JP2013524836A - 多能性細胞からの前部前腸内胚葉の生成 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2010年4月25日出願の米国特許仮出願第61/343,272号;2010年10月12日出願の米国特許仮出願第61/392,429号;および2011年1月25日出願の米国特許仮出願第61/436,166号の利益を主張する。前述のすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)によって授与された助成金交付番号第5T32CA078207-12の下で政府の支援で行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
(i)多能性細胞を誘導して胚体内胚葉細胞を形成するために、塩基性FGF(bFGF)、骨形態形成タンパク質4(BMP4)およびアクチビンAの存在下で前記多能性細胞を培養するステップと、
(ii)胚体内胚葉細胞を誘導して前部前腸内胚葉細胞を形成するために、BMPの阻害剤、例えば、ノギンまたはコーディンまたはフォリスタチン、および/またはTGF-βシグナル伝達の阻害剤、例えば、SB-431542の存在下およびアクチビンAの非存在下で胚体内胚葉細胞を培養するステップと
を含む方法を提供する。
胚体内胚葉のヒトESもしくはiPS細胞からの生成は、マウスES細胞から胚体内胚葉を発生させるために用いられるプロトコールを適合することにより達成され得る。Kuboら、Development 131巻:1651〜1662頁(2004年);Gadueら、Proc Natl Acad Sci USA 103:16806〜16811頁(2006年);Gouon-Evansら、Nat Biotechnol、24巻:1402〜1411頁(2006年)。ヒトES細胞を、低濃度のBMP4(例えば、約0.5〜10ng/ml、例えば、1ng/ml)でパルス標識し、低濃度のBMP4およびbFGF(例えば、約5〜20ng/ml、例えば、約10ng/ml)中で培養し、次いで、組織処理されていないプラスチック上で高濃度のアクチビンA(50〜500ng/ml、例えば、75〜150ng/ml、例えば、約100ng/ml)中で培養し、胚様体(EB)の形成をもたらす。EBは、実質的に均一に内胚葉からなる。内胚葉の発生は、CXCR4およびc-KITの発現によって確認することができる。内胚葉の発生は、5日まで、ESマーカーであるSOX2を喪失し、MIXL1、SOX17およびFOXA2を経時的に獲得することによって達成される。
アクチビンAが内胚葉を誘導するが、アクチビンAは、この組織を後方化することが発見されている。したがって、前部前腸内胚葉の調製は、アクチビンAを低減するまたは除去し、その後、胚体内胚葉を形成することが必要である。したがって、特定の態様において、本発明は、前部前腸内胚葉について濃縮された集団細胞の形成ならびに中間のおよび後部の内胚葉シグナルの欠乏のための方法を提供する。かかる集団は、前部前腸内胚葉に存在する分子マーカーを発現し、前部前腸内胚葉に存在しない分子マーカーが欠乏する。
したがって、特定の実施形態において、本発明は、前部前腸内胚葉細胞について濃縮された細胞集団を提供する。前部前腸内胚葉の濃縮された集団は、少なくとも25%、例えば、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または少なくとも99.9%の前部前腸内胚葉細胞を含む。
胸腺、副甲状腺、気管および肺などの最も多くの前部前腸内胚葉に由来するほとんどの臓器は、前部前腸内胚葉の腹側または腹外側の面である。
肺マーカーGATA6を発現する腹側化した前部前腸内胚葉は、Wntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子(EGF)および線維芽細胞増殖因子(FGF)からなる群から選択される1種または複数の因子と併用したレチノイン酸(RA)で処理することにより誘導することができる。いくつかの実施形態において、肺マーカーの誘導(例えば、肺マーカーを発現する細胞または組織の生成)は、Wnt3a、FGF10、FGF7、BMP4、EGFおよびRAの存在下で胚体内胚葉を培養することにより促進される。
19日目までWnt3a、FGF10、FGF7、BMP4、EGFおよびRAで処理を継続することによって、低レベルの末端II型肺胞細胞マーカーSP-Cをもたらした。これらの因子が、11日目にWnt3a、FGF7およびFGF10により置換されたとき、SP-Cの最適な発現は達成された。
前部前腸内胚葉が、Wnt3a、FGF10、FGF7、BMP4、EGFの存在下で腹側化され、それに続いて、11日目にこれらの因子を除去し、SHH、FGF8またはその両方を添加したとき、腹側化した前部前腸内胚葉からの特異的な副甲状腺マーカーの誘導は達成された。
特定の実施形態において、本発明は、前部前腸内胚葉細胞の増殖、分化または生存に影響を与える作用物質を同定するための方法を提供する。これらの方法は、試験される作用物質の存在下で前部前腸内胚葉細胞の濃縮された集団を培養するステップと、前記作用物質の存在下および非存在下で前記細胞の増殖、分化または生存を比較するステップとを含み、前記作用物質の存在下での違いは、前記細胞の増殖、分化または生存に影響を与える作用物質の同定を示している。
本明細書に記載した方法により誘導され、多能性細胞に由来する前部前腸内胚葉細胞は、それに由来する組織への損傷から起こる状態またはそれに由来する組織の非存在から起こる状態を治療するための細胞置換治療用の細胞または組織の生成に有用であり、その状態とは、例えば、それだけには限らないが、甲状腺が、遺伝子突然変異、自己免疫攻撃または(甲状腺機能亢進症または甲状腺癌の場合)外科的除去のため機能的でない(甲状腺機能低下症);遺伝的原因による、または外科的アブレーション後に起こる副甲状腺機能低下症;肺損傷;例えば、同種造血幹細胞移植(HSCT)によって損傷したまたは先天性疾患(ディジョージ症候群およびNude/SCID症候群)のため存在しない胸腺上皮などであった。
本発明を、以下の実施例においてさらに記載しており、これは特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を制限しない。
ヒト胚性および人工多能性幹細胞からの前部前腸内胚葉の生成
以下の材料および方法を、本実施例において用いた。
胚本体の3つの胚葉のうちの1つである、胚体内胚葉は、原腸形成6中の高濃度のアクチビンA、模倣のnodalシグナル伝達によりES細胞から誘導される。定量的PCRによりhES細胞系HES2におけるこの過程の実験により、原始線条マーカーMIXL1、次いで、内胚葉転写因子SOX17およびFOXA2がアップレギュレートされる転写カスケードが明らかになった(図1A)(D'Amourら、Nat.Biotechnol.24巻、1392〜1401頁(2006年);Gouon-Evansetら、Nat.Biotechnol.24巻、1402〜1411頁(2006年);Gadueら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103巻、16806〜16811頁(2006年);Zorn & Wells、Annu.Rev.Cell Dev.Biol.25巻、221〜251頁(2009年);Yasunagaら、Nat.Biotechnol.23巻、1542〜1550頁(2005年))。4dのアクチビンAへの曝露後、細胞の>95%は、胚体内胚葉マーカーCXCR4、c-KITおよびEPCAMを発現した(図1B)(Yasunagaら、Nat.Biotechnol.23巻、1542〜1550頁(2005年))。原腸形成後、胚体内胚葉は、前後軸のアイデンティティーが異なる管を形成する(Zorn & Wells、Annu.Rev.Cell Dev.Biol.25巻、221〜251頁(2009年))。胚体内胚葉内で、多能性マーカーSOX2は、前腸マーカーとして再出現し、CDX2は、後腸を同定する(Sherwoodら、Dev.Dyn.238巻、29〜42頁(2009年))。培養の5日目のアクチビンA除去後、CDX2およびSOX2の両方の発現の増加を観察し(図1A)、前部および後部の胚体内胚葉の混合物の生成が示唆された。したがって、胚体内胚葉の誘導後に付加されたどのシグナルが、前部(SOX2+)内胚葉生成を促進し、後部の(CDX2+)内胚葉生成を抑制するかを実験した。
本発明が、その詳細な説明と併せて記載されており、前述の説明は例証するものであり、添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限するものではないということが理解されるべきである。他の態様、利点、および修正形態は、以下の特許請求の範囲内である。
Claims (51)
- 前部前腸内胚葉細胞について濃縮された細胞集団。
- 少なくとも約50%の前部前腸内胚葉細胞を含む、請求項1に記載の細胞集団。
- 前記前部前腸内胚葉細胞が咽頭内胚葉細胞である、請求項1または2に記載の細胞集団。
- 前部前腸内胚葉細胞を誘導する方法であって、胚体内胚葉細胞をBMPの阻害剤またはTGF-βシグナル伝達の阻害剤を用いて培養するステップを含む方法。
- 前記胚体内胚葉細胞をBMPの前記阻害剤およびTGF-βシグナル伝達の前記阻害剤を用いて培養するステップを含む、請求項4に記載の方法。
- 胚体内胚葉が、アクチビンAの非存在下で培養される、請求項4または5に記載の方法。
- BMPの前記阻害剤が、ノギン、コーディン、またはフォリスタチンである、請求項4〜6のいずれか一項にに記載の方法。
- BMPの前記阻害剤がノギンである、請求項7に記載の方法。
- TGF-βシグナル伝達の前記阻害剤が、SB431542である、請求項4から8のいずれか一項に記載の方法。
- BMPの前記阻害剤がノギンであり、TGF-βシグナル伝達の前記阻害剤がSB-431542である、請求項4から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉細胞が胚様体細胞である、請求項4から10のいずれか一項に記載の方法。
- アクチビンA中で前記胚体内胚葉細胞を培養するステップをさらに含む、請求項4から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉細胞が、アクチビンAの非存在下でBMPの前記阻害剤およびTGF-βシグナル伝達の前記阻害剤を用いて培養される、請求項4から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記前部前腸内胚葉細胞がヒト細胞である、請求項4から13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記前部前腸内胚葉細胞が多能性細胞に由来する、請求項4から14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多能性細胞がES細胞である、請求項15に記載の方法。
- 前記多能性細胞がiPS細胞である、請求項15に記載の方法。
- 前記多能性細胞がヒト細胞である、請求項15から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記前部前腸内胚葉細胞がFoxa2を発現し、前記胚体内胚葉細胞においてSox2およびCdx2の発現と比べて、Sox2発現のレベルの上昇およびCdx2発現のレベルの低下を含む、請求項4から18のいずれか一項に記載の方法。
- 多能性細胞から前部前腸内胚葉細胞の濃縮された集団を調製する方法であって、
(i)前記多能性細胞を誘導して胚体内胚葉細胞を形成する条件下で前記多能性細胞を培養するステップと、
(ii)前記胚体内胚葉細胞を誘導して前部前腸内胚葉細胞を形成する条件下で前記胚体内胚葉細胞を培養し、それによって、前部前腸内胚葉細胞の前記濃縮された集団を調製するステップと
を含む方法。 - 前記多能性細胞が、前記多能性細胞を誘導して前記胚体内胚葉細胞を形成するためにbFGF、BMP4およびアクチビンAの存在下で培養される、請求項20に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉細胞が、前記胚体内胚葉細胞を誘導して前記前部前腸内胚葉細胞を形成するためにBMPの阻害剤またはTGF-βシグナル伝達の阻害剤の存在下およびアクチビンAの非存在下で培養される、請求項20または21に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉細胞が、前記胚体内胚葉細胞を誘導して前記前部前腸内胚葉細胞を形成するためにBMPの前記阻害剤およびTGF-βシグナル伝達の前記阻害剤の存在下ならびにアクチビンAの非存在下で培養される、請求項22に記載の方法。
- BMPの前記阻害剤が、ノギンまたはコーディンである、請求項22または23に記載の方法。
- BMPの前記阻害剤がノギンである、請求項24に記載の方法。
- TGF-βシグナル伝達の前記阻害剤が、SB-431542である、請求項22から25のいずれかに記載の方法。
- 前記多能性細胞が1〜4日間培養される、請求項20から26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉細胞が2〜6日間培養される、請求項20から27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記前部前腸内胚葉細胞を単離するステップをさらに含む、請求項20から28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多能性細胞がES細胞である、請求項20から29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多能性細胞がiPS細胞である、請求項20から29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多能性細胞がヒト細胞である、請求項30または31に記載の方法。
- 請求項4から19のいずれか一項に記載の方法によって誘導された前部前腸内胚葉細胞。
- 請求項20から32のいずれか一項に記載の方法によって調製された前部前腸内胚葉細胞の濃縮された集団。
- 前部前腸内胚葉細胞の増殖、分化または生存に影響を与える作用物質を同定する方法であって、試験される作用物質の存在下で請求項1から3のいずれか一項に記載の細胞集団を培養するステップと、前記作用物質の存在下および非存在下で前記細胞の増殖、分化または生存を比較するステップとを含み、前記作用物質の存在下での違いが、前記細胞の増殖、分化または生存に影響を与える作用物質の同定を示している方法。
- 細胞分化に関与する遺伝子を同定する方法であって、胚体内胚葉細胞および前部前腸内胚葉細胞を単離するステップと、前記胚体内胚葉細胞および前記前部前腸内胚葉細胞の遺伝子発現プロフィールを比較するステップとを含み、前記胚体内胚葉細胞および前記前部前腸内胚葉細胞の間で差次的に発現する遺伝子の同定が、細胞分化に関与する遺伝子を示している方法。
- 胚体内胚葉から前部前腸内胚葉への進行の分子マーカーを認識する抗体を同定する方法であって、請求項1に記載の濃縮された細胞集団に対する抗体を産生させるステップと、前記抗体が前記胚体内胚葉に結合するよりも有意に高く前記前部前腸内胚葉に結合する抗体についてスクリーニングするステップとを含む方法。
- 前記抗体が、前記胚体内胚葉に有意に結合しない、請求項37に記載の方法。
- 前記前部前腸内胚葉細胞が、腹側化した前部前腸内胚葉細胞である、請求項1から3のいずれか一項に記載の細胞集団。
- 前部前腸内胚葉の腹側化を誘導する方法であって、Wntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子(EGF)および線維芽細胞増殖因子(FGF)からなる群から選択される1種または複数の因子で前記前部前腸内胚葉を培養するステップを含む方法。
- Wntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子(EGF)および線維芽細胞増殖因子(FGF)からなる群から選択される2つ以上の因子で前記前部前腸内胚葉を培養するステップを含む、請求項40に記載の方法。
- 前記因子が、FGF7、FGF10、EGF、BMP-4およびWnt3aからなる群から選択される、請求項40または41に記載の方法。
- 細胞中で肺の運命を誘導する方法であって、前記腹側化した前部前腸内胚葉細胞を誘導して前記肺の運命を示すために、レチノイン酸の存在下で、請求項4から32のいずれか一項に記載の方法によって産生された前部前腸内胚葉細胞を、Wntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子(EGF)および線維芽細胞増殖因子(FGF)からなる群から選択される1種または複数の因子で培養するステップを含む方法。
- 前記肺の運命の細胞を示す前記細胞が、1種または複数の肺マーカーを発現する、請求項43に記載の方法。
- 前記1種または複数の肺マーカーが、Gata6またはサーファクタントタンパク質C(SP-C)である、請求項44に記載の方法。
- 前記腹側化した前部前腸内胚葉細胞が、前部前腸内胚葉をWntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子(EGF)および線維芽細胞増殖因子(FGF)からなる群から選択される1種または複数の因子で培養することによって誘導された、請求項43に記載の方法。
- 前記腹側化した前部前腸内胚葉細胞が、前部前腸内胚葉をWntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子(EGF)および線維芽細胞増殖因子(FGF)からなる群から選択される2つ以上の因子を用いて培養することによって誘導された、請求項46に記載の方法。
- 前記腹側化した前部前腸内胚葉細胞が、前部前腸内胚葉をWntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子(EGF)および線維芽細胞増殖因子(FGF)からなる群から選択される2つ以上の因子で培養することによって誘導された、請求項47に記載の方法。
- 細胞中で副甲状腺の運命を誘導する方法であって、腹側化した前部前腸内胚葉細胞をソニックヘッジホッグ(SHH)および線維芽細胞増殖因子(FGF)で培養するステップを含む方法。
- 前記副甲状腺の運命の細胞を示す前記細胞が、副甲状腺マーカーを発現する、請求項49に記載の方法。
- 前記副甲状腺マーカーがGCMBである、請求項50に記載の方法。
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