JP6470687B2 - 小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製 - Google Patents

小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製 Download PDF

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Description

本発明は、ヒト胚体内胚葉(definitive endoderm)等の多能性幹(PS)細胞から膵臓内胚葉を作製する方法に関する。
ベータ細胞移植は、I型糖尿病の根本的な治癒をもたらす可能性がある。しかし、ドナーベータ細胞の限定された利用能は、この処置の臨床治療としての使用を制約する。多能性幹細胞は、無限に増殖し、多くの細胞型へと分化することができる。よって、PS細胞は、ベータ細胞の有望な供給源である。しかし、糖尿病の処置にPS細胞を用いる前に、PS細胞は、効率的にかつ再現性よく分化して膵臓細胞となる必要がある。
脊椎動物胚発生において、多能性細胞は、三胚葉;外胚葉、中胚葉および内胚葉を生じる。胚体内胚葉(DE)の誘導は、内胚葉由来組織の形成に向けた最初の工程である。DE細胞から膵臓内胚葉(PE)の作製は、インスリン産生ベータ細胞の作製に必要である。内分泌前駆細胞(EP)となる潜在性を有するPE細胞は、2種の重要な転写因子、PDX1およびNKX6.1の共発現を特徴とする。
PS細胞から膵臓細胞を作製するために、段階的in vitro分化プロトコールが確立された。このようなプロトコールは一般に、SOX17およびFOXA2を共発現するDEや、原腸、前腸後部、PE、EPならびに最終的には成熟したベータ細胞の形成等、いくつかのステージを含む膵発生の主要な事象を模倣する。現在までに、hES細胞の効率的なDE分化は、アクチビンA処理により達成された。膵臓ベータ細胞の作製における次の主要な工程は、PDX1およびNKX6.1を共発現するPEを作製することである。いくつかのグループが、PS細胞をDEおよびPEに分化させることのできるin vitroプロトコールを開発したが、これらはごく僅かな割合のNKX6.1/PDX1二重陽性(db+ve)細胞を作製することしかできず、重要なことに、in vitroで完全に成熟したベータ細胞を作製することはできなかった[Caiら(2010);D'Amourら(2006);Kunisadaら(2012);Schulzら(2012);Zhangら(2009);Ameriら(2010)]。
WO/2010/136583 WO03/055992 WO2007/042225
本発明は、少なくとも5%の細胞がPDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を産生する方法であって、胚体内胚葉(DE)細胞を、
a.BMP阻害剤LDN-193189[table 1(表1)に列挙されている]
b.キナーゼ阻害剤[table 1(表1)およびtable 2(表2)に列挙されている]
c.レチノイン酸受容体アゴニスト[table 2(表2)に列挙されている]
からなる群の少なくとも1種の化合物の有効量に曝露して、ヒトDE細胞を膵臓細胞または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法に関する。
本発明は、少なくとも5%の細胞がPDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を産生するための方法であって、DE細胞を、
a.BMP阻害剤LDN-193189[table 1(表1)に列挙されている]
b.N-アルキル化された、またはN-アルキル化されていない1,9-ピラゾロアントロン(pyrazoloanthrone)の異性体[table 1(表1)およびtable 2(表2)に列挙されている]
c.レチノイン酸受容体アゴニスト[table 2(表2)に列挙されている]
からなる群の少なくとも1種の化合物の有効量に曝露して、ヒトDE細胞を膵臓または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法にさらに関する。
本発明は、少なくとも5%の細胞がPDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を産生するための方法であって、胚体内胚葉細胞を、
a.BMP阻害剤LDN-193189
b.JNK阻害剤II
c.AM580
からなる群の少なくとも1種の化合物の有効量に曝露して、ヒトDE細胞を膵臓または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法にさらに関する。
本発明は、少なくとも5%の細胞がPDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を作製するための方法であって、胚体内胚葉細胞を有効量のBMP阻害剤LDN-193189に曝露して、ヒトDE細胞を膵臓または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法にさらに関する。
本発明は、少なくとも5%の細胞がPDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を作製するための方法であって、DE細胞を有効量のBMP阻害剤LDN-193189に曝露し、その後、次の分子:
a.Wnt阻害剤IWP2
b.ヘッジホッグ阻害剤シクロパミン(Cyc)
のうち1種に曝露して、ヒトDE細胞を膵臓または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法にさらに関する。
本発明は、少なくとも5%の細胞がPDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を作製するための方法であって、DE細胞を有効量のBMP阻害剤LDN-193189に曝露し、その後、JNK阻害剤II、レチノイン酸またはレチノイン酸誘導体、bFGFおよび次の分子:
a.Wnt阻害剤IWP2
b.ヘッジホッグ阻害剤シクロパミン
のうち1種の組み合わせに曝露して、ヒトDE細胞を膵臓または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法にさらに関する。
本発明は、少なくとも5%の細胞がPDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を作製するための方法であって、DE細胞を有効量のBMP阻害剤LDN-193189に曝露し、その後、レチノイン酸またはレチノイン酸誘導体、bFGFおよびLDN-193189と組み合わせたJNK阻害剤IIの組み合わせに曝露して、DE幹細胞を膵臓または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法にさらに関する。
本発明の一実施形態において、レチノイン酸受容体アゴニストまたはキナーゼ阻害剤のうちいずれか1種は、bFGFと組み合わせることができる。
本発明は、本発明の方法により得ることができる膵臓細胞または膵臓細胞前駆体にさらに関する。
本発明は、ヒト多能性幹細胞をtable 1(表1)およびtable 2(表2)に列挙されている少なくとも1種の化合物に曝露することにより産生される、膵臓細胞または膵臓細胞前駆体に関する。
本発明は、幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、table 1(表1)およびtable 2(表2)の化合物のうちいずれか1種の使用に関する。
本発明は、幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するためのLDN-193189の使用に関する。
本発明は、幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189と続くシクロパミンまたはIWP2の使用に関する。
本発明は、内分泌細胞運命にコミットしたPE細胞の顕著な特徴であるNKX6.1/PDX1二重陽性細胞の割合を増加させるための方法を提供することにより、ヒトPS細胞を成熟したベータ細胞へと分化させる効率を改善するための代替的なアプローチを採用する。
一態様において、本発明は、改善された膵臓細胞集団、即ち、NKX6.1/PDX1二重陽性細胞の割合が増加したPEを提供する。
さらに、本発明は、内分泌系列へとさらに発生するために重要となるより均質な膵臓細胞集団を提供する。
本発明はまた、次のステージに移行するためにより同調した膵臓集団を提供する。
本発明は、例示的な実施形態の開示から明らかとなる、さらに別の問題を解決することもできる。
小分子ライブラリーを用いた、ライブラリースクリーニングアプローチとも称されるPEスクリーニングアプローチを示す図である。DEプロトコール(一般方法を参照)に従って多能性幹(PS)細胞を胚体内胚葉(DE)に分化させ、スクリーニングのために96ウェルプレートに播種した。膵臓内胚葉(PE)スクリーニングを初期および後期相に分けた。初期相において、PE分化の最初の7日間に、公表されているbFGFに基づくプロトコール(Ameriら、2010、WO/2010/136583も参照されたい)に加えて化合物を添加し、次に、化合物なしでさらに6日間継続した。後期相において、最後の6日間のみに、bFGFに基づくプロトコールに加えて化合物を添加した。 ライブラリースクリーニングアプローチの初期相のヒットを示すグラフである。ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)(黒)またはhESC(白)由来の胚体内胚葉細胞を96ウェル光学プレートに播種し、bFGFに基づく14日間のプロトコールを用いて膵臓内胚葉に分化させた。14日間の最初の7日間に、bFGFに基づくプロトコールに加えて化合物を添加し、InCell analyzer 2000(GE Healthcare社)を用いてNKX6.1/PDX1二重陽性細胞を解析した。グラフは、ベンチマークプロトコールと比較した、NKX6.1/PDX1二重陽性細胞の割合の効果(％)を示す。 ライブラリースクリーニングアプローチの後期相のヒットを示すグラフである。hiPSC(黒)またはhESC(白)由来の胚体内胚葉細胞を96ウェル光学プレートに播種し、bFGFに基づく14日間のプロトコールを用いて膵臓内胚葉に分化させた。最後の6日間に、bFGFに基づくプロトコールに加えて化合物を添加し、InCell analyzer 2000(GE Healthcare社)を用いてNKX6.1/PDX1二重陽性細胞を解析した。グラフは、ベンチマークプロトコールと比較した、NKX6.1/PDX1二重陽性細胞の割合の効果%を示す。 第2の、候補に基づくPEスクリーニングアプローチを示すグラフである。DEプロトコール(一般方法を参照)に従って多能性幹(PS)細胞を胚体内胚葉に分化させ、スクリーニングのために96ウェルプレートに播種した。膵臓内胚葉スクリーニングを2個の部分に分けた。スクリーニング1において、PE分化の最初の8日間に、基本培地(RPMI1640+0.1%PEST+12%KOSR)に化合物を添加した。2日ずつ増加させた4つの異なる時間枠で化合物を検査し、次に、さらに6日間、bFGFに基づく公表されたプロトコール(Ameriら、2010)において細胞に分化を継続させた。スクリーニング2において、先ず4日間、スクリーニング1からのヒット化合物を用いて細胞を分化させ、次に、最後の10日間に、スクリーニング化合物を基本培地に添加した。 スクリーニング毎に並行して実験した、ベンチマークプロトコールとして用いたAmeriら、2010に従って分化させた細胞と比較した、候補スクリーニング1および2からのヒットを示すグラフである。スクリーニング1において、1種のヒット化合物を同定し(LDN-193189)、これは、最初の4日間に添加し、続いて4日間基本培地で培養した場合に最も有効であることが判明した。スクリーニング2に関して、先ずスクリーニング1からのヒット化合物に細胞を4日間曝露し、スクリーニング2からのヒット化合物を分化の最後の10日間添加した際に、2種のヒット化合物を同定した(シクロパミンおよびIWP-2)。グラフは、ベンチマークプロトコールと比較した、NKX6.1/PDX1二重陽性細胞の割合の効果(％)を示す(hiPSCのバーを黒、hESCのバーを白で示す)。 ベンチマークプロトコール[Ameriら(2010)]と比較した、2種の個々のスクリーニング(小分子ライブラリーおよび候補アプローチ)において見出されたヒット化合物の組み合わせによる、PDX1/NKX6.1二重陽性細胞の量における有利な効果を示すグラフである。hiPSCのバーを黒、hESCのバーを白で示す。
略語のリスト
+ve:陽性
bFGF:塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF)(FGF2としても公知)
Cyc:シクロパミン
db:二重陽性
DE:胚体内胚葉
hBS:ヒト胚盤胞由来幹
hBSC;ヒト胚盤胞由来幹細胞
hES:ヒト胚性幹
hESC:ヒト胚性幹細胞
hiPSC:ヒト人工多能性幹細胞
hPSC:ヒト多能性幹細胞
KOSR:ノックアウト(Knock-out)血清代替物
NKX6.1:NK6ホメオボックス1
PDX1:膵臓および十二指腸ホメオボックス1
PEST:ペニシリンストレプトマイシン
PS:多能性幹
Rockout:Rhoキナーゼ阻害剤III
RT:室温
説明
本発明は、ヒト胚体内胚葉細胞および人工多能性幹細胞等、幹細胞から膵臓内胚葉を作製する方法に関する。本発明は、内分泌細胞集団に達するのに必要な細胞ステージの1つであるPE細胞集団のマーカーである、NKX6.1/PDX1二重陽性細胞のパーセンテージを改善するための方法を提供することにより、ヒトPS細胞を成熟したベータ細胞へと分化させる効率を改善するための代替的なアプローチを採用する。
さらに、本発明は、内分泌系列へとさらに発生するために重要となるより均質で同調した膵臓細胞集団を提供する。
本発明は、例示的な実施形態の開示から明らかとなる、さらに別の問題を解決することもできる。
一実施形態において、本発明に係る方法により得ることができる膵臓内分泌細胞は、インスリン産生細胞であり、必要に応じて、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチドおよび/またはグレリン産生細胞に分化した細胞と共に得られる。本明細書において、「インスリン産生細胞」は、検出可能な量のインスリンを産生および貯蔵または分泌する細胞を指す。「インスリン産生細胞」は、個々の細胞であっても細胞の集合体であってもよい。
別の一実施形態において、膵臓細胞を含む細胞集団は、体細胞集団から得られる。一部の態様において、体細胞集団は、胚性様幹(ES、例えば、多能性)細胞へと脱分化するように誘導された。斯かる脱分化した細胞は、人工多能性幹細胞(iPSC)とも命名される。
別の一実施形態において、膵臓細胞を含む細胞集団は、胚性幹(ES、例えば、多能性)細胞から得られる。一部の態様において、膵臓細胞を含む細胞集団は、ES様細胞等、多能性細胞である。
別の一実施形態において、膵臓細胞を含む細胞集団は、胚性分化幹(ESまたは多能性)細胞である。分化は、胚様体および/もしくは単層細胞培養またはこれらの組み合わせにおいて行われる。
別の一実施形態において、細胞集団は、幹細胞の集団である。一部の態様において、細胞集団は、膵臓内分泌系列へと分化した幹細胞の集団である。
幹細胞とは、自己再生前駆細胞、非再生前駆細胞および最終分化細胞を含む、単細胞レベルにおいて自己再生および分化して後代細胞を産生するその能力の両方により定義される未分化細胞である。幹細胞はさらに、in vitroで複数の胚葉(内胚葉、中胚葉および外胚葉)由来の様々な細胞系列の機能細胞へと分化する能力を特徴とし、加えて移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞に注入されると全てではないが大部分の組織に実質的に寄与する能力も特徴とする。
幹細胞は、その発生上の潜在性によって、(1)あらゆる胚性および胚体外細胞型を生じ得ることを意味する全能性幹細胞;(2)あらゆる胚性細胞型を生じ得ることを意味する多能性幹細胞;(3)細胞系列のサブセットを生じ得るが、全て特定の組織、器官または生理系内のものであることを意味する多能性幹細胞[例えば、造血幹細胞(HSC)は、HSC(自己再生)、血液細胞制限的少能性(oligopotent)前駆細胞ならびに正常な血液構成成分であるあらゆる細胞型および要素(例えば、血小板)を含む後代を産生することができる];(4)多能性幹細胞よりも限られた細胞系列サブセットを生じ得ることを意味する少能性幹細胞;ならびに(5)単一の細胞系列を生じ得ることを意味する単分化能幹細胞(例えば、***形成幹細胞)に分類される。
幹細胞から膵臓細胞を得るためのプロトコールは、D'Amour, K. A.ら(2006);Jiang, J.ら(2007);Kroon, E.ら(2008)に記載されているプロトコールにより例証されるが、これらに限定されない。
体細胞から、またはES様細胞等の多能性細胞へと脱分化するよう誘導された体細胞から膵臓細胞を得るためのプロトコールは、Aoi, T.ら(2008);D'Amour, K. A.ら(2006);Jiang, J.ら(2007);Kroon, E.ら(2008);Takahashi, K.ら(2007);Takahashi, K.、およびYamanaka, S.(2006)およびWernig, M.ら(2007)に記載されているプロトコールにより例証されるが、これらに限定されない。
本明細書において、「分化する」または「分化」は、未分化状態から分化状態へと、未成熟状態からより成熟した状態へと、または未成熟状態から成熟状態へと細胞が進行する過程を指す。例えば、初期未分化胚性膵臓細胞は、増殖し、PDX1、NKX6.1およびPTF1a等の特徴的マーカーを発現することができる。成熟したまたは分化した膵臓細胞は、増殖せず、高レベルの膵臓内分泌ホルモンまたは消化酵素を分泌する。例えば、完全に分化したベータ細胞は、グルコースに応答して高レベルのインスリンを分泌する。細胞相互作用の変化および成熟化が起こると、細胞が未分化細胞のマーカーを喪失したり、または分化細胞のマーカーを獲得したりする。単一マーカーの喪失または獲得は、細胞が「成熟したまたは完全に分化した」ことを示し得る。用語「分化因子」は、インスリン産生ベータ細胞も含有する成熟した内分泌細胞へのその分化を増強するために膵臓細胞に添加される化合物を指す。例示的な分化因子としては、肝細胞増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、エキセンディン-4、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子-1、神経増殖因子、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子およびグルカゴン様ペプチド1が挙げられる。一部の態様において、細胞の分化は、1種または複数の分化因子を含む培地における細胞の培養を含む。
本明細書において、「ヒト多能性幹細胞(hPSC)」は、いかなる供給源に由来してもよい細胞であって、適切な条件下で、全3胚葉(内胚葉、中胚葉および外胚葉)の派生体である様々な細胞型のヒト後代を産生することのできる細胞を指す。hPSCは、8〜12週齢SCIDマウスにおいてテラトーマを形成する能力および/または組織培養において全三胚葉の同定可能な細胞を形成する能力を有し得る。ヒト多能性幹細胞の定義には、30の文献中でヒト胚性幹(hES)細胞として表示されることが多いヒト胚盤胞由来幹(hBS)細胞を含む様々な種類の胚性細胞[例えば、Thomsonら(1998)、Heinsら(2004)を参照]と共に、人工多能性幹細胞[例えば、Yuら(2007);Takahashiら(2007)を参照]が含まれる。本明細書に記載されている様々な方法および他の実施形態は、種々の供給源由来のhPSCを必要とするかまたは利用する場合がある。例えば、使用に適したhPSCは、発生中の胚から得てもよい。それに加えてまたはそれに代えて、適したhPSCは、樹立細胞株および/またはヒト人工多能性幹(hiPS)細胞から得てもよい。
本明細書において、「hiPSC」は、ヒト人工多能性幹細胞を指す。
ES細胞株は、子宮外胚を破壊せず、臨床成績に影響を与えずに、単一卵割球から得てもよい[Chungら(2006)およびKlimanskayaら(2006)]。
本明細書において、用語「胚盤胞由来幹細胞」は、BS細胞と表示され、ヒト型は、「hBS細胞」と名付けられる。文献において、この細胞は多くの場合、胚性幹細胞、より具体的には、ヒト胚性幹細胞(hESC)と称される。よって、本発明において用いられる多能性幹細胞は、例えば、WO03/055992およびWO2007/042225に記載されている通り、胚盤胞から調製された胚性幹細胞、あるいは市販のhBS細胞または細胞株であり得る。しかし、例えば、Yuら(2007);Takahashiら(2007)およびYuら(2009)に開示されている通り、OCT4、SOX2、NANOGおよびLIN28等、特定の転写因子で成体細胞を処理することにより多能性細胞へと再プログラム化される分化した成体細胞を含む、任意のヒト多能性幹細胞を本発明において用いることができることがさらに想定される。
本明細書において、JNK阻害剤IIは、N-アルキル化された、またはN-アルキル化されていない1,9-ピラゾロアントロンの異性体または互変異性体を含む。1,9-ピラゾロアントロンは、「SMILES:c1ccc2c(c1)-c3c4c(cccc4[nH]n3)C2=O」または「1,6-ジヒドロジベンゾ[cd,g]インダゾール-6-オン」と定義することができる。
DEF培地またはDEF-CS培地/系は、ヒト多能性幹細胞の樹立および繁殖のための成分が明確な平衡培養培地であるDEF-CS培地/系である。
本発明の実施形態:
1.少なくとも5%の細胞がPDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を産生する方法であって、胚性幹細胞を、
a.BMP阻害剤
b.キナーゼ阻害剤
c.レチノイン酸受容体アゴニスト
からなる群の少なくとも1種の化合物の有効量に曝露して、ヒト胚性幹細胞を膵臓細胞または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法。
2.前記化合物が、table 1(表1)またはtable 2(表2)に列挙されている、実施形態1に記載の方法。
3.キナーゼ阻害剤が、N-アルキル化された、またはN-アルキル化されていない1,9-ピラゾロアントロンの異性体である、実施形態1または2に記載の方法。
4.前記キナーゼ阻害剤が、JNK阻害剤IIである、実施形態1〜3に記載の方法。
5.前記レチノイン酸受容体アゴニストが、AM580である、実施形態1〜2に記載の方法。
6.前記JNK阻害剤IIが、AM580と組み合わされる、実施形態1〜5に記載の方法。
7.bFGFが存在する、実施形態3〜6に記載の方法。
8.前記bFGFが、FGF2、FGF7またはFGF10である、実施形態7に記載の方法。
9.前記bFGFが、FGF7である、実施形態8に記載の方法。
10.前記BMP阻害剤が、LDN-193189である、実施形態1に記載の方法。
11.前記LDN-193189に続いて、Wnt阻害剤またはヘッジホッグ阻害剤への曝露が行われる、実施形態10に記載の方法。
12.前記Wnt阻害剤が、IWP2である、実施形態11に記載の方法。
13.前記ヘッジホッグ阻害剤が、シクロパミンである、実施形態12に記載の方法。
14.前記膵臓細胞または膵臓細胞前駆体の10〜20%、10〜30%、10〜40%、5〜20%、5〜30%、5〜40%、5〜50%、5〜60%または5〜70%、5〜80%、40〜80%または5〜90%が、PDX1/NKX6.1二重陽性である、実施形態1〜13に記載の方法。
15.前記膵臓細胞または膵臓細胞前駆体の5〜50%が、PDX1/NKX6.1二重陽性である、実施形態14に記載の方法。
16.前記膵臓細胞または膵臓細胞前駆体の40〜80%が、PDX1/NKX6.1二重陽性である、実施形態1〜9のいずれか一実施形態に記載の方法。
17.実施形態1〜16に記載の方法により得ることができる膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
18.ヒト多能性幹細胞をTable 1(表1)またはTable 2(表2)に列挙されている少なくとも1種の化合物に曝露することにより産生される、膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
19.前記化合物が、LDN-193189である、実施形態18に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
20.前記化合物が、JNK阻害剤IIである、実施形態18に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
21.前記化合物が、AM580である、実施形態18に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
22.膵臓細胞または膵臓細胞前駆体が、少なくとも1種の追加の薬剤と組み合わせた少なくとも1種の化合物に幹細胞を曝露することにより産生される、実施形態18に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
23.前記LDN-193189が、JNK阻害剤IIおよびAM580と組み合わされる、実施形態22に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
24.前記LDN-193189に続いて、シクロパミンへの曝露が行われる、実施形態22に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
25.前記LDN-193189に続いて、IWP2への曝露が行われる、実施形態22に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
26.前記化合物が、Table 2(表2)に列挙されているレチノイン酸受容体アゴニストと組み合わせたJNK阻害剤IIである、実施形態22に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
27.JNK阻害剤IIが、AM580と組み合わされる、実施形態22に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
28.JNK阻害剤IIが、AM580およびbFGFと組み合わされる、実施形態22に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
29.bFGFが、FGF2、FGF7またはFGF10である、実施形態28に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
30.bFGFが、FGF7である、実施形態29に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
31.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、Table 1(表1)またはTable 2(表2)の化合物の使用。
32.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、JNK阻害剤IIの使用。
33.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、レチノイン酸受容体アゴニストと組み合わせたJNK阻害剤IIの使用。
34.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、AM580と組み合わせたJNK阻害剤IIの使用。
35.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189の使用。
36.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189と続くシクロパミンまたはIWP2の使用。
37.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189と続くシクロパミンの使用。
38.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189と続くIWP2の使用。
39.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189と続くJNK阻害剤II、AM580およびbFGFとの組み合わせの使用。
40.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189と続くJNK阻害剤II、AM580、LDN-193189およびbFGFの組み合わせの使用。
41.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189と続くJNK阻害剤II、AM580、LDN-193189、bFGFおよびシクロパミンまたはIWP2の組み合わせの使用。
42.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189と続くJNK阻害剤II、AM580、LDN-193189、bFGFおよびシクロパミンの組み合わせの使用。
43.幹細胞から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189と続くJNK阻害剤II、AM580、LDN-193189、bFGFおよびIWP2の組み合わせの使用。
44.少なくとも5%がPDX1/NKX6.1二重陽性を発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を産生する方法であって、胚体内胚葉細胞を、次の群:
a.BMP阻害剤、および
b.キナーゼ阻害剤、および
c.レチノイン酸受容体アゴニスト
のそれぞれからの少なくとも1種の化合物の有効量に曝露して、胚体内胚葉細胞を膵臓細胞または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含む方法。
45.BMP阻害剤が、LDN-193189である、実施形態44に記載の方法。
46.レチノイン酸受容体アゴニストが、AM580である、実施形態44に記載の方法。
47.レチノイン酸受容体アゴニストが、レチノイン酸誘導体である、実施形態44に記載の方法。
48.キナーゼ阻害剤が、N-アルキル化された、またはN-アルキル化されていない1,9-ピラゾロアントロンの異性体である、実施形態44に記載の方法。
49.キナーゼ阻害剤が、JNK阻害剤IIであり、AM580と組み合わされる、実施形態44に記載の方法。
50.前記キナーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストが、bFGFと組み合わされる、実施形態44に記載の方法。
51.前記キナーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストが、FGF7またはFGF10と組み合わされる、実施形態44に記載の方法。
52.胚体内胚葉細胞をbFGFなしで有効量のLDN-193189に曝露する第1の工程と、bFGFの存在下でAM580と組み合わせたJNK阻害剤IIに曝露する第2の工程とを含む、実施形態44〜46に記載の方法。
53.IWP2などのwnt阻害剤および/または
シクロパミンなどのヘッジホッグ阻害剤
からなる群の少なくとも1種の化合物への曝露後に、胚体内胚葉細胞を有効量のLDN-193189に曝露する工程を含む、実施形態44〜46に記載の方法。
54.前記膵臓細胞または膵臓細胞前駆体の少なくとも5%、少なくとも10%、10〜30%、10〜40%、5〜70%、10〜80%または5〜100%が、PDX1/NKX6.1二重陽性である、実施形態44〜53のいずれか一実施形態に記載の方法。
55.実施形態44〜54に記載の方法をin vitroで使用することにより得ることができる膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
56.JNK1、2もしくは3またはSycまたはSrcまたはGSK-3またはP38 MAPKまたはP38キナーゼまたはRhoキナーゼまたはMEKまたはChk2またはVEGFR1、2もしくは3またはPDGFRbまたはKDR/Flk-1を標的とするキナーゼ阻害剤に、胚体内胚葉細胞をin vitroで曝露することにより産生される、膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
57.キナーゼ阻害剤が、JNK阻害剤IIであり、胚体内胚葉細胞が、次の化合物:
LDN-193189、
Wnt阻害剤、
ヘッジホッグ阻害剤、
レチノイン酸受容体アゴニスト
のうち少なくとも1種にも曝露される、実施形態56に規定の方法により産生される膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
58.胚体内胚葉細胞が、Table 2(表2)に列挙されているレチノイン酸受容体アゴニストと組み合わせたJNK阻害剤IIに曝露される、実施形態56に記載の膵臓細胞または膵臓細胞前駆体。
59.膵臓内胚葉前駆体から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、Table 1(表1)またはTable 2(表2)のキナーゼ阻害剤化合物の使用。
60.膵臓内胚葉前駆体から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、組み合わせたJNK阻害剤IIおよびLDN-193189の使用。
61.膵臓内胚葉前駆体から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、レチノイン酸受容体アゴニストと組み合わせたJNK阻害剤IIの使用。
一般方法
多能性幹細胞のin vitro培養
ヒト胚性幹(hES)細胞、系統SA121およびヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)chIPS4(Cellectis社)を、T75培養フラスコ内のDEF-CS培養培地(Cellectis社)において育成した。5μM Rock阻害剤Y-27632(Sigma社#Y0503)を用いて細胞を単細胞継代し、実験のために40000細胞/cm2の密度で播種した。加湿インキュベーター(ThermoScientific Model 371)において37℃、5%CO2で細胞を培養した。
多能性幹細胞から胚体内胚葉へのin vitro分化
hES細胞(系統SA121)およびhiPSC(chIPS4)のコンフルエント培養物をRPMI1640(Gibco社#61870)において1回洗浄し、RPMI1640における3μM CHIR99021(Axon社#1386)で処理した。24時間後に、細胞をRPMI1640で洗浄し、RPMI1640における100ng/mlアクチビンA(Peprotech社#120-14E)で処理した。24時間後、毎日培地交換しつつ、アクチビンA培地に2%B27(Invitrogen社#17504-044)を2日間添加した。分化の間中、加湿インキュベーターにおいて37℃、5%CO2で細胞を維持した。
hESおよびhiPS細胞由来胚体内胚葉の播種
ヒトES細胞由来のDEおよびヒトiPS細胞由来のDE細胞をPBS-/-で洗浄し、Tryple Select(Invitrogen社、12563-029)を用いて5分間トリプシン処理した。DE細胞をRPMI1640に注意深く懸濁し、1回洗浄し、その後、DE播種培地[アクチビンA 100ng/ml、2%B27、RPMI1640、0.1%PEST(Gibco社#15140)]に再懸濁した。96ウェル光学プレート(BD Bioscience社)において200000個/cm2でDE細胞を播種し、翌日、スクリーニング化合物を用いたPE分化を開始した。
解析
PE分化8または14日目に、培地を吸引し、続いて4%パラホルムアルデヒド(VWR社、97.131.000)により細胞を室温で30分間固定した。細胞をPBSで洗浄し、0.5%Triton X-100(Sigma社、9002-93-1)で10分間透過処理し、洗浄し、0.5%TNBバッファー(Perkin Elmer社)において30分間室温でブロッキングした。一次抗体、マウス抗NKX6.1(Abcore社#A55F12)およびヤギ抗PDX1(Abcam社#47383)をPBS中の0.1%Triton X-100でそれぞれ1:500および1:8000に希釈し、各ウェルに添加して、4℃で一晩インキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄した。DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、Applichem社、A4099.0010)ならびに二次抗体、Alexa Fluor 488ロバ抗ヤギおよびAlexa Fluor 594ロバ抗マウス(両者共にInvitrogen社)をPBS中の0.1%Triton X-100で1:1000に希釈し、各ウェルに45分間添加した。細胞を5回洗浄し、イメージングのために200μLのPBS中に置いた。
InCell Analyzer 2000(GE Healthcare社)を用いてイメージングを行った。10×対物レンズを用いてウェル当たり4視野を捕捉した。DAPI対比染色に基づく総細胞数およびNKX6.1/PDX1二重陽性細胞数を、InCell Developer Toolbox 1.8(GE Healthcare社)を用いて決定した。NKX6.1/PDX1二重陽性細胞の割合を、各プレートにおけるベンチマークに対して標準化し、効果(％)を計算した。効果が200%を超える値をヒットと分類した。
膵臓内胚葉は、2種の転写因子、NKX6.1およびPDX1の共発現を特徴とする。PEを作製するための公表されたプロトコールの多くは、NKX6.1/PDX1二重陽性細胞成績が低く無効である。PEプロトコールの効力を増強することが、望ましい成績である。従って、本出願人らは、小分子のライブラリーをスクリーニングして、既存のPEプロトコールを改善し得る新規化合物を同定した。この実験は、阻害剤、アゴニストまたはアンタゴニストが、シグナル伝達経路または染色体到達性を調節し、これがNKX6.1/PDX1二重陽性細胞の割合を改善し得るという仮定に基づき行われた。
(実施例1)
NKX6.1/PDX1共発現を誘導する小分子のスクリーニング
小分子
スクリーニングには、4種の異なるライブラリー、すなわちキナーゼ阻害剤ライブラリー(Calbiochem社#539743)、生理活性脂質ライブラリー(Enzo Life Sciences社#BML-2800)、核内受容体リガンドライブラリー(Enzo Life Sciences社#BML-2802)およびホスファターゼ阻害剤ライブラリー(Enzo Life Sciences社#BML-2834) が含まれていた。生理活性ライブラリー内の化合物は、1uMおよび0.1uMで検査した。他のライブラリー由来の化合物は、10uMおよび1uMで検査した。第2の候補に基づくスクリーニングアプローチには、膵発生に関与する主要シグナル伝達経路を標的とする小分子が含まれていた。
NKX6.1/PDX1スクリーニング
PEを作製するためのbFGFに基づく培地製剤(Ameriら2010)(RPMI1640、Gibco社#61870;12%KOSR、Gibco社#10828;0.1% PEST、Gibco社#15140;64ng/mL bFGF、Peprotech社#100-18B)に加えてライブラリー化合物をスクリーニングした。
ライブラリーPEスクリーニングアプローチを、初期および後期相に分けた(図1)。
初期相において、PE分化の最初の7日間に、PE培地に加えて化合物を検査し、続いて化合物なしのPE培地を用いて分化をさらに6日間継続させた。
後期相において、最初の7日間にPE培地においてDE細胞を分化させた。続く6日間において、PE培地に加えて化合物を検査した。12個の陽性対照ウェル(PE培地)および12個の陰性対照ウェル(bFGFなしのPE培地)が、各96ウェルプレートに含まれた。培地交換を毎日行った。初期相スクリーニングにおいて同定されたヒットを図2に図解し、table 1(表1)に列挙する。後期相スクリーニングにおいて同定されたヒットを図3に図解し、table 2(表2)に列挙する。
bFGFを添加しない基本培地(RPMI1640、Gibco社#61870;12%KOSR、Gibco社#10828;0.1%PEST、Gibco社#15140)において、候補アプローチから得た化合物をスクリーニングした。この候補アプローチスクリーニングを2個の部分に分けた(図4)。第1の部分において、PE分化の最初の8日間に、2日間増分の時間間隔で化合物を検査した(2日間の化合物曝露と続く6日間の基本培地、または4日間の化合物曝露と続く4日間の基本培地、または6日間の化合物曝露と続く2日間の基本培地、または8日間の化合物曝露)。
これらの8日間の後に1枚のプレートを固定し、PDX1およびNKX6.1発現を解析した。第2のプレートは、公表されたPEプロトコール[Ameriら(2010)]を用いてさらに6日間さらに分化させた。
第2の部分において、第1の部分からのヒット化合物によってDE細胞を分化させ、続く6〜10日間、基本培地において化合物を検査した。
ベンチマークプロトコール[Ameriら(2010)]を対照とした。
第1および第2の部分の実験の両方において、培地交換を毎日行った。
候補スクリーニングアプローチにおいて同定されたヒットを図5に図解し、これはTable 1(表1)およびTable 2(表2)にも含まれている。
(実施例2)
NKX6.1/PDX1共発現を誘導する小分子ヒットの組み合わせ
ライブラリーアプローチからのヒットと候補スクリーニングアプローチからのヒットとの組み合わせ
DE細胞を4日間50nM LDN-193189に曝露し、続いて8日間AM580(AH Diagnostics社、BML GF104 0025)、JNK阻害剤II(Calbiochem社、420119)、50nM LDN-193189および64ng/ml FGF2、またはAM580、JNK阻害剤II、50nM LDN-193189、64ng/ml FGF2およびIWP2、またはAM580、JNK阻害剤II、50nM LDN-193189、64ng/ml FGF2およびシクロパミンに曝露した(図6)。培地交換を毎日行った。
(実施例3)
ヒト人工多能性幹細胞においてNKX6.1/PDX1共発現を誘導する小分子の確認
PEを作製するためのbFGFに基づく培地製剤(Ameriら2010)(RPMI1640、Gibco社#61870;12%KOSR、Gibco社#10828;0.1%PEST、Gibco社#15140;64ng/mL bFGF、Peprotech社#100-18B)上で、ヒット化合物[Table 1(表1)およびTable 2(表2)]をスクリーニングした。
スクリーニングを初期および後期相に分けた(図1)。初期相において、PE分化の最初の7日間に、PE培地に加えて化合物を検査し、続いて化合物なしのPE培地を用いてさらに6日間継続した。後期相において、最初の7日間にPE培地においてDE細胞を分化させた。続く6日間において、PE培地に加えて化合物を検査した。12個の陽性対照ウェル(PE培地)および12個の陰性対照ウェル(bFGFなしのPE培地)が、各96ウェルプレートに含まれた。培地交換を毎日行った。
効果が200%を超える値をヒットと分類した(図2および図3)。
Table 1(表1)は初期のヒット化合物を示す。
PE培地と比較して200%を超えてNKX6.1/PDX1二重陽性細胞の割合を増強する化合物。ライブラリー、ライブラリー内の化合物の位置、標的、化学構造、ヒット濃度およびPDX1/NKX6.1二重陽性細胞のパーセンテージを列挙する。
Figure 0006470687
Table 2(表2)は後期のヒット化合物を示す。PE培地と比較して200%を超えてNKX6.1/PDX1二重陽性細胞の割合を増強する化合物。ライブラリー、ライブラリー内の化合物の位置、標的、化学構造、ヒット濃度およびPDX1/NKX6.1二重陽性細胞のパーセンテージを列挙する。
Figure 0006470687
Figure 0006470687
本明細書において本発明の特定の特色を図解および説明してきたが、当業者であれば、多くの修正、代用物、変更および均等物を認識するであろう。従って、添付の特許請求の範囲は、このような修正および変更を、本発明の真の趣旨の範囲内に収まるものとして全て包含するよう企図されていることを理解されたい。
(参考文献)
Figure 0006470687

Claims (10)

  1. 少なくとも5%がPDX1/NKX6.1二重陽性を発現する膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を産生する方法であって、胚体内胚葉細胞を、次の群:
    a. LDN-193189、および
    b. JNK阻害剤II、および
    c. AM580
    のそれぞれからの少なくとも1種の化合物の有効量に曝露して、胚体内胚葉細胞を膵臓細胞または膵臓細胞前駆体に分化させる工程を含み、
    胚体内胚葉細胞をbFGFなしで有効量のLDN-193189に曝露する第1の工程と、bFGFの存在下でAM580と組み合わせたJNK阻害剤IIに曝露する第2の工程とを含む、方法。
  2. JNK阻害剤IIが、N-アルキル化された、またはN-アルキル化されていない1,9-ピラゾロアントロンの異性体である、請求項1に記載の方法。
  3. 前記JNK阻害剤IIおよびAM580が、FGF7またはFGF10と組み合わされる、請求項1に記載の方法。
  4. IWP2などのwnt阻害剤および/または
    シクロパミンなどのヘッジホッグ阻害剤
    からなる群の少なくとも1種の化合物への曝露後に、胚体内胚葉細胞を有効量のLDN-193189に曝露する工程を含む、請求項1に記載の方法。
  5. 前記膵臓細胞または膵臓細胞前駆体の少なくとも5%、少なくとも10%、10〜30%、10〜40%、5〜70%、10〜80%または5〜100%が、PDX1/NKX6.1二重陽性である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
  6. in vitroで使用される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
  7. LDN-193189、JNK1、2もしくは3を標的とするJNK阻害剤IIおよびAM580に、胚体内胚葉細胞をin vitroで曝露することを含み、胚体内胚葉細胞をbFGFなしで有効量のLDN-193189に曝露する第1の工程と、bFGFの存在下でAM580と組み合わせたJNK阻害剤IIに曝露する第2の工程とを含む、膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を産生する方法。
  8. 胚体内胚葉細胞が、次の化合物:
    Wnt阻害剤、
    ヘッジホッグ阻害剤
    のうち少なくとも1種にも曝露される、請求項7に記載の方法。
  9. 請求項1から8のいずれか一項に記載の方法における、膵臓内胚葉前駆体から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、LDN-193189、AM580およびTable 1(表1)またはTable 2(表2)に記載されたJNK阻害剤IIの使用。
  10. 請求項1から8のいずれか一項に記載の方法における、膵臓内胚葉前駆体から膵臓細胞または膵臓細胞前駆体を誘導するための、JNK阻害剤II、LDN-193189およびAM580の組み合わせの使用。
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