungsformen die SC-Zelle weist β in vitro und in vivo GSIS Antworten. In einigen Ausführungsformen ist die in vitro und / oder in vitro GSIS Reaktion ähnelt den GSIS Antworten endogener reifer β-Zellen. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle weist eine in vitro (GSIS) Antwort, die die GSIS Reaktion endogener β-Zellen ähnelt. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zelle weist eine in vivo GSIS Antwort, die die GSIS Reaktion endogener β-Zellen ähnelt. GSIS Antwort kann unmittelbar nach der Transplantation in einen Menschen oder ein Tier beobachtet werden. In einigen Ausführungsformen wird die GSIS Antwort innerhalb von zwei Wochen nach der Transplantation des SC-β-Zelle in einem menschlichen oder tierischen Subjekt beobachtet. In einigen Ausführungsformen wird die GSIS Antwort innerhalb von zwei Wochen nach der Transplantation des SC-β-Zelle in einem menschlichen oder tierischen Subjekt beobachtet.
In einigen Ausführungsformen wird die GSIS Antwort des SC-β-Zelle bis zu drei Wochen, vier Wochen, fünf Wochen 6 Wochen, 7 Wochen, 8 Wochen, 9 Wochen, 10 Wochen, 1 1 Wochen, 12 Wochen, 13 Wochen beobachtet, 14 Wochen, 15 Wochen, 16 Wochen, 17 Wochen, 18 Wochen, 6 Monate, 7 Monate, 8 Monate, 9 Monate, 10 Monate, 1 1 Monate oder bis zu 1 Jahr oder mehr nach der Transplantation des SC-β-Zelle in einen menschlichen oder tierischen Subjekt.
In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zellen zeigen zumindest eine Markierung des reifen endogenen pankreatischen β-Zellen. Beispielhafte Marker beinhalten, ohne Einschränkung, Pdxl, HNF6, Ptfl ein, Sox9, Foxa2, Nkx2.2, Ngn3 und NKX6- 1. In einigen Ausführungsformen die Expression eines Marker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus, HNF6, Ptfl einem, Sox9, FOXA2, Nkx2.2, Ngn3 und N X6- 1 wird durch eine statistisch signifikante Menge in den SC-β-Zellen relativ hochreguliert den pluripotenten Stammzellen (zB embryonalen Stammzellen oder pluripotenten Zellen), von denen die SC-β-Zellen abgeleitet werden.
Die Erfindung zieht die Verwendung jeder TGF-β-Signalweg-Inhibitor, Insulin-positiven endokrinen Zellen zu differenzieren und / oder reifen in SC-β-Zellen (beispielsweise allein oder mit einer beliebigen Kombination von mindestens einem Schilddrüsenhormon (induziert TH) Signalweg Aktivator oder gegebenenfalls ein Proteinkinase-Inhibitor). In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalwegs umfasst TGF-β-Rezeptor Typ I-Kinase-Signalweg. In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors umfasst ALK5 Inhibitor II.
Die Erfindung zieht die Verwendung jeder Thyroidhormon Signalweg Aktivator, Insulin-positiven endokrinen Zellen zu differenzieren und / oder reifen in SC-β-Zellen (induziert beispielsweise allein oder mit einer beliebigen Kombination von mindestens einem TGF-β-Signalisierung Pathway-Inhibitor, oder gegebenenfalls ein Protein-Kinase-Inhibitor). In einigen Ausführungsformen das Schilddrüsenhormon-Signalweg Aktivator T3.
In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, NKX6- 1 -positiven werden Insulin-positiven Zellen gegebenenfalls mit einem Proteinkinaseinhibitor in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen werden nicht mit dem Proteinkinaseinhibitor in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen werden mit dem Proteinkinaseinhibitor in Kontakt gebracht. Die Offenbarung betrifft die Verwendung eines beliebigen Proteins Kinase-Hemmer, Insulin-positiven endokrinen Zellen zu differenzieren und / oder reifen in SC-β-Zellen (induziert beispielsweise allein oder mit einer beliebigen Kombination von mindestens einem TGF-β-Signalweg-Inhibitor und / oder Schilddrüsenhormon-Signalweg Aktivator). In einigen Ausführungsformen umfasst das Protein-Kinase-Inhibitor Staurosporin.
In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Inkontaktbringen der Population von Zellen (zB Insulin-positiven endokrinen Zellen) mit zumindest einer zusätzlichen β-Zellreifungsfaktor.
In manchen Ausführungsformen umfasst die zumindest eine zusätzliche β-Zellreifungsfaktor a Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR)-Inhibitor. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Kontaktieren der Pdxl - positive, NKX6- 1 - positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen mit einem CFTR-Inhibitor. Die Offenbarung sieht die Verwendung jeglicher CFTR-Inhibitor, Insulin-positiven endokrinen Zellen zu differenzieren und / oder reifen in SC-β-Zellen (beispielsweise allein oder mit einer beliebigen Kombination von mindestens einem TGF-β-Signalweg-Inhibitors und / oder induziert ein Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator und gegebenenfalls die Proteinkinase-Inhibitor). In einigen Ausführungsformen umfasst das CFTR-Inhibitor Gly-H 101.
In manchen Ausführungsformen umfasst die zumindest eine zusätzliche β-Zellreifungsfaktor einen O-GlcNAcase Inhibitor. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Kontaktieren der Pdxl -positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen mit einem O- GlcNAcase Inhibitor. Die Offenbarung sieht die Verwendung jeglicher O-GlcNAcase Inhibitor, Insulin-positiven endokrinen Zellen zu differenzieren und / oder reifen in SC-β-Zellen (beispielsweise allein oder mit einer beliebigen Kombination von mindestens einem TGF-β-Signalweg-Inhibitors und induziert / oder Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator und gegebenenfalls ein Proteinkinase-Inhibitor). In einigen Ausführungsformen der Inhibitor von O-GlcNAcase umfasst Thiamet G.
Der Fachmann wird erkennen, dass die Konzentrationen der Mittel (zB Wachstumsfaktoren) verwendet werden, können variieren. 100 µM - in einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen mit dem mindestens einen TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von zwischen 100 nm in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen mit dem mindestens einen TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 10 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen, die mit dem mindestens einen TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 200 nM, 300 nM, 400 nM, 500 nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM oder 900 kontaktiert nM. In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen, die mit dem mindestens einen TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 2 µM, 3 µM, 4 µM 5 µM, 6 µM, 7 µM, 8 µM oder 9 kontaktiert µM. In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen, die mit dem mindestens einen TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 9,1 µM, 9,2 µM, 9,3 µM, 9,4 µM, 9,5 µM, 9,6 µM, 9,7 µM 9,8 µM kontaktiert oder 9,9 µM. In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen mit dem mindestens einen TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 1 1 µM, 12 µM, 13 µM, 14 µM kontaktiert. 1 5 µM, 16 µM, 17 µM, 1 8 µM oder 19 µM. In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen, die mit dem mindestens einen TGF-β-Signalweg-Inhibitors in einer Konzentration von 10,1 µM kontaktiert, 10,2 µM, 10,3 µM, 10,4 µM, 10,5 µM, 10,6 µ 10,7 µM, 10,8 µM oder 10,9 µM.
In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen mit dem Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von zwischen 0,1 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen mit dem Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 1 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen mit dem Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 0,2 µM, 0,3 µM, 0,4 µM 0,5 µM, 0,6 µM 0,7 µM, 0,8 µM oder 0,9 µM kontaktiert. In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven Zellen mit dem endokrinen γ Thyroidhormon-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 1 .1 µM kontaktiert, 1,2 µM, 1 .3 µM, 1 .4 µM 1,5 µM, 1 .6 µM, 1 0,7 µM, 1 0,8 µM oder 1,9 µM. In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen mit dem Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator in einer Konzentration von 2 µM, 3 µM, 4 µM 5 µM, 6 µM, 7 µM, 8 µM oder 9 µM kontaktiert.
In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen mit dem Protein-Kinase-Inhibitor in einer Konzentration von 1 bis 0 nm kontaktiert. In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen mit dem Protein-Kinase-Inhibitor in einer Konzentration von 100 nM in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen mit dem Protein-Kinase-Inhibitor in einer Konzentration von 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM oder 90 nM in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen mit dem Protein-Kinase-Inhibitor in einer Konzentration von 1 bis 10 nM, 120 nM, 130 nM, 140 nM, 150 nM, 160 nM, 170 nM, 1 80 nM oder 190 nM in Kontakt gebracht, In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen mit dem Protein-Kinase-Inhibitor in einer Konzentration von 200 nM, 300 nM, 400 nM, 500 nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM oder 900 nM in Kontakt gebracht.
In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, N X6- 1 -positive, Insulin positive endokrinen Zellen werden mit dem CFTR-Inhibitor in einer Konzentration von zwischen 100 nm kontaktiert - 100 µM, In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, 10 µM - N X6-1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen werden mit dem CFTR-Inhibitor in einer Konzentration von zwischen 10 nm kontaktiert.
In einigen Ausführungsformen die Pdxl -positive, NKX6- 1 -positiven werden Insulin positive endokrinen Zellen mit dem O-GlcNAcase Inhibitor in einer Konzentration von 100 nM in Kontakt gebracht. In einigen Ausführungsformen sind die Pdxl -positive, NKX6-1 - 10 µM - positiv sind, Insulin-positiven endokrinen Zellen mit dem O-GlcNAcase Inhibitor in einer Konzentration von 10 nM in Kontakt gebracht.
In einigen Ausführungsformen wird ein SC-β-Zelle kann durch Differenzieren zumindest eines Teils des Pdxl -positiven erhalten werden NKX6-1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen in SC-β-Zellen durch ein Verfahren des Kontaktierens des Pdxl-positive, NKX6- 1 -positiven, Insulin-positiven endokrinen Zellen unter Bedingungen, die Zellclusterbildung fördern mit i) ein transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β) Signalweg-Inhibitors, ii) eine Schilddrüsenhormon-Signalweg Aktivator und gegebenenfalls iii) ein Proteinkinaseinhibitor, jeden zweiten Tag über einen Zeitraum von sieben bis 14 Tagen, um die in vitro-Reifung von zumindest einigen der Pdxl -positive, NKX6-1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen in SC-β-Zellen zu induzieren, wobei Der SC-β Zellen eine GSIS Antwort sowohl in vitro und / oder in vivo. In einigen Ausführungsformen die GSIS Reaktion ähnelt der GSIS Antwort eines endogenen β-Zelle.
In einigen Ausführungsformen wird ein SC-β-Zelle kann durch Differenzierung erhalten werden, zumindest einige Pdxl -positive, NKX6-1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen in einer Population in SC-β-Zellen, beispielsweise durch Kontaktieren des Pdxl -positiven, NKX6- 1 -positiven, Insulin-positiven endokrinen Zellen mit i) ein transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β) Signalweg-Inhibitors, ii) eine Schilddrüsenhormon-Signalweg Aktivator und gegebenenfalls iii) ein Protein-Kinase-Inhibitor, um induzieren die in vitro-Reifung von zumindest einigen der Pdxl - positive, NKX6- 1 -positive, Insulin produzierende endokrinen Zellen in SC-β-Zellen, wobei die SC-β Zellen eine GSIS Antwort sowohl in vitro und / oder in vivo dass ähneln die GSIS Reaktion eines endogenen β-Zelle.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Erzeugen SC-β-Zellen, wobei das Verfahren umfasst: in Kontakt Pdxl -positive, NKX6- 1 -positiven, Insulin-positiven endokrinen Zellen unter Bedingungen, die Zellclusterbildung fördern mit i) eine Transformations Wachstumsfaktor-β (TGF-β) Signalweg-Inhibitors, ii) ein Schilddrüsenhormon-Signalweg Aktivator und gegebenenfalls iii) ein Protein-Kinase-Inhibitor, um die in vitro-Reifung von zumindest einigen der Pdxl -positive, NKX6- 1 induzieren - positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen in SC-β-Zellen, wobei die SC-β Zellen eine GSIS Antwort sowohl in vitro und / oder in vivo. In einigen Ausführungsformen die GSIS Reaktion ähnelt der GSIS Antwort eines endogenen β-Zelle.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Erzeugen von SC-β-Zellen von pluripotenten Zellen, wobei das Verfahren umfasst: a) Differen pluripotenten Stammzellen in einer Population in Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen; b) Differenzieren zumindest einige der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pdxl-positive, NKX6- 1 - positive Pankreas-Vorläuferzellen durch ein Verfahren des Kontaktierens der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen unter Bedingungen, die Zellklumpen mit i) zumindest zu fördern einen Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie, ii) mindestens einem SHH-Pathway-Inhibitor und gegebenenfalls iii) eine RA Signalweg Aktivator, jeden zweiten Tag über einen Zeitraum von fünf Tagen, um die Differenzierung von zumindest einigen der Pdxl -positiven Pankreas veran Vorläuferzellen in der Population in NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, wobei die NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen exprimiert Pdxl und NKX6-1; c) Differenzieren zumindest eines Teils des Pdx l -positive, NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pdxl -positive, NKX6-1-positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen durch ein Verfahren des Kontaktierens des Pd l -positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen unter Bedingungen, die das Zell aggregierende mit i) einem TGF-β-Signalweg-Inhibitor, b) einem TH-Signalwegs Aktivator und gegebenenfalls c) mindestens einem SHH-Pathway-Inhibitor, ii) eine RA-Signalweg-Aktivator, iii) einen Y-Sekretase-Inhibitor, und vi) mindestens einem Wachstumsfaktor aus der (EGF) Familie des epidermalen Wachstumsfaktors, jeden zweiten Tag über einen Zeitraum von fünf bis sieben Tage, um die Differenzierung von zumindest einigen der Pdxl induzieren - positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pdxl -positive, NKX6- 1, Insulin-positiven endokrinen Zellen, wobei die Pdxl -positive, NKX6- 1, Insulin-positiven endokrinen Zellen exprimieren Pdxl, N X6- 1, NKX2- 2, afb, glis3, Surl, Kir6.2, ZnT8, SLC2A 1, SLC2A3 und / oder Insulin; und d) Differenzieren zumindest eines Teils des Pdxl - positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen in SC-β-Zellen durch ein Verfahren des Kontaktierens des Pdx l -positive, N X6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrine Zellen unter Bedingungen, die das Zellclustern i fördern) ein transformierender Wachstumsfaktor β (TGF-β) Signalweg-Inhibitors, ii) ein Schilddrüsenhormon-Signalweg Aktivator und gegebenenfalls iii) ein Protein-Kinase-Inhibitor, jeden zweiten Tag über einen Zeitraum von sieben bis 14 Tagen, um die in vitro-Reifung von zumindest einigen der Pdxl -positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen in SC-β-Zellen zu induzieren, wobei die SC-β Zellen eine GSIS Antwort in vitro und / oder in vivo.
In einigen Ausführungsformen der GSIS Reaktion ähnelt der GSIS Reaktion eines endogenen reifen β-Zellen.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Erzeugen von SC-β-Zellen von pluripotenten Zellen, wobei das Verfahren umfasst: a) Differenzieren zumindest einige pluripotenten Zellen in einer Population in Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen; b) Differenzieren zumindest einige der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pdxl-positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen durch ein Verfahren des Kontaktierens der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen unter Bedingungen, die das Zell aggregierende mit i) KGF, ii) Santl und gegebenenfalls iii) geringe Konzentrationen von RA, jeden zweiten Tag über einen Zeitraum von fünf Tagen, um die Differenzierung von zumindest einem Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in der Population in NKX6-1-positiven Pankreas-Vorläuferzellen, wobei veran die NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen exprimiert Pdxl und NKX6-1; c) Differenzieren zumindest einige der Pdxl positive, N X6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pdxl -positive, NKX6-1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen durch ein Verfahren des Kontaktierens des Pdxl positive, NKX6-1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit i) ALK5 Inhibitor II, II) T3, und gegebenenfalls iii) Santl, iv) RA, v) XXI und vi) Betacellulin, jeden zweiten Tag über einen Zeitraum von fünf bis sieben Tage, um die veran Differenzierung von zumindest einigen der Pdxl -positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in Pdxl - positive, NKX6- 1, Insulin-positiven endokrinen Zellen, wobei die Pdxl -positive, NKX6- 1, Insulin-positiven endokrinen Zellen exprimieren Pdxl, N X6-1, NKX2-2, MAFB, glis3, Surl, Kir6.2, ZnT8, SLC2A 1, SLC2A3 und / oder Insulin; und d) Differenzieren zumindest einige der Pdxl-positive, NKX6-1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen in SC-β-Zellen durch ein Verfahren des Kontaktierens des Pdxl -positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen unter Bedingungen, die Zellklumpen mit i) ALK5 Inhibitor II, II) T3, und gegebenenfalls iii) Staurosporin fördern, jeden zweiten Tag über einen Zeitraum von sieben bis 14 Tagen mit der in vitro-Reifung von zumindest einigen der Pdxl -positiven zu induzieren , NKX6- 1 -positive, insulinproduzierenden endokrinen Zellen in SC-β-Zellen, wobei die SC-β Zellen eine GSIS Antwort in vitro und in vivo, das die GSIS Antwort eines endogenen β Zelle ähneln.
Im allgemeinen wird die Pdxl -positive, NKX6-1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen werden in einem geeigneten Kulturmedium für einen Zeitraum, der ausreicht, um die in vitro-Reifung von zumindest einigen der Pdxl -positiven induzieren gehalten, NKX6-1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen in SC-β-Zellen. Beispiele für geeignete Kulturmedien sind oben in Tabelle 4 unten in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5

CMR Inselmedium

(„CMRLS“)

CMRL 1066 supplementiert

cat#99-603-CV

Mediatech

Wir ergänzen das mit 10% Hyclone

FBS
In einigen Ausführungsformen umfasst das geeignete Kulturmedium Connought Medical Research Laboratories 1066 ergänzt islet Medien (CMRLS). In einigen Ausführungsformen umfasst das geeignete Kulturmedium eine Komponente CMRLS (zB zusätzliche Zink). In einigen Ausführungsformen wird das geeignete Kulturmedium in Tabelle 3 gezeigt. In einigen Ausführungsformen wird die CMRLS mit Serum (zB human) ergänzt. In einigen Ausführungsformen wird die CMRLS mit Serumersatz (zB KOSR) ergänzt. In einigen Ausführungsformen wird die CMRLS mit fötalem Rinderserum ergänzt. In einigen Ausführungsformen wird die CMRLS mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt. In einigen Ausführungsformen kann ein geeignetes Kulturmedium zur Differenzierung von Insulin-positiven endokrinen Zellen in SC-β-Zellen umfasst S3 Medien. In einigen Ausführungsformen, die Bedingungen, die das Zell aggregierende umfassen ein Suspensionskultur. In einigen Ausführungsformen kann die Zeitdauer mindestens 7 Tagen. In einigen Ausführungsformen umfasst die Zeitdauer von 7 Tagen bis 21 Tagen. In einigen Ausführungsformen kann die Zeitdauer umfasst, zwischen 7 und 14 Tagen.
In einigen Ausführungsformen kann die Zeitdauer zwischen 10 und 14 Tagen. In einigen Ausführungsformen kann die Zeitdauer umfasst 14 Tage. In einigen Ausführungsformen wird die Suspensionskultur ergänzt jeden zweiten Tag (beispielsweise mit den β-Zellreifungsfaktoren).
In manchen Ausführungsformen ist mindestens 1%, mindestens 2%, mindestens 3%, mindestens 4%, mindestens 5%, mindestens 6%, mindestens 7%, mindestens 8%, mindestens 9 %, mindestens 10%, mindestens 20%, mindestens 30%, mindestens 40%, mindestens 50% des Pdxl -positive, NKX6-1 -positive, Insulin positive endokrinen Zellen werden induziert, um in SC- reifen β-Zellen. In einigen Ausführungsformen zumindest zu mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 99% des Pdxl - positive, NKX6-1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen induzierte reifen in SC-β-Zellen. In einigen Ausführungsformen mindestens 30% der Zellen erzeugten umfassen SC-β-Zellen. In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zellen exprimieren C-Peptid, Insulin, NKX6- 1 Pdxl und koexprimieren NKX6- 1 und C-Peptid.
In einigen Ausführungsformen die SC-β-Zellen umfassen menschliche Zellen. In einigen Ausführungsformen ist die Erzeugung der SC-β-Zellen in vitro skalierbar.
Isolierte Zellpopulationen
Aspekte der Offenbarung beziehen sich auf isolierte Populationen von Zellen gemäß einem hierin beschriebenen Verfahren hergestellt. In einigen Ausführungsformen sind eine Population von SC-β-Zellen durch Kontaktieren von mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläufer davon mit wenigstens einer hier beschriebenen β-Zellreifunsfaktoren produziert. Bei einigen Ausführungsformen, eine Bevölkerung von SC-β-Zellen durch Kontaktieren von mindestens einem Insulin-positive endokrinen Zelle oder Vorläufer davon mit mindestens zwei hierin beschriebenen β-Zellreifunsfaktoren produziert. In einigen Ausführungsformen sind eine Population von SC-β-Zellen durch Kontaktieren von mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläufer davon mit mindestens drei hierin beschriebenen β-Zellreifunsfaktoren produziert. In einigen Ausführungsformen sind eine Population von SC-β-Zellen durch Inkontaktbringen mindestens eines produziertes Insulin-positiven endokrinen cel l oder einer Vorstufe davon mit mindestens vier hier beschriebenen β-Zellreifunsfaktoren. In einigen Ausführungsformen sind eine Population von SC-β-Zellen durch Kontaktieren von mindestens einem Insulin-positive endokrinen Zelle oder Vorläufer davon mit mindestens fünf hierin beschriebenen β-Zellreifunsfaktoren produziert. In einigen Ausführungsformen sind eine Population von SC-β-Zellen durch In-Kontakt erzeugt mindestens einen Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläufer davon mit mindestens sechs, mindestens sieben, mindestens acht, mindestens neun, wenigstens zehn β-Zellreifung hierin beschriebenen Faktoren.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung eine isolierte Population von endgültigen Entodermzellen. Eine isolierte Population von endgültigen Entodermzellen kann durch Differenzieren zumindest einige pluripotenten Zellen in einer Population in endgültige Entodermzellen, zB erhalten werden mit einem Verfahren zum Kontaktieren einer Population von pluripotenten Zellen mit i) mindestens einem Wachstumsfaktor aus der TGF-β Superfamilie ist, und ii) einem Wnt-Signalweg-Aktivator, um die Differenzierung von zumindest einigen der pluripotenten Zellen in der Population in endgültige Entodermzellen, wobei die endgültige Entodermzellen exprimieren zumindest eine Markierung charakteristisch endgültige Endoderm induzieren.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung eine isolierte Population von Urdarm Schlauchzellen. Eine isolierte Population von Urdarm Schlauchzellen kann durch Differenzieren zumindest einige definitive Entoderm Zellen in einer Population in Urdarm Schlauchzellen, beispielsweise durch ein Verfahren des Kontaktierens der definitiven Endoderms Zellen mit mindestens einem Wachstumsfaktor aus der Fibroblasten-Wachstumsfaktor erhalten werden, (FGF) -Familie, die Differenzierung von zumindest einigen der endgültigen Entodermzellen in Urdarm Schlauchzellen induzieren, wobei die Urdarm Schlauchzellen exprimieren zumindest eine Markierung charakteristisch definitive Entoderm.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung eine isolierte Population von Pdxl - positive Pankreas-Vorläuferzellen. Eine isolierte Population von Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen kann durch Differenzieren zumindest einige Urdarm Schlauchzellen in einer Population in Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, beispielsweise erhalten werden durch ein Verfahren des Kontaktierens der Urdarm Schlauchzellen mit i) mindestens ein Knochenmorphogeneseprotein (BMP) Signalweg-Inhibitors, ii) mindestens einem Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie, iii) mindestens einem SHH-Pathway-Inhibitor, iv) mindestens ein-Retinsäure (RA) Signalweg Aktivator; und v) mindestens einem Proteinkinase-C-Aktivator, um die Differenzierung von zumindest einigen der Urdarm Schlauchzellen in Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, wobei die Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen exprimieren Pdxl induzieren.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung eine isolierte Population von NKX6- 1-positiven Pankreas-Vorläuferzellen. Eine isolierte Population von NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen kann durch Differenzieren zumindest einige Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in einer Population in Pdx l -positiven erhalten werden NKX6- 1 - positiven Pankreas-Vorläuferzellen, beispielsweise durch ein Verfahren der Kontaktieren der Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit i) mindestens einem Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie, ii) mindestens einem SHH-Pathway-Inhibitor und gegebenenfalls iii) eine RA-Signalweg-Aktivator, um die Differenzierung von zumindest einem Pdxl induzieren-positive Pankreas-Vorläuferzellen in der Bevölkerung in NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, wobei die N X6- 1 - positive Pankreas-Vorläuferzellen exprimiert Pdx l und NKX6- 1.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung eine isolierte Population von Insulin-positiven endokrinen Zellen. Eine isolierte Population von Insulin-positiven endokrinen Zellen kann durch Differenzieren zumindest einige Pdxl -positive, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in einer Population in Pdxl -positive, NKX6-1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen, beispielsweise erhalten werden, durch ein Verfahren des Kontaktierens der Pdxl -positive, N X6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, die mit i) einer TGF-β) Signalweg-Inhibitors, ii) einem TH-Signalwegs Aktivator und gegebenenfalls mindestens eine zusätzliche β-Zellreifung Faktor, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i) mindestens einem SHH-Pathway-Inhibitor, ii) eine RA Signalweg Aktivator iii) einen Y-Sekretase-Inhibitor, iv) und vi) mindestens einem Wachstumsfaktor aus epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) Familie, um die Differenzierung von zumindest einigen der Pdxl-positiven in Pdxl zu induzieren, NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen - positive, NKX6- 1, Insulin-positiven endokrinen Zellen, wobei die Pdxl -positive, NKX6-1, Insulin-positiven endokrinen Zellen exprimieren Pdxl, NKX6-1, NKX2-2, MAFB, glis3, Surl, Kir6.2, ZnT8, SLC2A 1, SLC2A3 und / oder Insulin.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung eine isolierte Population von SC-β-Zellen. Eine isolierte Population von SC-β-Zellen durch Differenzierung mindestens etwas Pdxl-positive, NKX6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen in einer Population in SC-β-Zellen, beispielsweise durch ein Verfahren des Kontaktierens des Pdxl erhalten werden - positiv, NKX6-1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen mit i) einem transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β) Signalweg-Inhibitors, ii) ein Schilddrüsenhormon-Signalweg Aktivator und gegebenenfalls iii) ein Protein-Kinase-Inhibitor, zu induzieren die in vitro-Reifung von zumindest einigen der Pdxl - positive, NKX6-1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen in SC-β-Zellen, wobei die SC-β Zellen eine GSIS Antwort in vitro und / oder in vivo. In einigen Ausführungsformen die GSIS Reaktion ähnelt der GSIS Antwort eines endogenen β-Zelle.
Aspekte der Offenbarung beinhalten Mikrokapseln, die isolierte Populationen hierin (beispielsweise SC-β-Zellen) beschriebenen Zellen. Mikrokapseln sind in der Technik bekannt. Geeignete Beispiele für Mikrokapseln werden in der Literatur beschrieben (zB Jahansouz et al, „Evolution of / 3-Zellersatztherapie bei Diabetes mellitus: die Inselzelltransplantation". Journal of Transplantation 201 1, Volume 201 1, Artikel-ID 247959; Orive et al., „Anwendung der Verkapselung von Zellen zur kontrollierten Abgabe von biologischen Therapeutika", Advanced Drug Delivery Reviews (2013),
http: //dx.doi. Org / 10.1016 /j .addr.2013.07.009; . Hernandez et al, „Mikrokapseln und Mikroträger für die In-situ-Zelle Lieferung", Advanced Drug Delivery Reviews 2010; 62: 71 1-730; Murua et al, „Zell Mikroverkapselung: Auf dem Weg zu klinischen Anwendung"., Journal of Controlled Release 2008; 132: 76-83; und Zanin et al, „Die Entwicklung von eingekapselten Zelltechnologien wie Therapien für neurologische und sensorische Erkrankungen", Journal of Controlled Release 2012. 160: 3-13). Mikrokapseln können in einer Vielzahl von Weisen formuliert werden. Ausführungsmikrokapseln umfassen ein Alginat Kerns durch eine Polykation-Schicht von einer äußeren Membran bedeckt Alginat umgeben. Das Polykation Membran eine semipermeable Membran, die die Stabilität und Biokompatibilität verleiht.
Beispiele von Polykationen umfassen, ohne Einschränkung, Poly-L-Lysin, Poly-L-Ornithin, Chitosan, Lactose modifizierten Chitosan und photopolymerisiert Biomaterialien. In einigen Ausführungsformen wird die Core-Alginat modifiziert, beispielsweise, um ein Gerüst, umfassend ein Alginat Kern kovalent konjugierten Oligopeptide mit einer RGD-Sequenz (Arginin, Glycin, Asparaginsäure) zu erzeugen. In einigen Ausführungsformen wird die Core-Alginat modifiziert, beispielsweise, um ein kovalent verstärkte Mikrokapsel mit einem chemoenzymatisch konstruiert Alginat erhöhter Stabilität herzustellen. In einigen Ausführungsformen wird die Core-Alginat modifiziert, beispielsweise, an membranmimetischen Folien durch in situ Polymerisation von Acrylat-funktionalisiertes Phospholipiden zusammengesetzt zu erzeugen. In einigen Ausführungsformen! Mikrokapseln aus enzymatisch modifizierte Alginate mit Epimerasen besteht. Bei einigen Ausführungsformen Mikrokapseln kovalente Verbindungen zwischen benachbarten Schichten der Mikrokapsel-Membran. In einigen Ausführungsform enthält die Mikrokapsel eine Subsieve großen Kapsel, Alginat in Verbindung mit Phenoleinheiten.
In einigen Ausführungsformen enthält die Mikrokapsel ein Gerüst, umfassend Alginat-Agarose. In einigen Ausführungsformen wird die SC-β-Zelle mit PEG, bevor sie innerhalb Alginat verkapselt modifiziert. In einigen Ausführungsformen werden die isolierten Populationen von Zellen, beispielsweise SC-β-Zellen werden in photo Liposomen und Alginat verkapselt. Sollte es zu schätzen wissen, dass die in den Mikrokapseln verwendeten Alginat kann durch andere geeignete Biomaterialien, einschließlich ersetzt werden, ohne Einschränkung, PEG, Chitosan, PES Hohlfasern, Kollagen, Hyaluronsäure, Dextran mit RGD, EHD und PEGDA, PMBV und PVA, PGSAS Agarose, Agarose mit Gelatine, PLGA und mehrschichtigen Ausführungsformen davon.
In einigen Ausführungsformen können Zusammensetzungen, die Populationen von Zellen gemäß den hierin beschriebenen Verfahren auch als funktionelle Komponente in einer mechanischen Vorrichtung ausgebildet, um eine oder mehrere der Polypeptide endokrine Pankreasinselzellen produziert werden. In ihrer einfachsten Form enthält die Vorrichtung eine Population von Pankreas-beta-Zellen (zB von Populationen von Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufern davon hergestellt) hinter einer halbdurchlässigen Membran, die Durchgang verhindert, der Zellpopulation unter Beibehaltung sie in der Vorrichtung, sondern erlaubt Durchgang von Insulin, Glukagon oder Somatostatin durch die Zellpopulation sezerniert. Dies schließt Populationen von Pankreas-beta-Zellen, die mikroverkapselt sind, typischerweise in der Form von Zellclustern, die Zell-Wechselwirkung, der Entdifferenzierung hemmt ermöglichen. Zum Beispiel US-Pat. No. 4391, 909 beschreiben Inselzellen in einem Sphäroid semipermeable Membran aus Polysaccharidpolymere> 3.000 mol verkapselt. Gew. die quervernetzt sind, so dass sie durchlässig für Proteine der Größe von Insulin, jedoch undurchlässig für Moleküle über 100.000 mol. Gew.
Das US-Patent. No. 6.023.009 beschreibt Inselzellen in einer semipermeablen Membran aus Agarose und Agaropectin verkapselt. Mikrokapseln dieser Art sind für die Verabreichung in die Körperhöhle eines diabetischen Patienten angepasst und sind gedacht, um einige Vorteile bei der Verringerung histocompatibility Probleme oder Anfälligkeit für Bakterien haben.
Kompliziertere Vorrichtungen sind auch für die Verwendung, um eine Population von Pankreas-beta-Zellen von Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufer davon nach den hier beschriebenen Verfahren hergestellt enthalten in Betracht, sei es für eine Implantation in Patienten mit Diabetes oder zur extrakorporalen Therapie. Das US-Patent. No. 4.378.016 beschreibt einen künstlichen endokrinen Drüsen eine extrakorporale Segment eine subkutane Segment und eine austauschbare Umschlag mit den Hormon-produzierenden Zellen mit. Das US-Patent Nr. 5,674,289 beschreibt einen bioartifiziellen Pankreas, die eine Inselkammer, die durch eine semipermeable Membran, um eine oder mehrere Vascularizing Kammern offen umgebenden Gewebe getrennt. Nützliche Vorrichtungen haben typischerweise eine Kammer ausgebildet ist, die Inselzellen enthält, und eine Kammer von den Inselzellen durch eine semipermeable Membran, die die sezernierten Proteine von den Inselzellen sammelt getrennt und die auch eine Rückseite, die Inselzellen Signalisierung kann beispielsweise des zirkulierenden Blutzuckerspiegel.
Aspekte der Offenbarung beinhalten Assays, die isolierte Populationen hierin (beispielsweise SC-β-Zellen) beschriebenen Zellen. In einigen Ausführungsformen können die Assays zur Identifizierung von einem oder mehreren Kandidaten-Mittel, die zu fördern oder zu hemmen, eine β Zellschicksal, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus β-Zellproliferation, β Zellreplikation und β Zelltod, β-Zellfunktion, β Zelle Suszeptibilität verwendet werden In den Immunangriff oder β-Zelle Anfälligkeit Entdifferenzierung oder Differenzierung. In einigen Ausführungsformen können die Assays zur Identifizierung von einem oder mehreren Kandidaten-Mittel, die die Differenzierung von mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder eines Vorläufers davon in die SC-β-Zellen zu fördern verwendet werden. In einigen Ausführungsformen können die Assays zur Identifizierung von einem oder mehreren Kandidaten-Mittel, die β-Zellen Insulin produzieren oder erhöhen Produktion oder Sekretion von Insulin stimuliert werden.
Die Erfindung zieht Verfahren, in dem SC-β-Zellen werden gemß den hier von iPS-Zellen aus Zellen extrahiert oder von Personen, die unter einer Krankheit (zB Diabetes, Fettleibigkeit oder einer β zell- zusammenhängenden Störung getrennt abgeleitet beschriebenen Verfahren erzeugten), und jene SC-β-Zellen auf normale β-Zellen von gesunden Individuen verglichen, die nicht die Krankheit auf Unterschiede zwischen den SC-β-Zellen und normalen β-Zellen, die als Marker für Krankheiten (beispielsweise epigenetische und / oder genetische werden könnten). In einigen Ausführungsformen sind β-Zellen von diabetischen Individuum erhalten und im Vergleich zur normalen β-Zellen, und dann werden die β-Zellen zu iPS umprogrammiert und die IPS-Zellen sind für die genetische und / oder epigenetische Marker, die in der β-Zellen erhalten vorliegen analysiert vom Diabetiker jedoch nicht in den normalen β-Zellen vorhanden, um Markierungen (zB prädiabetischen) identifizieren. In einigen Ausführungsformen werden die iPS Zellen und / oder SC-β von diabetischen Patienten abgeleitet zum Screening auf Mittel verwendet (beispielsweise Mittel, die in der Lage, Gene Beitrag zu einem diabetischen Phänotyp zu modulieren).
Verfahren zur Differenzierung von Insulin-positiven endokrinen Zellen zu SC-β-Zellen
Generieren SC-β cel ls durch Umsetzung von mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon mit den Verfahren der Offenbarung weist eine Reihe von Vorteilen. Zunächst werden die Verfahren der Offenbarung erlauben es, autologe SC-ß-Zellen, die spezifisch für und genetisch mit einem individuellen angepaßten Zellen generieren. Im allgemeinen sind autologe Zellen weniger wahrscheinlich als bei nichtautologen Zellen unterliegen immunologische Abstoßung zu sein. Die Zellen aus mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einem Vorläufer davon, zum Beispiel ein Pankreas-Vorläufer durch Neuprogrammierung einer somatischen Zelle (zB eine Fibroblasten) von dem Individuum zu einem pluripotenten Zustand und dann Züchten der pluripotenten Zellen abgeleitet worden sind zumindest einige der pluripotenten Zellen mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einem Vorläufer davon, gefolgt von der Transplantation von dem mindestens einen Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläufer davon in die einzelnen, so dass der mindestens eine Insulin unterscheiden positive endokrinen Zelle oder Vorläufer davon reift in vivo in eine SC-β-Zelle oder induzierten Reifung in vitro der mindestens eine Insulin-positiven endokrinen Zelle in eine SC- Zelle.
In einigen Ausführungsformen kann ein Gegenstand, von dem mindestens ein Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläufer davon erhalten werden ist ein Säuger, wie einem Menschen. In einigen Ausführungsformen wird der Gegenstand aus einer β Zellenstörung leidet. In einigen Ausführungsformen wird das Subjekt an Diabetes leiden. In einigen Ausführungsformen wird der Gegenstand von Prädiabetes leidet. In solchen Ausführungsformen der mindestens eine Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläufer davon können in einer SC-β-Zelle ex vivo mit den Verfahren wie hier beschrieben, unterschieden werden und dann auf den Gegenstand, von dem die Zellen wurden in einem Verfahren gewonnen, um zu behandeln, verabreicht Gegenstand für die β Zellen Erkrankung (zB Diabetes).
In manchen Ausführungsformen ist mindestens ein Insulin-positiven endokrinen Zelle oder ein Vorläufer davon ist in einem Gegenstand (in vivo) und wird konvertiert, um einen SC-β-Zelle werden durch die Verfahren, wie sie hier in vivo offenbart. In einigen Ausführungsformen kann die Umwandlung von mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon auf eine SC-β-Zelle in vivo durch Verabreichung an ein Individuum einer Zusammensetzung, umfassend mindestens eine, mindestens zwei, mindestens drei, erreicht, zumin mindestens vier, mindestens fünf, wenigstens sechs oder mehr β-Zellreifunsfaktoren wie hierin beschrieben. In einigen Ausführungsformen kann die Umwandlung von mindestens einem Insulin-positive endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon auf eine SC-β-Zelle in vivo durch Verabreichung an ein Individuum einer Zusammensetzung, umfassend mindestens eine, mindestens zwei, mindestens drei, erreicht, zumin mindestens vier, mindestens fünf, mindestens sechs oder β-Zellreifunsfaktoren wie hierin beschrieben.
In einigen Ausführungsformen kann das Inkontaktbringen durch Beibehalten der mindestens einen Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon in einem Kulturmedium, umfassend das eine oder mehrere β-Zellreifunsfaktoren durchgeführt werden. In einigen Ausführungsformen kann mindestens eine Insulin-positive endokrine Zelle oder ein Vorläufer davon gentechnisch verändert sein.
In einigen Ausführungsformen ist mindestens ein Insulin-positiven endokrinen Zelle oder ein Vorläufer davon kann gentechnisch verändert, um ein oder mehrere β Zellmarker exprimieren, wie hierin offenbart, beispielsweise zum Ausdruck mindestens ein Polypeptid ausgewählt aus Pankreas- und Duodenal-Homeobox-1 (PDX- 1) Polypeptid, Insulin, C-Peptid, Amylin, E-Cadherin, Hηí3β, PCI / 3, B2, Nkx2.2, N X6- 1, GLUT2, PC2, ZnT-8, oder eine Aminosäuresequenzen im Wesentlichen homolog hiervon, oder funktionelle Fragmente oder funktionelle Varianten davon.
Wenn der mindestens eine Insulin-positiven endokrinen Zelle oder ein Vorläufer davon ist, unter in vitro Bedingungen gehalten herkömmlichen Gewebekulturbedingungen und Verfahren können verwendet werden und sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Isolierung und Kulturverfahren für verschiedene Zellen sind gut innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns auf dem Gebiet.
In den Verfahren der Offenbarung mindestens eine Insulin-positiven endokrinen Zelle oder ein Vorläufer davon kann im allgemeinen unter Standardbedingungen von Temperatur, pH und anderen Umgebungsbedingungen, beispielsweise als adhärente Zellen in Gewebekulturplatten gezüchtet werden, bei 37 ° C in einer Atmosphäre, die 5 bis 10% C02. Den Zellen und / oder dem Kulturmedium in geeigneter Weise modifiziert werden, um die Umwandlung in SC-β-Zellen zu erreichen, wie hier beschrieben. In bestimmten Ausführungsformen mindestens eine Insulin-positiven endokrinen Zelle oder ein Vorläufer davon, zum Beispiel ein Pankreas-Vorläufer kann am oder in der Gegenwart eines Materials, das imitiert ein oder mehrere Eigenschaften der extrazellulären Matrix oder eine oder mehrere extrazelluläre Matrix kultiviert werden, oder Basalmembrankomponenten. In einigen Ausführungsformen Matrigel™ verwendet. Andere Materialien umfassen Proteine oder Gemische davon, wie Gelatine, Kollagen, Fibronectin, usw. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird mindestens ein Insulin positive endokrinen Zelle oder ein Vorläufer davon kann in Gegenwart einer Feeder-Schicht von Zellen kultiviert werden.
Derartige Zellen können beispielsweise von murinen oder menschlichen Ursprungs. Sie können auch bestrahlt werden, chemisch durch Behandlung mit einem chemischen Inaktivator inaktiviert, wie Mitomycin C, oder auf andere Weise behandelt, um ihre Proliferation zu hemmen, wenn gewünscht. In anderen Ausführungsformen mindestens ein Insulin-positiven endokrinen Zelle oder ein Vorläufer davon sind ohne Feeder-Zellen kultiviert. Bei einigen Ausführungsformen davon sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufern in Bedingungen, die Zellklumpen zu fördern, kultiviert. Wie hierin verwendet, bedeutet „Bedingungen, die Zellklumpen zu fördern“ bezieht sich auf jede Bedingung, die die Clusterbildung von Zellen während der Differenzierung der Zellen in Richtung auf SC-β-Zellen stimuliert. In einigen Ausführungsformen, die Bedingungen, die das Zell aggregierende umfassen ein Suspensionskultur. Boretti und Gooch (Tissue Eng. 2006 April; 12 (4): 939-48) Bericht, der Kultur in mindestens haft Bedingungen (niedrige Serum-mittel, gering haftende Substrat) stimulierten Zellclusterbildung in der Transdifferenzierung von erwachsenen Pankreasgang Epithelzellen zu Beta-Zellen in vitro. Daher ist, ohne an eine Theorie gebunden zu sein, in einigen Ausführungsformen, die Bedingungen, die das Zell aggregierende umfassen minimal haftenden Bedingungen, beispielsweise mit niedrigem Serum mittel, niedrig haftenden Substrat.
Bei bestimmten Beispielen die β-Zellreifunsfaktoren können verwendet werden, um die Differenzierung von mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einer Vorstufe zu induzieren davon durch Aussetzen bzw. Kontaktieren von mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon mit einer wirksamen Menge eines hier beschriebenen, um den mindestens einen Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläufer davon in mindestens einen SC-β-Zelle (zB eine reife Pankreas-β-Zelle) unterscheiden β-Zellreifung Faktor.
Entsprechend beziehen, sind Zellen und Zusammensetzungen, die durch die hierin beschriebenen Verfahren hergestellt. Die exakte Menge und die Art der β-Zellreifung Faktor kann abhängig von der Zahl von Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufer davon, der gewünschten Differenzierungsstufe und der Anzahl vorherDifferenzierungsStadien die durchgeführt wurden variieren.
In bestimmten Beispielen wird ein β-Zellreifung Faktor in einer wirksamen Menge vorhanden. Wie hierin verwendet, bedeutet „wirksame Menge“ betrifft die Menge der Verbindung, die zur Unterscheidung von mindestens 10% oder mindestens 20% oder mindestens 30% der Zellen vorhanden sein sollten in einer Population von Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorstufen davon in SC-β-Zellen.
In weiteren Beispielen, β-Zellreifunsfaktoren in dem Kulturmedium von der mindestens einen Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon vorliegen, oder alternativ kann die β-Zellreifunsfaktoren der mindestens einen Insulin zugesetzt werden positive endokrine Zelle oder einer Vorstufe davon in irgendeiner Phase des Wachstums.
Bestätigung des Vorhandenseins und der Identifizierung von Zellen, SC-β-Zellen
Man kann jedes Mittel gemeinsam für einen Fachmann auf dem Gebiet, um die Anwesenheit eines SC-β-Zelle, zum Beispiel bestätigen eine reife Pankreas-β-Zelle erzeugt die Induktion der Differenzierung von mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon durch Einwirkung von mindestens einem β-Zellreifung Faktor, wie hierin beschrieben.
In einigen Ausführungsformen das Vorhandensein von β Zellmarker, zB chemisch induzierte SC-β-Zellen, können durch Erfassen der Anwesenheit oder Abwesenheit von einem oder mehr durchgeführt werden -I ll - Marker indikativ für eine endogene β-Zelle. In einigen Ausführungsformen kann das Verfahren das Erfassen der positive Ausdruck (zB das Vorhandensein) eines Markers für die reifen β-Zellen. In einigen Ausführungsformen kann der Marker unter Verwendung eines Reagens, beispielsweise ein Reagens zum Nachweis von NKX6- 1 und C-Peptid nachweisbar. Insbesondere SC-β-Zellen zum Ausdruck hierin NKX6-1 und C-Peptid und keine signifikanten Mengen anderer Marker, die ein Anzeichen für unreife β Zellen (zB MAFB) würde auszudrücken. Ein Reagenz für einen Marker kann beispielsweise ein Antikörper gegen den Marker oder Primer für eine RT-PCR oder PCR-Reaktion, beispielsweise eine halbquantitative oder quantitative RT-PCR oder PCR-Reaktion. Solche Marker können verwendet werden, um zu bewerten, ob ein SC-β Zelle hergestellt wurde. Der Antikörper oder andere Nachweisreagenz an eine Markierung, beispielsweise einem radiologisch, fluoreszieren (GFP) oder kolorimetrischen Markierung für Verwendung beim Nachweis verknüpft werden.
Wenn das Nachweisreagenz ein Primer ist, kann es in Trockenpräparat z zugeführt werden, lyophilisiert oder in einer Lösung.
Der Verlauf der mindestens eine Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon auf eine SC-β-Zelle kann durch die Bestimmung der Expression von Markern Charakteristik des reifen β-Zellen beobachtet werden. In einigen Verfahren wird die Expression bestimmter Marker durch Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit des Markers bestimmt. Alternativ kann die Expression von bestimmten Markierungen durch Messung der Pegel, bei dem der Marker in die Zellen der Zellkultur oder Zellpopulation vorhanden ist, bestimmt werden. In bestimmten Verfahren wird die Expression von Markern charakteristisch SC-β-Zellen sowie das Fehlen einer signifikanten Expression von Markern Charakteristik der Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufern davon, zB pluripotente Stammzelle oder Pankreas-Vorläuferzellen, aus denen sie abgeleitet wurde festgestellt wird.
Wie in Verbindung mit der Überwachung der Herstellung eines SC-β-Zelle (zB eine reife Pankreas-β-Zelle) aus einem Insulin-positiven endokrinen Zellen qualitative oder halbquantitative Techniken wie Blot Übertragungsmethoden und Immunzytochemie beschrieben, verwendet werden, um Markerexpression zu messen, unter Verwendung von allgemein dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren sein. Alternativ können Marker-Expressions exakt durch die Verwendung von Verfahren, wie quantitative PCR durch die üblicherweise in der Technik bekannten Verfahren quantifiziert werden. Darüber hinaus wird es ersichtlich, dass an der Polypeptidebene viele der Marker der Pankreasinselhormon-exprimierenden Zellen sezernierte Proteine. Als solche Techniken zum Messen extrazellulären Marker Inhalte, wie ELISA, verwendet werden.
SC-β-Zellen kann auch durch die Herunterregulierung von Markern Charakteristik der pluripotenten Stammzellen, aus dem die SC-β-Zelle ist aus induzierten charakterisiert werden. Zum Beispiel kann SC-β-Zellen von pluripotenten Stammzellen abgeleitet charakterisiert werden durch eine statistisch signifikante Herabregulierung der pluripotenten Stammzellmarker alkalische Phosphatase (AP), NANOG, OCT-4, SOX-2 SSEA4, TRA- 1 - 60 oder TRA- 1 -81 in der reifen verglichen mit der Expression in der pluripotenten Stammzelle aus dem er abgeleitet wurde. Andere Marker von pluripotenten Zellmarker exprimiert wird, umfassen, sind jedoch nicht mit alkalischer Phosphatase (AP) begrenzt wird; ABCG2; Stufe spezifische embryonale Antigen-1 (SSEA- 1); SSEA-3; SSEA-4; TRA-1 -60; TRA- 1 -81; Tra-2-49 / 6E; Eras / ECATS, E-Cadherin; βΓII- Tubulin; a-smooth muscle actin (a-SMA); Fibroblasten-Wachstumsfaktor 4 (FGF4), Cripto, Daxl; Zinc Finger Protein 296 (Zfp296); N-acety Transferase- 1 (National); (ES-Zellmarkers 1 (ECAT 1); ESG 1 / DPPAS / ECAT2; ECAT3; ECAT6; ECAT7; ECAT8; ECAT9; ECAT10; ECAT15-1; ECAT1 5-2; Fth 1 17; Sal 14; undifferenzierte embryonale Zelle Transkriptionsfaktor (Utfl); Rexl; p53; G3PDH; Telomerase, einschließlich TERT; Stumm X-Chromosom-Gene; Dnmt3a; Dnmt3b; TRIM28; F-box Protein 15 (Fbxl 5) enthalten; Nanog / ECAT4; Oct3 / 4; Sox2; Klf4; c-Myc; Esrrb; TDGF1; GABRB3; Zfp42, Foxd3; GDF3; CYP25A 1; Entwicklungs Pluripotenz-assoziierten 2 (DPPA2); T-Zell-Lymphom Haltepunkt 1 (Tel l); DPPA3 / Stella; DPPA4; Dnmt3L; Soxl 5; Stat3; Grb2; SV40 Large T-Antigen; HPV 16 E6; HPV 16-E7, β-Catenin, und BMI l und andere allgemeine Marker für Pluripotenz, etc, und mindestens eine oder mehrere von diesen sind in einer statistisch signifikanten Menge in eine reife reguliert, verglichen mit der pluripotenten Stammzelle, aus der sie abgeleitet.
Es ist verständlich, dass die vorliegende Erfindung nicht auf diese Marker als reifer β Zellmarker hier aufgeführten beschränkt, und die vorliegende Erfindung umfasst auch Marker wie Zelloberflächenmarker, Antigene und andere Genprodukte einschließlich ESTs, RNA (einschließlich mikroRNAs und Antisense-RNA), DNA (einschließlich Gene und cDNAs) und Teile davon.
Die Anreicherung, Isolierung und Reinigung einer SC-β-Zelle
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Isolierung einer Population von SC-β-Zellen aus einer heterogenen Population von Zellen, wie eine gemischte Population von Zellen, SC-β-Zellen und insulin positive endokrinen Zellen oder Vorläufern, umfassend, aus denen Der SC-ß-Zellen abgeleitet wurden. Eine Population von SC-β-Zellen durch ein beliebiges der oben beschriebenen Verfahren hergestellt angereichert, isoliert und / oder durch Verwendung eines Zelloberflächenmarker an den SC-β-Zellen vorhanden sind, die nicht auf dem Insulin-positiven endokrinen Zelle vorhanden ist, gereinigt oder Vorläufer davon, aus der sie abgeleitet wurde. Solche Zelloberflächenmarker werden auch als Affinitäts-Tag, der für ein SC- β-Zelle bezeichnet. Beispiele von für SC-β-Zellen Affinitäts-Tags sind Antikörper, Liganden oder andere Bindungsmittel, die für ein Markermolekül ist, wie ein Polypeptid, das heißt auf der Zelloberfläche einer SC-β-Zellen vorhanden ist, aber sich nicht wesentlich vorhanden ist auf anderen Zelltypen (zB Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufern davon).
In einigen Verfahren wird ein Antikörper, der an ein Zelloberflächenantigen auf einer SC-β-Zelle bindet (zB ein huma SC-β-Zelle) als Affinitäts-Tag für die Anreicherung, Isolierung oder Reinigung von chemisch induzierten (beispielsweise durch Kontaktieren mit zumin verwendet mindestens ein β-Zellreifung Faktor, wie hierin beschrieben), SC-β-Zellen durch die hierin beschriebenen Verfahren hergestellt. Solche Antikörper sind bekannt und im Handel erhältlich.
Der Fachmann wird ohne weiteres erkennen, die Prozesse für die Verwendung von Antikörpern für die Anreicherung, Isolierung und / oder Aufreinigung von SC-β-Zelle. Zum Beispiel kann in einigen Ausführungsformen des Reagens, wie ein Antikörper, mit einer Zellpopulation, die SC-β-Zellen, wobei der ceil Bevölkerung behandelt wurde, um die interzelluläre Adhäsion zu reduzieren und das Substrat inkubiert. Die Zellpopulation werden dann gewaschen, zentrifugiert und
resuspendiert. In einigen Ausführungsformen, wenn der Antikörper nicht bereits mit einer Markierung markiert ist, die Zellsuspension wird dann mit einem sekundären Antikörper, wie ein FITC-konjugierter Antikörper, die zur Bindung an den primären Antikörper ist. Der SC-β-Zellen werden dann gewaschen, zentrifugiert und in Puffer resuspendiert. Der SC-β-Zellsuspension wird dann analysiert und sortiert werden mit Hilfe eines Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS). Antikörper-gebundene, fluoreszierende umgewandelten Zellen getrennt von nicht gebundenen, nicht-fluoreszierenden Zellen gesammelt (zB unreif, Insulin-produzierenden Zellen), was zu der Isolierung von SC-β-Zellen von anderen in der Zellsuspension vorhanden Zellen, zB Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorstufen davon, oder unreif, Insulin-produzierenden Zellen (zB andere differenzierten Zelltypen).
In einer anderen Ausführungsform der hierin beschriebenen Verfahren wird das isolierte Zellzusammensetzung, die SC-β-Zellen kann durch die Verwendung eines alternativen Affinitäts- basierendes Verfahren oder durch zusätzliche Runden der Vereinzelung durch die gleichen oder andere Marker, die spezifisch für SC gereinigt werden -β-Zellen. Zum Beispiel kann in einigen Ausführungsformen wird FACS-Sortierung verwendet werden, um zuerst eine SC-β-Zelle, die NKX6- 1, entweder allein oder mit der Expression von C-Peptid, oder alternativ mit einem β-Zellmarker exprimiert hierin aus Zellen, die nicht offenbart zu isolieren Ausdruck eines dieser Marker (zB negative Zellen) in der Zellpopulation. Eine zweite FAC Sortier, z.B. Sortieren der positiven Zellen erneut mit FACS, um Zellen, die positiv für eine andere Marker sind zu isolieren, als die erste Art bereichert die Zellpopulation für umprogrammiert Zellen.
In einer alternativen Ausführungsform FACS-Sortierung wird, Einzelzellen durch negativ Sortieren für einen Marker, die auf den meisten Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufer davon vorhanden ist, ist aber nicht auf SC-β Zellen herangezogen.
In manchen Ausführungsformen der hier beschriebenen Verfahren werden SC-β-Zellen fluoreszierend, ohne die Verwendung eines Antikörpers, dann von nicht markierten Zellen mit Hilfe eines Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS) isoliert markiert. In solchen Ausführungsformen wird eine Nukleinsäure GFP, YFP oder andere Nukleinsäure ein exprimierbares fluoreszierenden Markergens, wie das Gen, das Luciferase codiert, wird verwendet, um umgewandelten Zellen unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren zu markieren. Zum Beispiel kann in einigen Ausführungsformen mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure, die für GFP oder ein biologisch aktives Fragment davon in mindestens eine Insulin-positiven endokrinen Zelle, die zuerst chemisch in eine SC-β-Zelle, wobei eine stromab des induzierten eingeführten ein Promotor exprimiert in SC-β-Zelle, wie beispielsweise die Insulin-Promotor, so dass die Expression des GFP-Genprodukt oder das biologisch aktive Fragment davon unter der Steuerung der Insulin-Promotor.
Neben den eben beschriebenen Verfahren, chemisch induzierte SC-β-Zellen können auch durch andere Techniken zur Zellisolierung isoliert werden. Zusätzlich kann SC-β-Zellen auch angereichertes oder durch Methoden der serielle Subkultur in den Wachstumsbedingungen, die die selektive Überleben oder selektive Expansion der SC-β-Zellen zu fördern, isoliert werden. Solche Verfahren sind Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt und können die Verwendung von Mitteln umfassen, wie beispielsweise Insulin, die Mitglieder der TGF-beta-Familie, einschließlich Activin A, TGF-betal, 2 und 3, Knochen Proteine (B P-2, -3, -4, -5, -6, -7, 1 1 - - 12 und - 13), Fibroblastenwachstums Faktoren-1 und -2, platelet-derived growth factor AA und - BB, plättchenreiches Plasma, insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF-I, II) Wachstumsdifferenzierungsfaktor (GDF-5, - 6, -7, -8, - 10, - 1 1 - 15), vaskulären endothelialen Zellwachstumsfaktors (VEGF), Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), Pleiotrophin, Endothelin, epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), beta-cellulin, unter anderem.
Andere pharmazeutische Verbindungen können beispielsweise Nicotinamid, glucagonähnlichen Peptid -I (GLP-1) und II, GLP-1 und 2 mimetibody, Exendin-4, Retinsäure, Parathormon.
Unter Verwendung von hierin beschriebenen angereicherten die Verfahren können isolierte und / oder gereinigte Populationen von SC-β-Zellen in vitro von Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufer davon (die aus pluripotenten Stammzellen nach den hier beschriebenen Methoden unterschieden wurden) hergestellt werden, . In einigen Ausführungsformen bevorzugt, Anreicherung, Isolierung und / oder Reinigungsverfahren beziehen sich auf die in vitro-Produktion von huma SC-β-Zelle von menschlichem Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufern davon, die aus menschlichen pluripotenten Stammzellen differenziert wurden, oder von menschlichen pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen). In einer solchen Ausführungsform, in der SC-β-Zellen von Insulin-positiven endokrinen Zellen, die zuvor von der endgültigen Entodermzellen abgeleitet wurden, die zuvor von iPS abgeleitet wurden differenziert, kann der SC-β Zelle autolog zum Gegenstand, von denen der sein Zellen wurden gewonnen, um die iPS-Zellen zu erzeugen.
Mit den hierin beschriebenen Verfahren isolierten Zellpopulationen SC-β-Zellen werden in SC-β Zellgehalt von zumindest etwa 2- bis etwa 1000-fach angereichert, im Vergleich zu einer Population von Zellen vor der chemischen Induktion der Insulin - positiven endokrinen Zellen oder Vorläuferpopulation. In einigen Ausführungsformen kann SC-β-Zellen durch mindestens etwa 5- bis etwa 500-fache im Vergleich zu einer Population vor der chemischen Induktion eines Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläuferpopulation angereichert werden. In anderen Ausführungsformen kann SC-β-Zellen von mindestens etwa 10- bis etwa 200-fache im Vergleich zu einer Population vor der chemischen Induktion von Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläuferpopulation angereichert werden. In noch anderen Ausführungsformen kann SC-β-Zelle von wenigstens etwa 20- bis etwa 100-fache im Vergleich zu einer Population vor der chemischen Induktion von Insulin positive endokrinen Zelle oder Vorläuferpopulation angereichert werden. In noch anderen Ausführungsformen kann SC-β-Zelle von wenigstens etwa 40- bis etwa 80-fach im Vergleich zu einer Population vor der chemischen Induktion von Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläuferpopulation angereichert werden.
In bestimmten Ausführungsformen kann SC-β-Zelle von zumindest etwa 2- bis etwa 20-fach im Vergleich zu einer Population vor der chemischen Induktion von Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläuferpopulation angereichert werden.
Zusammensetzungen, die SC-β-Zellen enthalten
Einige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen, wie beispielsweise Zellkulturen oder Zellpopulationen Zelle mit SC-β-Zellen, wobei die SC-β-Zellen wurden aus mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon abgeleitet. In einigen Ausführungsformen sind die Zellzusammensetzungen umfassen Insulin-positiven endokrinen Zellen. In einigen Ausführungsformen sind die Zellmassen enthalten NKX6- 1 -pancreatic Progenitorzellen. In einigen Ausführungsformen sind die Zellmassen enthalten Pdxl -pancreatic Progenitorzellen. In einigen Ausführungsformen sind die Zellmassen enthalten Urdarm Schlauchzellen. In einigen Ausführungsformen sind die Zellmassen enthalten definitive Entodermzellen.
In Übereinstimmung mit bestimmten Ausführungsformen sind die chemisch induzierte SC-β-Zellen Säugerzellen, und in einer bevorzugten Ausführungsform werden solche SC-β-Zellen huma SC- ß-Zellen. In einigen Ausführungsformen haben die Insulin-positiven Zellen von endokrinen definitive Entodermzellen zB abgeleitet menschliche definitive Entoderm Stammzellen. In Übereinstimmung mit bestimmten Ausführungsformen sind die chemisch induzierte Pdxl -positiven Bauchspeicheldrüsenvorläuferzellen Säugetierzellen und in einer bevorzugten Ausführungsform, wie Pdxl -positiven Bauchspeicheldrüsenvorläuferzellen sind menschliche Pdxl -positiven Bauchspeicheldrüsenvorläuferzellen.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen, wie beispielsweise einem isolierten Zellpopulation oder Zellkultur, umfassend SC-ß-Zellen durch die Verfahren hergestellt, wie hierin offenbart. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen, wie beispielsweise isolierte Zellpopulationen oder Zellkulturen, die aus chemie induzierte SC-β-Zellen durch die Verfahren hergestellt, wie hierin offenbart. In solchen Ausführungsformen die SC-β-Zellen weniger als etwa 90%, weniger als etwa 85%, weniger als etwa 80%, weniger als etwa 75%, weniger als etwa 70%, weniger als etwa 65%, weniger als etwa 60 %, weniger als etwa 55%, weniger als etwa 50%, weniger als etwa 45%, weniger als etwa 40%, weniger als etwa 35%, weniger als etwa 30%, weniger als etwa 25%, weniger als etwa 20%, weniger als etwa 1 bis 5%, weniger als etwa 12%, weniger als etwa 10%, weniger als etwa 8%, weniger als etwa 6%, weniger als etwa 5%, weniger als etwa 4%, weniger als etwa 3%, weniger als etwa 2% oder weniger als etwa 1% der gesamten Zellen in der SC-β-Zellen Bevölkerung.
In einigen Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung eine Population von SC-β-Zellen, aus denen sich mehr als etwa 90% der Gesamtzellen in der Zellpopulation, zum Beispiel etwa mindestens 95%, oder mindestens 96% oder mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens etwa 99% oder etwa mindestens 1 00% der Gesamtzellen in der Zellpopulation SC-β-Zellen.
Bestimmte andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen Zusammensetzungen, wie einem getrennten Zellpopulation oder Zellkulturen, eine Kombination von SC-β-Zellen und insulin positive endokrinen Zellen oder Vorläufer davon, aus der die SC-β-Zellen abgeleitet wurden. In einigen Ausführungsformen sind die Insulin-positiven endokrinen Zellen, aus denen die SC-β-Zellen abgeleitet sind weniger als etwa 25%, weniger als etwa 20%, weniger als etwa 15%, weniger als etwa 10%, weniger als etwa 5%, weniger als etwa 4%, weniger als etwa 3%, weniger als etwa 2% oder weniger als etwa 1% der gesamten Zellen in der isolierten Zellpopulation oder Kultur.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen Zusammensetzungen, wie isolierte Zellpopulationen oder Zellkulturen, die durch die hierin beschriebenen und folgendes umfassen chemisch induzierte SC-β-Zellen, wie die meisten Zelltyp Verfahren hergestellt. In einigen Ausführungsformen können die hier beschriebenen Verfahren und Prozesse erzeugt eine isolierte Zellkultur und / oder Zellpopulationen, die mindestens etwa 99%, mindestens etwa 98%, mindestens etwa 97%, mindestens etwa 96%, mindestens etwa 95% mindestens etwa 94%, mindestens etwa 93%, mindestens etwa 92%, mindestens etwa 91%, mindestens etwa 90%, mindestens etwa 89%, mindestens etwa 88%, mindestens etwa 87%, zumin mindestens etwa 86%, mindestens etwa 85%, mindestens etwa 84%, mindestens etwa 83%, mindestens etwa 82%, mindestens etwa 81%, mindestens etwa 80%, mindestens etwa 79%, mindestens etwa 78%, mindestens etwa 77%, mindestens etwa 76%, mindestens etwa 75%, mindestens etwa 74%, mindestens etwa 73%, mindestens etwa 72%, mindestens etwa 71%, mindestens etwa 70% mindestens etwa 69%, mindestens etwa 68%, mindestens etwa 67%, mindestens etwa 66%, mindestens etwa 65%, mindestens etwa 64%, mindestens etwa 63%, mindestens etwa 62%, zumin mindestens etwa 61%, mindestens etwa 60%, mindestens etwa 59%, mindestens etwa 58%, mindestens etwa 57%, mindestens etwa 56%, mindestens etwa 55%, mindestens etwa 54%, mindestens etwa 53%, mindestens etwa 52%, mindestens etwa 51% oder zumindest etwa 50% SC-β-Zellen.
In einer weiteren Ausführungsform isolierte Zellpopulationen oder Zusammensetzungen von Zellen (oder Zellkulturen) umfassen huma SC-β-Zellen. In anderen Ausführungsformen können die Methoden und Verfahren, wie hierin beschrieben isolierten Zellpopulationen, umfassend mindestens etwa 50%, mindestens etwa 45%, mindestens etwa 40%, mindestens etwa 35%, mindestens etwa 30%, mindestens etwa erzeugen 25%, mindestens etwa 24%, mindestens etwa 23%, mindestens etwa 22%, mindestens etwa 21%, mindestens etwa 20%, mindestens etwa 19%, mindestens etwa 18%, mindestens etwa 17% mindestens etwa 16%, mindestens ungefähr 1 5%, mindestens etwa 14%, mindestens ungefähr 13%, mindestens etwa 12%, mindestens etwa 1 1%, mindestens etwa 10%, mindestens etwa 9 %, mindestens etwa 8%, mindestens etwa 7%, mindestens etwa 6%, mindestens etwa 5%, mindestens etwa 4%, mindestens etwa 3%, mindestens 2% oder mindestens etwa 1% SC -β-Zellen. In bevorzugten Ausführungsformen können isolierte Zellpopulationen huma SC-β-Zellen aufweisen. In einigen Ausführungsformen ist der Prozentsatz der SC-β-Zellen in den Zellkulturen oder Populationen ohne Rücksicht auf den Feeder-Zellen in der Kultur verbleibenden berechnet.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen, wie beispielsweise isolierte Zellpopulationen oder Zellkulturen, die aus Mischungen von SC-β-Zellen und insulin positive endokrinen Zellen oder Vorläufer davon, aus der sie aus differenzierten wurden. B. Zellkulturen oder Zellpopulationen, umfassend mindestens etwa 5 SC-β-Zellen für ungefähr alle 95 Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufer davon hergestellt werden. In anderen Ausführungsformen, Zellkulturen oder Zellpopulationen, umfassend mindestens etwa 95 SC-β-Zellen für ungefähr alle 5 Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufer davon hergestellt werden. Zusätzlich werden die Zellkulturen oder Zellpopulationen, die andere Verhältnisse von SC-β-Zellen insulin positive endokrinen Zellen oder Vorläufer davon in Betracht gezogen. Beispielsweise umfassend Zusammensetzungen mindestens etwa 1 SC-β-Zelle für ungefähr alle 1, 000,000, oder zumindest 100.000 Zellen oder ein mindestens 10.000 Zellen oder mindestens 1000-Zellen oder 500 oder mindestens 250 oder mindestens 100 oder mindestens 10 Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufer davon hergestellt werden.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen Zusammensetzungen, wie Zellkulturen oder Zellpopulationen, die aus menschlichen Zellen, einschließlich huma SC-β-Zelle, die mindestens ein Merkmal eines endogenen β-Zelle anzeigt.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, Zellkulturen und / oder Zellpopulationen SC-β-Zellen aufweisen huma SC-β-Zellen, die nicht-rekombinante Zellen sind. In solchen Ausführungsformen sind die Zellkulturen und / oder Zellpopulationen frei von oder im Wesentlichen frei von rekombinanten huma SC-β-Zellen.
β-Zellreifungsfaktoren
Aspekte der Offenbarung beinhalten Inkontaktbringen Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufer davon mit β-Zellreifunsfaktoren, beispielsweise, um die Reifung der Insulin-positiven endokrinen Zellen oder die Differenzierung der Vorläufer davon in SC-β-Zellen zu induzieren (zB , reife Pankreas-β-Zellen). Der Begriff „β-Zellreifung Faktor“ bezieht sich auf ein Mittel, fördert oder trägt zur Umwandlung von mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon auf eine SC-β-Zelle. Bei einigen Ausführungsformen induziert der β-Zellreifungsfaktor die Differenzierung von pluripotenten Zellen (zB iPSCs oder HES) in definitiven Endoderms Zellen, zB in Übereinstimmung mit einem hierin beschriebenen Verfahren. In einigen Ausführungsformen induziert das β-Zellreifung Faktor die Differenzierung von Zellen in definitiven Endoderms Urdarm Schlauchzellen, beispielsweise in Übereinstimmung mit einem hierin beschriebenen Verfahren. In einigen Ausführungsformen induziert das β-Zellreifung Faktor die Differenzierung Urdarm Schlauchzellen in Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, beispielsweise in Übereinstimmung mit einem hierin beschriebenen Verfahren. In einigen Ausführungsformen induziert das β-Zellreifung Faktor die Differenzierung Pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen in NKX6- 1 -positiven Pankreas-Vorläuferzellen, beispielsweise in Übereinstimmung mit einem hierin beschriebenen Verfahren. In einigen Ausführungsformen induziert das β-Zellreifung Faktor der Differenzierung von Pankreas-Vorläufer NKX6-1 - positiven Zellen in Insulin-positiven endokrinen Zellen, beispielsweise in Übereinstimmung mit einem hierin beschriebenen Verfahren.
In einigen Ausführungsformen induziert das β-Zellreifung Faktor die Reifung von Insulin-positiven endokrinen Zellen in SC-β-Zellen, beispielsweise in Übereinstimmung mit einem hierin beschriebenen Verfahren.
In der Regel kann zumindest ein hierin beschriebener β-Zellreifungsfaktor allein verwendet werden oder in Kombination mit anderen β-Zellreifunsfaktoren zu SC-β-Zellen nach den Verfahren wie hier offenbart zu erzeugen. In einigen Ausführungsformen mindestens zwei, mindestens drei, mindestens vier, mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens sieben, mindestens acht, mindestens neun, wenigstens zehn hierin beschriebenen β-Zellreifunsfaktoren werden in die verwendete Verfahren zum Erzeugen von SC-β-Zellen.
Transforming Growth Factor-β (TGF-β) Superfamilie
Aspekte der Offenbarung beziehen sich auf die Verwendung von Wachstumsfaktoren aus dem transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β) Superfamilie, wie β-Zellreifunsfaktoren. Der „TGF-β-Superfamilie“ bedeutet Proteine mit strukturellen und funktionellen Eigenschaften von bekannten TΰPβ Familienmitglieder. Die 1G¥ Familie von Proteinen, ist gut charakterisiert, die beide aus strukturellen und funktionellen Aspekten. Es umfasst die TG? Reihe von Proteinen, die Inhibine (einschließlich Inhibin A und Inhibin B), die Activine (einschließlich Activin A, Activin B und Activin AB), MIS (Mullerian hemmende Substanz), BMP (bone morphogenetic proteins), DPP (decapentaplegic) Vg - 1, MNSF (monoklonale unspezifische Suppressor-Faktor) und andere. Aktivität dieser Familie von Proteinen auf eine spezifische Bindung an bestimmte Rezeptoren auf verschiedenen Zelltypen. Mitglieder dieser Familie Anteil Regionen der Sequenzidentität, insbesondere am C-Terminus, die auf ihre Funktion zu korrelieren. Die Familie 1G¥ umfasst mehr als hundert verschiedene Proteine, die alle teilen mindestens eine Region der Aminosäuresequenzidentität auf.
Mitglieder der Familie umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die folgenden Proteine beschränkt, wie durch ihre GenBank-Zugangsnummern identifiziert: P07995, PI 833 1, P08476, Q04998, P03970, P43032, P55102, P27092, P42917, P09529, P27093, P04088, Q04999, PI 7491, P55104, Q9WUK5, P55103, 088.959, 008.717, P58166, 061.643, P35621, P09534, P48970, Q9NR23, P25703, P30884, P12643, P49001, P21274, 046.564, 019.006, P22004, P20722, Q04906, Q07104, P30886 , P18075, P23359, P22003, P34821, P49003, Q90751, P21275, Q06826, P30885, P34820, Q29607, I 2644, Q90752, 046576, P27539, P48969, Q26974, P07713, P91706, P91699, P27091, 042.222, Q24735, P20863, 018.828, P55106, Q9PTQ2, 014793, 008689, 042221, 018830, 01 8831, 018836, 035312, 042220, P43026, P43027, P43029, 095.390, Q9R229, 093.449, Q9Z1 W4, Q9BDW8, P43028, Q7Z4P5, P50414, P17246, P5483 1 , P04202, P01 137, P09533, P 1834 I, 01901 1, Q9Z1 Y6, P07200, Q9Z217, 095.393, P55105, P30371, Q9MZE2, Q07258, Q96S42, P97737, AA A97415.1, NP 776.788,1, NP 058.824,1, EAL24001 0,1, 1 S4 Y, NP 001.009.856,1, NP 032.406,1, NP 999.193,1, XP- 519.063,1, AAG 17260,1, CAA40806.1, IMP 001.009.458,1, AAQ55808.1, AAK40341.1, AAP33019.1, AAK21265.1, AAC59738.1, CAI46003.1, B40905, AAQ5581 1 .1, AAK40342.1, XP- 540.364,1, P55102, AAQ55810.1, NP 990.727,1, CAA51 163,1, AAD50448.1, JC4862, PN0504, BAB 1 7600,1, AAH56742.1, BAB 17.596,1, CAG06183.1, CAG05339.1, BAB 17601 .1, CAB43091. 1, A36192, AAA49162. I, AAT42200.1, NP 789.822,1, AAA59451.1, AAA59169.1, XP- 541.000,1, NP-990.537,1, NP 002.184,1, AAC14187.1, AAP83319.1, AAA59170.1, BAB 16973,1, AAM66766.1, WFPGBB, 1201278C, A AH30029.1, CAA49326.1, XP- 344.131,1, AAH48845.1, XP- 148.966,3, 148.235, B41398, AAH77857.1, AAB26863.1, 1.706.327 A, BAA83804.1, NP 571.143,1, CAG00858.1, BAB17599.1, BAB 17602.1, AAB61468.1, PN0505, PN0506, CAB43092.1, BAB 17.598,1, B AA22570.1, BAB 16.972,1, BAC81672.1, BAA12694.1, BAA08494.1, B36192, C36192, BAB16971.1, NP 034.695,1, AAA49160.1, CAA62347.1, AAA49161.1, AAD30132.1, CAA58290.1, NP-005.529,1, XP- 522.443,1, AAM27448.1, XP- 538.247,1, AAD30133.1, AAC36741.1, AAH 10404,1, NP 032.408,1, AAN03682.1, XP- 509.161,1, AAC32311.1, NP-651.942,2, AAL51005.1, AAC39083.1, AAH85547.1, NP 71023,1, CAF94113.1, EAL29247.1, AAW30007.1, AAH90232.1, A29619, NP 001.007.905,1, AAH73508.1, AAD02201.1, NP- 999.793,1, NP 990.542,1, AAF 19841,1, AAC97488.1, AAC60038.1, NP 989.197,1, NP 571.434,1, EAL41229.1, AAT07302.1, CAI19472.1, NP 031.582,1, AAA40548.1, XP- 535.880,1, NP 037.239,1, A AT72007.1, XP- 418.956,1, CAA41634. 1, BAC30864.1, CAA38850.1, CAB81657.2, CAA45018.1, CAA45019.1, BAC28247.1, NP 031.581,1, NP 990.479,1, NP 999.820,1, AAB27335.1, S45355, CAB82007.1, XP- 534.351,1, NP 058.874,1, NP 031.579,1, 1REW, AAB96785.1, AAB46367.1, CAA05033.1, BAA89012.1, 1ES7, AAP20870.1, BAC24087.1, AAG09784.1, BAC06352.1, AAQ89234.1, AAM27000.1, AAH30959.1, CAGO 1491,1, NP 571.435,1, 1 REU, AAC60286.1, BAA24406.1, A36193, AAH55959.1, AAH54647.1, AAH90689.1, CAG09422.1, Badl 6743,1, NP 032.134,1, XP-532.179,1, AAB24876.1, AAH57702.1, AAA82616.1, CAA40222.1, CAB90273.2, XP-342.592,1 , XP- 534.896,1, XP- 534.462,1, 1LX1, XP- 417.496,1, AAF34179.1, AAL73188.1, CAF96266.1, AAB34226.1, AAB33846.1, AAT12415.1, AA033819.1, AAT72008.1, AAD38402.1 , BAB68396.1, CAA45021.1, AAB27337.1, AAP69917.1, AAT12416.1, NP 571.396,1, CAA53513.1, AAO33820.1, AAA48568.1, BAC02605.1, BAC02604.1, BAC02603.1, BAC02602 0,1, BAC02601.1, BAC02599.1, BAC02598.1, BAC02597.1, BAC02595.1, BAC02593.1, BAC02592.1, BAC02590.1, AAD28039.1, AAP74560.1, AAB94786.1, NP 001.483,2 , XP- 528.195,1, NP 571.417,1, NP-001.001.557,1, AAH43222.1, AAM33143.1, CAG10381.1, BAA31132.1, EAL39680.1, EAA12482.2, P34820, AAP88972.1, AAP74559.1, CAI16418.1, AAD30538.1, XP-345.502,1, NP- 038.554,1, CAG04089.1, CAD60936.2, NP 031.584,1, B55452, AAC60285.1, BAA06410.1, AAH52846.1, NP 031.580,1, NP 036.959,1, CAA45836.1, CAA45020.1, 029.607, AAB27336.1, XP- 547.817,1, AAT12414.1, AAM54049.1, AAH78901.1, AA025745.1, NP 570.912,1, XP- 392.194,1, AAD20829.1, AAC97113.1, AAC61694.1, AAH60340.1, AAR97906.1, B AA32227.1, BAB68395.1, BAC02895.1, AAW51451.1, AAF82188.1, XP- 544.189,1, NP-990.568,1, BAC80211.1, AAW82620.1, AAF99597.1, NP 571.062,1, CAC44179.1, AAB97467.1, AAT99303.1, AAD28038.1, AAH52168.1, NP 001.004.122,1, CAA72733.1, NP 032.133,2, XP- 394.252,1, XP- 224.733,2, JH0801, AAP97721.1, NP 989.669,1, S43296, P43029, A55452, AAH32495.1, XP- 542.974,1, NP 032.135,1, AAK30842.1, AAK27794. 1, BAC30847.1, EAA 12064,2, AAP97720.1, XP- 525.704,1, AAT07301.1, BAD07014.1, CAF94356.1, AAR27581.1, A AG 13.400,1, AAC60127.1, CAF92055.1, XP- 540.103,1, AAO20895 0,1, CAF97447.1, AAS01764.1, BAD08319.1, CAA10268.1, NP 998.140,1, AAR03824.1, AAS48405.1, AAS48403.1, AAK53545.1, AA 84666,1, XP- 395.420,1, AAK56941.1, AAC47555.1, AAR88255.1, EAL33036.1, AAW47740.1, AAW29442.1, NP 722.813,1, AAR08901.1, AAO15420.2, CAC59700.1, AAL26886.1, AAK71708.1, AAK71707.1, CAC51427.2, AAK67984.1, AAK67983.1, AA 28706,1, P07713, P91706, P91699, CAG02450.1, AAC47552.1, NP 005.802,1, XP - 343.149,1, AW34055.1, XP- 538.221,1, AAR27580.1, XP- 125.935,3, AAF21633.1, AAF21630.1, AAD05267.1, Q9Z1 W4, NP 031.585,2, NP-571.094,1, CAD43439.1, CAF99217.1, CAB63584.1, NP 722.840,1, CAE46407.1, XP-417.667,1, BAC53989.1, BAB 19659,1, AAM46922.1, AAA81169.1, AAK28707.1, AAL05943.1, AAB17573 0,1, CAH25443.1, CAG 10269,1, BAD16731.1, EAA00276.2, AAT07320.1, AAT07300.1, AAN15037.1, CAH25442.1, AAK08152.2, 2009388A, AAR12161.1, CAGO 1961,1, CAB63656.1 , CAD67714.1, CAF94162.1, NP 477.340,1, EAL24792.1, NP 001.009.428,1, AAB86686.1, A AT40572.1, A AT40571.1, AAT40569.1, NP 33886,1, AAB49985.1, AAG39266.1, Q26974, AAC77461.1, AAC47262.1, BAC05509.1, NP 055.297,1, XP- 546.146,1, XP- 525.772,1, NP-060.525,2, AAH33585.1, AAH69080.1, CAG12751.1, AAH74757.2, NP 034.964,1, NP 038.639,1, 042.221, AAF02773.1, NP 062.024,1, AAR 18244,1, AAR 14343,1, XP-228.285,2, AAT40573.1, AAT94456.1, AAL35278.1, AAL35277.1, AAL17640.1, AAC08035.1, AAB86692.1, CAB40844.1, BAC38637.1, BAB 16046,1, AAN63522.1, NP 571.041,1, AAB04986.2, AAC26791.1 , AAB95254.1, BAA11835.1, AAR18246.1, XP-538.528,1, BAA31853.1, AAK18000.1, XP- 420.540,1, AAL35276.1, AAQ98602.1, CAE71944.1, AAW50585.1, AAV63982.1, AAW29941.1, AAN87890.1, AAT40568.1, CAD57730.1, AAB81508.1, AAS00534.1, AAC59736.1, BAB79498.1, AAA97392. 1, AAP85526.1, P- -999600,2, NP- 878.293. 1, B AC82629.1, CAC60268. 1, CAG04919.1, AAN 10123,1, CAA07707.1 AAK20912.1, AAR88254.1, CAC34629.1, AAL35275.1, AAD46997.1, AAN03842.1, NP- 571.951,2, CAC50881 0,1, AAL99367.1, AAL49502. 1, AAB71839.1, AAB65415.1, NP-624.359,1, NP- 990.153. 1, AAF78069.1, AAK49790.1, NP- 919.367,2, NP- 001 192,1, XP- 544.948,1, AAQ18013.1, AAV38739.1, NP- 851.298,1, CAA67685.1, AAT67171 0,1, AAT37502.1, AAD27804.1, AAN76665.1, BAC 1 1909,1, XP- 421.648,1, CAB63704.1, NP- 037.306,1, A55706, AAF02780.1, CAG09623.1, NP- 067.589,1, NP- 035.707,1, AA V30547.1, AAP49817.1, BAC77407.1, AAL87199.1, CAG07172.1, B36193, CAA33024.1, NP- 001.009.400,1, AAP36538.1, XP- 512.687,1 , XP- 510.080,1, AAH05513.1, 1 TZ, AAH 14.690,1, AAA31526.1.
Es ist vorgesehen, dass jede Wachstumsfaktor aus der TGF-β Superfamilie, die in der Lage ist, entweder allein oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen β-Zellreifunsfaktoren der Induktion der Differenzierung von mindestens einem Insulinproduzierenden, endokrinen Zelle oder Vorstufe davon in eine SC-β-Zelle in den Verfahren, Zusammensetzungen und hierin beschriebenen Kits verwendet werden.
Der Wachstumsfaktor aus der TGF-β kann natürlich gewonnen werden oder rekombinante. In einigen Ausführungsformen der Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie umfasst Activin A. Der Ausdruck „Activin A“ schließt Fragmente und Derivate Activin A. Der Ablauf eines Ausführungs Activin A wird als SEQ ID NO: 1 offenbart in US Pub. Nr. 2009/0155218 (die '218-Veröffentlichung"). Andere nicht einschränkende Beispiele von Activin A in SEQ ID NO: 2-16 der '218 Veröffentlichung und nicht einschränkende Beispiele von Nukleinsäuren Activin A kodieren, sind in SEQ ID NO: 33-34 des '218 Veröffentlichung. In einigen Ausführungsformen der Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie umfasst ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens 30%, mindestens 40%, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80% mindestens 90%, mindestens 95% oder mindestens 99% oder mehr identisch zu SEQ ID NO: 1 der '218 Veröffentlichung.
In einigen Ausführungsformen der Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie umfasst Wachstumsdifferenzierungsfaktor 8 (GDF8). Der Begriff „GDF8“ schließt Fragmente und Derivate GDF8. Die Sequenzen GDF8 Polypeptide sind für den Fachmann. In einigen Ausführungsformen der Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie umfasst ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens 30%, mindestens 40%, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80% mindestens 90%, mindestens 95% oder mindestens 99% oder mehr identisch mit dem menschlichen GDF8 Polypeptidsequenz (GenBank Accession EA 10880).
In einigen Ausführungsformen der Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Überfamilie besteht aus einem Wachstumsfaktor, der eng an GDF8 zusammenhängt, zB Wachstumsdifferenzierungsfaktor 1 1 (GDF 1 1). Die Polypeptidsequenzen GDF 1 1 sind für den Fachmann. In einigen Ausführungsformen der Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie umfasst ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens 30%, mindestens 40%, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80% mindestens 90%, mindestens 95% oder mindestens 99% oder mehr identisch mit dem menschlichen GDF 11-Polypeptid-Sequenz (GenBank Accession AAF21630).
In bestimmten Ausführungsformen sind die Verfahren, Zusammensetzungen und Kits, die hierin offenbart mindestens einen Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie auszuschließen.
In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie mit einem Mittel ersetzt werden, ahmt die mindestens einen Wachstumsfaktor aus der TGF-β-Superfamilie. Ausführungsmittel, die den mindestens einen Wachstumsfaktor nachahmen aus der TGF-β-Superfamilie gehören, ohne Einschränkung, IDE1 und IDE2.
TGF-beta Signalweg-Inhibitoren
Aspekte der Offenbarung beziehen sich auf die Verwendung von TGF-β-Signalweg-Inhibitoren als β-Zellreifunsfaktoren. Es wird erwogen, dass jede TGF-β-Signalweg-Inhibitor, der in der Lage ist, entweder allein oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen β-Zellreifunsfaktoren der Induktion der Differenzierung von mindestens einem Insulin-produzierenden, endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon in ein SC -β-Zelle kann in den Verfahren, Zusammensetzungen und hierin beschriebenen Kits verwendet werden. In bestimmten Ausführungsformen die hierin offenbarten Verfahren, Zusammensetzungen und Kits schließen eine TGF-β-Signalweg-Inhibitor.
In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalwegs umfasst TGF-β-Rezeptor Typ I-Kinase (TGF-β RI) Signalisierung. In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors umfasst ALK5 Inhibitor II (CAS 446859-33-2, eine ATP-kompetitiven Inhibitor von TGF-B RI-Kinase, die auch als RepSox, IUPAC Namen bekannt: 2- [5- (6 - Methylpyridin-2-yl) -1 H-pyrazol-4-yl] -1, 5-naphthyridin. In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitor ein Analogon oder Derivat von AL-5-Inhibitor II.
In einigen Ausführungsformen ist das Analogon oder Derivat von ALK5 Inhibitor II eine Verbindung der Formel I, wie in der US-Patentschrift Nr 2012/0021519 beschrieben, durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit hierin aufgenommen.
In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitor ein in der US Patentveröffentlichung Nr 2010/0267731 beschrieben, TGF-β-Rezeptor-Inhibitor. In einigen Ausführungsformen umfasst der TGF-β-Signalweg-Inhibitor ein in der US-Patentschriften Nr. 2009/01 86076 und 2007/0142376 beschrieben ALK5 Inhibitor.
In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors A 83-01. In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors nicht A 83-01. In einigen Ausführungsformen, die hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren schließen eine 83-01.
In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitor SB 43 1542. In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitor SB 431542 nicht. In einigen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren auszuschließen SB 431542.
In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors D 4476. In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors nicht D 4476. In einigen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren auszuschließen D 4476.
In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors GW 788.388. In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors nicht GW 788.388. In einigen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren auszuschließen GW 788.388.
In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors LY 364.947. In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors nicht LY 364.947. In einigen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren auszuschließen LY 364.947.
In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors LY 580276. In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors nicht LY 580276. In einigen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren auszuschließen LY 580276.
In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitor SB 525.334. In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors zu Sb-525.334. In einigen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren auszuschließen SB 525.334.
In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitor SB 505.124. In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors zu Sb-505.124. In einigen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren auszuschließen SB.
In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors SD 208. In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors nicht SD 208. In einigen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren auszuschließen SD 208.
In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors GW 6604. In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors nicht GW 6604. In einigen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren auszuschließen GW 6604.
In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors GW 788.388. In einigen Ausführungsformen ist die TGF-β-Signalweg-Inhibitors nicht GW 788.388. In einigen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren auszuschließen GW 788.388.
LY-364947, SB-525334, SD-208 und SB-505124, erhältlich von Sigma, PO:
Aus der Sammlung des oben beschriebenen Verbindungen, die folgende kann aus verschiedenen Quellen gewonnen werden Box 14508, St. Louis, MO, 63178-9916; 616.452 und 616.453 von Calbiochem (EMD Chemicals, Inc.), 480 S. Democrat Road, Gibbstown, NJ, 08027 zur Verfügung; GW788388 und GW6604 von Glaxosmithkline, 980 Great West Road, Brentford, Middlesex, TW8 9GS, Vereinigtes Königreich; LY580276 von Lilly Research, Indianapolis, 46285. und SI 6 von Biogen Idee, P. O. Box 14627, 5000 Davis Drive, Research Triangle Park, NC, 27709-4627.
Wnt-Signalweg
Aspekte der Offenbarung beziehen sich auf die Verwendung von Aktivatoren des Wnt-Signalwegs, wie β-Zellreifunsfaktoren. Es wird erwogen, dass jede Wnt-Signalwegs fähig ist, Aktivator, der entweder allein oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen β-Zellreifunsfaktoren induzieren die Differenzierung von zumindest einer insulinproduzierenden endokrinen Zelle oder Vorläufer davon in eine SC-β Zelle kann in den Verfahren, Zusammensetzungen und hierin beschriebenen Kits verwendet werden.
In einigen Ausführungsformen der Wnt-Signalweg Aktivator CHIR99021. In einigen Ausführungsformen der Wnt-Signalweg Aktivator ein Derivat von CHIR99021 zB einem Salz CHIR99021 zB Trihydrochlorid, ein Hydrochloridsalz von CHIR99021. In einigen Ausführungsformen der Wnt-Signalweg Aktivator Wnt3a rekombinantes Protein ist. In einigen Ausführungsformen der Wnt-Signalweg Aktivator ein Glycogensynthasekinase 3 (GSK3) -Inhibitor. Beispielhafte GSK3-Inhibitoren gehören, ohne Einschränkung, 3F8, A 1070722, AR-A 01441 8, BIO, Blo-Acetoxim, FRATide, 10Z-Hymenialdisin, Indirubin-3 'Oxim, Kenpaullon, L803, L803-mts, Lithiumcarbonat, NSC 693868 , SB 216.763, SB 415286, TC-G 24, TCS 2002 TCS 2131 1 1 19 TWS und Analoga oder Derivaten von beliebigen von diesen. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Verfahren, Zusammensetzungen und hierin offenbarten Kits schließen eine Signalpfads Aktivator.
Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) Familie
Aspekte der Offenbarung beziehen sich auf die Verwendung von Wachstumsfaktoren aus der FGF-Familie, wie β-Zellreifunsfaktoren. Es wird erwogen, dass jede Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie, das in der Lage ist, entweder allein oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen β-Zellreifunsfaktoren der Induktion der Differenzierung von mindestens einem Insulin-produzierenden, endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon in ein SC-β-Zelle kann in den Verfahren, Zusammensetzungen und hierin beschriebenen Kits verwendet werden. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Verfahren, Zusammensetzungen und hierin offenbarten Kits schließen eine Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie.
In einigen Ausführungsformen weist der zumindest eine Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF). Die Polypeptidsequenzen GF sind für den Fachmann. In einigen Ausführungsformen der Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie umfasst ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens 30%, mindestens 40%, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95% oder mindestens 99% oder mehr identisch mit dem menschlichen KGF Polypeptidsequenz (GenBank Accession AAB2143 1).
In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie umfasst FGF2. Die Polypeptidsequenzen FGF2 sind für den Fachmann. In einigen Ausführungsformen der Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie umfasst ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens 30%, mindestens 40%, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95% oder mindestens 99% oder mehr identisch mit dem menschlichen FGF2 Polypeptidsequenz (GenBank NP_001997).
In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie umfasst FGF8b. Die Polypeptidsequenzen FGF8b sind für den Fachmann. In einigen Ausführungsformen der Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie umfasst ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens 30%, mindestens 40%, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%>, die mindestens 80% o mindestens 90%>, mindestens 95% oder mindestens 99% oder mehr identisch mit dem menschlichen FGF8b Polypeptidsequenz (GenBank Accession AAB40954).
In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie umfasst FGF 10. Die Polypeptidsequenzen FGF10 sind für den Fachmann. In einigen Ausführungsformen der Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie umfasst ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens 30%, mindestens 40%, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95% oder mindestens 99% oder mehr identisch mit dem humanen FGF 10 Polypeptidsequenz (GenBank Accession CAG46489).
In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie umfasst FGF21. Die Polypeptidsequenzen FGF21 sind für den Fachmann. In einigen Ausführungsformen der Wachstumsfaktor aus der FGF-Familie umfasst ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens 30%, mindestens 40%, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95% oder mindestens 99% oder mehr identisch mit dem menschlichen FGF21 Polypeptidsequenz (GenBank Accession AAQ89444.1).
Knochenmorphogeneseprotein (BMP) Signalweg-Inhibitoren
Aspekte der Offenbarung beziehen sich auf die Verwendung von BMP-Signalweg-Inhibitoren als β-Zellreifunsfaktoren. BMP-Signalfamilie ist eine unterschiedliche Untergruppe der TGF-β-Superfamilie (Sebald et al. Biol. Chem. 385: 697-710, 2004). Über zwanzig bekannten BMP-Liganden werden durch drei verschiedene Typ II (BMPRII, ActRIIa und ActRIIB) und mindestens drei Typ I (ALK2, ALK3 und ALK6) Rezeptoren erkannt. Dimere Liganden erleichtern die Montage von Rezeptor Heteromere, so dass der konstitutiv-aktive Typ-II-Rezeptor-Serin / Threonin-Kinasen zu spät Typ I-Rezeptor-Serin / Threonin-Kinasen Leuchtstoff. Aktivierten Typ-I-Rezeptoren phosphorylieren BMPresponsive (BR) SMAD Effektoren (SMADs 1, 5 und 8), um die nukleäre Translokation im Komplex mit SMAD4, ein Co-SMAD die ebenfalls erleichtert TGF-Signalisierung zu vereinfachen. Zusätzlich kann BMP Signale intrazellulären Effektoren wie MAPK p38 in einer SMAD-unabhängigen Weise zu aktivieren (Nohe et al Zellsignal. 16: 291 -299, 2004). Lösliche BMP-Antagonisten wie Noggin, chordin, gremlin, und Follistatin Grenze BMP-Signalgebung durch Ligandenbindung.
Es ist vorgesehen, dass jedes BMP-Signalweg-Inhibitor, der in der Lage ist, entweder allein oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen β-Zellreifunsfaktoren der Induktion der Differenzierung von mindestens einem Insulin-produzierenden, endokrinen Zelle oder eines Vorläufers davon in ein SC-β-Zelle in den Verfahren, Zusammensetzungen und hierin beschriebenen Kits verwendet werden. In bestimmten Ausführungsformen der hier beschriebenen Aspekt können die Verfahren, Zusammensetzungen und hierin offenbarten Kits schließen eine BMP-Signalweg-Inhibitors.
In einigen Ausführungsformen umfasst das BMP-Signalweg-Inhibitors LDN 193189 (auch als LDN 1931 89 1062368-24-4 bekannt LDN- 193 1 89, 3 189 DM, DM-3 189, IUPAC Name: 4- [6- (4-piperazin- l -ylphenyl) pyrazolo [l, 5-a] pyrimidin-3- yl] chinolon).
In einigen Ausführungsformen ist die BMP-Signalweg-Inhibitor einen Analog oder Derivat LDN 193189, beispielsweise ein Salz, Hydrat, Lösungsmittel, Ester oder Prodrug LDN 193 189. In einigen Ausführungsformen ein Derivat (zB Salz) der LDN 1931 89 umfasst LDN 193 189 Hydrochlorid.
In einigen Ausführungsformen umfasst das BMP-Signalweg-Inhibitor eine Verbindung der Formel I aus der US-Patentschrift Nr 201 1 / 0.053.930.
Sonic Hedgehog (SHH) Signalweg
Aspekte der Offenbarung beziehen sich auf die Verwendung von SHH-Signalweg-Inhibitoren als β-Zellreifunsfaktoren. Es wird erwogen, dass jede SHH-Signalweg-Inhibitor, der in der Lage ist, entweder allein oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen β-Zellreifunsfaktoren der Induktion der Differenzierung von mindestens einem Insulinproduzierenden, endokrinen Zelle oder Vorläufer davon in eine SC-β Zelle kann in den Verfahren, Zusammensetzungen und hierin beschriebenen Kits verwendet werden.
In einigen Ausführungsformen der SHH-Signalweg-Inhibitors umfasst Sant l. In einigen Ausführungsformen die SHH-Signalweg-Inhibitors umfasst SANT2. In einigen Ausführungsformen die SHH-Signalweg-Inhibitors umfasst SANT3. In einigen Ausführungsformen die SHH-Signalweg-Inhibitors umfasst SANT4. In einigen Ausführungsformen die SHH-Signalweg-Inhibitors umfasst Cur61414. In einigen Ausführungsformen umfasst der SHH-Signalweg-Inhibitors Forskolin. In einigen Ausführungsformen umfasst der SHH-Signalweg-Inhibitors Tomatidin. In einigen Ausführungsformen die SHH-Signalweg-Inhibitors umfasst AY9944. In einigen Ausführungsformen umfasst der SHH-Signalweg-Inhibitors Triparanol. In einigen Ausführungsformen die SHH-Signalweg-Inhibitors umfasst Verbindung A oder Verbindung B (wie in US Pub offenbart. Nein. 2004/0060568). In einigen Ausführungsformen die SHH-Signalweg-Inhibitors umfasst ein Steroid-Alkaloid, die Hedgehog-Signalgebung (zB Cyclopamin oder ein Derivat davon), wie in US Pub offen antagonisiert.
Nein.
2006/0276391. In bestimmten Ausführungsformen schließen die hier offenbarten Verfahren, Zusammensetzungen und Kits einen SHH-Signalweg-Inhibitor aus.
Retinsäure Signalweg
Aspekte der Offenbarung beziehen sich auf die Verwendung von Modulatoren der Retinsäure Signalisierung als β-Zellreifunsfaktoren. Es wird erwogen, dass jeder Modulator von Retinsäure-Signalisierung, die in der Lage ist, entweder allein oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen β-Zellreifunsfaktoren der Induktion der Differenzierung von mindestens einem Insulin-produzierenden, endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon in einer SC- β-Zelle in den Verfahren, Zusammensetzungen und hierin beschriebenen Kits verwendet werden.
In einigen Ausführungsformen der Modulator von Retinsäure-Signalisierung umfasst einen Aktivator von Retinoesäure-Signalisierung. In einigen Ausführungsformen umfasst das RA-Signalweg Aktivator Retinsäure. In einigen Ausführungsformen ist die RA-Signalweg Aktivator ein Retinsäure-Rezeptor-Agonisten. Beispielhafte Retinsäure-Rezeptor-Agonisten beinhalten, ohne Einschränkung, CD 1530 AM 580, TTNPB, CD 437, Ch 55, BMS 961, AC 261066, AC 55649, BIN 80, BMS 753, Tazaroten, Adapalen und CD 2314.
In einigen Ausführungsformen der Modulator von Retinsäure Signalisierungs einen Inhibitor von Retinsäure-Signalisierung. In einigen Ausführungsformen wird die Retinsäure-Signalweg-Inhibitors umfasst DEAB (IUPAC Name: 2- [2- (Diethylamino) ethoxy] -3-Ei- 2-enylbenzaldehyde). In einigen Ausführungsformen wird die Retinsäure-Signalweg-Inhibitors umfasst ein Analogon oder Derivat von DEAB.
In einigen Ausführungsformen wird die Retinsäure-Signalweg-Inhibitors umfasst ein Retinsäure-Rezeptor-Antagonist. In einigen Ausführungsformen sind die Retinsäure-Rezeptor-Antagonist (E) -4- [2- (5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-phenyl-2- naphthalinyl) ethenyl] benzoesäure (E) -4 - [[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-phenylethynyl) - 2-naphthalinyl] ethenyl] benzoesäure, (E) -4- [2- [5,6-Dihydro-5,5- Dimethyl-8- (2-naphthalenyl) -2-naphthalenyl] ethenyl] benzoesäure und (E) -4- [2- [5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8- (4-methoxyphenyl) -2-naphthalenyl] ethenyl] benzoesäure. In einigen Ausführungsformen umfasst der Retinsäure-Rezeptor-Antagonist BMS 195.614 (CAS # 253310-42-8), ER 50891 (CAS # 187400-85-7), BMS 493 (CAS # 170355-78-9), CD-2665 (CAS # 170355-78-9), LE 135 (CAS # 155877-83- 1), BMS 453 (CAS # 166977-43- 1) oder MM 1 1253 (CAS # 345952-44-5).
In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Verfahren, Zusammensetzungen und hierin offenbarten Kits schließen eine Modulator von Retinsäure-Signalisierung. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Verfahren, Zusammensetzungen und hierin offenbarten Kits schließen eine Retinsäure-Signalweg Aktivator. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Verfahren, Zusammensetzungen und hierin offenbarten Kits schließen eine Retinsäure-Signalweg-Inhibitors.
Protein Kinase C
Aspekte der Offenbarung beziehen sich auf die Verwendung von Proteinkinase C-Aktivatoren, wie β-Zellreifunsfaktoren. Proteinkinase-C ist eine der größten Familien von Proteinkinaseenzyme und wird von einer Vielzahl von Isoformen zusammen. Konventionelle Isoformen umfassen eine, βḯ, βΠ, γ: neue Isoformen enthalten δ, ε, η, Θ; und atypische Isoformen enthalten ξ und ı/λ. PKC Enzyme kommen in erster Linie aber cytosolische Translokation an die Membran, wenn aktiviert. Im Zytoplasma wird PKC durch andere Kinasen oder autophosphoryliert phosphoryliert. Um aktiviert werden, einige PKC Isoformen (zum Beispiel, PKC-ε) benötigen ein Molekül auf Diacylglycerin („DAG“) Bindungsstelle oder Phosphatidylserin („PS“) Bindungsstelle zu binden.
Andere sind in der Lage, ohne sekundäre Bindungs Boten überhaupt aktiviert werden. PKC-Aktivatoren, die dem DAG Site binden, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Bryostatin, picologues, Phorbolester Aplysiatoxin und gnidimacrin beschränkt. PKC-Aktivatoren, die auf die PS-Stelle binden, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, mehrfach ungesättigte Fettsäuren und deren Derivate beschränkt. Es wird erwogen, dass jede der Proteinkinase C-Aktivator, der in der Lage ist, entweder allein oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen β-Zellreifunsfaktoren der Induktion der Differenzierung von mindestens einem Insulin-produzierenden, endokrinen Zelle oder Vorläufer davon in eine SC-β Zelle kann in den Verfahren, Zusammensetzungen und hierin beschriebenen Kits verwendet werden.
In manchen Ausführungsformen umfasst die PKC-Aktivator PDBU. In einigen Ausführungsformen umfasst die PKC-Aktivator TPB. In einigen Ausführungsformen umfasst die PKC-Aktivator cyclopropaniert mehrfach ungesättigten Fettsäuren, cyclopropaniert einfach ungesättigte Fettsäuren, cyclopropaniert fach ungesättigte Fettalkohole, cyclopropaniert einfach ungesättigte Fettalkohole, cyclopropaniert fach ungesättigten Fettsäureestern, cyclopropaniert Fettsäureester, cyclopropaniert polyungesättigten Fettsäuresulfate monoungesättigte, cyclopropaniert einfach ungesättigte Fettsäure Sulfate, cyclopropaniert mehrfach ungesättigten Fettsäuren Phosphate, cyclopropaniert einfach ungesättigte Fettsäure Phosphate, makrozyklische Laktone, DAG-Derivate, Isoprenoide, octylindolactam V, gnidimacrin, iripallidal, Ingenol,
napthalenesulfonamides, Diacylglycerin-Kinase-Inhibitoren, Fibroblasten-Wachstumsfaktor 18 (FGF-18), Insulinwachstumsfaktor, Hormone und Wachstumsfaktor-Aktivatoren, wie in WIPO Veröffentl. WO / 2013/071282 . In einigen Ausführungsformen umfasst das bryostain bryostatin- 1, Bryostatin-2, Bryostatin-3, Bryostatin-4, Bryostatin-5, Bryostatin-6, Bryostatin-7, Bryostatin-8, Bryostatin-9, bryostatin- 10, Bryostatin-1 1 bryostatin- 12 bryostatin- 13, Bryostatin-14, bryostatin- 15. bryostatin- 16, Bryostatin-17 oder bryostatin- 1 8. In bestimmten Ausführungsformen die hierin offenbarten Verfahren, Zusammensetzungen und Kits schließen eine Proteinkinase C-Aktivator.
y-Sekretase-Inhibitoren
Aspekte der Offenbarung beziehen sich auf die Verwendung von γ-Sekretase-Inhibitoren als β-Zellreifunsfaktoren. Es wird erwogen, dass jede γ-Sekretase-Inhibitor, der in der Lage ist, entweder allein oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen β-Zellreifunsfaktoren der Induktion der Differenzierung von mindestens einem Insulinproduzierenden, endokrinen Zelle oder Vorläufer davon in eine SC-β Zelle kann in den Verfahren, Zusammensetzungen und hierin beschriebenen Kits verwendet werden. Zahlreiche γ-Sekretase-Inhibitoren sind bekannt. In einigen Ausführungsformen umfasst das γ- Sekretase-Inhibitor XXI. In einigen Ausführungsformen umfasst die γ-Sekretase-Inhibitor DAPT. Weitere Ausführungs γ-Sekretase-Inhibitoren umfassen, ohne Einschränkung, in den US-Patenten der γ-Sekretase-Inhibitoren. Nr. 7049296 , 8481, 499, 8501, 813, und der WIPO Pub. WO / 2013/052700 . In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Verfahren, Zusammensetzungen und hierin offenbarten Kits schließen eine y-Sekretase-Inhibitor,
Schilddrüsenhormon Signalweg Aktivatoren
Aspekte der Offenbarung beziehen sich auf die Verwendung des Schilddrüsenhormons Signalweg Aktivatoren wie β-Zellreifunsfaktoren. Es wird erwogen, dass jede Thyroidhormon-Signalweg-Aktivator, der in der Lage ist, entweder allein oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen β-Zellreifunsfaktoren der Induktion der Differenzierung von mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläufer davon in eine SC-β Zelle kann in den Verfahren, Zusammensetzungen und hierin beschriebenen Kits verwendet werden. In bestimmten Ausführungsformen der hier beschriebenen Aspekt können die Verfahren, Zusammensetzungen und hierin offenbarten Kits schließen eine Thyroidhormon-Signalweg Aktivator. In bestimmten Ausführungsformen der hier beschriebenen Aspekt können die Verfahren, Zusammensetzungen und hierin offenbarten Kits auszuschließen T3 oder ein Analogon von T3 beschrieben.
In einigen Ausführungsformen das Schilddrüsenhormon-Signalweg Aktivator Trijodthyronin (T3). In einigen Ausführungsformen das Schilddrüsenhormon-Signalweg Aktivator ein Analogon oder Derivat von T3. Ausführungs Analoga T3 umfassen, sind aber nicht beschränkt auf selektive und nicht-selektive Thyromimetika, TPvß selektiver Agonist-GC 1, GC-24,4-Hydroxy-PCB 106, B0781 1 MB07344,3,5- diiodothyropropionic Säure (begrenzte DITPA); die selektive TR-β-Agonisten GC-1; 3-Iodothyronamine (T (l) AM) und 3,3', 5-triiodothyroacetic Säure (Triac) (bioaktiven Metaboliten des Hormon Thyroxin (T (4)); KB-21 und 15 KB- 141; Thyronamine; SKF L -94.901; DIBIT; 3 ‚-AC-T2; Tetrajodthyroessigsäure (Tetrac) und triiodothyroacetic Säure (Triac) (über oxidative Desaminierung und Decarboxylierung von Thyroxin [T4] und Trijodthyronin [T3] alanin-Kette), 3,3‘, 5' -triiodothyronine (rT3) (über T4 und T3 Dejodierung), 3,3'-Diiodthyronin (3,3 ‚-T2) und 3,5-Diiodthyronin (T2) (über T4, T3 und rT3 Dejodierung) und 3- iodothyronamine (T1 AM) und Thyronamine (T0AM) (über T4 und T3 Dejodierung und Aminosäure Decarboxylierung), wie auch für TH strukturelle Analoga wie 3,5,3‘- triiodothyropropionic Säure (Triprop), 3,5-Dibrom -3-pyridazinone- l -thyronine (L- 940.901), N- [3,5-dimethyl-4-(4'-hydroxy-3'-isopropylphenoxy) phenyl] -oxamidsäure (CGS 23425), 3,5 Dimethyl-4 - [(4'-hydroxy-3'-isopropylbenzyl) -phenoxy] essigsäure (GC 1), 3,5-Dichlor-4 - [(4-hydroxy-3-isopropylphenoxy) phenyl] essigsäure (KB- 141) und 3,5-diiodothyropropionic Säure (DITPA).
In einigen Ausführungsformen das Schilddrüsenhormon-Signalweg Aktivator ein Prodrug oder Prohormon von T3, wie T4-Schilddrüsenhormon (beispielsweise L-Thyroxin oder 3,5,3', 5'-Tetraiodthyronin).
In einigen Ausführungsformen ist das Thyroidhormon-Signalweg Aktivator ein im US-Patent Nr. 7, 163,91 8 beschrieben Jodthyronin Zusammensetzung.
Epidermal Growth Factor (EGF) Familie
Aspekte der Offenbarung beziehen sich auf die Verwendung von Wachstumsfaktoren aus der EGF-Familie, wie β-Zellreifunsfaktoren. Es wird erwogen, dass jede Wachstumsfaktor aus der EGF Familie, die in der Lage ist, entweder allein oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen β-Zellreifunsfaktoren der Induktion der Differenzierung von mindestens einem Insulin-produzierenden, endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon in ein SC -β-Zelle kann in den Verfahren, Zusammensetzungen und hierin beschriebenen Kits verwendet werden. In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF umfasst Betacellulin. In einigen Ausführungsformen zumindest eine Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF EGF umfasst. Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ist ein 53 Aminosäure-Zytokin, das proteolytisch von einem großen integralen Membranproteinvorläufer abgespalten wird, in einigen Ausführungsformen der Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF umfasst eine Variante EGF-Polypeptid, zB ein isoliertes epidermalen Wachstumsfaktor-Polypeptid mit mindestens 90% Aminosäureidentität mit dem menschlichen Wildtyp-EGF-Polypeptidsequenz, wie in US-Pat. No. 7.084.246 .
In einigen Ausführungsformen der Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF umfasst ein angelegtes EGF-Mutante, bindet und agonistisch den EGF-Rezeptor, wie im US-Patent offenbart ist. Nr 8,247,531 . In einigen Ausführungsformen ist der zumindest eine Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF mit einem Mittel, das einen Signalweg in der EGF-Familie aktiviert ersetzt. In einigen Ausführungsformen der Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF umfasst eine Verbindung, die EGF nachahmt. In bestimmten Ausführungsformen die hierin offenbarten Verfahren, Zusammensetzungen und Kits schließen eine Wachstumsfaktor aus der Familie der EGF.
Proteinkinase-Inhibitoren
Aspekte der Offenbarung beziehen sich auf die Verwendung von Protein-Kinase-Inhibitoren als β-Zellreifunsfaktoren. Es wird erwogen, dass jede Proteinkinase-Inhibitor, der in der Lage, entweder allein oder in Kombination mit anderen β ceil Reifungsfaktoren zur Induktion der Differenzierung von mindestens einem Insulin-produzierenden, endokrine ceil oder dessen Vorläufer in eine SC-β Aal! in den Verfahren, Zusammensetzungen und hierin beschriebenen Kits verwendet werden.
In einigen Ausführungsformen umfasst das Protein-Kinase-Inhibitor Staurosporin. In einigen Ausführungsformen umfasst das Protein-Kinase-Inhibitor ein Analogon von Staurosporin. Ausführungs Analoga von Staurosporin beinhalten, ohne Einschränkung, Ro-31- 8220, ein Bisindolylmaleimid (Bis) -Verbindung, I0'- {5 <fr> - [(methoxycarbonyl) amino] -2' <r> - methyl} -phenylaminocarbonylstaurosporine ein staralog (siehe zB Lopez el ah, „Staurosporin abgeleiteten Inhibitoren erweitern den Anwendungsbereich der Analogsensitive Kinase Technologie", J. Am. Ckern. Soc. 2013; 135 (48): 18.153 bis 18.159) und, CGP41251.
In einigen Ausführungsformen ist die Proteinkinase Inhibitor ein Inhibitor von PKCp. In einigen Ausführungsformen ist der Proteinkinase Inhibitor ein Inhibitor von <> PKCfi mit folgender Struktur oder einem Derivat, Analog oder eine Variante der Verbindung wie folgt:
In einigen Ausführungsformen der Inhibitor PKCp eine GSK-2-Verbindung mit der folgenden Struktur oder ein Derivat, Analog oder eine Variante der Verbindung wie folgt:
In einigen Ausführungsformen der Inhibitor von PKC ist ein Bisindolylmaleimid. Ausführungs Bisindolylmaleimiden umfassen, ohne Beschränkung, Bisindolylmaleimid I, Bisindolylmaleimid II Bisindolylmaleimid III, Hydrochlorid, oder einem Derivat, Analog oder eine Variante. In einigen Ausführungsformen kann ein Derivat oder eine Variante oder ein Analog davon ausgewählt ist aus einem Derivat oder einer Variante von Analogon einer Verbindung, ausgewählt aus den Verbindungen, ausgewählt aus:
In einigen Ausführungsformen ist der PKC-Inhibitor ein Pseudo oder ein Derivat, Analog oder eine Variante der Verbindung wie folgt:
In einigen Ausführungsformen ist der PKC-Inhibitor indorublin-3-motioxirae, 5-Iodo oder ein Derivat, Analog oder eine Variante der folgenden Verbindung:
In bestimmten Ausführungsformen schließen die Verfahren, Zusammensetzungen und hier offenbarten Kits einen Proteinkinase-Inhibitor aus.
Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) Inhibitor
Aspekte der Offenbarung beziehen sich auf die Verwendung der CFTR-Inhibitoren als β-Zellreifunsfaktoren. Es wird erwogen, dass jede CFTR-Inhibitor, der in der Lage ist, entweder allein oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen β-Zellreifunsfaktoren der Induktion der Differenzierung von mindestens einem Insulin-produzierenden, endokrinen Zelle oder Vorläufer davon in eine SC-β-Zelle in den Verfahren, Zusammensetzungen und hierin beschriebenen Kits verwendet werden.
Es sind zahlreiche CFTR Inhibitoren der hierin beschriebenen Verwendung sind für den Fachmann. Ausführungs CFTR-Inhibitoren beinhalten, ohne Einschränkung, LPA2 Rezeptoragonist Inhibitoren von CFTR in US Pub offenbart. No. 2007/00781 1 1, Hydrazid enthaltende CFTR-Inhibitoren in der US-Pat. No. 7888332 und CFTR-Hemmer in WIPO Pub offenbart. WO / 2008/121877 , ein CFTR-Inhibitor-Verbindung in US Pub offenbart. No. 2008/0269206 . In einigen Ausführungsformen umfasst das CFTR-Inhibitor ein Glycin Hydrazid Porenverschluß CFTR-Inhibitor. In einigen Ausführungsformen umfasst das CFTR-Inhibitor Gly-H O l l. In einigen Ausführungsformen umfasst das CFTR-Inhibitor Gly-H O l l Derivat oder Analogon (siehe zB Muanprasat et al., „Discovery of Glyciine Hydrazide Poren- Okklusionsbauteil CFTR Inhibitors", J. Gen. Physiol 2004; 124 (2): 125-137). In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Verfahren, Zusammensetzungen und hierin offenbarten Kits schließen eine CFTR-Inhibitor.
O-GlcNAcase Inhibitor
Aspekte der Offenbarung beziehen sich auf die Verwendung von O-GlcNAcase Inhibitoren als β-Zellreifunsfaktoren. Es wird erwogen, dass jede O-GlcNAcase Inhibitor, die fähig ist, entweder allein oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen β-Zellreifunsfaktoren zur Induktion der di fferentiation mindestens eines Insulinproduzierenden, endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon in einer SC- β-Zelle in den Verfahren, Zusammensetzungen und hierin beschriebenen Kits verwendet werden. Zahlreiche O-GlcNAcase Inhibitoren der hierin beschriebenen Verwendung sind für den Fachmann. Beispielhafte O-GlcNAcase Inhibitoren umfassen, ohne Einschränkung, durchlässigen Glycosidase-Inhibitoren (siehe zB WIPO Pub. WO / 2013/169576 und WO / 2013/166654 ) und selektive Glycosidaseinhibitoren (siehe zB WIPO Pub. Nein. WO / 2013/000084 und WO / 2013/000085 ). In einigen Ausführungsformen umfasst die O-GlcNAcase Inhibitor Thiamet G. In bestimmten Ausführungsformen sind die Verfahren, Zusammensetzungen und Kits, die hierin offenbart einen O-GlcNAcase Inhibitor auszuschließen.
Zusammensetzngen mit Beimischungen
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Mischung von Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufer davon, und mindestens ein β-Zellreifung Faktor, beispielsweise zur Induktion der Differenzierung von mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläufer davon an SC-ß-Zellen zu werden.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die Zusammensetzung, beispielsweise eine Reaktionsmischung, umfassend mindestens ein Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einen Vorläufer davon (beispielsweise eine Population von Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufern davon zur Differenzierung in SC-β Zellen) und mindestens ein β-Zellreifung Faktor. Alternativ betrifft die vorliegende Erfindung eine Reaktionsmischung, umfassend (i) eine Population von SC-β-Zellen durch chemische Induktion der Differenzierung einer Population von Insulin-positiven endokrinen Zellen oder deren Vorläufersubstanzen zu einer SC-β-Zelle hergestellt wird, und (ii) mindestens ein β-Zellreifung Faktor.
In einigen Ausführungsformen sind die Konzentrationen des mindestens einen β-Zellreifung Faktors zu dem Reaktionsgemisch zugegeben wird, eine ausreichende Dosis für die Induktion mindestens einen Insulin-positiven endokrinen Zellen oder deren Vorläufersubstanzen zu einer SC-β-Zelle zu differenzieren, wie hierin beschrieben.
In manchen Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung eine Konzentration an mindestens einem β-Zellreifung Faktor von etwa 25 nM bis 10 µM oder zwischen ungefähr 25 nm bis 50 nm oder etwa 50 nm bis 100 nm oder etwa 100 nM bis 200 nm oder etwa 200 nm bis etwa 500 nm oder etwa 500 nm bis etwa 1 µM oder etwa 1 bis 2 µM oder etwa 2 bis 5 µM oder etwa 5 bis 10 µM.
In einigen Ausführungsformen kann eine Zusammensetzung oder Mischung weist eine Konzentration von mindestens einem β-Zellreifung Faktor von mindestens etwa 5 nm, mindestens etwa 7 nm, wenigstens 10 nm, wenigstens 12 nm, wenigstens etwa 15 nM, mindestens etwa 17 nm, wenigstens 20 nm, wenigstens 25 nm von mindestens etwa 30 nM, mindestens etwa 35 nm, zumindest etwa 40 nM, mindestens etwa 45 nM, mindestens etwa 50 nM mindestens etwa 100 nM oder mindestens etwa 200 nm, noch mehr bevorzugt mindestens 300 nm oder mindestens etwa 400 nM oder mindestens etwa 500 nm oder mehr als 500 nm, oder jede beliebige ganze Zahl zwischen 10-500 nM oder jede ganze Zahl zwischen 5 -50 nM, oder jede beliebige ganze Zahl zwischen 50- 100 nm, oder jede beliebige ganze Zahl zwischen 100 nm-200 nm oder jede ganze Zahl zwischen 200 nm-500 nm. In einigen Ausführungsformen wird eine Zusammensetzung oder Mischung weist eine Konzentration von mindestens einem β-Zellreifung Faktor von mindestens etwa 0,1 µM oder mindestens etwa 0,2 µM oder mindestens etwa 0,3 µM oder mindestens etwa 0,4 µM oder mindestens etwa 0,5 µM oder mindestens etwa 1 µM, mindestens etwa 1 .5 µM, mindestens etwa 2 µM, mindestens etwa 2,5 µM, mindestens etwa 3 µM mindestens etwa 3,5 µM, mindestens etwa 4 µM zumin mindestens etwa 4,5 µM, mindestens etwa 5 µM mindestens etwa 6 µM, mindestens etwa 7 µM, mindestens etwa 8 µM, mindestens etwa 9 µM, oder zumindest etwa 10 µM, oder mehr als 10 µM oder irgendeine ganze Zahl zwischen 0,1 -0,5 µM oder eine ganze Zahl zwischen etwa 0,5-10 µM oder eine ganze Zahl zwischen 0,1 -10 µM, oder jede ganze Zahl zwischen 0,5-5 µM, oder jede ganze Zahl zwischen 5 µM- 10 µM.
Zusammensetzungen und Kits
Beschrieben sind Zusammensetzungen, die eine hierin beschriebene Zelle umfassen (zB eine SC-β-Zelle oder reife Pankreas-β-Zelle). In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung auch ein hier beschrieben und / oder Zellkulturmedien, β-Zellreifung Faktor. Hierin beschrieben sind auch Zusammensetzungen, die die hierin beschriebenen (zB Zellkulturmedien, die ein oder mehrere der hierin beschriebenen Verbindungen) Verbindungen. Hierin beschrieben sind Kits.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft zum Praktizieren hierin offenbarten Verfahren und für die Herstellung von SC-β-Zellen oder reife Pankreas-β-Zellen hierin offenbarten Kits. In einem Aspekt umfasst ein Bausatz mindestens eine Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon und mindestens ein β-Zellreifung Faktor, wie hierin beschrieben, und gegebenenfalls kann das Kit weitere Anweisungen zum Umwandeln mindestens einer insulin positive endokrinen Zellen umfassen oder Vorstufe davon auf eine Population von SC-β-Zellen unter Verwendung eines hierin beschriebenen Verfahrens. In einigen Ausführungsformen enthält der Kit wenigstens zwei β-Zellreifunsfaktoren. In einigen Ausführungsformen enthält der Kit wenigstens drei β-Zellreifunsfaktoren. In einigen Ausführungsformen enthält der Kit wenigstens vier β-Zellreifunsfaktoren. In einigen Ausführungsformen enthält der Kit wenigstens fünf β-Zellreifunsfaktoren. In einigen Ausführungsformen enthält der Kit wenigstens sechs β-Zellreifunsfaktoren. In einigen Ausführungsformen enthält der Kit wenigstens sieben β-Zellreifunsfaktoren.
In einigen Ausführungsformen umfasst der Kit mindestens acht β-Zellreifunsfaktoren. In einigen Ausführungsformen enthält der Kit wenigstens neun β-Zellreifunsfaktoren. In einigen Ausführungsformen enthält der Kit wenigstens zehn β-Zellreifunsfaktoren. In einigen Ausführungsformen umfasst das Kit β-Zellreifunsfaktoren zur Differenzierung von pluripotenten Zellen, endgültige Entodermzellen. In einigen Ausführungsformen umfasst das Kit β-Zellreifunsfaktoren zur Differenzierung definitiven Endoderms Zellen Urdarm Schlauchzellen. In einigen Ausführungsformen umfasst das Kit β-Zellreifunsfaktoren zur Differenzierung Urdarm Schlauchzellen zu -positiven Pankreas-Vorläuferzellen Pdxl. In einigen Ausführungsformen umfasst das Kit β-Zellreifunsfaktoren zur Differenzierung N X6-1 - positive Pankreas-Vorläuferzellen auf Insulin-positiven endokrinen Zellen. In einigen Ausführungsformen umfasst das Kit β-Zellreifunsfaktoren zur Differenzierung von Insulin-positiven endokrinen Zellen zu SC-β-Zellen.
In einigen Ausführungsformen umfasst das Kit eine beliebige Kombination von β-Zellreifunsfaktoren, beispielsweise für die Differenzierung pluripotenter Zellen, endgültige endodenn Zellen differen definitiven Endoderms Zellen Urdarm Schlauchzellen, differen Urdarm Schlauchzellen zu -positiven Pankreas-Vorläufer Pdxl Zellen differen NKX6- 1 - positiven Pankreas-Vorläuferzellen auf Insulin-positiven endokrinen Zellen und differenzierenden Insulin-positiven endokrinen Zellen zu SC-β-Zellen.
In einer Ausführungsform kann das Kit eine pluripotente Stammzelle für die Zwecke, die als positive Kontrolle verwendet werden, umfassen, zum Beispiel, zu beurteilen oder zu überwachen, die Wirksamkeit oder die Fähigkeit einer Verbindung der Formel (I) chemisch induzieren die pluripotenten Stammzellen Zelle, um in mindestens eine Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläufer davon in eine SC-β-Zelle zu differenzieren, und in der Folge. Dementsprechend kann das Kit eine ausreichende Menge von mindestens einem β-Zellreifung Faktor zum Induzieren der Differenzierung von einer Steuer pluripotenten Stammzellpopulation (Positivkontrolle) sowie die Induktion der Differenzierung von einer Population von pluripotenten Stammzellen von Interesse (zB die Benutzer umfassen bevorzugte pluripotente Stammzelle zB ein IPS-Zelle) in mindestens einen Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläufer davon oder in eine SC-β-Zelle.
In einigen Ausführungsformen kann die Verbindung in dem Kit in einem wasserdichten oder gasdichten Behälter, der in einigen Ausführungsformen im Wesentlichen frei von anderen Komponenten des Kits bereitgestellt werden. Die Verbindung kann in mehr als einem Behälter zugeführt werden, beispielsweise kann es in einem Behälter mit ausreichend Reagenz für eine vorbestimmte Anzahl von Reaktionen, zum Beispiel 1, 2, 3 oder größere Anzahl von getrennten Reaktionen pluripotente Stammzellen zur definitiven Endoderms induzieren geliefert werden Zellen, und anschließend in Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufern davon, und anschließend in SC-β-Zellen. Ein β-Zellreifung Faktor kann in jeder Form bereitgestellt werden, beispielsweise flüssige, getrocknet oder gefriergetrockneter Form. Es wird bevorzugt, dass eine Verbindung (e) (zB β-Zellreifunsfaktoren) beschriebenen im Wesentlichen reine und / oder steril sein. Wenn eine Verbindung (en), die hierin beschrieben ist, in einer flüssigen Lösung, vorzugsweise ist die flüssige Lösung eine wässerige Lösung mit einer sterilen wässrigen Lösung bevorzugt. Wenn eine Verbindung (en), die hier beschrieben wird als ein getrockneter Form bereitgestellt, in der Regel ist die Rekonstitution durch Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels.
Das Lösungsmittel, beispielsweise sterilem Wasser oder Puffer kann gegebenenfalls in dem Kit bereitgestellt werden.
In einigen Ausführungsformen kann das Kit weiterhin umfasst optional Informationsmaterial. Das Informationsmaterial können beschreibende, anweisend, Marketing oder anderes Material, das zu den hierin beschriebenen Verfahren und / oder die Verwendung einer Verbindung (en), die hier für die hierin beschriebenen Verfahren beschrieben, betrifft sein.
Das Informationsmaterial der Kits nicht in seiner Anweisung oder Informationsmaterial begrenzt. In einer Ausführungsform kann das Informationsmaterial Informationen über Herstellung der Verbindung gehören, das Molekulargewicht der Verbindung, die Konzentration, Verfallsdatum, Chargen- oder Produktionsstandort Informationen, und so weiter. In einer Ausführungsform bezieht sich die Informationsmaterialien, Verfahren zur Verabreichung der Verbindung. Zusätzlich wird die Informationsmaterial der Kits nicht in seiner Form beschränkt. In vielen Fällen wird das Informationsmaterial wie Instruktionen wird in Drucksachen, beispielsweise einer gedruckten Text, Zeichnung und / oder eine Fotografie, beispielsweise ein Etikett oder bedruckte Bogen versehen ist. Allerdings kann das Informationsmaterial auch in anderen Formaten, wie Blindenschrift, Computer-lesbaren Material, Video-Aufnahme, oder Audio-Aufnahme zur Verfügung gestellt.
In einer anderen Ausführungsform, die Informationsmaterial des Kits ist Kontaktinformationen, beispielsweise eine physikalische Adresse, Email-Adresse, Website oder Telefonnummer, wo ein Benutzer des Kits können inhaltliche Informationen zu einer Verbindung hierin beschrieben und / oder seine Verwendung in erhalten die hierin beschriebenen Verfahren. Natürlich kann die Informationsmaterialien auch in jeder beliebigen Kombination von Formaten zur Verfügung gestellt werden.
In einer Ausführungsform kann das Informationsmaterial Anweisungen umfassen, um eine Verbindung (en) (zB ein β-Zellreifung Faktor), wie hier in geeigneter Weise beschrieben auszuführen hierin beschriebenen Verfahren, beispielsweise in einer geeigneten Dosis zu verabreichen, Darreichungsform oder Art der Verabreichung (beispielsweise hier beschrieben eine Dosierung, die Dosierungsform, oder ein Modus der Verabreichung) (zum Beispiel um eine Zelle in vitro oder einer Zelle in vivo). In einer anderen Ausführungsform kann das Informationsmaterial Anweisungen, um eine Verbindung (en), die hier zu einem geeigneten Gegenstand, beispielsweise ein Mensch, zB ein menschlicher oder mit einem Risiko für eine hier oder an eine Zelle in vitro beschrieben Störung beschrieben verabreichen enthalten.
Neben der Verbindung (en), die hierin beschrieben wird, die Zusammensetzung des Kits können auch andere Komponenten, wie beispielsweise ein Lösungsmittel oder Puffer, ein Stabilisator, ein Konservierungsmittel, einen Geschmacksstoff (beispielsweise einem bitteren Antagonist oder Süßstoff) enthalten ein Duftstoff oder anderen kosmetischen Bestandteil und / oder ein zusätzliches Mittel, beispielsweise zur Induktion pluripotenten Stammzellen (beispielsweise in vitro) oder zur Behandlung eines Zustands oder einer Störung beschrieben. Alternativ können die anderen Bestandteile in dem Kit, jedoch in unterschiedlichen Zusammensetzungen oder Behälter als eine hier beschriebene Verbindung enthalten sein. In solchen Ausführungsformen kann das Kit Anweisungen für das Mischen einer Verbindung (en), die hierin beschrieben, und die anderen Bestandteile, oder für die Verwendung einer Verbindung (en), die hierin zusammen mit den anderen Bestandteilen beschrieben, beispielsweise Anweisungen, die Kombination der beiden Mittel vor der Verabreichung umfassen .
ein β-Zellreifung Faktor, wie hierin beschrieben kann in jeder Form bereitgestellt werden, beispielsweise flüssige, getrocknet oder gefriergetrockneter Form. Es wird bevorzugt, dass eine Verbindung (e) beschrieben werden im Wesentlichen reine und / oder steril sind.
Wenn eine Verbindung (en), die hierin beschrieben ist, in einer flüssigen Lösung, vorzugsweise ist die flüssige Lösung eine wässerige Lösung mit einer sterilen wässrigen Lösung bevorzugt. Wenn eine Verbindung (en), die hier beschrieben wird als ein getrockneter Form bereitgestellt, in der Regel ist die Rekonstitution durch Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels. Das Lösungsmittel, beispielsweise sterilem Wasser oder Puffer kann gegebenenfalls in dem Kit bereitgestellt werden.
Das Kit kann einen oder mehrere Behälter für die Zusammensetzung, die mindestens ein β-Zellreifung Faktor, wie hierin beschrieben umfassen. In einigen Ausführungsformen enthält der Kit getrennte Behälter (beispielsweise zwei getrennte Behälter für die beiden Agenten), Trennwände oder Fächer für die Zusammensetzung (en) und Informationsmaterial. Zum Beispiel kann die Zusammensetzung in einer Flasche, Phiole oder Spritze enthalten ist, und die Informationsmaterialien können in einer Kunststoffhülse oder Paket enthalten sein. In anderen Ausführungsformen sind die einzelnen Elemente des Kits in einem einzigen, ungeteilten Behälter enthalten. Beispielsweise wird die Zusammensetzung in einer Flasche, Fläschchen oder eine Spritze, die daran die Informationsmaterial in Form von einem Etikett versehen ist, enthalten ist. In einigen Ausführungsformen umfasst das Kit eine Mehrzahl (beispielsweise ein Satz) von einzelnen Behältern, die jeweils eine oder mehrere Einheitsdosierungsformen (zB ein hier beschriebenen Dosierungsform) einer hierin beschriebenen Verbindung. Beispielsweise umfasst der Kit eine Mehrzahl von Spritzen, Ampullen, Folienpackungen oder Blisterpackungen, die jeweils eine Einzeldosis eines hierin beschriebenen Verbindung.
Die Behälter der Kits können luftdicht, wasserdicht (zB undurchlässig für Feuchtigkeitsänderungen oder Verdampfung) und / oder lichtdicht sein.
Das Set enthält wahlweise eine Vorrichtung zur Verabreichung der Zusammensetzung geeignet ist, beispielsweise eine Spritze, Inhalationsmittel, Pipette, Zangen, Messlöffel, Tropfenzähler (zB Pipette), Tupfer (zB ein Wattestäbchen oder Holz Tupfer), oder eine solche Abgabevorrichtung. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Gerät ein medizinisches Implantat Einrichtung, beispielsweise für chirurgische Einsetzen verpackt.
Das Kit kann auch eine Komponente enthalten, für die Detektion eines Markers für die SC- β-Zellen, zum Beispiel für eine Markierung hierin beschrieben, beispielsweise ein Reagenz zur Detektion positiver SC- β-Zellen. Oder in einigen Ausführungsformen kann das Kit auch Reagenzien umfassen zum Nachweis negativer Marker der SC-β-Zellen zum Zweck der negativen Selektion von SC-β-Zellen oder zur Identifizierung von Zellen, die nicht diese negativen Marker exprimieren (beispielsweise SC- β-Zellen). Die Reagenzien können beispielsweise ein Antikörper gegen den Marker oder Primer für eine RT-PCR oder PCR-Reaktion, beispielsweise eine halbquantitative oder quantitative RT-PCR oder PCR-Reaktion. Solche Marker können verwendet werden, um zu beurteilen, ob eine iPS-Zellen erzeugt worden sein. Wenn das Nachweisreagenz ein Antikörper ist, kann es in Trockenpräparat z zugeführt werden, lyophilisiert oder in einer Lösung. Der Antikörper oder andere Nachweisreagenz an eine Markierung, beispielsweise einem radiologisch, fluoreszieren (GFP) oder kolorimetrischen Markierung für Verwendung beim Nachweis verknüpft werden. Wenn das Nachweisreagenz ein Primer ist, kann es in Trockenpräparat z zugeführt werden, lyophilisiert oder in einer Lösung.
Es kann wünschenswert sein, um eine Analyse des Karyotyps der SC-β-Zellen durchzuführen. Dementsprechend kann der Kit eine Komponente zur Karyotypisierung, beispielsweise eine Sonde, einen Farbstoff, ein Substrat, ein Enzym, einen Antikörper oder andere nützliche Reagenzien zur Herstellung eines Karyotyps einer Zelle umfassen.
Das Kit kann SC-β-Zellen, beispielsweise reife Pankreas-β-Zellen von der gleichen Art von Insulin-positiven endokrinen Zelle oder eines Vorläufers davon zur Verwendung als positive Kontrollzelltyp stammen, zum Beispiel enthalten.
Das Kit kann ebenfalls Informationsmaterial, zum Beispiel Anleitungen für die Verwendung von zwei oder mehr der Komponenten in dem Kit enthalten.
Das Informationsmaterial können beschreibende, anweisend, Marketing oder anderes Material, das zu den hierin beschriebenen Verfahren und / oder die Verwendung einer Verbindung (en), die hierin zum Differenzieren eines pluripotenten Stammzelle gemäß den hierin beschriebenen Verfahren beschrieben, betrifft sein. In einer Ausführungsform kann das Informationsmaterial Informationen über Herstellung der Verbindung gehören, das Molekulargewicht der Verbindung, die Konzentration, Verfallsdatum, Chargen- oder Produktionsstandort Informationen, und so weiter. In einer Ausführungsform bezieht sich die Informationsmaterialien, Verfahren zum Kultivieren einer Population von Insulin-positiven endokrinen Zellen in der Gegenwart von mindestens einem β-Zellreifung Faktor beschrieben.
Verfahren zur Verabreichung einer Zelle
In einer Ausführungsform sind die hier beschriebenen Zellen, zB eine Population von SC-β-Zellen sind transplantierbaren, beispielsweise eine Population von SC-β-Zellen können an ein Subjekt verabreicht werden. In einigen Ausführungsformen, das Subjekt, das eine Bevölkerung von SC-β-Zellen verabreicht wird, ist das gleiche Thema, von dem eine pluripotente Stammzelle verwendet werden, um in einen SC-β-Zelle differenziert wurde (zB für die autologe Zelltherapie) erhalten. In einigen Ausführungsformen ist der Patient ein anderes Thema. In einigen Ausführungsformen ein Subjekt an Diabetes leiden, wie zB Typ I Diabetes, oder ein normales Subjekt. Zum Beispiel können die Zellen für die Transplantation (zB eine Zusammensetzung, umfassend eine Population von SC-β-Zellen) eine Form für eine Transplantation geeignet, zum Beispiel einer Organtransplantation ist.
Das Verfahren kann ferner die Verabreichung der Zellen an einen Patienten, der dessen bedarf, beispielsweise einem Säuger, beispielsweise einem Menschen. Die Quelle der Zellen kann ein Säugetier, vorzugsweise ein Mensch sein. Die Quelle oder der Empfänger der Zellen kann auch ein nicht-menschliches Subjekt, beispielsweise ein Tiermodell.
Der Begriff „Säugetier“ umfasst Organismen, die Mäuse, Ratten, Kühe, Schafe, Schweine, Kaninchen, Ziegen, Pferde, Affen, Hunde, Katzen, und vorzugsweise Menschen gehören. Ebenso kann transplantierbaren Zellen aus jeder dieser Organismen, einschließlich eines nicht-menschlichen transgenen Organismus erhalten werden. In einer Ausführungsform werden die transplantierbaren Zellen gentechnisch verändert, beispielsweise die Zellen enthalten, die ein exogenes Gen oder wurden gentechnisch zu inaktivieren oder ein endogenes Gen zu verändern.
Eine Zusammensetzung, umfassend eine Population von SC-β-Zellen können einem Subjekt unter Verwendung einer implantierbaren Vorrichtung verabreicht werden. Implantierbare Geräte und zugehöriger Technologie sind in der Technik bekannt und sind als Abgabesysteme, bei denen ein kontinuierlicher oder zeitlich festgelegten Freisetzungs Lieferung von Verbindungen oder Zusammensetzungen hierin beschriebenen erwünscht ist. Darüber hinaus ist das implantierbare Gerät Abgabesystem nützlich für bestimmte Zielpunkte der Verbindung oder Zusammensetzung del ivery (zB lokalisierte Websites, Organe).. Negrin et al, Biomaterials, 22 (6): 563 (2001). Timed-Release-Technologie mit alternativen Versandmethoden können auch in dieser Erfindung verwendet werden. Beispielsweise kann timed-release-Formulierungen auf Basis von Polymertechnologien Retard-Techniken und Einkapselungsverfahren (zB polymeren liposomal) auch zur Abgabe der Verbindungen und Zusammensetzungen hierin beschriebenen verwendet werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine Bevölkerung von insulinproduzierenden, Glucose reagierenden Zellen
Bei der Verabreichung an ein Subjekt, eine Zellpopulation, die durch die Verfahren hergestellt, wie hierin beschrieben, zum Beispiel eine Population von SC-β-Zellen (durch Kontaktieren von mindestens einem Insulin-positiven endokrinen Zelle mit mindestens einer β-Zellreifung Faktor (beispielsweise einem, zwei, drei, vier, fünf oder mehr β-Zellreifunsfaktoren wie hierin beschrieben hergestellten) können an einen Patienten zum Beispiel in pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzungen verabreicht werden. Diese pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge einer Population von SC-β-Zellen wie oben beschrieben mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern (Additiven) und / oder Verdünnungsmittel beschrieben, zusammen formuliert.
Wie nachstehend ausführlich beschrieben, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung besonders für die Verabreichung in fester oder flüssiger Form, unter anderem für die folgenden geeignet formuliert werden: (1) orale Verabreichung, zum Beispiel Arzneitränke (wässrige oder nicht ige wässrige Lösungen oder Suspensionen), Pastillen, Dragees, Kapseln, Pillen, Tabletten (zB solche, die zur bukkalen, sublingualen, und systemische Absorption), Boli, Pulver, Granulate, Pasten zur Anwendung auf der Zunge ausgerichtet ist; (2) parenterale Verabreichung, zum Beispiel durch subkutane, intramuskuläre, intravenöse oder epidurale Injektion als zum Beispiel eine sterile Lösung oder Suspension oder Formulierung mit verzögerter Freisetzung; (3) topische Anwendung, zum Beispiel als Creme, Salbe oder einem Kontroll-LED-release Pflaster oder Spray auf die Haut aufgetragen; (4) intravaginal oder intrarektal, zum Beispiel als Pessar, Creme oder Schaum; (5) sublingual; (6) ocularly; (7) transdermal; (8) transmukosal; oder (9) nasal. Zusätzlich können Verbindungen, in einen Patienten implantiert werden oder unter Verwendung eines Arzneimittelabgabesystems injiziert.
Siehe zum Beispiel Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199-236 (1984); Lewis, Hrsg. „Controlled Release von Pestiziden und Pharma" (Plenum Press, New York, 1981); US-Patent Nr. 3,773,919 und U.S. Patent Nr. 35 3,270,960 .
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „pharmazeutisch annehmbar“ bezieht sich auf solche Verbindungen, Materialien, Zusammensetzungen und / oder Dosierungsformen Bezug zu nehmen, im Rahmen einer vernünftigen medizinischen Beurteilung zur Verwendung im Kontakt mit den Geweben von Menschen und Tieren ohne übermäßige Toxizität, Reizung, allergische Reaktion oder andere Probleme oder Komplikationen, mit einem vernünftigen Nutzen / Risikoverhältnis.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „pharmazeutisch verträglicher Träger“ bedeutet ein pharmazeutisch verträgliches Material, Zusammensetzung oder Träger wie einen flüssigen oder festen Füllstoff, Verdünnungsmittel, Exzipient, Hilfsmittel bei der Herstellung (beispielsweise Gleitmittel, Talkum Magnesium, Calcium oder Zinkstearat oder Stearinsäure) oder die lösungs Einkapselungsmaterial, bei der Durchführung oder dem Transport des Gegenstandsverbindung von einem Organ oder Teil des Körpers zu einem anderen Organ oder Teil des Körpers beteiligt ist. Jeder Träger muss „akzeptabel“ in dem Sinne, dass er mit den anderen Bestandteilen der Formulierung und nicht schädlich für den Patienten verträglich sein. Einige Beispiele von Materialien, die dazu dienen können als pharmazeutisch verträgliche Träger schließen ein: (1) Zucker wie Lactose, Glucose und Saccharose; (2) Stärken wie Maisstärke und Kartoffelstärke; (3) Cellulose und ihre Derivate, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, mikrokristalline Cellulose und Celluloseacetat; (4) Tragant-Pulver; (5), Malz; (6) Gelatine; (7) Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat und Talkum; (8) Exzipienten wie Kakaobutter und Zäpfchenwachse; (9) Öle wie Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Distel oi l, Sesamöl, Olivenöl, Maisöl und Sojabohnenöl; (10) Glykole wie Propylenglykol; (1: 1), Polyole, wie Glycerin, Sorbit, Mannit und Polyethylenglykol (PEG); (12) Ester wie Ethyloleat und Ethyllaurat; (13) Agar; (14) Puffermittel, wie Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid; (15) Alginsäure; (16) pyrogenfreies Wasser; (17) isotonische Kochsalzlösung; (18), Ringer-Lösung; (19) Ethylalkohol; (20) pH-gepufferten Lösungen; (21) Polyester, Polycarbonate und / oder Polyanhydride; (22) Füllstoffe, wie Polypeptide und Aminosäuren (23) Serumkomponente, wie zB Serumalbumin, HDL und LDL; (22), C2-Ci2alcohols, wie Ethanol; und (23) andere nicht-toxische kompatible Substanzen, die in pharmazeutischen Formulierungen eingesetzt.
Netzmittel, Färbemittel, Trennmittel, Überzugsmittel, Sßstoffe, Geschmacksstoffe, Duftstoffe, Konservierungsmittel und Antioxidantien können auch in der Formulierung vorhanden sein. Die Begriffe wie „Exzipient“, „Träger“, „pharmazeutisch verträglicher Träger“ oder dergleichen werden hier austauschbar verwendet.
Der Ausdruck „therapeutisch wirksame Menge“, wie hierin in Bezug auf eine Population von Zellen verwendet, bedeutet die Menge der relevanten Zellen in einer Population von Zellen, beispielsweise SC- β-Zellen oder reife Pankreas-β-Zellen oder Zusammensetzung, die SC- β-Zellen der vorliegenden Erfindung, die wirksam zur Erzeugung einer gewünschten therapeutischen Wirkung in mindestens einer Subpopulation von Zellen in einem Tier bei einem vernünftigen Nutzen / Risiko-Verhältnis, anwendbar auf jede medizinische Behandlung anwendbar ist. Zum Beispiel eine Menge an einer Population von SC-β-Zellen zu einem Subjekt, die ausreicht, um eine statistisch signifikante, messbare Änderung zumindest eines der Symptome von Typ-1 produzieren verabreicht, Typ 1, 5 oder Typ 2-Diabetes, wie glykosyliertes Hämoglobin Ebene, Nüchternblutzuckerspiegel, Hypoinsulinämie usw. Die Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Menge liegt innerhalb der Fähigkeit des Fachmanns auf dem Gebiet. Im Allgemeinen kann eine therapeutisch wirksame Menge mit der Geschichte, Alter, Zustand, Geschlecht sowie dem Schweregrad der Person und der Art der Erkrankung in der Betreffzeile und Verabreichung von anderen pharmazeutischen Wirkstoffen variieren.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „verabreichen“ bezieht sich auf die Platzierung einer Zusammensetzung zu einem Gegenstand durch ein Verfahren oder eine Route, die in zumindest teilweise die Lokalisierung der Zusammensetzung an einer gewünschten Stelle derart, dass gewünschte Wirkung erzeugt führt. Eine Verbindung oder Zusammensetzung, die hier beschrieben sind, können auf jedem geeigneten Weg im Stand der Technik bekannt sind, einschließlich verabreicht werden kann, aber nicht beschränkt auf, orale oder parenterale Wege, einschließlich intravenöse, intramuskuläre, subkutane, transdermale, Atemwegs (Aerosol), pulmonale, nasale, rektale begrenzt und topischen (einschließlich bukkalen und sublingualen) Verabreichung geeignet sind.
Ausführungsverabreichungsarten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Injektion, Infusion, Instillation, Inhalation oder Ingestion. „Injektion“ umfasst, ohne Beschränkung intravenöse, intramuskuläre, intraarterielle, intrathekale, intraventrikuläre, intrakapsuläre, intraorbitale, intrakardiale, intradermale, intraperitoneale, transtracheale, subkutane, subkutanen, intraartikulären, sub Kapsel, subarachnoide, intraspinale, intracerebro spinale und intrasternale Injektion und Infusion. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Zusammensetzungen durch eine intravenöse Infusion oder Injektion verabreicht.
Mit „Behandlung“, „Prävention“ oder „Linderung“ einer Erkrankung oder Störung bedeutet, Verzögerung oder Verhinderung des Ausbruchs einer solchen Krankheit oder Störung, Reversieren, Linderung, Besserung, Hemmung, eine Verlangsamung oder Verhinderung des Fortschreitens, Verschlimmerung oder eine Verschlechterung des Fortschreitens oder der Schwere des Zustandes mit einer solchen Erkrankung oder Störung, verbunden. In einer Ausführungsform werden die Symptome einer Krankheit oder Störung, die durch mindestens 5% verringert, mindestens 10%, mindestens 20%, mindestens 30%, mindestens 40% oder mindestens 50%.
Die Behandlung von Diabetes wird von medizinischen Standardverfahren bestimmt. Ein Ziel der Diabetes-Behandlung ist es, Zuckerspiegel auf so normal zu bringen, wie gefahrlos möglich ist. Häufig gesetzten Ziele sind 80- 120 Milligramm pro Deziliter (mg / dl) vor den Mahlzeiten und 100- 140 mg / dl vor dem Schlafengehen. Eine besondere Arzt kann unterschiedliche Ziele des Patents eingestellt, abhängig von anderen Faktoren, wie zum Beispiel, wie oft der Patient hat einen niedrigen Blutzuckerreaktionen. Nützliche medizinische Tests umfassen Tests auf Blut und Urin der Patienten Blutzuckerspiegel, um zu bestimmen, Tests für glykosyliertes Hämoglobin-Ebene (HbA in lokalen Währungen, ein Maß für die durchschnittliche Blutzuckerspiegel in den letzten 2-3 Monaten, wobei Normalbereich 4-6%), Tests für Cholesterin und Fett Ebenen und Tests für Urin-Protein-Ebene. Solche Tests sind Standard-Tests, die den Fachleuten in der Technik bekannt (siehe beispielsweise American Diabetes Association, 1998). Eine erfolgreiche Behandlung Programm kann auch durch weniger Patienten in das Programm mit Komplikationen im Zusammenhang mit Diabetes, wie zum Beispiel Erkrankungen des Auges, Nierenerkrankungen, oder Nervenerkrankungen bestimmt werden.
zur Verzögerung des Auftretens von Diabetes in einem Subjekt bezieht sich auf des Einsetzens von mindestens einem Symptom des Diabetes, zB, Hyperglykämie, Hypoinsulinämie, diabetische Retinopathie, diabetische Nephropathie, bl indness, Gedächtnisverlust, Nierenversagen, kardiovaskulären Erkrankungen (einschließlich koronarer verzögern Herzkrankheit, periphere arterielle Verschlusskrankheit, zerebrovaskuläre Erkrankungen, Arteriosklerose und Bluthochdruck), Neuropathie, autonome Dysfunktion, hyperglykämischen hyperosmolares Koma, oder Kombinationen davon, für mindestens 1 Woche, mindestens 2 Wochen, mindestens 1 Monat, mindestens 2 Monate, mindestens 6 Monate, mindestens 1 Jahr mindestens 2 Jahre, mindestens 5 Jahre, mindestens 10 Jahren, die mindestens 20 Jahre, seit mindestens 30 Jahren, mindestens 40 Jahre oder mehr, und kann die gesamte Lebensdauer des gehören Gegenstand.
In bestimmten Ausführungsformen ist der Patient ein Säugetier, beispielsweise einem Primaten, beispielsweise ein Mensch ist. Die Begriffe „Patient“ und „Betreff“ werden hier austauschbar verwendet. Vorzugsweise ist das Subjekt ein Säuger ist. Der Säuger kann ein Mensch, nicht-menschlichen Primaten, Maus, Ratte, Hund, Katze, Pferd oder Kuh sein, sind aber nicht auf diese Beispiele beschränkt. Außer Menschen Säugetiere können vorteilhaft als Themen, die Tiermodellen von Diabetes Typ 1, Typ 2 Diabetes Mellitus oder Pre-diabetischen Bedingungen stellen verwendet werden. Zusätzlich können die hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden, um domestizierte Tiere und / oder Haustieren zu behandeln. Ein Schlagwort kann männlich oder weiblich sein. Ein Schlagwort kann derjenige, der zuvor mit der Diagnose oder als leiden oder mit Diabetes (zB Typ 1 oder Typ 2), eine oder mehrere Komplikationen im Zusammenhang mit Diabetes, oder ein Pre-diabetischen Zustand bezogen, und wahlweise, aber nicht müssen identifiziert werden bereits Behandlung für den Diabetes, die eine oder mehrere Komplikationen im Zusammenhang mit Diabetes, oder Pre-diabetischen Zustand unterzogen.
Ein Thema kann auch derjenige, der nicht von Diabetes oder ein Pre-diabetischen Zustand leidet sein. Ein Thema kann auch derjenige, der mit diagnostiziert wurde oder als die an Diabetes leiden, eine oder mehrere Komplikationen im Zusammenhang mit Diabetes, oder ein Pre-diabetischen Zustand bezogen identifiziert werden, aber die Verbesserungen bei bekannten Diabetes-Risikofaktoren zeigen als Folge der Aufnahme eines oder mehrerer Behandlungen für Diabetes, eine oder mehrere Komplikationen im Zusammenhang mit Diabetes oder Pre-diabetischen Zustand. Alternativ kann ein Thema auch derjenige, der zuvor noch nicht als mit Diabetes, eine oder mehrere Komplikationen im Zusammenhang mit Diabetes, oder ein Pre-diabetischen Zustand diagnostiziert werden. So kann beispielsweise ein Gegenstand, der einen oder mehrere Risikofaktoren für Diabetes, Komplikationen im Zusammenhang mit Diabetes zeigt, oder ein Pre-diabetischen Zustand, oder ein Subjekt, das Diabetes-Risikofaktoren nicht aufweist, oder ein Thema, die asymptomatisch für Diabetes ist zu sein, eine oder mehrere Diabetes-Komplikationen oder ein Pre-diabetischen Zustand. Ein Thema kann auch derjenige, der aus oder mit dem Risiko der Entwicklung von Diabetes oder ein Pre-diabetischen Zustand leidet sein.
Ein Thema kann auch derjenige, der mit diagnostiziert wurde oder als mit einer oder mehreren Komplikationen im Zusammenhang mit Diabetes oder ein Pre-diabetischen Zustand, wie hierin definiert, oder alternativ kann ein Gegenstand, der nicht zuvor mit der Diagnose oder identifiziert werden identifiziert werden mit einer oder mehreren Komplikationen im Zusammenhang mit Diabetes oder einem prädiabetischen Zustand bezogen.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „behandlungsbedürftigen SC-β-Zellen“ bezieht sich auf einen Gegenstand, der mit diagnostiziert wird oder als leiden, mit oder mit einem Risiko für die Entwicklung von Diabetes (zB Typ 1, Typ 1,5 oder Typ identifiziert 2) ein oder mehrere Komplikationen von Diabetes, oder einem prädiabetischen Zustand bezogen.
Ein Subjekt, das einer Population von SC-β-Zellen können mit jedem für die Diagnose von Diabetes verwendeten Verfahren identifiziert werden. So kann beispielsweise Diabetes Typ 1 mit einem glykosylierten Hämoglobins (A 1 C) Test, eine zufällige Blutzuckermessung und / oder eine Nüchtern-Blutzucker-Test diagnostiziert werden. Parameter für die Diagnose von Diabetes sind in der Technik bekannt und verfügbar Fachleuten ohne viel Aufwand.
In einigen Ausführungsformen können die Verfahren der Erfindung umfassen ferner die Auswahl eines Probanden als in der Notwendigkeit zusätzlicher SC-β-Zellen identifiziert. Ein Subjekt mit Bedarf einer Bevölkerung von SC-β-Zellen können auf der Grundlage der vorhandenen Symptome wie Symptome der Typ 1, Typ 1, 5 oder Diabetes Typ 2 gewählt werden. Beispielhafte Symptome von Diabetes umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, übermäßiger Durst (Polydipsie), häufigem Wasserlassen (Polyurie), extremen Hunger (Polyphagie), extreme Müdigkeit, Gewichtsverlust, Hyperglykämie, niedriger Insulinspiegel, hoher Blutzucker (zB Zucker beschränkt Spiegel über 250 mg, mehr als 300 mg), die Anwesenheit von im Urin, Müdigkeit, Gegenwart Ketone trockenen und / oder juckende Haut, Sehstörungen, langsame Heilung Schnitte oder Wunden, mehr Infektionen als sonst, Taubheit und Kribbeln in den Füßen, diabetische Retinopathie, diabetische Nephropathie, Erblindung, Verlust des Gedächtnisses, Nierenversagen, Herz-Kreislauferkrankungen (einschließlich koronarer Herzerkrankung, periphere Arterienerkrankung, zerebrovaskuläre Erkrankung, Atherosklerose und Bluthochdruck), Neuropathie, autonome Dysfunktion, Hyperglykämie hyperosmolaren Koma, und Kombinationen davon.
In einigen Ausführungsformen kann eine Zusammensetzung, die eine Population von SC-β-Zellen für die Verabreichung an ein Subjekt kann ferner einen pharmazeutisch aktiven Wirkstoff, wie beispielsweise solche Mittel, die in der Technik für die Behandlung von Diabetes und oder mit anti- hyperglykämische Aktivitäten bekannt zum Beispiel Inhibitoren der Dipeptidyl-Peptidase 4 (DPP-4) (zB Alogliptin, Linagliptin, Saxagliptin, Sitagliptin, Vildagliptin und Berberin), Biguanide (zB Metformin, Buformin und Phenformin), Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor (PPAR) Modulatoren wie Thiazolidindione (TZD) (beispielsweise Pioglitazon, Rivoglitazone, Rosiglitazon und Troglitazon), dual PPAR-Agonisten (zB Aleglitazar, muraglitazar und Tesaglitazar), Sulfonylharnstoffen (zB Acetohexamid, Carbutamid, Chlorpropamid, Gliclazid, Tolbutamid, Tolazamid, Glibenclamid (Glibenclamid), Glipizide, Gliquidone, Glyclopyramide und Glimepirid), Meglitinide („Glinide“) (zB, Nateglinide, Repaglinide und Mitiglinide), Glucagon-like Peptid-1 (GLP-1) und Analoga (beispielsweise Exendin-4, Exenatide , Liraglutid, Albiglutide), Insulin und Insulinanaloga (zB Insulin lispro, Insulinaspart, Insluin glulisine, Insulin glargin, Insulindetemir, Exubera und NPH-Insulin), alpha-Glucosidase-Inhibitoren (zB Acarbose, Miglitol und Voglibose), Amylin-Analoga (z.B Pramlintide), Sodium abhängigen Glucose-Cotransporter T2 (SGLT T2) Inhibitoren (zB Dapgliflozin, Remogliflozin und Sergliflozin) und andere (zB Benfluorex und Tolrestat).
Bei Typ 1 Diabetikern, sind β-Zellen in unerwünschter Weise durch die anhaltende Autoimmunreaktion zerstört. Somit kann diese Autoimmunreaktion durch die Verwendung von Verbindungen, die Hemmung oder einen solchen Autoimmunantwort zu blockieren gedämpft werden. In einigen Ausführungsformen kann eine Zusammensetzung, die eine Population von SC-β-Zellen für die Verabreichung an ein Subjekt ferner ein pharmazeutisch aktives Mittel, das ein Immunreaktion-Modulator. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „Immunantwort Modulator“ bezieht sich auf die Verbindung (beispielsweise ein niedermolekularer, ein Antikörper, ein Peptid, eine Nukleinsäure oder Gentherapie-Reagenz), die Autoimmunantwort in einem Subjekt inhibiert. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, eine Immunantwort Modulator inhibiert die Autoimmunantwort durch Hemmung der Aktivität, die Aktivierung oder die Expression von inflammatorischen Cytokinen (zB IL-12, IL-23 oder IL-27) oder STAT-4. Ausführungsimmunantwort Modulatoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Mitglieder der Gruppe bestehend aus Lisofylline (LSF), und die LSF-Analoga und Derivate in der US-Pat. No. 6,774 , 130 , deren Inhalt hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen.
Eine Zusammensetzung, die SC-β-Zellen, um den Gegenstand in der gleichen Zeit wie die Verabreichung eines pharmazeutisch aktiven Mittels oder einer Zusammensetzung, umfassend die administriert werden, von verschiedenen Zeiten. Wenn sie zu verschiedenen Zeiten verabreicht, können die Zusammensetzungen, die eine Population von SC-β-Zellen und / oder pharmazeutischen Wirkstoff zur Verabreichung an einen Patienten innerhalb von 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten, 60 Minuten, 2 Stunden, 3 Stunden, 4 verabreicht werden , Stunden, 8 Stunden, 12 Stunden, 24 Stunden nach der Verabreichung des anderen. Wenn eine Zusammensetzung, umfassend eine Population von SC-β-Zellen und einer Zusammensetzung, die einen pharmazeutischen Wirkstoff in verschiedenen pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, können Verabreichungswege verschieden sein. In einigen Ausführungsformen wird ein Gegenstand eine Zusammensetzung, die SC-β-Zellen verabreicht. In anderen Ausführungsformen wird ein Subjekt eine Zusammensetzung, umfassend ein pharmazeutisch aktives Mittel verabreicht, in einer anderen Ausführungsform ein Subjekt ein Zusammensetzungen, umfassend eine Population von SC-β-Zellen mit einem pharmazeutisch aktiven Mittel vermischt verabreicht. In einer anderen Ausführungsform wird ein Gegenstand eine Zusammensetzung, umfassend eine Population von SC-β-Zellen und eine Zusammensetzung, die einen pharmazeutischen Wirkstoff, wobei die Verabreichung im Wesentlichen gleichzeitig oder nach einander verabreicht werden.
Die Toxizität und therapeutische Wirksamkeit der Verabreichung eines Zusammensetzungen, umfassend eine Population von SC-β-Zellen können durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren, zum Beispiel bestimmt werden, zur Bestimmung der LD50 (die Dosis letal zu 50% der Bevölkerung) und der ED 50 (der therapeutisch wirksamen Dosis bei 50% der Bevölkerung). Zusammensetzungen, umfassend eine Population von SC-β-Zellen, die große therapeutische Indizes aufweisen, sind bevorzugt.
Die Menge einer Zusammensetzung, umfassend eine Population von SC-B-Zellen können unter Verwendung von mehreren etablierten Tiermodellen getestet werden.
Die nicht-übergewichtige diabetische (NOD) Maus trägt einen genetischen Defekt in Insulitis Ergebnisse zeigen an mehreren Wochen alt (Yoshida et al., Rev. Immunogenet. 2: 140, 2000). 60-90% der Frauen entwickeln manifester Diabetes um 20-30 Wochen. Die immun verwandten Pathologie scheint ähnlich den bei menschlicher Typ-I-Diabetes ist. Andere Modelle von Typ I-Diabetes sind Mäuse mit Transgen und Knockout-Mutationen (Wong et al., Immunol. Rev. 169: 93, 1999). Ein Rattenmodell für spontane Diabetes Typ I wurde kürzlich von Lenzen et al. (Diabetologia 44: 1 1 89, 2001). Hyperglykämie kann auch bei Mäusen (> 500 mg Glucose / dl) durch eine einzelne intraperitoneale Injektion von Streptozotocin induziert werden (Soria et al, Diabetes. 49: 1 57, 2000), oder durch sequenzielle niedrigen Dosen von Streptozotocin (Ito et al., Environ. Toxicol. Pharmacol. 9:71, 2001). Um die Wirksamkeit der implantierten Inselzellen zu testen, werden die Mäuse für die Rückkehr von Glucose auf ein normales Niveau überwacht (<200 mg / dl).
Größere Tiere bieten ein gutes Modell für die im Anschluss an die Folgeerscheinungen von chronischen Hyperglykämie. Hunde können insulinabhängig gemacht werden durch Entfernen der Bauchspeicheldrüse (J. Endocrinol. 158: 49, 2001), oder durch die Fütterung Galactose (Kador et al, Arch.. Opthalmol. 1 13: 352, 1995). Es gibt auch eine vererbte Modell für Typ I-Diabetes in keeshond Hunde (Am. J. Pathol. 105: 194, 1981). Frühe Arbeiten mit einem Hund-Modell (Banting et al, Can. Med. Assoc. J. 22: 141, 1922) führte zu ein paar Kanadier machen eine lange Seereise nach Stockholm im Februar 1925.
Zur Veranschaulichung, eine Pilotstudie kann durch Implantieren einer Bevölkerung von SC-β-Zellen in den folgenden Tieren durchgeführt werden: a) nicht-diabetischen Nackt (T-Zell-defizienten) Mäusen; b) Nacktmäusen gerendert diabetischen durch Streptozotocin-Behandlung; und c) Nacktmäusen in den Prozess der Regenerierung Inselchen folgende partielle Pankreatektomie. Die Anzahl der Zellen transplantiert ist äquivalent zu ~ 1000-2000 normalen menschlichen β-Zellen unter die Nierenkapsel implantiert werden, in der Leber oder in der Bauchspeicheldrüse. Für nicht-diabetischen Mäusen, können die Endpunkte der Beurteilung des Überlebens des Transplantats (histologische Untersuchung) und die Bestimmung der Insulinproduktion durch die biochemische Analyse, RIA, ELISA und Immunhistochemie. Streptozotocin behandelt und teilweise pancreatectomized Tiere können auch für das Überleben, metabolische Kontrolle (Blutzucker) und Gewichtszunahme zu bewerten.
In einigen Ausführungsformen werden Daten aus den Zellkulturassays und Tierstudien erhalten werden, können bei der Formulierung eines Dosierungsbereichs zur Verwendung beim Menschen verwendet werden. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von zirkulierenden Konzentrationen, die die ED 50 mit wenig oder keiner Toxizität einschließen. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs je nach der eingesetzten Dosierungsform und dem verwendeten Verabreichungsweg variieren.
Die therapeutisch wirksame Dosis einer Zusammensetzung, die eine Population von SC-β-Zellen können auch zunächst aus Zellkulturassays abgeschätzt werden. Eine Dosis kann in Tiermodellen in vivo formuliert werden, um eine Sekretion von Insulin bei einer Konzentration, die geeignet in Abhängigkeit von zirkulierenden Glukose im Plasma zu erzielen. Alternativ können die Wirkungen einer bestimmten Dosierung in einem geeigneten Bioassay überwacht werden.
In Bezug auf die Dauer und Häufigkeit der Behandlung ist es typisch für qualifizierte Ärzte, Themen, um zu bestimmen, wenn die Behandlung ist die Bereitstellung therapeutischer Nutzen zu überwachen und zu bestimmen, ob zu erhöhen oder verringern Dosierung, steigen oder fallen Verabreichungshäufigkeit, einzustellen Behandlung fortsetzen Behandlung oder sonstige Veränderung Behandlungsschema. Die Dosierung kann von einmal wöchentlich, täglich in Abhängigkeit von einer Anzahl von klinischen Faktoren, wie der Empfindlichkeit des Subjekts an die Polypeptide variieren. Die gewünschte Dosis kann auf einmal verabreicht werden, oder in Teildosen, beispielsweise geteilt, 2-4 Teildosen und über einen bestimmten Zeitraum, beispielsweise verabreicht wird, die in geeigneten Intervallen über den Tag oder anderen geeigneten Zeitplan. Solche Unterdosen können als Einheitsdosierungsformen verabreicht werden. In einigen Ausführungsformen ist die Verabreichung chronisch, beispielsweise einer oder mehreren Dosen täglich über einen Zeitraum von Wochen oder Monaten. Beispiele für Dosierungsschemata sind Verwaltung täglich, zweimal täglich, dreimal täglich oder vier oder mehrmals täglich über einen Zeitraum von 1 Woche, 2 Wochen, 3 Wochen, 4 Wochen, 1 Monat, 2 Monate, 3 Monate, 4 Monate, 5 Monate oder 6 Monate oder mehr.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung stellen die Methoden Verwendung einer isolierten Population von SC-β-Zellen, wie hierin offenbart. In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine isolierte Population von SC-β-Zellen, wie hierin offenbart sind können zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung in Fächern in der Notwendigkeit der Behandlung verwendet werden, für die Verwendung bei der Transplantation, zum Beispiel ein Thema, das hat oder das Risiko der Entwicklung von Diabetes, zum Beispiel aber nicht beschränkt auf Patienten mit angeborenen und erworbenen Diabetes beschränkt. In einer Ausführungsform kann eine isolierte Population von SC-β-Zellen genetisch modifiziert werden. In einem anderen Aspekt kann der Gegenstand haben oder bei Gefahr von Diabetes und / oder Stoffwechselstörungen. In einigen Ausführungsformen kann eine isolierte Population von SC-β-Zellen, wie hierin offenbart autolog und / oder allogen sein. In einigen Ausführungsformen ist der Patient ein Säugetier, und in anderen Ausführungsformen ist das Säugetier ein Mensch ist.
Die Verwendung einer isolierten Population von SC-β-Zellen, wie hierin beschrieben stellt Vorteile gegenüber bestehenden Verfahren, da die Population von SC-β-Zellen können aus Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufer davon aus Stammzellen, beispielsweise abgeleitet unterschieden iPS-Zellen erhalten oder aus dem Patienten verabreicht wird eine isolierte Population von SC-β-Zellen geerntet.
Dies ist äußerst vorteilhaft, da es eine erneuerbare Quelle von SC-β-Zellen mit aus Stammzellen zu Insulin-positiven endokrinen Zellen durch sie üblicherweise von einem Fachmann auf dem Gebiet bekannte Verfahren unterschieden werden, und dann weiter durch die hierin beschriebenen Methoden unterschieden pankreatische β-ähnlichen Zellen oder Zellen, die mit Pankreas-β-Zelle Merkmalen, die zur Transplantation in einen Patienten, insbesondere eines im Wesentlichen reinen Population von reifen pankreatischen β-ähnliche Zellen, die die Risiken und Einschränkungen von Zellen aus anderen Systemen abgeleitet haben.
In einer anderen Ausführungsform wird eine isolierte Population von SC-β-Zellen (zB reife Pankreas-β-Zellen oder β-ähnliche Zellen können als Modelle zum Studium Eigenschaften für die Differenzierung in Insulin-produzierende Zellen, beispielsweise pankreatische β-Zellen verwendet werden, oder pankreatischen β-ähnlichen Zellen, oder Wege der Entwicklung von Zellen, Endoderm Ursprungs in pankreatischen β-Zellen.
In einigen Ausführungsformen kann die Insulin-positiven endokrinen Zellen oder SC-β-Zellen können gentechnisch so manipuliert Marker operativ an Promotoren, die exprimiert werden, wenn ein Marker exprimiert oder sezerniert wird, kann beispielsweise ein Marker operativ verknüpft werden verknüpft umfassen kann ein Insulinpromotor, so dass der Marker exprimiert wird, wenn die Insulin-positiven endokrinen Zellen oder deren Vorläufersubstanzen eine Differenzierung in SC-β-Zellen, die Expression und Sekretion von Insulin. In einigen Ausführungsformen kann eine Population von SC-β-Zellen als Modell für die Untersuchung der Differenzierungsweg von Zellen, die in β-Inselzellen oder Bauchspeicheldrüsen β-ähnliche Zellen differenziert werden.
In anderen Ausführungsformen werden die Insulin produzierenden, Glucose ansprechenden Zellen können als Modell für die Untersuchung der Rolle von Insel β-Zellen in der Bauchspeicheldrüse und in der Entwicklung von Diabetes und Stoffwechselstörungen eingesetzt werden. In einigen Ausführungsformen können die SC-β-Zellen von einem normalen Subjekt oder von einem Gegenstand, die eine Mutation und / oder eines Polymorphismus trägt (zB in dem Gen Pdx 1, die früh einsetzende insulinabhängiger Diabetes mellitus (NIDDM) führt zu sein, sowie Mody Typ 4 (MODY4), die verwendet werden können, um kleine Moleküle und andere therapeutische Mittel, die verwendet werden können, um Patienten mit Diabetes mit einer Mutation oder eines Polymorphismus in Pdxl Behandlung zu identifizieren. In einigen Ausführungsformen kann die SC-β-Zellen gentechnisch verändert, um den Polymorphismus in dem Gen Pdxl bevor sie an einen Patienten zur therapeutischen Behandlung eines Patienten mit Diabetes verabreicht korrigieren. In einigen Ausführungsformen kann die SC-β cel ls gentechnisch verändert, um eine Mutation und / oder eines Polymorphismus tragen.
In einer Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Diabetes oder einer Stoffwechselstörung in einem Subjekt, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, umfassend eine Population von SC-β-Zellen, wie hierin an einen Patienten mit Diabetes und / oder offen eine Stoffwechselstörung. In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Diabetes, umfassend das Verabreichen einer Zusammensetzung, umfassend eine Population von SC-β-Zellen, wie sie hier zu einem Subjekt, hat offenbart oder ist das Risiko der Entwicklung von Diabetes in einer wirksamen Menge, die ausreicht zur Bildung von Insulin erhöhte in Reaktion auf einen erhöhten Blutzuckerspiegel.
In einer Ausführungsform der obigen Verfahren ist das Subjekt ein Mensch ist und eine Population von SC-β-Zellen, wie hierin offenbart menschliche Zellen sind. In einigen Ausführungsformen berücksichtigt die Erfindung, dass eine Population von SC-β-Zellen, wie sie hierin offenbart sind, direkt an die Bauchspeicheldrüse eines Patienten verabreicht wird, oder systemisch verabreicht wird. In einigen Ausführungsformen, eine Bevölkerung von SC-β-Zellen, wie hierin offenbart kann an jeder geeigneten Stelle im Probanden in einer Kapsel in das Blutgefäß oder in der Leber oder einem anderen geeigneten Ort, wo verabreicht die Population von SC-β-Zellen verabreicht werden, beispielsweise kann Insulin in Reaktion auf einen erhöhten Blutzuckerspiegel in dem Subjekt zu sezernieren.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit Diabetes oder einer Stoffwechselstörung, die als Folge des genetischen Defekt, Verletzung, Umwelt Beleidigung oder Anlage, schlechte Gesundheit, Fettleibigkeit und andere Diabetes-Risikofaktoren allgemein bekannt auftritt gerichtet durch einen Fachmann auf dem Gebiet. Wirksamkeit der Behandlung eines Patienten eine Zusammensetzung verabreicht, umfassend eine Population von SC-β-Zellen durch klinisch akzeptierten Kriterien und Tests, die beispielsweise (i) glykiertem Hämoglobin umfassen überwacht werden (A1 C) Test, der Fächer durchschnittlichen Blut anzeigt Zuckerspiegel in den letzten zwei bis drei Monate, durch Messen des Prozentsatzes der Blutzuckerspiegel an Hämoglobin, der Sauerstoff-Transportprotein in den roten Blutkörperchen gebunden. Die höheren Blutzuckerspiegel, desto mehr Hämoglobin Zucker beigefügt. Ein A1 C-Ebene von 6,5 Prozent oder höher auf zwei getrennten Tests zeigt, das Thema hat Diabetes. Ein Test-Wert von 6 bis 6,5% vorschlagen, das Thema hat Prädiabetes, (ii) Zufall Blutzuckertest.
Eine Blutprobe wil l von dem Subjekt zu einem zufälligen Zeitpunkt genommen werden, und eine zufällige Blutzuckerspiegel von 200 Milligramm pro Deziliter (mg / dL) -1 1 0,1 Millimol pro Liter (mmol /1), oder höher angegeben das Thema Diabetes hat, (iii) Nüchternblutzucker-Test. Eine Blutprobe wird von dem Subjekt nach nächtlichem Fasten gemacht. Ein Nüchternblutzuckerwert zwischen 70 und 99 mg / dL (3,9 und 5,5 mmol /1) ist normal. Wenn die Probanden Nüchtern-Blutzuckerspiegel ist 126 mg / dL (7 mmol /1) oder höher auf zwei separaten Tests, hat das Thema Diabetes. Ein Blutzuckerspiegel von 100 bis 125 mg / dl (5,6-6,9 mmol /l) zeigt das Subjekt Prädiabetes, (iv) oraler Glukosetoleranztest. Eine Blutprobe wird nach dem Thema genommen werden seit mindestens acht Stunden oder über Nacht fasten und dann verschluckt einen zuckerhaltigen Lösung und der Blutzuckerspiegel wird zwei Stunden später gemessen werden. Ein Blutzuckerspiegel unter 140 mg / dL (7,8 mmol /1) ist normal. Ein Blutzuckerspiegel von 140 bis 199 mg / dL (7,8 bis 1 1 mmol / L) wird als Prädiabetes.
Dies wird manchmal als gestörter Glukosetoleranz (IGT) bezeichnet. Ein Blutzuckerspiegel von 200 mg / dL (1 1 .1 mmol / L) oder höher kann angeben Diabetes.
In einigen Ausführungsformen werden die Wirkungen der Verabreichung von einer Population von SC- β-Zellen, wie hierin auf einen Patienten, der dessen bedarf, mit einer verbesserten Belastbarkeit oder andere Lebensqualitätswerte zugeordnet bart und verminderte Mortalität. Die Wirkungen der Zelltherapie mit einer Bevölkerung von SC-β-Zellen im Verlauf von Tagen bis Wochen nach der Behandlung offensichtlich. Jedoch können vorteilhafte Wirkungen bereits einige Stunden nach der Behandlung beobachtet werden und können mehrere Jahre andauern. Bei einigen Ausführungsformen, die Wirkungen der Zelltherapie mit einer Bevölkerung von SC-β-Zellen tritt innerhalb von zwei Wochen nach dem Verfahren.
In einigen Ausführungsformen kann eine Population von SC-β-Zellen, wie hierin offenbart für die Gewebewiederherstellung oder Regenerierung in einem menschlichen Patienten oder einem anderen Gegenstand, der einer solchen Behandlung verwendet werden. In einigen Ausführungsformen Zusammensetzungen der Populationen von SC-β-Zellen in einer Weise, dass sie zu pfropfen oder wandern zur beabsichtigten Gewebestelle und wiederherzustellen oder zu regenerieren die funktionell defizienten Bereich ermöglicht, verabreicht werden. Spezielle Geräte zur Verfügung, die für die Verwaltung von Zellen, die Wiederherstellung einer Bevölkerung von β-Zellen in der Bauchspeicheldrüse oder an einem anderen gewünschten Ort angepasst sind. Dementsprechend kann der SC-β-Zellen zu einem Empfänger Bauchspeicheldrüse durch Injektion verabreicht werden, oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht.
In einigen Ausführungsformen Zusammensetzungen, umfassend eine Population von SC-β-Zellen, wie hierin offenbart eine Vielzahl von Anwendungen in der klinischen Therapie, Forschung, Entwicklung und kommerzielle Zwecke. Für therapeutische Zwecke, zum Beispiel kann eine Population von SC-β-Zellen, wie hierin beschrieben verabreicht werden, um die Insulinproduktion in Reaktion zu verbessern, um Glucosekonzentration im Blut für jede erkannte Notwendigkeit zu erhöhen, wie beispielsweise eine angeborene Störung der Stoffwechselfunktion, die Wirkung eines Krankheitszustand (zB Diabetes), oder das Ergebnis einer erheblichen Trauma (dh Schäden an der Bauchspeicheldrüse oder Verlust oder Beschädigung von β Inselzellen). In einigen Ausführungsformen sind eine Population von SC-β-Zellen, wie hierin offenbart, um dem Subjekt verabreicht nicht nur zur Wiederherstellung der Funktion zu Beschädigungen oder sonstigen ungesunde Gewebe, aber auch Umgestaltung der beschädigten Gewebe zu erleichtern.
Um die Eignung der Zellzusammensetzungen für die therapeutische Verabreichung zu bestimmen, kann die Population von SC-β-Zellen zunächst in einem geeigneten Tiermodell getestet werden. Auf einer Ebene werden die Zellen auf ihre Fähigkeit, zu überleben und ihren Phänotyp in vivo aufrechtzuerhalten beurteilt. Zellzusammensetzungen enthaltend SC-β-Zellen zu immundefizienten Tieren verabreicht werden (zB Nacktmäuse oder Tieren gemacht immundefizienten chemisch oder durch Bestrahlung). Gewebe nach einem Zeitraum von Nachwachsen geerntet und, ob die verabreichten Zellen oder Nachkommen davon sind noch vorhanden beurteilt.
Dies kann durch die Verabreichung von Zellen, die eine nachweisbare Markierung (beispielsweise grün fluoreszierendes Protein oder β-Galaktosidase) exprimieren durchgeführt werden; sie (zum Beispiel mit BrdU oder [3H] Thymidin) oder durch nachfolgende Detektion eines konstitutiven Zellmarker (beispielsweise unter Verwendung von human-spezifischen Antikörper) vormarkiert sind. Das Vorhandensein und Phänotyp der verabreichten Population von SC-β-Zellen durch Immunhistochemie oder ELISA untersucht unter Verwendung von human-spezifischen Antikörper, oder durch RT-PCR-Analyse unter Verwendung von Primern und Hybridisierungsbedingungen, die bewirken, Amplifikation spezifisch für Mensch zu sein
Polynukleotide nach den veröffentlichten Sequenzdaten.
Eine Reihe von Tiermodellen zur Prüfung von Diabetes sind für solche Tests zur Verfügung und sind in der Technik allgemein bekannt, beispielsweise wie in US-Pat. No. 6, 187.991 , die hier durch Bezugnahme aufgenommen wird, als auch im Nagetiermodell; NOD (nicht-adipösen Maus), BB_DB Mäusen, Ratten und DP TCR Mäusen und anderen Tiermodellen von Diabetes wie in Rees et al, Diabet Med. 2005 April; 22 (4): 359-70; Srinivasan K, et al., J Indian Med. Res. 2007 März; 125 (3): 451 -7; Chatzigeorgiou A, et al., In Vivo. 2009 März-Apri 1; 23 (2): 245-58, die hier durch Bezugnahme aufgenommen sind.
In einigen Ausführungsformen, eine Bevölkerung von SC-β-Zellen, wie hierin beschrieben kann in jeder physiologisch verträglichen Hilfsstoff, wobei die SC-β-Zellen können einen geeigneten Ort für die Replikation, Proliferation und / oder Verpflanzung finden verabreicht werden. In einigen Ausführungsformen kann eine Population von SC-β-Zellen, wie hierin offenbart durch Injektion, Katheter oder dergleichen eingeführt werden. In einigen Ausführungsformen kann eine Population von SC-β-Zellen, wie hierin beschrieben bei Temperaturen von flüssigem Stickstoff eingefroren und über lange Zeiträume in der Lage ist die Verwendung auf dem Auftauen gelagert werden. Erstarrt, wird eine Population von SC-β-Zellen in der Regel in 10% DMSO, 50% FCS, 40% RPMI 1640 Medium gespeichert werden. Nach dem Auftauen der Zellen kann durch die Verwendung von Wachstumsfaktoren und / oder Nährzellen mit Kultivierungs SC-β-Zellen assoziiert erweitert werden, wie hierin offenbart.
In einigen Ausführungsformen, eine Bevölkerung von SC-β-Zellen, wie hierin beschrieben kann in der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung zugeführt werden, mit einer isotonischen Exzipienten unter ausreichend sterilen Bedingungen für die Verabreichung an Menschen hergestellt wird.
Für allgemeine Grundsätze in medizinischen Formulierung wird der Leser auf die Zelltherapie: Stammzelltransplantation, Gentherapie, und zelluläre Immuntherapie, vertreten durch G. Morstyn & W. Sheridan eds, Cambridge University Press, 1996; und Blutstammzell-Therapie, ED Ball, J. Lister & P. Recht, Churchill Livingstone, 2000. Wahl des zellularen Träger und etwaigen Begleitelementen der Zusammensetzung, die eine Population von SC-β-Zellen, wie hierin beschrieben wird in Übereinstimmung mit der Strecke und eine Vorrichtung zur Verabreichung verwendet angepasst werden. In einigen Ausführungsformen kann eine Zusammensetzung, die eine Population von SC-β-Zellen auch aus oder mit einem oder mehreren anderen Bestandteilen, die die Transplantation oder funktionelle Mobilisierung der SC-β-Zellen zu erleichtern, begleitet werden. Geeignete Bestandteile umfassen Matrixproteine, die Unterstützung oder Förderung der Haftung der SC-β-Zellen oder komplementären Zelltypen, insbesondere Endothelzellen. In einer anderen Ausführungsform kann die Zusammensetzung resorbierbaren oder biologisch abbaubare Matrix Gerüste umfassen.
In einigen Ausführungsformen kann eine Population von SC-β-Zellen, wie hierin beschrieben genetisch um Gene, die in Insulin-produzierende Zellen, wie Pankreas-β-Zellen, beispielsweise vorstellen verändert werden Reparatur eines genetischen Defekts in einem Individuum, selektierbaren Marker usw. oder Genen nützlich Selektion gegen nicht-Insulin-produzierenden Zellen, die aus mindestens einem Insulin-positive endokrine oder Vorstufe davon oder für die selektive Selbstmord implantierter SC-β-Zellen differenziert. In einigen Ausführungsformen kann eine Population von SC-β-Zellen auch gentechnisch verändert werden, um das Überleben, die Proliferation Steuerung und dergleichen zu verbessern. In einigen Ausführungsformen eine Population von SC-β-Zellen, wie hierin offenbart kann genetische Veränderung durch Transfektion oder Transduktion mit einem geeigneten Vektor, homologe Rekombination oder andere geeignete Technik, so dass sie ein Gen von Interesse exprimieren. In einer Ausführungsform wird eine Population von SC-β-Zellen mit Genen, die eine katalytische Komponente der Telomerase (TERT), typischerweise unter einem heterologen Promotor, der Telomeraseexpression hinaus, was im Rahmen der endogenen Promotors tritt erhöht transfiziert (siehe internationale Patentanmeldung WO 98/14592 , die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird).
In anderen Ausführungsformen wird ein Selektionsmarker eingeführt, um eine größere Reinheit der Population von SC-β-Zellen zu schaffen. In einigen Ausführungsformen kann eine Population von SC-β-Zellen genetisch verändert werden, unter Verwendung der Vektor enthaltenden Überstände über einen Zeitraum 8-16 h und dann in Wachstumsmedium ausgetauscht 1 -2 Tagen. Genetisch veränderte SC-β-Zellen können unter Verwendung eines Arzneimittelselektionsmittel wie Puromycin, G418 oder Blasticidin ausgewählt werden, und dann rekultiviert.
Die Gentherapie kann verwendet werden, um entweder eine Zelle zu modifizieren, um ein Gen-Produkt zu ersetzen, um die Regeneration des Gewebes zu erleichtern, um Krankheiten zu behandeln oder um das Überleben der Zellen nach der Implantation in einen Patienten zu verbessern (dh Unterdrückung von Abstoßungsreaktionen).
In einer alternativen Ausführungsform kann eine Population von SC-β-Zellen, wie hierin beschrieben kann auch genetisch um ihre Fähigkeit zu erhöhen bei der Geweberegeneration beteiligt sind oder, um ein therapeutisches Gen, das eine Stelle der Verabreichung zu liefern verändert werden. Ein Vektor wird unter Verwendung des bekannten Kodierungssequenz für das gewünschte Gen, das funktionell mit einem Promotor entweder pan-spezifisch oder spezifisch aktiv in den differenzierten Zelltyp verknüpft gestaltet. Von besonderem Interesse sind Zellen, die gentechnisch verändert sind, um eine oder mehrere Wachstumsfaktoren der verschiedenen Typen, wie Somatostatin, Glucagon, und andere Faktoren exprimieren.
Es sind viele Vektoren nützlich zur Übertragung exogener Gene in Ziel SC-β-Zellen, wie hierin beschrieben zur Verfügung. Die Vektoren können episomal, z.B. Plasmide, Viren abgeleitete Vektoren wie Cytomegalovirus, Adenovirus, usw., oder in das Zielzellgenom durch homologe Rekombination oder eine zufällige Integration, beispielsweise integriert werden, Retroviren abgeleitete Vektoren wie MMLV, HIV-1, ALV usw. In einigen Ausführungsformen können Kombinationen von Retroviren und einer geeigneten Verpackungszelllinie ebenfalls Anwendung finden, wobei die Kapsid-Proteine funktionell zur Infektion der SC-ß-Zellen, wie sie hierin offenbart ist. Üblicherweise wird SC-β-Zellen und Viren für mindestens etwa 24 Stunden in das Kulturmedium inkubiert werden. In einigen Ausführungsformen sind die SC-β-Zellen dann erlaubt, in dem Kulturmedium für kurze Zeitintervalle in einigen Anwendungen wachsen, zB 24-73 Stunden oder für mindestens zwei Wochen und kann gestattet werden, fünf Wochen oder mehr zu wachsen, vor der Analyse. Häufig verwendete retrovirale Vektoren sind „defekt“, dh nicht in der Lage, um virale Proteine, die für produktive Infektion erforderlich zu produzieren. Replikation des Vektors erforderlich Wachstum in der Verpackungszelllinie.
Das Wirtszellspezifität des Retrovirus wird durch das Hüllprotein, env (pi 20) bestimmt. Das Hüllprotein wird von der Verpackungszelllinie zur Verfügung gestellt. Hüllproteine von mindestens drei Arten, ökotropen, xenotropen und amphotropen. Retroviren mit ökotrope Hüllprotein, zum Beispiel verpackte MMLV, infizieren können die meisten Mäuse und Ratten-Zelltypen. Ecotrope Verpackungszelllinien umfassen BOSC23 (Pear et al. (1993) P.N.A.S. 90: 8392-8396). Retroviren tragen amphotropen Hüllprotein, zB 4070A (Danos et al., Supra) werden zur Infektion von Säuger meisten Zelltypen, einschließlich von Mensch, Hund, Maus. Amphotropen Verpackungszelllinien umfassen PA12 (M iller et al, (1985) Mol, Cell Biol, 5.43 1 -437); PA317 (Miller et al. (1 86), Mol. Gen. Zelle. Biol. 6: 2895-2902) GRIP (Danos et al (. 1988) PNAS 85: 6460-6464). Retroviren mit xenotropen Hüllprotein, zum Beispiel verpackte AKR env, infizieren können die meisten Säugetierzelltypen außer Mäusezellen. In einigen Ausführungsformen können die Vektoren Gene, die später entfernt werden müssen, zum Beispiel umfassen Verwendung eines Rekombinase-Systems, wie beispielsweise Cre / Lox, oder die Zellen, die sie exprimieren zerstört, zB indem Gene, die selektive Toxizität zu ermöglichen, wie Herpesvirus TK, Bc l - Xs usw.
Als Promotoren sind in einer gewünschten Zielzelltyp davon aktiviert wird, entweder die transfizierten cel 1 oder Nachkommenschaft. Durch transkriptionale Aktivierung ist es beabsichtigt, dass die Transkription wird über dem Grundniveau in der Zielzelle von mindestens etwa 100-fach mehr gewöhnlich von mindestens etwa 1000-fach erhöht werden. Verschiedene Promotoren bekannt, die in verschiedenen Zelltypen induziert.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Population von SC-β-Zellen, wie sie hierin offenbart sind, geeignet zur Verabreichung systemisch oder an ein Ziel anatomischen Ort. Eine Population von SC-β-Zellen in der Bauchspeicheldrüse oder des Subjekts gepfropft werden in der Nähe, zum Beispiel, oder systemisch, beispielsweise verabreicht werden können, aber nicht beschränkt auf intraarterielle oder intravenöse Verabreichung. In alternativen Ausführungsformen kann eine Population von SC-β-Zellen der vorliegenden Erfindung in verschiedener Weise, wie es angemessen sein, um das Implantat in den Pankreas oder sekretorische System, einschließlich, aber nicht parenteral, einschließlich intravenöser und intraarterieller Verabreichung, intrathekalen Verabreichung verabreicht werden, intraventrikuläre Verabreichung intraparenchymalen, intrakranielle, intracisternal, intrastriatalen und intranigral Verwaltung. Optional sind eine Population von SC-β-Zellen in Verbindung mit einem Immunsuppressivum verabreicht wird.
In einigen Ausführungsformen kann eine Population von SC-β-Zellen verabreicht und im Einklang mit guter medizinischer Praxis verabreicht werden, wobei der klinische Zustand des einzelnen Patienten, die vor Ort und Dauer der Anwendung, Terminplanung der Verabreichung, Alter des Patienten , Geschlecht, Körpergewicht und andere Faktoren, die Ärzten bekannt sind. Die pharmazeutisch „wirksame Menge“ für die Zwecke hier wird somit durch solche Überlegungen, wie sie in der Technik bekannt sind, bestimmt. Die Menge muss wirksam zur Verbesserung zu erreichen, einschließlich, aber nicht zu einer verbesserten Überlebensrate oder schnellere Genesung oder Verbesserung oder Eliminierung von Symptomen und anderen Indikatoren, wie als geeignete Maßnahmen von den Fachleuten auf dem Gebiet ausgewählt werden begrenzt. Klinik, klinisch Büro, Notaufnahme, Krankenstation, Intensivstation, Operationssaal, Katheter Suiten und radiologische Suiten: Eine Population von SC-β-Zellen können an ein Subjekt in den folgenden Orten verabreicht werden.
In weiteren Ausführungsformen wird eine Population von SC-β-Zellen zur späteren Implantation / Infusions gespeichert. Eine Population von SC-β-Zellen können in mehr als eine Aliquote oder Einheit aufgeteilt werden, dass ein Teil einer Population von SC-β-Zellen ist für die spätere Anwendung aufbewahrt, während ein Teil unmittelbar auf den Gegenstand aufgebracht wird. Mäßige bis langfristige Speicherung aller oder eines Teils der Zellen in einer Zellbank liegt auch innerhalb des Umfangs dieser Erfindung, wie in der US Patentanmeldung Seriennummer 20030054331 und Patentanmeldung Nr WO03024215 , und wird durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen. Am Ende der Verarbeitung kann die konzentrierten Zellen in einer Abgabevorrichtung in den Empfänger durch irgendein dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt geladen werden kann, wie eine Spritze, für die Platzierung.
In einigen Ausführungsformen wird eine Population von SC-β-Zellen können allein oder in Kombination mit anderen Zellen, Gewebe, Gewebefragmenten, Wachstumsfaktoren wie VEGF und andere bekannte angiogene oder Arteriogenese Wachstumsfaktoren, biologisch aktive oder inerte Verbindungen, resorbierbaren aufgebracht werden Kunststoffgerüste, oder anderen Zusatzstoff, die die Lieferung, Wirksamkeit, Verträglichkeit oder eine Funktion der Bevölkerung zu erweitern. In einigen Ausführungsformen kann eine Population von SC-β-Zellen auch durch Insertion von DNA oder durch die Platzierung in der Zellkultur in einer Weise zur Ableitung einer strukturellen oder therapeutischen Zweck zu ändern, zu verbessern oder zu ergänzen, die Funktion der Zellen, modifiziert werden . Beispielsweise werden Gentransfertechniken für die Stammzellen durch Durchschnittsfachmann in der Technik bekannt, wie offenbart in (Morizono et al, 2003;.. Mosca et al, 2000) und können virale Transfektion Techniken umfassen, und insbesondere Adeno-assoziierte Virus-Gen-Transferverfahren, wie in (Walther und Stein, 2000) offenbart (Athanasopoulos et al., 2000).
Nicht-virale basierte Techniken können ebenfalls durchgeführt, wie offenbart werden (Murarnatsu et al., 1998).
In einem weiteren Aspekt kann in einigen Ausführungsformen, eine Bevölkerung von SC-β-Zellen konnte mit einem Gen proangiogener Wachstumsfaktor (en) kombiniert werden. Gene anti- apoptotischen Faktoren oder Wirkstoffe kodieren könnten ebenfalls angewendet werden. Zugabe des Gens (oder einer Kombination von Genen) könnte durch jede Technologie im Stand der Technik, einschließlich aber nicht beschränkt auf adenovirale Transduktion begrenzt „Genkanonen“ Liposomen-vermittelte Transduktion, und Retrovirus oder Lentivirus-vermittelte Transduktion, Plasmid Adeno-assoziierten Virus bekannt ist. Zellen könnten zusammen mit einem Trägermaterial tragenden Genabgabevehikel, die zur Freisetzung und / oder Darstellen Gene in die Zellen über die Zeit, so dass die Transduktion fortgesetzt werden kann oder initiiert werden, implantiert werden. Insbesondere, wenn die Zellen und / oder die Zellen enthaltenden Gewebes an einen anderen Patienten als der Patient, von dem die Zellen und / oder Gewebe erhalten wurden verabreicht, ein oder mehrere immunsuppressive Mittel können dem Patienten, der die Zellen und / oder Gewebe zu verabreichenden zu reduzieren und vorzugsweise zu verhindern, die Abstoßung des Transplantats.
Wie hier verwendet, wird der Begriff „immunsuppressives Arzneimittel oder Agens“ soll pharmazeutische Mittel, hemmen oder diese stören normale Immunfunktion enthalten. Beispiele für Immunsuppressiva geeignet mit den hierin offenbarten Verfahren umfassen Mittel, die T-Zell / B-Zell-Costimulation Wege inhibieren, wie zB Mittel, die mit der Kupplung von T-Zellen und B-Zellen über den CTLA4 und B7 Wege stören, wie in der US-Patent Pub. Nein
2002/018221 1, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. In einer Ausführungsform ist ein Immunsuppressivum Cyclosporin A. Weitere Beispiele sind myophenylate Mofetil rapamicin und Anti -thymocyte Globulin. In einer Ausführungsform ist das Immunsuppressivum ist mit mindestens einem anderen therapeutischen Mittel verabreicht. Das Immunsuppressivum in einer Formulierung, die mit dem Verabreichungsweg kompatibel ist und an einem Patienten in einer Dosierung, die ausreicht, um die gewünschte therapeutische Wirkung zu erzielen verabreicht. In einer anderen Ausführungsform wird das Immunsuppressivum transient für einen ausreichenden Zeitraum um die Toleranz zu den kardiovaskulären Stammzellen der Erfindung zu induzieren.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die wirksame Mengen von einer Population von SC-β-Zellen werden ebenfalls von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen. Diese Zusammensetzungen umfassen eine wirksame Anzahl von SC-ß-Zellen, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Zusatzstoff oder Hilfsstoff. In bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung wird eine Population von SC-β-Zellen auf den Gegenstand, der ein Transplantat in steriler Kochsalzlösung verabreicht. In anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung wird eine Population von SC-β-Zellen in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) oder Isolyte S, pH 7,4, verabreicht. Andere Ansätze können ebenfalls verwendet werden, einschließlich der Verwendung von Serum-freien Zellmedien. In einer Ausführungsform sind eine Population von SC-β-Zellen im Plasma oder fötalem Rinderserum und DMSO verabreicht. Systemische Verabreichung einer Population von SC-β-Zellen auf den Gegenstand kann bei bestimmten Indikationen an der Stelle oder in der Nähe des erkrankten und / oder beschädigten Gewebes kann in anderen Indikationen bevorzugt bevorzugt sein, wohingegen eine direkte Verabreichung.
In einigen Ausführungsformen, eine Bevölkerung von SC-β-Zellen können gegebenenfalls in einem geeigneten Behälter mit schriftlichen Anweisungen für einen gewünschten Zweck, beispielsweise zur Rekonstitution oder Auftauen (falls gefroren) einer Population von SC-β-Zellen vor zu verpackenden Verabreichung an ein Subjekt.
In einer Ausführungsform kann eine isolierte Population von SC-β-Zellen, wie sie hierin offenbart sind, mit einem Differenzierungsmittel verabreicht. In einer Ausführungsform sind die SC-β-Zellen mit dem Differenzierungsmittel zur Verabreichung in das Subjekt kombiniert. In einer anderen Ausführungsform werden die Zellen getrennt zu dem Thema aus dem Differenzierungsmittel verabreicht. Gegebenenfalls, wenn die Zellen getrennt von dem Differenzierungsmittel verabreicht wird, gibt es eine zeitliche Trennung in der Verabreichung der Zellen und dem Differenzierungsmittel. Die zeitliche Trennung kann von etwa weniger als einer Minute im Zeitbereich, über Stunden oder Tage in der Zeit. Die Bestimmung der optima! Zeitpunkt und Reihenfolge der Verabreichung leicht und routinemäßig durch einen Fachmann auf dem Gebiet bestimmt.
Diagnose von Diabetes
Typ 1 Diabetes ist eine Autoimmunerkrankung, die zu einer Zerstörung der insulinproduzierenden β-Zellen des Pankreas führt. Insulinmangel verursacht eine Erhöhung des Nüchternblutzuckers (etwa 70- 120 mg / dl bei nicht-diabetischen Personen), die im Urin über der Nierenschwelle (etwa 190-200 mg / dl bei den meisten Menschen) erscheinen beginnt. Die Weltgesundheitsorganisation definiert den diagnostischen Wert der Nüchternblutzucker-Konzentration auf 7,0 mmol / 1 (126 mg / dl) und oben für Diabetes Mellitus (Vollblut 6. 1 mmol / 1 oder 1 10 mg / dl), oder 2-Stunden- Zuckerspiegel von 1 1 0,1 mmol / L oder höher (200 mg / dl oder höher).
Typ-1-Diabetes kann mit einer Vielzahl von Diagnosetests, die gehören diagnostiziert werden, sind aber nicht beschränkt auf, die folgenden: (1) glykosyliertem Hämoglobin (A 1 C) Test, (2) Zufallsblutzuckermessung und / oder (3) Nüchternblutzucker-Test.
Die glykiertem Hämoglobin (A 1 C) Test ist ein Bluttest, der den durchschnittlichen Blutzuckerspiegel eines Probanden während der letzten zwei bis drei Monaten widerspiegelt. Der Test misst die prozentuale Blutzucker an Hämoglobin gebunden, die mit Blutzuckerwerten korreliert (beispielsweise je höher der Blutzuckerspiegel, desto mehr Hämoglobin glycosyliertes). Ein A l C-Ebene von 6,5 Prozent oder mehr bei zwei verschiedenen Tests ist ein Hinweis auf Diabetes. Ein Ergebnis zwischen 6 und 6,5 Prozent gilt als prediabetic, die ein hohes Risiko, an Diabetes anzeigt.
Die Zufallsblutzucker-Test das Erhalten einer Blutprobe an einem beliebigen Zeitpunkt von einem Gegenstand mit Diabetes vermutet. Blutzuckerwerte in Milligramm pro Deziliter (mg / dl) oder Millimol pro Liter (mmol /l) ausgedrückt werden. Eine zufällige Blutzuckerspiegel von 200 mg / dL (1 1 0,1 mmol /1) oder höher zeigt das Thema wahrscheinlich hat Diabetes, vor allem, wenn sie mit einem der Anzeichen und Symptome von Diabetes, wie häufiges Wasserlassen und extremer Durst.
Für die Nüchtern-Blutzucker-Test wird eine Blutprobe nach nächtlichem Fasten erhalten. Ein Nüchternblutzuckerspiegel unter 100 mg / dL (5,6 mmol /l) gilt als normal. Ein Nüchternblutzuckerwert von 100 bis 125 mg / dL (5,6 bis 6,9 mmol / L) wird als prediabetic, während ein Niveau von 126 mg dl (7 mmol /l) oder höher auf zwei getrennten Tests ist bezeichnend für Diabetes.
Typ-1-Diabetes kann auch von Typ-2-Diabetes zu unterscheiden mit Hilfe eines C-Peptid-Test, der ein Maß für die endogene Insulinproduktion ist. Das Vorhandensein von Anti-Insel Antikörper (gegen Glutaminsäure-Decarboxylase, Insulinom assoziiertes Peptid-2 oder Insulin), oder das Fehlen von Insulinresistenz, von einem Glukosetoleranztest bestimmt wird, ist auch ein Hinweis auf 1 ein, so viele Typ 2 Diabetikern weiter produzieren Insulin intern, und alle haben eine gewisse Insulinresistenz.
Die Prüfung auf GAD 65-Antikörper wurde als eine verbesserte Test zur Differenzierung von Typ 1 und Typ 2 Diabetes vorgeschlagen worden, wie es scheint, dass das Immunsystem in Typ 1 Diabetes Ätiologie beteiligt.
In einigen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen für die Verwendung von Populationen von SC-β-Zellen durch die Verfahren hergestellt, wie hierin offenbart, um die Inselfunktion in einem Patienten, der einer solchen Therapie wiederherzustellen. Jede Bedingung in Bezug auf unzureichende Produktion eines endokrinen Pankreas (Insulin, Glukagon oder Somatostatin) oder die Unfähigkeit zur Sekretion korrekt regeln kann für die Behandlung mit Zellen betrachtet werden (zB Populationen von SC-β-Zellen), hergestellt gemß dieser Erfindung, soweit angemessen . Von besonderem Interesse ist die Behandlung von Typ-I (Insulin-unabhängig) Diabetes mellitus.
Fächer, der dessen bedarf kann für die Behandlung auf der Basis bestätigt langfristige Abhängigkeit von Verabreichung von exogenen Insulin und akzeptable Risiko-Profil ausgewählt werden. Gegenstand erhält ca. 10.000 SC-β-Zellen oder Zelläquivalente pro kg Körpergewicht. Wenn die Zellen nicht autologouse, um eine Fehlanpassung Allotyp überwinden, kann das Subjekt vor der Operation mit einem immunsuppressiven Mittel, wie FK506 und Rapamycin (oral) und Daclizumab (intravenös) behandelt werden. Zusammensetzung, umfassend eine Population von SC-β-Zellen durch einen Katheter in der Pfortader infundiert werden. Das Subjekt kann dann auf Bauch-Ultraschall und Bluttests unterzogen, um die Leberfunktion zu bestimmen. Tägliche Insulinbedarf verfolgt wird, und das Objekt wird eine zweite Transplantation gegeben, falls erforderlich. Follow-up-Überwachung beinhaltet häufige Bluttests für die Arzneimittelspiegel, Immunfunktion, allgemeinen Gesundheitszustand, und ob der Patient Insulin unabhängig bleibt.
Allgemeine Ansätze zur Bewältigung des Diabetes-Patienten sind in Standardlehrbüchern, wie beispielsweise die Textbook of Internal Medicine, 3rd Edition zur Verfügung gestellt, von der WN Kelley ed, Lippincott-Raven., 1997; und in Fachreferenzen, wie Diabetes mellitus:. eine grundlegende und klinische Text 2. Auflage, von D. Leroith ed, Lippincott Raven 2000; Diabetes (Atlas of Clinical Endocrinology Vol. 2) durch CR Kahn et al. eds, Blackwell Science. 1999; und Medical Management von Typ 1 Diabetes 3rd Edition, McGraw Hill 1 98. Verwendung von Inselzellen zur Behandlung von Diabetes vom Typ I wird ausführlich in Cellular Zusammenhänge in der Bauchspeicheldrüse diskutiert: Implikationen für Islet Transplantation, von L. Rosenberg et al, Chapman & Hall. 1999; und Fetal Islet Transplantation, von CM Peterson et al. Hrsg., Kluwer 1995.
Wie immer die letztendliche Verantwortung für die Auswahl der Probanden, der Art der Verabreichung und Dosierung von einer Bevölkerung von SC-β-Zellen ist die Verantwortung der Verwaltungs Kliniker. Für die Zwecke der kommerziellen Verbreitung, sind Populationen von SC-β-Zellen, wie hierin offenbart sind in der Regel in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung zugeführt wird, umfassend eine isotonische Exzipienten unter ausreichend steri le Bedingungen für die Verabreichung an Menschen hergestellt wird. Diese Erfindung umfasst auch Sets von Populationen von SC-β-Zellen, die zu jedem Zeitpunkt während ihrer Herstellung, Verbreitung und Verwendung existieren. Die Sätze von Populationen von SC-β-Zellen umfassen eine beliebige Kombination von zwei oder mehr in dieser Offenbarung beschrieben ist, beispielhaft, aber nicht die Zellpopulationen auf die Differenzierung der endgültigen Entodermzellen begrenzt pdxl -positiven Pankreas-Vorläuferzellen und die anschließende Differenzierung zB geworden in Insulin-produzierende Zellen, wie reife Pankreas-β-Zellen oder reife Pankreas β- ähnlichen Zellen, wie der Begriff hierin definiert ist.
In einigen Ausführungsformen kann die Zellzusammensetzungen, die Populationen von SC-β-Zellen in Kombination mit anderen Zelltypen, beispielsweise angewendet werden (zB in ein Subjekt implantiert) anderen differenzierten Zelltypen, die manchmal die denselben Genom. Jeder Zelltyp in der Gruppe können in getrennten Behältern in der gleichen Anlage oder an verschiedenen Orten, unter der Kontrolle des gleichen Unternehmens oder verschiedenen Einheiten teilen eine Geschäftsbeziehung zusammen verpackt werden, oder.
Für die allgemeinen Grundsätze in der medizinischen Formulierung von Zellzusammensetzungen wird der Leser auf die Zelltherapie: Stammzelltransplantation, Gentherapie, und zelluläre Immuntherapie, vertreten durch G. Morstyn & W. Sheridan eds, Cambridge University Press, 1996. Die Zusammensetzung gegebenenfalls in einem geeigneten Behälter mit schriftlichen Anweisungen für einen gewünschten Zweck, beispielsweise zur Behandlung des Diabetes verpackt.
In einigen Ausführungsformen können Zusammensetzungen, die Populationen von SC-β-Zellen ebenfalls als funktionelle Komponente in einer mechanischen Vorrichtung ausgebildet, um eine oder mehrere der Polypeptide endokrine Pankreasinselzellen produziert werden. In ihrer einfachsten Form enthält die Vorrichtung eine Population von SC-β-Zellen hinter einer halbdurchlässigen Membran, die Durchgang verhindert, der Zellpopulation unter Beibehaltung sie in dem Gerät, aber ermöglicht den Durchgang von Insulin, Glucagon, Somatostatin oder vom Zellpopulation sezerniert. Dies schließt Populationen von SC-β-Zellen, die mikroverkapselt sind, typischerweise in der Form von Zellclustern, die Aal erlauben! Interaktion, die Entdifferenzierung hemmt. Zum Beispiel US-Patent, Nr. 4,391, 909 beschreiben Inselzellen in einem Sphäroid semipermeable Membran aus Polysaccharidpolymeren> 3,000 mol verkapselt. Gew. die quervernetzt sind, so dass sie durchlässig für Proteine der Größe von Insulin, jedoch undurchlässig für Moleküle über 100.000 mol. Gew. Das US-Patent. No. 6.023.009 beschreibt Inselzellen in einer semipermeablen Membran aus Agarose und Agaropectin verkapselt.
Mikrokapseln dieser Art sind für die Verabreichung in die Körperhöhle eines diabetischen Patienten angepasst und sind gedacht, um einige Vorteile bei der Verringerung histocompatibility Probleme oder Anfälligkeit für Bakterien haben.
Kompliziertere Vorrichtungen sind auch für die Verwendung, um eine Population von SC-β-Zellen aufweisen, in Erwägung gezogen, entweder zur Implantation in Patienten mit Diabetes oder zur extrakorporalen Therapie. Das US-Patent. No. 4.378.016 beschreibt einen künstlichen endokrinen Drüsen eine extrakorporale Segment eine subkutane Segment und eine austauschbare Umschlag mit den Hormon-produzierenden Zellen mit. Das US-Patent. No. 5.674.289 beschreibt einen bioartifiziellen Pankreas, die eine Inselkammer, die durch eine semipermeable Membran, um eine oder mehrere Vascularizing Kammern offen umgebenden Gewebe getrennt. Nützliche Vorrichtungen haben typischerweise eine Kammer ausgebildet ist, die Inselzellen enthält, und eine Kammer von den Inselzellen durch eine semipermeable Membran, die die sezernierten Proteine von den Inselzellen sammelt getrennt und die auch eine Rückseite, die Inselzellen Signalisierung kann beispielsweise des zirkulierenden Blutzuckerspiegel.
Verfahren zum Identifizieren von β-Zellreifunsfaktoren, die die Herstellung von SC-β-Zellen oder β Bauchspeicheldrüsenzellen zu erhöhen
Es wird hierin ein Verfahren zum Identifizieren eines β-Zellreifung Faktor oder Mittel, das die Herstellung von SC-β-Zellen (zB reife Pankreas-β-Zellen) ansteigt. Bei bestimmten Beispielen hohem Gehalt und / oder Hochdurchsatz-Screeningverfahren bereitgestellt. Wobei das Verfahren das Aussetzen mindestens einen Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon zu mindestens einer Verbindung (beispielsweise eine Bibliothek Verbindung oder eine hierin beschriebene Verbindung) und Bestimmen, ob die Verbindung erhöht die Produktion von SC-β-Zellen, beispielsweise reife pankreatischen β-Zellen aus dem mindestens einen Insulin-positiven endokrinen Zelle oder des Vorläufers davon ist. Eine Zelle kann als eine SC-β-Zelle (zB eine reife Pankreas-β-Zelle) unter Verwendung eines oder mehrerer der hier beschriebenen Marker identifiziert werden. In einigen Beispielen der mindestens eine Insulin-positiven endokrinen Zelle oder die Vorläufer davon können vor der Belichtung mit der Bibliothek unterscheiden. In anderen Beispielen können zwei oder mehr Verbindungen verwendet werden, entweder einzeln oder zusammen, in dem Screening-Assay.
In weiteren Beispielen, die mindestens eine Insulin-positiven endokrinen Zelle oder die Vorstufe davon kann in einer Multi-Well-Platte gelegt werden. und eine Bibliothek von Verbindungen können durch Einsetzen der verschiedenen Mitglieder der Bibliothek in verschiedenen Vertiefungen der Multiwellplatte gescreent werden. Ein solches Screening von Bibliotheken schnell identifizieren Verbindungen, die in der Lage ist SC-ß-Zellen, beispielsweise reife Pankreas-β-Zellen, von der mindestens eine Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläufer davon sind.
In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner das Isolieren einer Population der SC-β-Zellen, beispielsweise Pankreas-β-Zellen (beispielsweise, bei dem mindestens 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 50%, 75% oder mehr des Themas Zelltyp).
In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner das Implantieren der SC-β-Zellen durch die Verfahren hergestellt, wie sie hier in einen Patienten (beispielsweise einem Patienten mit Diabetes, wie zB Typ I, Typ II oder Typ 1 Diabetes, 5) offenbart. In einigen Ausführungsformen wird die SC-β-Zelle aus einer Stammzelle aus einem Subjekt erhaltenen abgeleitet. In einigen Ausführungsformen wird die SC-β-Zelle aus einer Stammzelle von einem Spender sich von dem Gegenstand, beispielsweise einer relativen des Subjekts abgeleitet ist.
In einem Aspekt bietet die Erfindung ein SC-β-Zelle, zB eine reife Pankreas-β-Zelle von einem hierin beschriebenen Verfahren hergestellt. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend ein SC-β-Zelle von einem hierin beschriebenen Verfahren hergestellt.
In einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung ein Kit, umfassend: Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufern davon; mindestens ein β-Zellreifung Faktor hierin beschrieben; und Anweisungen zur Verwendung der Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufern davon, und die mindestens eine β-Zellreifung Faktor um einen SC-β Zelle (zB reife Pankreas-β-Zelle) zu erzeugen. In einigen Ausführungsformen kann das Kit weiterhin umfasst: eine Komponente für die Erfassung eines Markers für ein reifes β-Zelle, zum Beispiel für einen hier beschriebenen, beispielsweise ein Reagenz zum Nachweis eines Markers β Zellenlaufzeit, beispielsweise ein Antikörper-Marker gegenüber dem Marker; und eine reife Pankreas-β-Zelle, beispielsweise zur Verwendung als Kontrolle.
In einigen Ausführungsformen ferner umfasst der Kit: eine Komponente an eine endodermalen Zelle, zB eine endgültige endodermalen Zelle auf eine Zelle eines zweiten Zellentyps, beispielsweise mindestens ein Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläufer davon unterscheiden; und Anweisungen zur Verwendung der endodermalen Zellen (zB die definitive endodermalen Zellen) hierin beschrieben, und die Komponente in die Zelle einer zweiten Art mindestens ein Insulin-positive endokrinen Zelle oder Vorläufer davon zu erzeugen, beispielsweise. In einigen Ausführungsformen ferner umfasst der Kit: eine Komponente zum Nachweis eines Markers für die Zelle des zweiten Zellentyps, zum Beispiel für eine Markierung hierin beschrieben, zum Beispiel ein Reagens zum Nachweis von Pdxl, beispielsweise ein Antikörper gegen das Marker; und eine Zelle oder der zweite Zelltyp, beispielsweise mindestens ein Insulin-positive endokrinen Zelle oder Vorläufer davon, zum Beispiel zur Verwendung als Kontrolle.
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Erleichterung Differenzierung von Insulin-positiven endokrinen Zellen oder deren Vorläufersubstanzen zu SC-β-Zellen, umfassend das Bereitstellen mindestens einer Insulin-positiven pankreatischen endokrinen Zelle oder Vorläufer davon, und Bereitstellen mindestens eines β-Zellreifung Faktor (beispielsweise 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr, hier beschrieben), um den mindestens einen Insulin positive endokrinen Zelle oder einer Vorstufe davon auf eine SC-β-Zelle (zB eine reife Pankreas-β-Zelle) unterscheiden β-Zellreifunsfaktoren bei Einwirkung der Stammzelle der zumindest einen β-Zellreifung Faktor. Bei einigen Ausführungsformen davon, ist das mindestens eine Insulin-positiven endokrinen Zelle oder eines Vorläufers von einem Säugetier. Bei einigen Ausführungsformen davon, ist das mindestens eine Insulin-positiven endokrinen Zelle oder einer Vorstufe von Maus oder Mensch. In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Insulin-positive endokrinen Zelle oder Vorläufer davon aus Kultivieren einer embryonalen Stammzelle (zB eine Säuger embryonale Stammzelle, wie einer Maus oder menschliche embryonale Stammzelle), abgeleitet. In einigen Ausführungsformen der mindestens eine Insulin-positiven endokrinen Zelle oder Vorläufer davon aus Züchten einer pluripotenten Stammzelle (zB eine Säuger iPs Zelle wie eine Maus oder Mensch iPs Zelle) abgeleitet.
In einigen Ausführungsformen ist eine Vielzahl von Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufer davon in eine Mehrzahl von reifen pankreatischen β-Zellen oder SC-β-Zellen, beispielsweise durch Kontaktieren der Vielzahl von Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufer davon unterschieden mit mindestens einer, mindestens zwei, mindestens drei oder mehrere der β-Zellreifunsfaktoren wie hierin beschrieben.
In einigen Ausführungsformen die eine Vielzahl von Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufer davon sind an die β-Zellreifunsfaktoren ausgesetzt sind, etwa 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 oder mehr Tagen. In einigen Ausführungsformen kann die Vielzahl von Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufer davon sind an die β-Zellreifunsfaktoren in einer Konzentration von etwa 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 400 nM, 500 belichtet nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM, 1 µM, 2 µM, 3 µM, 4 µM, 5 oder 10 µM µM. In einigen Ausführungsformen kann die Vielzahl von Insulin-positiven endokrinen Zellen oder Vorläufer davon sind an die β-Zellreifunsfaktoren in einer Konzentration von etwa 250 N ausgesetzt wird, 400 nM, 500 nM, 600 nM, 700 nM bzw. 800 nM. In einigen Ausführungsformen mehr als etwa 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% O, oder 90% der insulin positive endokrinen Zellen oder Vorläufern, davon werden in die reife Pankreas-β-Zellen oder β-SC Zellen differenziert.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung künstlichen Inseln, die unter Verwendung der hierin beschriebenen SC-β-Zellen. In einigen Aspekten umfasst eine künstliche Insel eine oder mehrere SC-β-Zellen in vitro aus pluripotenten Stammzellen, zum Beispiel unterschieden nach einem hier beschriebenen Verfahren.
In einigen Aspekten stellt die Offenbarung ein künstliches Pankreas, das SC-β-Zellen in vitro aus pluripotenten Stammzellen differenziert.
Es versteht sich, dass die vorstehende detaillierte Beschreibung und die folgenden Beispiele sind nur illustrativ und sollen nicht als Beschränkungen des Umfangs der Erfindung genommen werden. Verschiedene Änderungen und Modifikationen an den offenbarten Ausführungsformen, die dem Fachmann bekannt sein werden, können, ohne von dem Geist und Umfang der Offenbarung abzuweichen. Ferner sind alle Patente, Patentanmeldungen und Veröffentlichungen identifiziert ausdrücklich durch Bezugnahme für den Zweck der Beschreibung und Offenbarung, zum Beispiel eingebaut in solchen Publikationen, die in Verbindung mit der Offenbarung verwendet werden können, beschriebenen Methoden. Diese publ ikationen ausschließlich für ihre Offenbarung vor dem Anmeldetag der vorliegenden Anmeldung bereitgestellt. Nichts in dieser Hinsicht sollte als ein Eingeständnis, dass die Erfinder nicht berechtigt, eine solche Offenbarung aufgrund einer früheren Erfindung oder aus irgendeinem anderen Grund vorwegzunehmen. Alle Aussagen über den Zeitpunkt oder Zusicherung in Bezug auf den Inhalt dieser Dokumente werden auf dem zur Verfügung, um den Antragstellern Informationen beruhen und keine Zulassung für die Richtigkeit der Daten oder Inhalt dieser Dokumente dar.
Beispiele
Beispiel 1 - Generierung von funktionalen pankreatischen β-Zellen in vitro
Zusammenfassung
Die Erzeugung von insulinproduzierenden pankreatischen β-Zellen aus Stammzellen in vitro würde eine beispiellose Zellquelle für die Wirkstoffforschung und Zelltransplantationstherapie bei Diabetes bereitzustellen. Jedoch Insulin-produzierenden Zellen, die zuvor von der menschlichen pluripotenten Stammzellen (HPSC) erzeugt fehlen viele Merkmale bona fide β Zellen einschließlich Funktion in vitro und / oder in vivo. Die hier beschriebene Arbeit zeigt eine beispielhafte skalierbare Differenzierung Protokoll, das SC-β-Zellen in vitro erzeugt aus HPSC. Überraschenderweise und unerwarteterweise diese SC-β-Zellen sezernieren Mengen Insulin vergleichbar erwachsenen β-Zellen in Reaktion auf mehrere aufeinander Glucose Herausforderungen Fluss Ca2 +, Express Marker in β-Zellen und Paket Insulin fand in Sekretärin Granulate. Als ein Proof of Concept, SC-β-Zellen zu bekannten Diabetes-Medikamenten und proliferative Signale in vitro reagieren auch. Ferner sind die SC-β-Zellen sezernieren hohe Niveaus von Humaninsulin im Serum von Mäusen, die unmittelbar nach der Transplantation und Transplantation dieser Zellen abschwächt unmittelbar Hyperglykämie in diabetischen Mäusen.
Die hierin beschriebene Arbeit stellt einen großen Fortschritt bei der Verwendung von Stammzellen abgeleiteten β-Zellen (dh SC-β-Zellen) für die Behandlung von Diabetes und für in vitro-β-Zelle und Wirkstoffscreening.
Die folgende Arbeit zeigt einige Vorteile der SC-β-Zellen gemäß dem hierin beschriebenen, beispielsweise die SC-β-Zellen führen Glucose stimulierten Insulinsekretion in vitro, an menschliche Inselzellen β-Zellen durch Genexpression und Ultra Verfahren hergestellt, sezerHumanInsulin und verbessern Hyperglykämie, wenn sie in Mäuse transplantiert, eine neue Plattform für die Zelltherapie (zB Transplantation in einen Patienten, der Bedarf an zusätzlichen und / oder funktionelle β-Zellen), Arzneimittel-Screening (zB für die Insulin-Produktion / Sekretion, überleben, Dedifferenzierung, etc.), Forschung (zB Bestimmung der Unterschiede in der Funktion zwischen der normalen und diabetischen β-Zellen) und Gewebetechnik (beispielsweise unter Verwendung der SC-β-Zellen wie der erste Zellentyp in der Rekonstruktion eines Insel).
Einleitung
Die Entdeckung von menschlichen pluripotenten Stammzellen (HPSC) öffnete die Tür zu der Möglichkeit, dass Ersatz-Zellen und Gewebe könnte eines Tages zur Behandlung von Krankheiten oder Arzneimittel-Screening erzeugt werden. Research in den letzten zehn Jahren hat sich das Feld rückte näher an dieses Ziel durch die Entwicklung von Strategien, um Zellen, die sonst schwer zu erreichen sein würde, wie Nervenzellen oder Kardiomyozyten erzeugen (Kriks et al, 201. 1; Shiba et al, 2012.). Diese Zellen haben auch nach einer Rückenmarksverletzung in Tiermodellen transplantiert worden und sind in der Lage, in den Wirt mit einem vorteilhaften Effekt wie Unterdrückung von Arrhythmien mit Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen engraft, in einigen Fällen (Shiba et al., 2012), die Wiederherstellung der Fortbewegung mit Oligodendrozyten-Vorläuferzellen oder (Keirstead et al., 2005), verbesserte Vision nach der Transplantation von Netzhaut Epithelzellen in Nagetiermodellen von Blindheit (Lu et al., 2009).
Eine der am schnellsten wachsenden Krankheiten, die behandelbar Stammzellen abgeleitete Gewebe sein kann, ist Diabetes, die mehr als 300 Millionen Menschen weltweit nach der International Diabetes Federation. Typ 1 Diabetes resultiert aus der autoimmunen Zerstörung der β-Zellen im Pankreas-Insel während die Typ 2 Diabetes Ergebnisse häufiger aus dem peripheren Gewebe Insulin-Resistenz und β-Zelle Dysfunktion. Diese Patienten, insbesondere bei Patienten mit Typ 1 Diabetes, könnte möglicherweise durch die Transplantation von neuen funktionellen β-Zellen ausgehärtet werden. Transplantation von menschlichen Leichen Inseln hat gezeigt, dass Patienten Insulin für 5 Jahre oder mehr unabhängig über diese Strategie hergestellt werden, aber dieser Ansatz ist sehr begrenzt, da der Mangel an Spender menschlichen Inselchen (Bellin et al., 2012). Die Erzeugung einer unbegrenzten Vorrat an menschlichen β cel! s aus Stammzellen könnte diese Therapie für Millionen von neuen Patienten zu verlängern, β-Zellen sind ein idealer Testfall für die regenerative Medizin, da nur ein einziger Zelltyp erzeugt werden muss und diese Zellen können überall im Körper innerhalb eines immun Gerät platziert werden (zB eine Mikrokapsel, wie sie hier als Material oder mit Zugang zu dem Gefäßsystem) beschrieben.
Pharmaceutical Screening auf neue Medikamente, die β-Zellfunktion oder Proliferation zu verbessern identifizieren können auch durch begrenzten Vorräte an Leichen Inselchen und ihre hohe Variabilität durch Variation der Todesursache, Spender genetischen Hintergrund und anderen Faktoren in ihrer Isolation behindert. So konnte eine konsistente, gleichmäßige Versorgung der SC-β-Zellen bieten eine einzigartige und wertvolle Wirkstoffforschungsplattform für Diabetes.
Die bisherige Forschung hat erhebliche Fortschritte bei der Erzeugung der β-Zelllinie in vitro aus HPSC gemacht. Definitive Endoderm und anschließende Pankreas-Vorläuferzellen können nun mit hohen Wirkungsgraden (Kroon et al differenziert werden., 2008; D'Amour et al., 2006; D'Amour et al., 2005; Rezania et al., 2012). Wichtig ist diese Zellen können weiter in funktionelle β-Zellen innerhalb von drei bis vier Monate nach der Transplantation differenzieren sich in Nagetieren (Kroon et al, 2008;.. Rezania et al, 2012), was darauf hinweist, dass sie das Entwicklungspotenzial, in β-Zellen entwickeln, enthalten, wenn genug bereitgestellt Zeit und entsprechende Hinweise. Leider ist die monatelange Prozess durchlaufen die Zellen in vivo bleibt eine Blackbox, und es ist unklar, ob dieser Prozess bei menschlichen Patienten zu arbeiten. Andere Arbeiten wurden auf die Generierung von Insulin-produzierenden Zellen aus menschlichen Pankreas-Vorläufer in vitro gerichtet. , Die Zellen auf dem Laufenden erzeugt sind jedoch nicht bona fide β-Zellen. Diese Zellen entweder nicht durchführen Glukose-stimulierte Insulinsekretion in vitro, keine angemessene β Zellmarker wie NKX6- 1 oder PDX 1, ungewöhnlich Co-express andere Hormone wie Glukagon zu äußern, nicht zu nach der Transplantation in vivo funktionieren, oder zeigen eine Kombination aus diese abnormen Funktionen (D'Amour et al, 2006;. Cheng et al 2012;.. Narayanan et al, 2013;. Xie et al, 2013;. Nostra et al, 201 1).
Die hier beschriebene Arbeit stellt eine Strategie für nahezu unbegrenzte, groß angelegte Herstellung von funktionellen menschlichen β-Zellen aus HPSC in vitro. Mithilfe sequentiellen Modulation von Signalwegen in Kombination in einem 3-dimensionalen Zellkultursystem, monohormonal Insulin-produzierenden Zellen (SC-β-Zellen), die co-express Schlüssel β Zellmarkern und Anzeige β Zelle ultrastrukturelle Eigenschaften erzeugt werden kann. Außerdem können diese Zellen imitieren die Funktion des menschlichen Inselzellen in vitro und in vivo. Schließlich werden die Zellen zeigen, Proof of Concept ihrer Nützlichkeit für die dualen Ziele der in-vitro-Wirkstoffscreening und in vivo-Transplantation Therapie für Diabetes.
Ergebnisse
In vitro Erzeugung von Glukose erfassenden Insulin sezernierenden β-Zellen aus HPSC
Ein beispielhaftes Verfahren zur Erzeugung von funktionellen β-Zellen von HPSC in vitro ist in der Figur dargestellt. 1 A. Um eine große Zahl von β-Zellen, eine skalierbare Suspension basierenden Kultursystem, das> 10 <8> HPSC später differenzierten Zelltypen verwendet wurde, erzeugen können, erzeugen (Schulz et al., 2012). Cluster von HUES8 menschlichen embryonalen Stammzellen, etwa 100-200 µιτη im Durchmesser, wurden in hochreiner definitive Entoderm (> 95% Soxl 7+) und anschließend frühen Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse (> 90% PDX 1 +) unter Verwendung von Protokollen von vorherigen Veröffentlichungen angepasst induzierte (Fig. IB) (Schulz et al 2012;.. Rezania et al, 2012). Als nächstes wird ein Verfahren, das längere Zeit in Kultur mit FGF Familienmitglied KGF Hedgehog-Inhibitor Sant l, und einer niedrigen Konzentration von Retinsäure auf hohe NKX6- 1 + / PDX 1 + Coexpression Pankreas-Vorläufer Clustern (> 60% zu erzeugen N X6- 1 + / PDX 1 + Zellen) wurde identifiziert (1 A) Transplantation dieser Bauchspeicheldrüsenvorläuferzellen in Mäusen wurde berichtet, dass Anlass zu funktionellen β-Zellen in vivo nach 3-4 Monaten zu ergeben (Rezania et al., 2012).
Dies wurde als Ausgangspunkt für die Entwicklung des Protokolls um diese Generation von funktionellen β-Zellen in vitro zu rekapitulieren verwendet.
Die NKX6- 1 + / PDX 1 + Pankreas-Vorläuferzellen wurden dann in C-Peptid-exprimierenden endokrinen Zellen entweder mit einem zuvor veröffentlichten Protokoll (Steuerdifferenzierung) oder ein neu entwickeltes Protokoll (neue Differenzierung) unterschieden. Das Steuerdifferenzierungsprotokoll hergestellten Zellen im Laufe von mehreren Monaten, die monohormonal INS + und INS + / + GCG oder INS + / SST + polyhormonal (PH) Zellen waren. Die Nomenklatur pH-Wert wurde verwendet, um diese Zellpopulation beziehen. Der neue Differenzierungsprotokoll, andererseits eingebunden 2-3 Wochen einer einzigartigen Reihe von Kulturschritten, die das Hedgehog-Signalisieren Hemmung, Retinsäure Signalisierung, gamma- Sekretase Inhibition TGF Signalisierungs Hemmung, EGF Signalisierung Thyroidhormon-Signalisierung und die Medien islet CMRL 1066 (Nostro et al, 201 1,.. Rezania et al 2012;. Thowfeequ et al, 2007; Aguayo-Mazzucato et al, 2013;.. D'Amour et al, 2006). Es wurde vermutet, dass der C-Peptid + Zellen, die mit diesem neuen Differenzierungsprotokoll erzeugt waren ähnlich Primär erwachsenen β (1 ° β-Zellen), und als solche werden die genannten Zell-β (SC-β-Zellen) (dh SC- Stammzellen β-Zellen).
Das wichtigste Funktionsmerkmal einer β-Zelle ist ihre Fähigkeit, immer wieder Glukose stimulierte Insulinsekretion (GSIS) durchzuführen. Nahezu alle bestehenden gerichtet Differenzierungsprotokolle erzeugen Insulin-exprimierenden Zellen aus HPSC, die zur Durchführung scheitern GSIS in vitro (D'Amour et al, 2006). Ein Protokoll wurde unter Verwendung von endodermalen Vorläuferlinien als Ausgangspopulation die Zellen, die etwas Insulin in Reaktion auf eine einzelne Glucoseprovokation absondern könnten zu verzeichnen (Cheng et al., 2012). Umgekehrt sind die SC-β-Zellen erzeugt unter Verwendung der hier beschriebenen, mindestens drei aufeinanderfolgende hohe Glucose Herausforderungen reagieren Methoden. Diese Zellen sezerniert hohe Insulin in einem Muster ähnlich zu primären erwachsenen β-Zellen, während PH Zellen von der Steuerprotokoll nicht angesprochen haben (2A bis 2C und 3A-2C) Glucose. Der Stimulationsindex, wie durch das Verhältnis des Insulins in hoher Glucose (20 mM) zu geringen Glucose (2 mM) sezerniert berechnet, war bei SC-β-Zellen im Vergleich zu primären erwachsenen β-Zellen, 2,3 ± 0,9 und 2,3 ± 1 .4 beziehungsweise.
Zusätzlich gab es einen kleinen Prozentsatz der hohen Glucose Herausforderungen für die beide SC-beta-Zellen und primäre erwachsenen β-Zellen beide nicht reagieren. Weiterhin wird die Menge von Insulin, um 20 mM Glucose durch SC-β-Zellen sezerniert pro Zelle in Reaktion war ununterscheidbar von der von primären erwachsenen β-Zellen sezerniert wird, 2,6 ± 1 0,6 und 2,5 ± 1,2 µIU/10³ Zellen jeweils. Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass die in vitro Funktion der SC-β-Zellen, die unter Verwendung der neuen Differenzierung Protokoll ist sehr ähnlich wie ihre bona fide Primär erwachsenen β Zellgegenstücke.
Die in-vitro-Funktionalität von SC-β-Zellen, die unter Verwendung der neuen Differenzierungsprotokoll wurde später durch die Messung von Veränderungen der intrazellulären Ca²⁺ bestätigt. β-Zellen sense wechselnden Blutzuckerspiegel durch die Calcium-Signal; steigende Zuckerspiegel führt zu Membrandepolarisation was einen Einstrom von Calciumionen, die für die Auslösung Insulinfreigabe verantwortlich ist (Mohammed et al., 2009). Somit Calciumeinstrom in Zellcluster mit Fluo-4 AM, einem fluoreszierenden Calcium-Indikator-Farbstoff, in Echtzeit unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie gefärbt wurde überwacht (4A). Dieses Verfahren erlaubt Analyse der Calciumfluss sowohl auf einer Bevölkerung und Einzelzellebene, und zeigte, dass beide SC-β-Zellen und primäre erwachsenen β-Zellen reagierten auf sequentielle Glucose Herausforderungen durch wiederholte Erhöhung der intrazellulären Ca²⁺ in ähnlicher Weise in Übereinstimmung mit normalen GSIS, während der pH-Zellen mit dem Steuerdifferenzierungsprotokoll erzeugt angezeigt einen abnormalen Calcium-Reaktion in Übereinstimmung mit ihren anomalen GSIS (4B).
Wenn Einzelzellanalyse wurde durchgeführt, die meisten einzelnen SC-β-Zellen und primäre Erwachsenen β-Zellen reagierten auf 2-3 sequentielle Glukose Herausforderungen fließenden Calcium während die meisten PH-Zellen reagierten auf 0 Herausforderungen (4C-4E). Anders als Nagetier β-Zellen, menschliche β-Zellen bekannt, dass ein gewisses Maß an Dyssynchronie als Reaktion auf hohe Glukose (Rutter und Hodson, 2013) anzuzeigen. Diese Daten zeigen, dass sowohl die gesamte Bevölkerung und einzelne Zellen innerhalb der SC-β Zellcluster funktionieren ähnlich wie Zellen in isolierten Inseln ß und Weiterbildung unterstützen die Schlussfolgerung, dass die SC-β-Zellen, die unter Verwendung der neuen Differenzierung Protokollfunktion in vitro.
Stammzellen abgeleiteten β-Zellen aus HPSC Ähneln primären humanen β-Zellen
Nach der Feststellung, dass die SC-β-Zellen funktionieren wie primäre Erwachsenen β-Zellen in vitro wurden die beiden Zellpopulationen dann durch Protein-Expression analysiert, Genexpression, und Ultrastruktur. Anders als die meisten bisher berichteten HPSC abgeleiteten Insulin-produzierenden Zellen, diese SC-β-Zellen exprimieren sowohl normale β Zellmarker PDX l und NKX6- 1 (5A und 5B).
Seltene nicht-β Zellhormone werden beobachtet, aber nicht zusammen lokalisieren mit NK.X6- 1 / C- Peptid Co-positiven Zellen (5C). SC-β-Zellen zu färben, die sowohl auf Insulin und C-Peptid, einem Nebenprodukt der stöchiometrischen Proinsulin Verarbeitung, anzeigt, dass der Insulin-Färbung kommt von zellendogene Insulinproduktion (6) und Färbung für ISL 1 MAFA und MAFB (Fig . 7A-7C). Durchflusszytometrie Quantifizierung zeigt, dass die hier beschriebenen Verfahren können 40% NKX6- 1 / C-Peptids, ähnlich wie bei dem Prozentsatz in cadaveric menschlichen Inseln (5D) gefunden herzustellen. Außerdem sind nur 8% der gesamten C-Peptid + Zellen koexprimieren Glucagon und 4% koexprimieren Somatostatin (8A bis 8C). Obwohl weitgehend monohormonal Zellen wurden zuvor in einer Studie berichtet, die Zellen wurden nicht gezeigten Schlüssel zu exprimieren β Zellidentität Marker NKX6-1 oder Funktion in vivo (Cheng 2012). Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass die Differenzierung Protokolle, die höheren Ebenen der NKX6-1 führen zu besseren Ergebnissen für die Transplantation Pankreas-Vorläufertransplantationen erzeugen gerichtet (Rezania et al., 2013).
Zusätzlich wurden bedingte Knock-out Studien gezeigt, dass NKX6- 1 Expression ist für β-Zell-Funktion bei erwachsenen Maus Inseln notwendig, darauf hindeutet, dass die CoExpression dieser Faktoren in unseren Zellen kann erklären helfen, ihre funktionellen Fähigkeiten (Taylor et al., 2013) .
Das verbesserte Protein-Expression von mehreren wichtigen β Zellmarker zeigten, dass die Transkriptionsnetzwerk dieser Zellen besser aufeinander abgestimmt, dass der menschlichen Insel β-Zellen. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass die INS + PH-Zellen durch vorangegangenen Protokolle erzeugt nicht ähneln weiß erwachsenen Insel IMS + β-Zellen (Hrvatin et al, 2014;. Xie et al, 2013.). Microarray-Analyse der sortierten INS + Zellen, die durch die zuvor veröffentlichten Protokollen erzeugt zeigten, dass sie mit fötalen β-Zellen gruppierten und nicht mit funktionellen erwachsenen menschlichen β-Zellen über das gleiche Verfahren sortiert.
Um die SC-β-Zellen der Weitergabe an erwachsenen Menschen Inselchen vergleichen, INS + / NKX6- 1 + Zellen wurden mit dem gleichen Verfahren sortiert und durchgeführt globale Genexpressionsanalyse von Mikroarrays. Im Gegensatz zu den bisher veröffentlichten Stammzellen abgeleiteten INS + PH Zellen, die SC-β-Zellen hier beschriebenen enger mit humanen adulten β-Zellen als fötalen β-Zellen oder INS + PH-Zellen (5E) gebündelt. Zusätzlich können diese Daten zeigten, dass die Expression von β kanonischen Zellen Gene, wie PDX1, MNX 1 und NKX2-2 waren ähnlich zwischen SC-β-Zellen und erwachsene menschliche β-Zellen als vorherige INS + PH Zellen. Eine Analyse der Top 100 der Differenz ly exprimierten Genen in dem Datensatz zeigte auch, dass SC-β-Zellen und erwachsenen menschlichen β-Zellen waren ähnlich zueinander als frühere PH oder fötalen β-Zellen (5F). Es bleiben Unterschiede zwischen SC-β-Zellen und humanen adulten β-Zellen, die mit zusätzlichen geringfügigen Änderungen der Kulturmedienzusammensetzung verbessert werden könnte während der späten Stadien der Differenzierung.
Da die Gen- und Proteinexpressionsmuster von SC-β-Zellen ähneln denen der primäre menschliche β-Zellen wurde die Hypothese aufgestellt, dass SC-β-Zellen sollten ihre Insulinprotein Verpackung in geeigneten sekretorischen Granula wie bona fide β Zellen. β-Zellen-Paket Insulin in sekretorischen Granula, die anfangs hellgrau mit einem Heiligenschein und weiter reifen in dunkle kristallisiert polygonalen Granulate mit einem leichten Halo (F1G.9A) sind. Frühere Studien von INS + Zellen aus Stammzellen erzeugt zeigte, dass diese Zellen nur polyhormonal und alpha artige Körnchen, die unterschiedliche Rundgranulat mit einem dunklen Halogen sind (D'Amour et al, 2006;. Roon et al., 2008). Diese Ergebnisse wurden mit der Kontrollprotokoll, INS + Zellen, die nur anormale polyhormonal und alpha artigen Körnchen und wenige, wenn überhaupt, β Zellgranula ( 9A) erzeugt hatte rekapituliert. Auf der anderen Seite beschreibt die Verfahren, die hier erzeugt SC-β-Zellen, die in proto β Zellgranula (9A) verpackt und kristallisiert Insulinprotein.
Beide Entwicklungsinsulin Granulat und ausgereift, kristallisiert Insulin Granulat wurde in beiden primären humanen β-Zellen und SC-β-Zellen (9B) beobachtet. Den Proteingehalt dieser Körnchen zu bestätigen, wurde Immunogoldmarkierung mit Partikeln gegenüber Insulin und Glucagon geführt. Während die PH Zellgranulate ungewöhnlich sowohl Insulin und Glucagon-Protein, das primäre humane β-Zelle und SC-β-Zellen-Granulat nur Insulin (9C) enthalten enthalten. So ist die Ultrastruktur von SC-β-Zellen der Spiegel, dass erwachsene menschliche β-Zellen.
In vitro Erzeugung von Glucose erfassenden Insulin sezernierenden β Zellen aus hiPSC
Das zur Herstellung der funktionellen β Zellen aus HPSC entwickeln, wie oben weiter eingesetzt worden, um funktionelle β-Zellen von hiPSC Linien in vitro zu erzeugen diskutiert neue differentielle Protokoll. Die hiPSC Linien wurden an der Harvard iPSC Kern mit sich entweder aus nicht-diabetischen oder Typ-1-Diabetes-Patienten gewachsen Haut-Fibroblasten erzeugt wird. Im Gegensatz zu der HPSC Linie, die aus Embryonen erzeugt war, wurde das hiPSC Linie aus menschlichem Gewebe erzeugt wird, zeigt, dass die funktionellen β-Zellen können direkt von erkrankten Patienten entwickelt werden, das heißt, Patienten mit Typ 1 Diabetes.
Die resultierenden β-Zellen unterzogen, um Herausforderungen Glukose, um ihre Fähigkeit zu bestimmen, die immer wieder durchführen Glukose stimulierte Insulinsekretion (GSIS). Es wurde festgestellt, dass mehrere β-Zellen erzeugt unter Verwendung der hier beschriebenen, mindestens drei aufeinanderfolgende hohe Glucose Herausforderungen ( 10A- 10B) reagieren Methoden. In diesem besonderen Experiment wurden hiPSC-β-Zellen von einem nicht-diabetischen Zelllinie (1013-3FA) abgeleitet hiPSC-β-Zellen von einem Typ-1-Diabetes-Zelllinie (1031 SEVA) abgeleitet, verglichen.
Der Stimulationsindex, wie durch das Verhältnis des Insulins in hoher Glucose (20 mM) zu geringen Glucose (2 mM) sezerniert, betrug mehr für die β-Zellen von den nicht-diabetischen Zelllinie im Vergleich zu den β-Zellen von der Art abgeleiteten 1-Diabetes-Zelllinie. Weiterhin wird die Menge an Insulin in Reaktion auf entweder eine 2 mM oder 20 mM Glukose-Herausforderung sezerniert pro Zelle größer war als bei den β-Zellen vom Typ 1 Diabetiker Zellinie als für die β-Zellen von den nicht-diabetischen Zellinie abgeleitet. Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass der in vitro Funktion der hiPSC-β-Zellen von einem Typ-1-Diabetes-Zelllinie abgeleitet ist ähnlich zu den nicht-diabetischen Zellgegenstücke.
Nach der Feststellung, dass hiPSC-β-Zellen sind, die auf in vitro Glucose nächsten analysierten die Erfinder, wie ähnlich die nicht-diabetischen und Diabetes Typ 1 Zellpopulationen wurden durch Protein-Expression, Genexpression, und Ultra. Drei verschiedene nicht- diabetischen Zelllinien und drei verschiedenen Diabetes Typ 1-Zelllinien wurden verwendet, um die Expression NKX6-1 / C-Peptid zu bestimmen. Wie es der Fall mit dem HPSC war exprimiert diese hiPSC-β-Zellen sowohl normale β Zellmarker PDX1 und NKX6- 1 (11A-11F). Durchflusszytometrie Quantifizierung zeigt, dass die hier beschriebenen Verfahren können etwa 40% NKX6- 1 / C-Peptids, ähnlich wie bei dem Prozentsatz in cadaveric menschlichen Inseln (5D) gefunden herzustellen.
Stammzellen abgeleiteten β-Zellen Funktion in vivo nach Transplantation.

Die beschriebenen Daten bisher sind konsistent mit der Erzeugung des funktionalen humanen β-Zellen in vitro. Ihre Fähigkeit zur in vivo-Funktion weiter zu testen, wurden diese Zellen unter die Nierenkapsel von immunsupprimierten Mäusen transplantiert ( 12A bis 12D und Tabelle S1). Tabelle S1. ELISA Messungen von humanen Insulin aus dem Serum von Mäusen, die mit SC-β Zellen, primären β Zellen und PH Zellen transplantiert wurden.

		humanes Insulin (µIU/ml)				humanes Insulin (µIU/ml)				humanes Insulin (µIU/ml)
Zelltyp	ms#	0'	30'	Zelltyp	ms#	0'	30'	Zelltyp	ms#	0'	30'
SC-β- Zellen	1	2.2	1.1	1'β Zellen	1	1.1	2.8	PH-Zellen	1	nd	0.4
	2	5.1	2.5		2	1.4	2.0		2	nd	0.1
	3	1.8	4.0		3	0.5	2.4		3	nd	0.1
	4	1.3	3.2		4	0.7	1.4		4	nd	0.4
	5	2.1	2.4		5	1.1	1.7		5	nd	0.4
	6	nd	8.5		6	-0.4	-0.1		6	0.1	0.1
	7	nd	7.5		7	1.4	3.9		7	0.2	0.2
	8	nd	5.9		8	nd	5.1*		8	0.0	0.3
	9	nd	5.9		9	nd	13.0*		9	0.0	-0.2
	10	nd	2.9		10	nd	5.1*		10	0.5	1.2
	11	1.4	5.3		11	nd	1.5*		11	nd	0.7
	12	1.7	2.6		12	nd	4.4		12	nd	1.0
	13	2.3	4.3		13	nd	7.0		13	nd	1.6
	14	0.9	1.4		14	nd	2.2		14	nd	1.1
	15	nd	3.3		15	nd	3.2		15	0.3	0.6
	16	nd	3.5		16	nd	3.9		16	0.1	0.2
	17	nd	4.3		17	1.0	0.6		17	2.6	0.1
	18	nd	3.2		18	0.9	1.7
	19	nd	45.0#		19	5.9	2.6
	20	nd	36.1#		20	1.6	2.3
	21	nd	14.8#		21	1.0	1.7
	22	nd	67.5#
	23	nd	57.7#
	24	nd	3.0
	25	nd	2.8
	26	nd	5.6
	27	nd	7.5
	28	nd	7.8
	29	nd	6.4
	30	5.0	11.4
	31	4.3	5.1
	32	3.8	2.5
nd = nicht bestimmt
# 2 Wochen in vitro kultiviert während des letzten Schritts; alle anderen SC-β Zellen wurden 1 Woche kultiviert

Beim erwachsenen Menschen Inseln transplantiert werden, ist menschliches Insulin im Serum von diesen Mäusen innerhalb von zwei vwfcs nachweisbar. Umgekehrt, wenn zuvor veröffentlichten Pankreas-Vorläuferzellen wurden Farb- Mäuse transplantiert kein Insulin als RWO Wochen nach transplaru erkannt (Koon et al 2008; Schulz et al 2012; Rezania et al. 2012). Stattdessen benötigen die Zellen eine 3 bis 4 Monate währende und schlecht verstandene Reifungsphase in vivo. Andererseits sezernieren SC-β-Zellen wie humane Inselchen hohe Spiegel von Insulin in den Blutkreislauf des Wirtes als Antwort auf eine Glukoseprovokation innerhalb von zwei Wochen nach der Transplantation (siehe 12A). Als Kontrolle haben wir PH Zellen transplantiert, die unter Verwendung zuvor veröffentlichter Protokolle hergestellt wurden, und festgestellt, dass diese Zellen keine wesentlichen Spiegel von Insulin als Antwort auf Glukose in vivo sezernierten (12A). Darüber hinaus wurde auch bestätigt, dass es die generierten Pankreas-Vorläuferzellen nicht schafften, nennenswerte Insulinspiegel in vivo innerhalb von zwei Wochen, wie zuvor veröffentlicht (Fig, 12C) zu produzieren.
Einige Insulin produzierende Zellen, die nicht bona fide β-Zellen sind und Insulinin einer ungeregelten Weise in den Blutstrom des Tieres absondern können, funktionieren eher wie ein Insulin-Pellet als eine responsive β-Zelle. Um zu testen, ob SC-β-Zellen sezernieren nicht nur hohe Insulinspiegel, sondern auch dazu in einer funktionell für un ve ma ner Höhe von Humaninsulin im Blut der Mäuse vor und nach einer akuten Glucoseprovokation gern essen wurde. Für beide menschlichen Inseltransplantationen und SC-p-Zellen-Transplantationen, 9 von 12 Mäusen zeigten funktionelle Glucose stimuliert die Insulinsekretion in vivo 2 Wochen nach der Transplantation (12A).
Nach der Anschluß in vivo GSIS Aufgabe durchgeführt wurde, wurden die Tiere getötet und die transplantierten Nieren zur Analyse entnommen. Histologische Schnitte dieser Nieren zeigte die Anwesenheit von großen Transplantate von menschlichen Zellen unter die Nierenkapsel. Immunfluoreszenzfärbung dieser Transplantate zeigten, dass beide SC-β-Zellen und menschlichen Inseltransplantate enthalten hohe Konzentrationen an Insulin-exprimierenden Zellen (12B). Diese INS + Zellen auch coexprimiert den kanonischen β Zelltranskriptionsfaktor PDX1 wie für funktionelle β-Zellen erwartet. Analyse von Insulin und Glucagon-Färbung ergab weiter, dass die SC-β cel ls blieb monohormonal nach der Transplantation (13 × 13B). (1 3) Eine geringe Population von GCG + a-Zellen sind ebenfalls in diesem Protokoll erzeugt, wie durch Immunfluoreszenz beobachtet und Durchflusszytometrie-Analysen (7 und 10) und diese Zellen auch in vivo nach der Transplantation beobachtet.
Es wurde ferner beobachtet, dass die Insulinsekretion in vitro stieg im Laufe der Zeit, wenn Medien, insbesondere ergänzt CMRL Medien mit ALK5 Inhibitor und T3 Hormon wurde in der letzten Differenzierung Schritt verwendet. Somit SC-β-Zellen wurden in vitro kultiviert, um eine Woche (zwei Wochen anstelle von 1 Woche in diesem letzten Schritt Medien) und wurden beobachtet, um zu sehen, ob sie auch mehr Insulin sezer in vivo. Nach dem Umsetzen dieser gealterten Zellen wurden zehnfach höhere Konzentrationen von Insulin unerwartet beobachtet, als die gleiche Anzahl von transplantierten jüngeren SC-β-Zellen (12D). Wodurch die Höhe der Insulinfunktion in vivo mit menschlichem SC-ß-Zellen erreichbar war ähnlich der durch Transplantation von menschlichen Inseln erreicht. Zusammengenommen sind diese Transplantation Daten deuten darauf hin, dass SC-β-Zellen können eine alternative klinische Option für die Zelltransplantation, die nicht auf variable und begrenzten Vorräte von gespendeten Leichen Inseln oder auf angewiesen bieten ein schlecht verstanden und in vivo Reifezeit von transplantierten Stammzellen abgeleiteten schlecht einstellbarem Pankreas-Vorläuferzellen.
Kultur Medien
Um die in vitro-Reifung von zumindest einigen der Pdxl -positive, N X6- 1 -positive, Insulin-positiven endokrinen Zellen in SC-β-Zellen zu induzieren, die Pdxl -positive, NKX6-1 -positive, insulin positive endokrinen Zellen werden in einem geeigneten Kulturmedium für eine ausreichende Zeitdauer aufrechterhalten. In der vorliegenden Erfindung, wie oben erwähnt, wurde festgestellt, dass die Verwendung von CMRL Medien mit ALK5 Inhibitor und T3 Hormon erlaubt SC-β-Zellen in vitro, mehr Insulin in vivo zu sezernieren, kultiviert. Hinzufügen von zusätzlichen Faktoren, die CMRL Medien bei der letzten Stufe der Differenzierung (Stufe 6) (14A), jedoch wurde auch festgestellt, um eine bessere Glucose stimulierte Insulinsekretion (GSIS) Reaktion von SC-β-Zellen zu erzeugen, wie entweder durch Stimulation gemessen Index zwischen hohen und niedrigen Glukose Herausforderungen oder durch die Menge an Insulin freigesetzt. Solche zusätzlichen Faktoren können umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Santl, XXI und SSP beschränkt. Der Stimulationsindex, wie durch das Verhältnis des Insulins in hoher Glucose (15 mM) auf niedrige Glukose (2,5 mM) sezerniert berechnet, größer war als bei den SC-β-Zellen in einem CMRL Medien gehalten enthaltenden ALK5 Inhibitor, Hormon, T3 und entweder Sant l , XXI oder SSP als die SC-β-Zellen in nur CMRL Medien gehalten, CMRL haltigen Medien ALK5 Inhibitor und T3-Hormon oder S3 haltigen Medien ALK5 Inhibitor und T3-Hormon (14B).
Weiterhin wurde die Menge an Insulin sezerniert höher für den SC-β-Zellen in einem CMRL Medien gehalten enthaltenden ALK5 Inhibitor, Hormon, T3 und entweder Santl, XXI oder SSP als die SC-β-Zellen in nur CMRL Medium, CMRL Medium, enthaltend ALK5 gehalten Inhibitor und T3-Hormon oder S3 haltigen Medien ALK5 Inhibitor und T3-Hormon ( 14C). Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass nicht nur die Aufrechterhaltung SC-β-Zellen in CMRL Medien in der letzten Differenzierungsschritt die Reifung von zumindest einigen der Pdxl -positiven induzieren wichtig NKX6- 1 -positive, Insulin positive endokrinen Zellen in SC -β-Zellen, aber die weitere Zugabe von bestimmten Faktoren, wie Santl, XXI oder SSP den CMRL Medien Glucose verbessern Insulinsekretion (GSIS) der Zellen.
Verbessern des Überlebens und der Funktionen von Zellen
Eine Herausforderung für die Stammzellfeld wurde Erzeugung einer ausreichenden Menge an SC-β-Zellen, die nützlich für Arzneimittel-Screening, Krankheitsmodelle oder therapeutischen Verwendung sein kann. Zum Beispiel sind hES technisch schwierig zu kultivieren, sind anfällig für Apoptose bei zellulären Ablösung und Dissoziation massiven Zelltod insbesondere nach der vollständigen Dissoziation und eine geringe Klonierungseffizienz. (Watanabe, K. et al, Nature Biotechnology 25, 681 -. 686 (2007)). Als Ergebnis kann die Menge von lebensfähigen SC- β-Zellen ergab niedrig sein. Durch Ändern des Protokolls zwischen Schritt 3 und 6 in der in gezeigten Weise. 15 A, reiner NKX6.1 + endokrinen Clustern erzeugt werden (15B), was zu mehr SC-β-Zellen, die therapeutisch von Nutzen sein können.
In den Schritten 3-5, zum Beispiel, das Überleben der Zellen durch die Zugabe einer Rho-associated protein kinase-Inhibitor oder einen Felsen Inhibitor verbessert werden kann. Es wird angenommen, dass die Zugabe von einem Felsen Inhibitor verbessert das Überleben von ES-Zellen durch Verhinderung der Dissoziation induzierte Apoptose erhöht so ihre Klonierungseffizienz. (Watanabe et al.) Beispiele von Fels Inhibitoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Y-27632, Fasudil / HA 1077, und H-L-152 beschränkt. In der vorliegenden Erfindung wird die Behandlung der Zellen mit einem Stein Inhibitor wurde gezeigt, dass das Überleben der Zellen (15C) zu verbessern.
Neben der Behandlung der Zellen mit einem Inhibitor Rocki, die Zellen in den Schritten 3- 4 mit allein oder in Kombination mit Nicotinamid ActivinA behandelt werden. Activin A und Nicotinamid haben beide gezeigt worden, um das Überleben der Zelle zu verbessern. Ein Weg, auf dem sie verbessern das Zellüberleben durch Herunterregulieren SOX2, einem Marker für eine pi uri potenten Stammzellen, von etwa 81% bis etwa 47% (15D). Da SOX2 und N X6- 1 sich gegenseitig aus (15E), Herabregulierung von SOX2 führt zur Hochregulierung von N X6- 1, einem Marker für eine reife Pankreas-β-Zelle.
In den Schritten 5-6 kann das Überleben der Zellen durch die Behandlung von Zellen mit Staurosporin verbessert werden. Staurosporin ist bekannt, dass ein Aktivator von neuronalen, glialen sein und stammen celllike Neurosphere Differenzierung und ist auch gedacht, um die Apoptose zu induzieren. (Schumacher, et al., Mol. Zelle. Neurosci. 2003; 23 (4): 669-680). In der vorliegenden Erfindung wird die Zugabe von Staurosporin resultierte in einer nahezu reinen endokrinen Population durch Erhöhung des Prozentsatzes ChromograninA, einer endokrinen Pankreaszellmarker (15F) und den Anteil der NKX6-1. C-Peptid + Zellen (15G).
Schließlich Überleben der Zelle kann durch Behandlung von Zellen mit einem Kulturmedium, das Alk5i, T3 in Verbindung mit XXI, einer y-Sekretase-Inhibitor, β-Zellreifung verbessert verbessert werden. Wie in den Figuren gezeigt ist. 15 H und 1 51, die Zugabe von XXI zu dem Medium in den Schritten 5 und 6 können die NeuroDH Bevölkerung.
Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass die Zugabe bestimmter Verbindungen zu den Zellen in den verschiedenen Stadien während des Verfahrens ist bei der Verbesserung der Zellüberleben und Anreichern der Population von Zellen, die in therapeutisch nützlichen SC- β-Zellen differenzieren können wichtig.
Dienstprogramm ofSC-β-Zellen für Translational Biology
Eine große Herausforderung für die Stammzellfeld wurde Erzeugung differenzierten Zelltypen, die nahe genug an ihre normal entwickelten Pendants sind nützlich für Arzneimittel-Screening, Krankheitsmodelle oder therapeutischen Verwendung sein. SC-β-Zellen, die unter Verwendung der neuen Differenzierungsprotokoll, wie hier diskutiert anscheinend in ähnlicher Weise wie in primäre menschliche β-Zellen wirken sowohl in vitro als auch in vivo. Es war daher die Hypothese aufgestellt, dass diese Zellen nützlich für translationale Medizin (16A) sein könnte.
Einer der häufigste therapeutische Strategien zur Behandlung von Typ-2-Diabetes ist die Gabe von oralen Antidiabetika. Viele dieser pharmazeutischen Mittel wirken direkt auf die β-Zelle, um die Insulinsekretion zu erhöhen. Zum Beispiel Sulfonylharnstoffe erhöhen Sekretion von endogenen Insulin durch blockierende Kaliumkanäle (Modi, 2007). Aktuelle Wirkstoff-Screening auf β-Zellen beschränkt sich auf kleinen Inseln, transformierte Zelllinien oder stark schwankende und begrenzte Lieferungen von menschlichen Leichen Inselchen Nagetier. Da Nagetier Stoffwechsel menschlichen Stoffwechsel, eine zuverlässige, konsistente Lieferung von menschlichen β-Zellen für die Analyse nur teilweise imitiert sehr wertvoll wäre. Hier untersuchten die Erfinder, ob SC-β-Zellen könnte für therapeutische Screening in vitro verwendet werden.
Die Erfinder zuerst geprüft, ob SC-β-Zellen auf die bereits bestehenden Antidiabetika aus verschiedenen Klassen (16B) zu reagieren. LY2608204 Glucokinase Aktivator in klinischen Studien beim liraglutide Tolbutamid und Nateglinid sind Beispiele von GLP-1-Agonisten und Sekretagoga (Sulfonylharnstoffe und Meglitinide) verbunden sind, die klinisch verwendet wurden (Matschinsky 2009; Modi, 2007;. Vetere et al, 2014). Tatsächlich SC-β-Zellen zeigten einen Trend zu reagieren auf die Behandlung mit diesen Medikamenten durch die Erhöhung der Insulinsekretion in vitro nach einer Glukosebelastung (16C). Diese Daten liefern eine anfängliche Machbarkeitsstudie, die SC-β-Zellen konnte eine neuartige Plattform für zukünftige Wirkstoff-Screening bereitzustellen.
Als nächstes haben die Erfinder untersucht, ob SC-β-Zellen β Zellreplikation Modell könnte. Erhöhen β Zellmasse eines Patienten kann der Blutzuckerkontrolle, indem sie mehr Insulin insgesamt, ohne die Menge an Insulin pro Zelle produzierten β erhöhen verbessern. Bisher wenige oder gar keine Medikamente, die β Zellreplikation in Nagetier oder Zelllinie Modelle gefördert haben, die menschliche β-Zellen übersetzt. Hormonelle Kontrolle β Zellreplikation wurde durch Studien von Inselmasse der Schwangerschaft beim Menschen und Nagetieren mit Prolaktin-Behandlung vorgeschlagen (Parsons et al, 1992;.. Labriolas et al, 2007;. Brelje et al, 2004). Die Erfinder untersucht, ob die Behandlung mit Prolaktin könnte β Zellreplikation in einem SC-β-Zellpopulation zu erhöhen. Nach Kultivierung SC-β-Zellen mit Prolaktin wurden die Zellen gefärbt und auf die C-Peptids und des Proliferationsmarkers Ki67 (16D und 16E) befestigt ist. Wie primären humanen β-Zellen, die Grundlinie Anzahl der Ki67 + wuchernden SC-β-Zellen war sehr gering (0,20 ± 0,08% Ki67 + / C-Peptid +) (16F).
Die Quantifizierung der unbehandelten und Prolaktin-behandelten Zellen zeigten eine Tendenz zu einer stärkeren Verbreitung stromabwärts von Prolaktin (0,39 ± 0,08% Ki67 + / C-Peptid +), was darauf hindeutet, dass die SC-β-Zellen können in der Lage, die Proliferation Cues in Replikation Bildschirme (Fig reagieren. 16F).
Schließlich untersuchten die Erfinder, ob SC-β-Zellen direkt als ein Zelltherapie zur Behandlung von Diabetes sein könnten. Im Gegensatz zu Typ 2 Diabetes, die Erhöhung β-Zellfunktion oder β Zellreplikation über neue Arzneimittel dürfte wenig therapeutischen Nutzen für Patienten mit Typ-1-Diabetes haben, wo die Pankreas-β-Zellen werden durch Autoimmunangriff zerstört. Diese Patienten können jedoch durch den Ersatz verloren β-Zellen mit allogenen Spender-Inseln durch die Transplantation Edmonton-Protokoll behandelt (Shapiro et al., 2006).
Ein nützliches Modell für diese Art schwerer Diabetes ist der Akita-Maus. Akita Mäusen beherbergen eine Mutation in dem Gen, das Insulin zu Fehlfaltung von Proteinen, vollständige und irreversible β Zellenversagen und progressiv schwerer Hyperglykämie führt. Akita-Mäuse können normoglycemia per Maus oder menschlicher Inseltransplantation in die Nierenkapsel wiederhergestellt (Pearson et al., 2008). Daher SC-β-Zellen gemäß den hier beschriebenen Verfahren erzeugt wurden, getestet, um zu sehen, ob sie auch funktionieren, um diabetische Hyperglykämie zu kontrollieren. Die Ergebnisse zeigten, dass die Transplantation von SC-β-Zellen, aber nicht PH INS + Zellen der vorangegangenen Protokolle, in junge Akita Mäusen schnell umgekehrt die in diesen Tieren beobachtet progressiv zunehmenden Hyperglykämie (16G). Nüchtern-Blutzuckerwerten von Mäusen mit SC-β-Zellen transplantiert waren im Durchschnitt weniger als 200 mg / dl, während diejenigen mit Kontroll PH Zellen transplantiert zeigte progressiv höheren Blutzuckerspiegel über 400 mg / dl, wie sie für nicht transplantierten Akita Mäusen beobachtet worden (16G) (Pearson et al., 2008).
Wie zu erwarten, waren menschliche Insulinspiegel hoch in SC-β-Zelle transplantierten Tieren und kaum nachweisbar in PH Zelle transplantierten Kontrolltieren (16H). Die mit SC-β-Zellen transplantierten Mäusen zeigten auch bessere Gewichts Wartung als Kontrollmäuse, was auf normierte Insulinfunktion (17). So SC-β-Zellen sind in der Lage Absonderung von Insulin und Anhalten und Umkehren progressive Hyperglykämie in dem diabetischen Maus-Modell fast unmittelbar nach der Transplantation.
Diskussion
Die hier beschriebene Arbeit zeigt, dass funktionelle menschliche β-Zellen können direkt aus HPSC und hiPSC in vitro erzeugt werden. Kollektiv die hier beschriebenen Daten zeigen, dass diese Zellen (dh SC-β-Zellen) funktionieren ähnlich wie primäre menschliche β-Zellen sowohl in vitro als auch in vivo nach der Transplantation. SC-β-Zellen nach den für β-Zelle Studie und Therapie hierin beschriebenen vorliegenden mehrere neue Chancen Verfahren erzeugt. Limited Lieferungen von gespendeten Leichen Inselchen, hohe Variabilität zwischen den Proben aufgrund der Eigenschaften der Patienten oder zur Isolierung und dem trivial kleine Menge des menschlichen β Zellreplikation in vitro hat stark eingeschränkt menschlichen β Zellversorgung auf dem neuesten Stand. Diese Einschränkung wurde Transplantation Möglichkeiten für Patienten als auch mit hohem Durchsatz Wirkstoff-Screening und Krankheit Modellierung beschränkt. Eine einzelne 68 kg (1501b) Patient benötigt etwa 340-748000000 transplantierten Inselzellen, um Typ-1-Diabetes effektiv zu lösen über Inseltransplantation (McCall und Shapiro, 2012). Die hier beschriebene Strategie ist effizient und hoch skalierbar macht es praktisch für eine einzige Labor in die Hunderte von Millionen, Milliarden von SC-β-Zellen zu einer Zeit, zu wachsen.
Eine große klinische Vorteil SC-β-Zellen im Vergleich zu zuvor beschriebenen Stammzelle abgeleitet Therapien für Diabetes ist, dass diese Zellen stellen die erste Gelegenheit für eine Zelltherapie, die nicht eine möglicherweise unvorhersehbaren „black box“ Periode der weiteren Differenzierung in vivo erfordert.
Im Gegensatz zu primären humanen β-Zellen, SC-β-Zellen können auch aus Zellen einer beliebigen genetischen Hintergrund erzeugt werden. iPS-Zellen von Patienten mit Diabetes oder anderen Stoffwechselsyndrome können nun gewonnen und in SC-β-Zellen zur Krankheitsmodelle und Untersuchung der β-Zellfunktion oder Stressanfälligkeit oder Immunangriff unterschieden werden.
Technologien wie TALEN und CRISPR aktivieren Genom Bearbeitung von ES oder iPS-Zellen zu integrieren und zu Testvarianten durch genetische Analysen wie genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) identifiziert. Ähnlich könnte β Zelle Arzneimittelreaktionen nun zwischen genetisch gematchten mutierten und nicht-mutierten β-Zellen verglichen (Ding et al., 2013).
Identifizierung und Prüfung von Biomarkern für β-Zellfunktion oder Pharmakogenetik wird auch durch die Kombination dieser Technologien ermöglicht. So SC-ß-Zellen stellen eine neuartige, humanspezifischen Plattform für in-vitro-Wirkstoffforschung und Charakterisierung des Stoffwechsels und Diabetes.
Die Erzeugung von SC-β-Zellen stellt auch eine potentiell nützlichen Schritt in Richtung Zukunft Generation von Inselzellen und Pankreasorgane. Einbeziehung Pankreas Nische Zellen wie mesenchymalen oder Endothelzellen in Kulturen von Stammzellen abgeleitete Zellen der Bauchspeicheldrüse von Vorteil sein kann (Sneddon et al 2012;.. Lammert et al, 2001). Weitere Hinweise darauf, dass das Vorhandensein von alpha- und delta Zellen eine wichtige Rolle für die präzise Abstimmung der normalen β-Zellfunktion (Rodriguez-Diaz et a!., 201 1) ist. Darüber hinaus wird das Tissue Engineering eines Pankreasorgan Einbau funktioneller exokrinen und duktalen Gewebe erfordern, möglicherweise in genau festgelegten Architektur. Die Erzeugung von SC-β-Zellen stellt einen Schritt in Richtung Herstellung einer klinischen Auswirkungen durch die Nutzung der Stammzellbiologie.
Experimentelle Verfahren
Zellkultur
HPSC Linien wurden undifferenzierte in mTESRI (StemCell Technologies Inc .; 05.850) in 500 ml stir Flaschen (Corning, VWR, 89089-814) gehalten auf einem 9-Position platziert Platte am Rotationsrate von 70rpm in einem 37 ° C eingestellt rühren Inkubator, 5% C02 und 100% Luftfeuchtigkeit. Die Linie HUES8 war die Hauptleitung genutzt. Die Zellen wurden mit Accutase dispergiert und wurden als einzelne Zellen bei 0.5MI Löwen / ml in mTESR mit 10µM Y27632 ausgesät (Abcam; ab 120.129). mTESRI Medien wurde (w / o Y27632) 48 Stunden später geändert.
Die Kulturen wurden 24 Stunden nach diesem Medienwechsel aufgeteilt um ihre Clusterdurchmessergröße bei <300 µm zu halten. Die Kulturen wurden regelmäßig auf Krankheitserreger, Karyotyp und für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz Marker getestet.
Beispielhafte Medien, die für die gerichtete Differenzierung verwendet wurden:
SI Medium: MCDB 131 (Cellgro; 15-100-CV) + 8 mM D - (+) - Glucose (Sigma, G7528) + 2,46 g / 1 NaHC03 (Sigma; S3817) + 2% FAF-BSA (Proliant; 68700) + ITS-X (Invitrogen; 51500056) 1: 50.000 + 2 mM Glutamax (Invitrogen; 35050079) + 0,25 mM Vitamin C (Sigma Aldrich; A4544) + 1% Pen / Strep (Cellgro; 30-002-CI) .
S2 Medien: MCDB 131 + 8 mM D-Glucose + 1,23 g / L NaHC03 + 2% FAF- BSA + ITS-X 1: 50.000 + 2mMl Glutamax + 0,25 mM Vitamin C + 1% Pen / Strep.
S3 Medien: MCDB 131 + 8 mM D-Glucose + 1 .23g / L NaHCOj + 2% FAF- BSA + ITS-X 1: 200 + 2mMl Glutamax + 0,25 mM Vitamin C + 1% Pen / Strep
BE5 Medien: CDB 131 + 20 mM D-Glucose + 1.754g / L NaHC03 + 2% FAF-BSA + ITS-X 1: 200 + 2 mM Glutamax + 0,25 mM Vitamin C + 1% Pen / Strep + Heparin ^ g / ml (Sigma; H3149).
CMRLS: CMRL 1066 Ergänzte (Mediatech; 99-603-CV) + 10% FBS (HyClone ™ VWR; 16777) + 1% Pen / Strep.
Alle Medien wurden durch einen 0,22 µm Flaschenaufsatzfilter (Corning) sterilisiert. Für alle folgenden Medien ändert, wurden kleine Moleküle und Wachstumsfaktoren zu den Basismedien unmittelbar vor dem Medienwechsel in einem schlechten Lichthaube aufgenommen.
Zur Einleitung des SC-β-Zell-Differenzierung wurden die Zellen bei ausgesät 0.5million / ml und Differenzierung wurde 48 Stunden später begonnen. Medienwechsel waren folgende
Tag 1: SI + 1 Oong / ml Activin A (R & D Systems, 338-AC) (; 04-0004-10 Stemgent)) + 3µM Chir99021.
Tag 2: SI + 1 Oong / ml Activin A. Tage 4, 6: S2 + 50 ng / ml KGF (Peprotech; AF-100-19)).
An den Tagen 7, 8: S3 + 50 ng / ml KGF + 0.25µM Santl (Sigma; S4572) + 2µM Retinsäure (RA) (Sigma; R2625) + 200 nM LDN193189 (nur Day7) (Sigma; SML0559) + 500 nM PDBU (Merck Millipore; 524.390)).
Tage 9, 11, 13: S3 + 50 ng / ml KGF + 0.25µM Sant 1 + 1 OOnM RA.
Days 14,! 6: BE5 + 0.25µM Santl + 50 nM RA + 1 µM XXI (Merck Millipore; 565.790) + I OµM Alk5i II (Axxora; ALX-270-445) + I µM L-3,3', 5-Trijodthyronin (T3) (EMD Millipore; 64.245) + 20 ng / ml Betacellulin (Thermo Fisher Scientific; 50932345)).
Tage 18, 20: BE5 + 25 nM RA + 1 µM XXI + 1 OµM Alk5i II + 1 µM T3 + 20 ng / ml Betacellulin.
Tage 21 -35 (Medienwechsel jeden zweiten Tag): CMRLS + 10µM Alk5i II + 1 µM T3. Zellen wurden durch in vitro-Tests, nachdem zwischen den Tagen 28 und 32 getestet. Zellen wurden am Tag 28 transplantiert, sofern nicht anders vermerkt.
Alternativ Tage 21 -35: CMRLS + 10µM Alk5i II + 1 µM T3 + Santl.
Alternativ Tage 21 -35: CMRLS + 10µM Alk5i II + I µM T3 + XXI.
Alternativ Tage 21 -35: CMRLS + 10µM AlkSi II + I µM T3 + SSP.
Zur Erzeugung PH Protokoll Zellen früheren Veröffentlichungen nachahmen wurde das gleiche Differenzierungsprotokoll bis zum 14. Tag verwendet. An den Tagen 14 und 16 wurden die Zellen mit S3 + I µM Alk5i II, 200 nM LDN 193 189 und 1 OOnM RA zugeführt (Rezania et al., 2012). An den Tagen 18 und weiter wurden die Zellen jeden zweiten Tag mit S3 + 1 OOnM RA zugeführt. Die Zellen wurden in diesem Medium, bis experimentelle Analyse erhalten. Zellen wurden in Kultur gehalten und nach der gleichen Zahl von Tagen in Differenzierungsmedium wie die SC-β-Zellen, um die Auswirkungen von Zeit zu steuern getestet.
Durchflusszytometrie
Die Zellen wurden in Einzelzellsuspension durch Inkubation in TrypLE Express bei 37°C für 10-30 min in einem 15 ml Falcon-Röhrchen verteilt. Schon ab Stufe 5 Clustern länger dauern, bis in einzelne Zellen zu trennen. Cluster sollten mit TrypLE Express inkubiert werden, bis sie zu trennen, um einzelne Zellen beim Mischen durch Pipettieren vorsichtig nach oben und unten mit einem PI-000. Die TrypLE Express wurde mit 3-4 mal Medien und Zellen wurden für 5 min bei 1 OOOrpm gesponnen abgeschreckt. Zellen wurden zweimal in PBS mit einer 1 .7ml sichere Abdichtung Mikrozentrifugenröhrchen gewaschen und übertragen (Bioscience Inc. ; 1 1510). Stellen Sie sicher, mit 1 -10 Mio. Zellen / Rohr und verwenden 0,5- 1 ml Volumina in den folgenden. Zellen wurden in 4% Paraformaldehyd (PFA) (Elektronenmikroskopie Scienc Nm; 1 5710) resuspendiert und auf Eis für 30 min inkubiert. Zellen wurden dann 3 mal gewaschen in PBS, gefolgt von Inkubation in Blockierungspuffer (PBS + 0. 1% TritonX 1 OO (VWR, EM-9400) + 5% Eselserum (Jackson Immunoresearch, 017-000- 121)) auf Eis für 1 Stunde. Nach der Fixierung Zellen resistenter gegenüber Zentrifugation so nach Fixierung alle Zentrifugationen wurden bei 3000 g für 3 min durchgeführt.
Zellen wurden dann in Blockierungspuffer mit primären Antikörpern, resuspendiert und bei 4°C über Nacht inkubiert.
Primäre Antikörper wurden verwendet, 1: 300, wenn nicht anders vermerkt: Ziege Anti-Human-PDX-1 / IPF 1 (R & D Systems; AF2419), Maus-Anti-N X6-1 (University of Iowa, Entwicklungs Hybridoma Bank; F55A 12- Überstand) (1: 100), Kaninchen anti-Chromogranin A (Abeam; ab 5160 1), Ratte anti-Insulin (pro -) / C-Peptid (Developmental Studies Hybridoma Bank, auf der Universität von Iowa, GN-ID4) (Notwendigkeit Glukagon und Somatostatin hinzufügen). Zellen wurden 2-mal in Blocking-Puffer gewaschen und dann in Blockierungspuffer mit sekundärem Antikörper auf Eis für 2 Stunden (vor Licht geschützt) inkubiert. Sekundärantikörper Alexa Fluor 488, 647 (Life Technologies) oder PE (Thermo Fisher Scientific; NC9774252) konjugiert wurden verwendet, um primäre Antikörper zu visualisieren. Zellen wurden dann 3 mal gewaschen in Sortierpuffer (PBS + 0,5% BSA (Sigma, A8412)) und schließlich in 500-700µl Sortierpuffer resuspendiert, durch ein 40 um Nylon-Maische in FACS-Röhrchen filtriert (BD Falcon; 352.235), und analysiert unter Verwendung die LSR-II FACS Maschine (BD Biosciences) mit mindestens 30000 Ereignisse aufgezeichnet.
Die Analyse der Ergebnisse erfolgte mit der FlowJo Software.
Immunfluoreszenz
wurden die Zellen dispergiert und auf 96-Well-Platten ausplattiert. Nach einem Tag der Kultur wurden die Zellen in PBS in 4% PFA für 20 min bei RT gewaschen und fixiert. Folgende 3 Waschungen mit PBS wurden die Zellen für 1 Stunde bei RT in PBS + 0,1% Triton X-100 + 5% Eselserum blockiert. 500 Verdünnung: Alle primären Antikörper-Inkubationen wurden über Nacht bei 4 ° C in Blockierungslösung bei einem 1 getan Ziege anti-human PDX-1 / IPFL, Maus-anti-NKX6-1 Kaninchen-Anti-Chromogranin A, Ratte-anti-Insulin (Pro -) / C-Peptid, Ki67. 500-Verdünnung (vor Licht geschützt): Zellen wurden 2-mal in PBS durch sekundäre Antikörper-Inkubation für 1 Stunde bei RT in einem 1 am nächsten Tag, gefolgt. Sekundärantikörper Alexa Fluor 488, 594 oder 647 (Life Technologies) konjugiert wurden verwendet, um primäre Antikörper zu visualisieren. Folgende 3 Waschungen mit PBS wurden alle Kerne durch Färbung mit DAPI (Invitrogen visualisiert; D1306). Repräsentative Bilder wurden unter Verwendung eines Olympus 1X51 Mikroskop oder Zeiss LSC 700 konfokalen Mikroskop gemacht. Der Anteil der Zielzelltypen wurde mit der Array-Scan Cellomics High-Content-Screening-System quantifiziert. Hier 30 Bilder wurden pro Vertiefung erfasst und quantifiziert. Zellen, die durch Antikörperfärbung und Gesamtzellzahl (basierend auf DAPI Kerne Färbung) markiert waren, um quantifizierte Anteils der Zielzelltypen zu erhalten.
Immunhistochemie
Zell-Cluster oder Inseln wurden durch Eintauchen in 4% PFA für 1 Stunde bei RT fixiert. Proben wurden dann 3-mal mit PBS gewaschen, in HistoGel ™ eingebettet und für die histologische Analyse geschnitten. 10 µm Schnitte wurden dann einer deparrafinization Verwendung Histoclear (Thermoscientific; C78-2-G) und rehydratisiert. Für Antigen-Retrieval-Objektträger wurden in 0,1 M EDTA (Ambion, AM9261) hervorgegangen und in einem Dampfkochtopf gelegt
(Proteogenix; 2100 Retriever) für zwei Stunden. Objektträger wurden dann mit PBS + 0,1% Triton X-100 + 5% Eselserum für 1 Stunde bei RT geblockt, gefolgt von einer Inkubation in Blockierungslösung mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 ° C. Die folgenden primären Antikörper wurden verwendet, 1: 100, wenn nicht anders vermerkt: Ziege-Anti-Human PDX-1/IPF 1, Maus-Anti-NKX6- 1, Kaninchen-anti-Chromogranin A, Ratte anti-Insulin (pro -) / C-Peptid, Glucagon, Somatostatin. Zellen wurden 2-mal in PBS gewaschen, am nächsten Tag, gefolgt von sekundärem Antikörper Inkubation für 2 h bei RT (vor Licht geschützt). Sekundärantikörper Alexa Fluor 488 oder 594 konjugiert wurden verwendet, um primäre Antikörper zu visualisieren. Mit Deckgläschen bedeckt und mit Nagellack versiegelt; Nach Waschen mit PBS wurden die Histologiepräparaten in Vectashield Eindeckmedium mit DAPI (H-1200 Vector Laboratories) montiert. Repräsentative Bilder wurden unter Verwendung eines Olympus 1X51 Mikroskop oder Zeiss LSM 510 oder 710 konfokalen Mikroskop gemacht.
Glucose stimuliert die Insulinsekretion
rebs Puffer (Krb): Di H20 mit 128 mM NaCl, 5 mM KC1, 2,7 m CaCl 2, 1 0,2 mM MgCl 2, 1 mM Na2HP0, 1 0,2 mM KH2P04, 5 mM NaHC03, 10 mM HEPES (Life Technologies ; 15630080), 0,1% BSA (Proliant; 68700). Lösungen wurden auf 37 ° C im Inkubator äquilibriert und 1 ml Volumen wurden in dem folgenden Protokoll verwendet. Etwa 0,5 Millionen Zellen als Cluster übertragen wurden zu 1 .7ml sichere Abdichtung Mikrozentrifugenröhrchen autoklaviert und 2-mal gewaschen in Krb. Cluster wurden dann in Krb mit 2 mM Glukose vorinkubiert 2 Stunden lang im Inkubator, um restliche Insulin zu entfernen. Es ist erwähnenswert, dass für alle Inkubationen Gefäßdeckel wurden offen gelassen und mit einem Deckel, die für den Luftaustausch darf abgedeckt. Cluster wurden 2-mal in Krb gewaschen und dann in Krb inkubiert, das 2 mM Glucose für genau 30 min und 200 ul der nach der Inkubation (niedriger Glucoseprobe) Überstand gesammelt. Cluster wurden 2-mal in Krb gewaschen und dann in 20 mM Glucose mit Krb für genau 30 min und 200 ul Überstand inkubiert wurde nach Inkubation (hoher Glukoseprobe) gesammelt. Challenging mit niedriger und hoher Glucose wurde zwei weitere Male (3 gepaart Herausforderungen insgesamt) wiederholt. Schließlich wurden die Cluster 2 mal in Krb gewaschen und dann in Krb mit 2 mM Glucose + 30 mM KC1 für genau 30 min und 200 ul Überstand inkubiert wurde nach Inkubation (KC1 Polarisations Herausforderung Probe) gesammelt. Nach der KG Challenge wurden Clustern mit Tryple dispergiert und durch Viacel gezählt (Hersteller), um die Insulinsekretion Mengen zu normalisieren durch Zellzahl.
Standsproben sekretierten Insulin enthielten, wurden dann unter Verwendung des Ultra Menschliches Insulin ELISA verarbeitet (ALPCO Diagnostics; 80 INSHUU- E01.1) und die Proben wurden durch eine FLUOstar optima Spektrophotometer (BMG lantech) bei 450 nm gemessen. Wenn der ELISA nicht am gleichen Tag durchgeführt wird, wurden die Proben bei -80 ° C gelagert. Um die Insulinkonzentration im Bereich der ELISA erhalten, Verdünnen der Proben zwischen 1: 100 und 1: 200 in PBS wurde in der Regel ausreichend.
Die Elektronenmikroskopie
Zellcluster wurden mit einer Mischung, die 1 .25% PFA, 2,5% Glutaraldehyd und 0,03% Pikrinsäure in 0,1 M Natrium cocodylate Puffer (pH 7,4) für mindestens 2 Stunden bei RT. Zellcluster wurden dann in 0,1 M Cacodylatpuffer, für mindestens 2 Stunden bei RT gewaschen und post- mit einer Mischung von 1% Osmiumtetroxid (Os04) und 1, 5% Kaliumferrocyanid (KFeCN6) befestigt ist, in 0,1 M Cacodylatpuffer gewaschen und mit 1% Osmiumtetroxid (Os04)/ 1 0,5% Potassiumferrocyanide (KFeCN6) für 1 Stunde nachfixiert, in Wasser 3x 1 Stunde, gefolgt von 2 Waschungen in Wasser und nachfolgende Dehydratisierung in Qualitäten von gewaschen und in 1% igen wässrigen Uranylacetat angefärbt Alkohol (1 Omin jeweils; 50%, 70%, 90%, 2×1 Omin 100%). Die Proben wurden dann in propylenoxid für 1 Stunde inkubiert und in einem ON 1 infiltriert: 1 Mischung von Propylenoxid und TAAB Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, Kanada). Am folgenden Tag wurden die Proben in TAAB Epon eingebettet und bei 60 ° C für 48 Stunden polymerisiert. Ultradünnschnitte (etwa 60 nm) wurden auf einem Reichert-Ultracut-S Mikrotom geschnitten, nahm auf Kupfergittern, mit 0,2% Bleicitrat gefärbt und in einem JEOL 1200EX Transmissions-Elektronenmikroskop oder einem TecnaiG <2> Geist BioTWFN sucht. Die Bilder wurden mit einem AMT 2k CCD-Kamera erfasst und mit ImageJ Software analysiert.
SCID-beige Transplantationsstudien
5 Millionen HPSC abgeleitete Zellen als Cluster wurden in RPMI 1640 Medium (Life Technologies, 1 1 875-093) resuspendiert, wobei das Volumen von 200 ul in die PCR-Röhrchen aliquotiert und auf Eis gehalten, für 5 bis 10 Minuten vor dem Laden in der Katheter. Zur Herstellung von Zellenbelastung, jedem Katheter, Infusionssatz 23G x 3/4 „(Terumo, SB * S23BL) bis I-ml-Spritze verbunden ist, wurde mit 1 ml 5% FBS-Serum (Corning gespült; 35-01 1 -CV) hinzugefügt RPMI-Medium dann mit 0,6 ml von nicht-Serum beladen hinzugefügt RPMI-Medium. Cluster wurden durch die Spitze des Katheters Nadel geladen und vertikal angeordnet, um auf der Unterseite des Katheterschlauchs und in der Nähe der Spitze der Nadel durch die Schwerkraft für 5 Minuten bei Zimmertemperatur zu regeln. Während der Zellpräparationsschritt, immundefizienten (SCID / Beige) Mäuse (welchem Alter?) Wurden mit Avertin 1 .25% (250 mg / kg anästhesiert; 0,5 ml / 25 g 1% .25
Avertin / Körpergewicht) und linken Herzkammer Operationsstelle wurde rasiert und mit Betadin und Alkohol desinfiziert. Einschnitt von etwa 1 cm wurde gemacht, um die Niere freizulegen, und Cluster wurden unter die Nierenkapsel durch Einfügen Katheter Nadel unter die Nierenkapsel und Injizieren zu 1 OOul enthaltende Volumen 5.000.000 äquivalente Zellen von Clustern injiziert. Bauchhöhle wurde mit PDS resorbierbaren Fäden verschlossen (POLY-DOX; 2016- 06)) und die Haut mit chirurgischen Klammern (Kent Scientific Corp; INS750346-2). Die Mäuse wurden auf einem Mikro Temp Umwälzpumpe und Decke (~ 37 ° C) während der Operation / Erholungszeit in der schnellen Erholung von Mäusen nach der Narkose zu unterstützen platziert und mit einer Dosis von 5 mg / mkg Carprofen direkt nach der Operation und 24 Stunden nach der ersten Dosis. Die durchschnittliche Zeit für die Transplantation ist in ungefähr 3 Minuten pro Maus. Wundklammern wurden 14 Tage nach der Operation entfernt und die Mäuse wurden zweimal pro Woche überwacht.
Nach zwei Wochen der Erholung von der Operation, die Anwesenheit von humanem Insulin und der Glucoseempfindlichkeit der transplantierten Zellen wurden pro Bilden Glukosetoleranztest (GTT) beurteilt. (+) - - Nach dem Fasten die Mäuse für 16 Stunden über Nacht wurde GTT durch IP-Injektion von 2 g D durchgeführt Glukose /1 kg Körpergewicht und Blutsammlung vor und / oder nach der Injektion durch die Vena facialis Punktion mit Lanzette (Feather; 2017- 01). Humaninsulin wurde anschließend unter Verwendung des Human-Insulin-ELISA-Kits quantifiziert (ALPCO Diagnostics; 80-INSHUU-EO 11.). (Elektronenmikroskopie Scienc Nm; 15710) Transplantate wurden aus den SCID-Mäusen, in 4% PFA fixiert seziert, in Paraffin eingebettet und für die histologische Analyse geschnitten.
Calcium Imaging
etwa 10 bis 20 HPSC abgeleitet Cluster wurden auf 96-Well-Platte mit Matrigel beschichtet und man ließ sie für 24 Stunden in einem Inkubator bei 37°C anhaften, 5% C02 und 100% Luftfeuchtigkeit plattiert. Cluster wurden gewaschen mit vorgewärmtem (37°C) Krebs-Puffer mit 2,5 mM Glucose dann mit 50µM Ca <2 +> inkubiert - sensitiven Fluoreszenz Fluo4-AM (Life Technologies; F 14217) in 2,5 mM Glucose Krb Puffer für 45 Minuten Inkubator bei 37°C. Cluster wurden mit 2,5 mM Glucose Krb Puffer dann weiter in 37 ° C Inkubator für weitere 15 Minuten inkubiert. Cluster wurden dann sofort inszeniert im AxioZoom VI 6-Mikroskop (Carl Zeiss) für die Anschaffung von hochauflösenden Zeitreihen-Bildgebung von mehreren Chargen von Clustern in verschiedenen Vertiefungen. Fluo-4 wurde bei 488 nm angeregt wird und dessen Emission wurde zwischen 490 und 560 nm aufgezeichnet. Zeitreihen-Bilder wurden auf Einzelzellauflösung von 80x Vergrößerung in alle 17 Sekunden erfasst und bis zu 10 Löcher wurden in einem bildgebenden abgebildet. Progression von Glucose Herausforderungen und Zeit der Stimulation während der Bilderzeugung war wie folgt.
Imaging begann mit 5 Minuten Stimulation von 2 mM Glucose in Krb gefolgt von 5 Minuten Stimulation von 20 mM Glucose in rb Puffer. Diese niedrigen dann hohe Glukose Stimulationen wurden zwei weitere Male wiederholt, dann Bildgebung mit 5 Minuten Stimulation der 30 mM KC1 in Krb Puffer und mit der Gesamtaufnahmezeit von 35 Minuten beendet. Zwischen den Stimulationen Bildgebung wurde gestoppt und Cluster wurden mit 2 mM Glucose gewaschen Krb Puffer und dann mit dem nächsten Glucose Krb Puffer zugegeben. Fluoreszenzintensität ändert sich während 35 Minuten Bildgebung wurden in Einzelzellauflösung mit ImageJ / Fiji, indem STACKREG, um die Bewegung der Cluster im Laufe der Bildgebung und Rol-Manager zu korrigieren, um die Fluoreszenzintensität der Zellen im ganzen Messung analysiert Imaging. Alle 7 Stimulationen von 5 Minuten-Clips wurden in einem Film mit VirtualDub gemacht und in youtube zur gemeinsamen Nutzung von Daten veröffentlicht.
Die intrazelluläre Durchflusszytometrie und Genexpressionsanalyse
MARIS erfolgte wie in Hrvatins et al., 2014 beschrieben durchgeführt. Die Zellen wurden in Einzelzellsuspension geerntet, in 4% PFA auf Eis fixiert, mit primären Antikörper und dann Sekundärantikörper in Puffer, der RNasin inkubiert. Zellen wurden dann mittels FACS sortiert, um mindestens 100.000 Zellen pro Probe zu erhalten. Proben wurden anschließend in Verdaupuffer bei 50 ° C für 3 Stunden vor der RNA-Isolierung inkubiert. RNA-Konzentration wurde unter Verwendung von Nanodrop 1000 quantifiziert. Doppelsträngige cDNA wurde durch reverse Transkription von mindestens 1 Oong Gesamt-RNA erzeugt. Amplified mRNA (cRNA) wurde dann durch In vitro-Transkription mit Biotin-markierten Nukleotiden erzeugt über Nacht und durch Vakuumzentrifugation bei 30 ° C eingeengt. Mindestens 750ng cRNA pro Probe wurde auf Menschen HT- 12 Expression BeadChips (Illumina) mit dem Whole-Genome Expression Direkt Hybridization Kit (Illumina) hybridisiert. Chips wurden auf der Illumina Beadstation 500 gescannt. Rohdaten wurde durch Subtraktion des Hintergrunds und rank-invariant Normalisierung eingestellt. Vor der Berechnung fache Veränderung wurde ein Versatz von 20 auf alle Sondensatz bedeutet, negative Signale zu beseitigen aufgenommen. Die p-Werte für die Unterschiede zwischen den Durchschnittssignale wurden in GenomeStudio durch t-Test berechnet und für mehrere Hypothesen Tests durch die Benjamini-Hochberg-Methode in Kombination mit dem Illumina individuelle False Discovery Rate (FDR) Modell korrigiert. Aguayo-Mazzucato, C, Zavacki, AM, Marinelarena, A., Hollister-Lock, J., Khattabi, IE, Marsili, A., Weir, GC, Sharma, A., Larsen, PR und Bonner- Weir, S . (2013). Schilddrüsenhormon fördert Postnatale Rattenpankreas β-Zellentwicklung und Glucose-Responsive Insulinsekretion Durch MAFA. Diabetes 62, 1569-580.
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Claims

Einrichtung, welche eine Einrichtung mit einer Population nicht-nativer Pankreas-ß-Zellen umfasst, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen eine in vitro Glucose-stimulierte Insulin-Sekretion-Antwort auf einen Glucose-Test zeigen, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen mindestens eines von Somatostatin und Glucagon nicht exprimieren, und worin die Einrichtung ausgestaltet ist, Insulin zu produzieren und sezernieren, wenn in einem Individuum implantiert.
Einrichtung nach Anspruch 1, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen eine in vitro Glucose-stimulierte Insulin-Sekretion-Antwort auf einen ersten Glucose-Test, einen zweiten Glucose-Test, und einen dritten Glucose-Test zeigen, wenn der erste Glucose-Test, der zweite Glucose-Test und der dritte Glucose-Test nacheinander durchgeführt werden.
Einrichtung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Insulin-Sekretion durch die nicht-native Pankreas-ß-Zelle in Antwort auf einen Glucose-Test proportional zu der Glucose-Konzentration in dem Glucose-Test ist.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 1-3, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen ein oder mehrere kristalline Insulin-Körnchen umfassen.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 1-4, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen einen cytosolischen Ca2⁺-Flux in Antwort auf eine aufeinanderfolgende Anwendung eines ersten Glucose-Tests und eines zweiten Glucose-Test zeigen.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 1-5, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen monohormonell sind.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 1-6, worin Insulin durch die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen in mindestens 0,5 µIU pro 1000 Zellen pro 30 Minuten Inkubation sezerniert wird, wenn die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen mindestens 20 mM Glucose ausgesetzt werden.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 1-7, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen ein Genexpressions-Profil aufweisen, das verschieden ist von dem Genexpressions-Profil einer nativen ß-Zelle.
Einrichtung nach Anspruch 1-8, welches weiter Mikroträger oder Mikrokapseln umfasst.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 1-9, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen in einem Biomaterial verkapselt sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Alginat, PEG, Chitosan, PES-Hohlfasern, Kollagen, Hyaluronsäure, Dextran mit RGD, EHD, PEGDA, PMBV, PVA, PGSAS, Agarose, Agarose mit Gelatine, PLGA, und jede Kombinatinen davon.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 1-10, welche weiter eine semipermeable Membran umfasst, worin die semipermeable Membran ausgestaltet ist, die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen in dem Einrichtung zurückzuhalten und einen Durchgang von durch die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen sezerniertem Insulin zu ermöglichen.
Einrichtung nach Anspruch 11, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen durch die semipermeable Membran in einer Insel-Kammer von einer oder mehreren Vaskularisations-kammern des Einrichtung getrennt sind.
Einrichtung nach Anspruch 11 oder 12, worin die semipermeable Membran aus Polysaccharid oder Polykation besteht.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 1-13, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen vor Verkapselung mit PEG modifiziert werden.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 1-14, welche weiter einen Immunantwort-Modulator umfasst.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 1-15, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen genetisch modifiziert sind.
Einrichtung nach Anspruch 16, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen unter Verwendung des CRISPR Genom-Editiersystems genetisch modifiziert sind.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 1-17, welche weiter alpha Zellen und delta Zellen umfasst.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 1-18, welche weiter resorbierbare oder biologisch abbaubare Matrix-Gerüste umfasst.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 1-19, welche weiter ein extrakorporales Segment umfasst.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 1-20, welche weiter umfasst einen sonic-hedgehog (SHH) Weg-Inhibitor, einen Retinsäure-Signalweg-Aktivator, einen γ-Sekretase-Inhibitor, einen TGF-ß Signalweg-Inhibitor, einen Thyroidhormon-Signalweg-Aktivator, einen Wachstumsfaktor der epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) Familie, einen Knochen morphogenes Protein (BMP) Signalweg-Inhibitor, einen Proteinkinase C-Aktivator, einen Wachstumsfaktor der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) Familie, einen Wnt Signalweg-Aktivator, einen Wachstumsfaktor der TGF-β-Superfamilie, oder jede Kombination davon.
Einrichtung zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes in einem diese benötigenden Individuum, worin die Einrichtung eine Population nicht-nativer Pankreas-ß-Zellen umfasst, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen eine in vitro Glucose-stimulierte Insulin-Sekretion-Antwort auf einen Glucose-Test zeigen, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen nicht mindestens eines von Glucagon und Somatostatin exprimieren, und worin die Einrichtung ausgestaltet ist, Insulin zu produzieren und freizusetzen, wenn sie in das Individuum implantiert ist.
Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes, worin die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge nicht-nativer Pankreas-ß-Zellen umfasst, worin: (a) die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen ein oder mehrere kristalline Insulin-Körnchen umfassen; (b) die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen eine in vitro Glucose-stimulierte Insulin-Sekretion-Antwort auf einen Glucose-Test zeigen; und (c) die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen nicht mindestens eines von Glucagon und Somatostatin exprimieren.
Zusammensetzung nach Anspruch 23 zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-eine in vitro Glucose-stimulierte Insulin-Sekretion-Antwort auf einen ersten Glucose-Test, einen zweiten Glucose-Test, und einen dritten Glucose-Test zeigen, wenn der erste Glucose-Test, der zweite Glucose-Test und der dritte Glucose-Test nacheinander durchgeführt werden
Zusammensetzung nach Anspruch 23 oder 24 zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes, worin die Insulin-Sekretion durch die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen in Antwort auf einen Glucose-Test proportional zu der Glucose-Konzentration in dem Glucose-Test ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 23-25 zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen einen cytosolischen Ca²⁺ Flux in Antwort auf eine aufeinanderfolgende Anwendung eines ersten Glucose-Tests und eines zweiten Glucose-Test zeigen.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 23-26 zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen monohormonell sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 23-27 zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes, worin das durch die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen sezernierte Insulin mindestens 0,5 µIU pro 1000 Zellen pro 30 Minuten Inkubation ist, wenn die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen an mindestens 20 mM of Glucose exponiert sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 23-28 zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen ein Genexpressions-Profil aufweisen, das verschieden ist von dem Genexpressions-Profil einer nativen ß-Zelle.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 23-29 zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen genetisch modifiziert sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 23-30 zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes, worin die nicht-nativen Pankreas-ß-Zellen in einem Biomaterial verkapselt sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Alginat, PEG, Chitosan, PES-Hohlfasern, Kollagen, Hyaluronsäure, Dextran mit RGD, EHD, PEGDA, PMBV, PVA, PGSAS, Agarose, Agarose mit Gelatine, PLGA, und jeden Kombinationen davon.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 23-31 zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes, welche weiter alpha-Zellen und delta-Zellen umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 23-32 zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes, welche weiter resorbierbare oder biologisch abbaubare Matrix-Gerüste umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 23-33 zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes, worin die Zusammensetzung intravenös, intraarteriell, intrathekal, intraventriculär, intraparenchymal, intrakranial, intrazisternal, intrastriatal, intramuskulär, oder intranigral verabreicht wird.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 23-34 zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes, welches weiter umfasst einen sonic-hedgehog (SHH) Weg-Inhibitor, einen Retinäure Signalweg-Aktivator, einen γ-Sekretase-Inhibitor, einen TGF-ß Signalweg-Inhibitor, einen Schilddrüsenhormon-Signalweg-Aktivator, einen Wachstumsfaktor der epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) Familie, einen morphogenes Knochen-Protein (BMP) Signalweg-Inhibitor, einen Proteinkinase C-Aktivator, einen Wachstumsfaktor der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) Familie, einen Wnt Signalweg-Aktivator, einen Wachstumsfaktor der TGF-ß Superfamilie, oder jede Kombination davon umfasst.