CN111269875B

CN111269875B - 一种利用自体免疫细胞定向分化为胰岛细胞的方法

Info

Publication number: CN111269875B
Application number: CN202010212266.8A
Authority: CN
Inventors: 刘明录; 强邦明; 韩庆梅; 王立新; 张传鹏; 金海锋; 卢永灿; 冯建海; 李希鹏
Original assignee: Shandong Xinrui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Xinrui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-03-24
Filing date: 2020-03-24
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2040-03-24
Also published as: CN111269875A

Abstract

本发明提供一种利用自体免疫细胞定向分化为胰岛细胞的方法，所述方法为从患者外周血获取免疫细胞经体外去分化为诱导多能干细胞，再定向分化生成胰岛细胞。通过本发明中培养胰岛细胞的方法，选取的是自体外周血分离的免疫细胞，进行诱导定向分化为胰岛细胞，然后移植到同一个病人，降低病人的免疫排斥反应，除此之外，不存在组织配型和伦理方面的问题。本发明在诱导多能干细胞（iPSC）定向诱导分化为胰岛细胞时，经过20‑28天的诱导分化，通过DTZ染色鉴定最终诱导的胰岛细胞的纯度为62.4%以上。

Description

一种利用自体免疫细胞定向分化为胰岛细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种利用自体免疫细胞定向分化为胰岛细胞的方法，属于生物与新医药技术领域。

背景技术

胰腺是分泌胰脂肪酶、胰蛋白酶、弹性酶、胰淀粉酶等消化酶的外分泌腺，也是分泌胰高血糖素、胰岛素、生长抑素、胰多肽等胰腺激素的内分泌腺。胰腺激素是由胰腺中被称为“胰岛”的细胞群分泌的，它包括四种类型的细胞，分别为α细胞、β细胞、δ细胞、 pp细胞。

糖尿病是一种由于胰岛素缺乏或工作不足引起的疾病。这种病一旦在病人身上发生，就很难完全治愈。糖尿病有两种主要类型，胰岛素依赖型的I型糖尿病和胰岛素不依赖型的II型糖尿病。II型糖尿病是一种慢性疾病，是在机体获得胰岛素抵抗时发生的。II型糖尿病也被认为是一种生活方式相关的疾病，是由于不良的生活方式习惯，包括过度饮食或缺乏锻炼引起的肥胖或压力而导致的。II型糖尿病常发生在中老年人群，许多糖尿病患者患有II型糖尿病。

I型糖尿病是由自身免疫性疾病或病毒感染破坏β细胞或胰岛素分泌细胞引起的。胰岛素分泌细胞被破坏，胰岛素不能在体内分泌。I型糖尿病患者用胰岛素作为对症治疗。此外，应用胰腺或胰岛移植，使患者获得自动控制血糖水平的能力。血糖水平经常波动，胰腺或胰岛移植可以减轻患者的负担，可使患者血糖达到正常水平。然而，目前可供移植的胰腺和胰岛数量不足，且接受移植的病人必须终生服用免疫抑制剂，这种药物可能会引起其他副作用。

随着干细胞与组织工程领域的相关研究飞速发展，已有人研究出诱导多能干细胞定向分化为胰腺细胞的方法，并已申请专利，专利号为CN 104726395 B，但此方法还未应用到临床中。而且该专利中利用胚胎干细胞（ESCs）和异体诱导性多能干细胞（iPSCs）定向分化的胰腺细胞可能会引起糖尿病人的免疫排斥作用，同时胚胎干细胞应用到临床还涉及到伦理问题。在现有技术中，还有其他来源获得胰腺细胞，比如CN109053866A中利用表皮干细胞诱导分化为胰腺细胞，但此培养方法中应用了胎牛血清，由于胎牛血清是动物来源的，其含有动物蛋白，不能直接应用于临床。

基于以上问题，急需开发一种高效率利用自体免疫细胞定向分化为胰岛细胞的方法，且该胰岛细胞移植对患者的副作用较小，免疫排斥反应低，不存在伦理问题。

利用自体免疫细胞分化为胰岛细胞，首先需要将自体免疫细胞进行去分化得到iPSC，再定向诱导分化为胰岛细胞，此过程存在细胞培养时间长，转化率低，诱导分化的胰岛细胞的纯度低，胰岛细胞的胰岛素分泌水平低的缺陷。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种利用自体免疫细胞定向分化为胰岛细胞的方法，实现以下发明目的：

（1）缩短细胞培养时间；

（2）提高转化率，提高诱导分化的胰岛细胞的纯度；

（3）诱导的胰岛细胞胰岛素分泌水平与正常胰腺细胞持平。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种利用自体免疫细胞定向分化为胰岛细胞的方法，所述方法为从患者外周血获取免疫细胞经体外去分化为诱导多能干细胞，再定向分化生成胰岛细胞。

以下是对上述技术方案的进一步改进：

所述诱导多能干细胞，纯度≧95%。

所述定向分化生成胰岛细胞，包括诱导多能干细胞定向分化诱导生成内胚层细胞、诱导分化为原肠管细胞、诱导分化为胰腺祖细胞、诱导分化为胰腺内皮层细胞、诱导分化为胰岛细胞。

所述诱导多能干细胞定向分化诱导生成内胚层细胞，将诱导多能干细胞接种在用0.09-0.12%纤连蛋白包被的培养皿中，等细胞铺板达到60%左右时，用含CHIR99021化合物的S1培养基进行培养，培养22-26h后，更换新鲜的S1培养基，培养48-70h获得定型内胚层细胞。

所述S1培养基为DMEM低糖培养基，另含有95-105ng/mL的Activin A，体积百分比为1-3%的B27；所述含CHIR99021化合物的S1培养基，CHIR99021化合物的浓度为13-15 ug/ml。

所述诱导分化为原肠管细胞，将内胚层细胞使用S2培养基进行培养，培养68-76h获得原肠管细胞；所述S2培养基，为DMEM低糖培养基，另含有45-55ng/mL的KGF，体积百分比为1-3%的B27。

所述诱导分化为胰腺祖细胞，由原肠管细胞继续诱导分化为胰腺祖细胞，分为两个阶段，第一阶段为诱导早期胰腺祖细胞，共进行2-3天的培养，先在含有190-210nMLDN193189的S3培养基培养22-26h，更换S3培养基培养24-48h；第二阶段将早期胰腺祖细胞诱导成为胰腺祖细胞，使用S4培养基，培养4-6天。

所述S3培养基为DMEM/F12培养基，另含有45-55ng/mL的KGF、0.24-0.26uM的SANT1、490-510nM的PdbU、9.5-10.5uM的Y27632、1.9-2.1uM的RA、体积百分比为1-3%的B27；

所述S4培养基为DMEM/F12培养基，另含有45-55ng/mL的KGF、0.24-0.26uM的SANT1、4.5-5.5ng/ml的Activin A、9.5-10.5uM的Y27632、95-105nM的RA、体积百分比为1-3%的B27。

所述诱导分化为胰腺内皮层细胞，将胰腺祖细胞，在S5培养基中培养4-5天，诱导分化为胰腺内皮层细胞；所述S5培养基为DMEM高糖培养基，另含有0.24-0.26uM的SANT1、95-105nM的RA、0.95-1.05uM的XXI、9.5-10.5uM的SB431542、0.9-1.1uM的T3、19-21ng/mL的Betacellulin、体积百分比为1-3%的B27。

所述诱导分化为胰岛细胞，使用的培养基为包含9.5-10.5uM 的SB431542和0.9-1.1uM 的T3的CMRL1066培养基，培养4-7天。

本发明中的自体细胞为从外周血中分离出的免疫细胞，经过体外去分化获得诱导多能干细胞，再定向诱导分化为胰岛细胞，形成功能性胰岛细胞。

本发明中利用免疫细胞体外去分化获得诱导多能干细胞的方法参考CN108642014A专利中的方法，在此方法基础上将四种慢病毒合并成一种慢病毒，提高转染效率。

诱导多能干细胞定向分化为胰岛细胞的模式为：诱导多能干细胞-定型内胚层细胞-原肠管期-胰腺祖细胞-胰腺内胚层细胞-胰岛细胞，联合小分子化合物和细胞因子进行定向诱导为胰岛细胞。

本发明中利用自体外周血分离获得的免疫细胞，进行诱导定向分化为胰岛细胞，然后移植到同一个病人，降低病人的免疫排斥反应，除此之外，不存在组织配型和伦理方面的问题。且在胰岛细胞的培养过程中，培养基中添加的都是化学成分明确的因子，不存在动物源蛋白。

与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：

（1）通过本发明中培养胰岛细胞的方法，选取的是自体外周血分离的免疫细胞，进行诱导定向分化为胰岛细胞，然后移植到同一个病人，降低病人的免疫排斥反应，除此之外，不存在组织配型和伦理方面的问题。

（2）本发明在诱导多能干细胞（iPSC）定向诱导分化为胰岛细胞时，经过20-28天的诱导分化，通过DTZ染色鉴定最终诱导的胰岛细胞的纯度达62.4%。

（3）经过本发明方案诱导得到的胰岛细胞，具有分泌胰岛素的功能，与正常胰腺细胞水平相当。

附图说明

图1为本发明免疫细胞诱导成的诱导多能干细胞的显微镜图；

图2为本发明诱导多能干细胞定向诱导的胰腺祖细胞的显微镜图；

图3为本发明诱导后的胰岛细胞的显微镜图；

图4为RT-qPCR检测定型内胚层细胞标志物表达的柱状图；

图5为RT-qPCR检测胰腺祖细胞标志物表达的柱状图；

图6为RT-qPCR检测胰岛细胞标志物表达的柱状图；

图7为ELISA检测细胞中的胰岛素含量的柱状图；

图8为胰岛细胞DTZ染色结果的显微镜图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。

实施例1 从患者外周血获取免疫细胞经体外去分化为诱导多能干细胞

此实施例的方法参照的是CN108642014 A专利中诱导诱导多能干细胞的方法。将外周血50mL与生理盐水按1：1的比例稀释。将稀释后的血液小心地加在同等体积淋巴细胞分离液上，形成明显分层，室温水平离心900g，25min。此时离心管中自上而下形成4层，取第二层的白膜层，尽量全部取出。加2倍的生理盐水，洗涤细胞2次，离心后弃上清，收集免疫细胞。

用RPMI培养基对免疫细胞进行过夜培养后，将准备好的包含OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC四种基因的慢病毒感染免疫细胞，培养，筛选，诱导得到诱导多能干细胞（见附图1），纯度95%以上。

实施例2 诱导多能干细胞定向分化生成胰岛细胞

诱导多能干细胞定向分化诱导生成内胚层细胞，步骤如下：将诱导完成的诱导多能干细胞用分离液分离，将细胞团用移液管吹散，接种在用0.1%纤连蛋白包被的培养皿中，等细胞铺板达到60%左右时，用S1培养基进行培养，第一天加入14ug/ml 的CHIR99021化合物进行诱导细胞。第二天更换新鲜的S1培养基（不加入CHIR99021化合物），培养2天获得定型内胚层细胞。收集细胞，利用RT-qPCR鉴定定型内胚层标志基因SOX17、FOXA2表达。

内胚层细胞继续分化诱导成原肠管，将培养基更换为S2培养基，隔天换液，培养3天获得原肠管细胞。

由原肠管细胞继续诱导分化为胰腺祖细胞，分为两个阶段，此阶段使用S3、S4培养基进行培养。第一阶段为诱导早期胰腺祖细胞，需要进行三天培养，第一天更换含有200nMLDN193189的S3培养基培养一天，第二天更换新鲜的S3培养基（不含LDN193189）培养2天。第二阶段将早期胰腺祖细胞诱导成为胰腺祖细胞，更换S4培养基，培养5天，并隔两天换液。经过此阶段诱导得到胰腺祖细胞（见附图2）。

胰腺祖细胞诱导分化为胰腺内皮层细胞，需要4天的时间，此阶段利用S5培养基进行培养，需要隔天换液。

胰腺内皮层细胞进行最后诱导分化为胰岛细胞，此阶段使用的培养基为包含SB431542（10uM）和T3（1uM）的CMRL1066培养基，需要隔天更换新鲜的培养基和因子，培养4天左右，检测蛋白标记物，鉴定胰岛细胞（见附图3）。

实施例2的诱导时间为22天。

本发明中，作为优选的技术方案，各培养基的组分为：

S1培养基为DMEM低糖培养基，另含有100ng/mL的Activin A，体积百分比为2%的B27。

S2培养基为DMEM低糖培养基，另含有50ng/mL的KGF，体积百分比为2%的B27。

S3培养基为DMEM/F12培养基，另含有50ng/mL的KGF、0.25uM的SANT1、500nM的PdbU、10uM的Y27632、2uM的RA、体积百分比为2%的B27。

S4培养基为DMEM/F12培养基，另含有50ng/mL的KGF、0.25uM的SANT1、5ng/ml的Activin A、10uM的Y27632、100nM的RA、体积百分比为2%的B27。

S5培养基为DMEM高糖培养基，另含有0.25uM的SANT1、100nM的RA、1uM的XXI、10uM的SB431542、1uM的T3、20ng/mL的Betacellulin、体积百分比为2%的B27。

所述B27为50倍的浓缩母液。

实施例3 RT-qPCR法检测各阶段细胞特异性标志物的表达

收取S1、S4、S6阶段最后一天的细胞，利用常规方法进行提取总RNA、合成cDNA、q-PCR扩增目的基因，其检测的特异性标志物包括SOX17、FOXA2、PDX1、 NKX6-1、INS、GCG、SST，结果如附图4-6。引物序列由北京博迈德生物技术有限公司合成，基因的引物序列、退火温度见下表。

由图4-6可知，内胚层特异性标志物SOX17在定型内胚层阶段有很强的表达，FOXA2在定型内胚层阶段也有高表达，而胰腺发育相关的转录因子PDX1，胰腺内胚层相关的转录因子NKX6-1在原肠管细胞被诱导为胰腺祖细胞阶段时，表达量升高。随着这些转录因子的激活，胰岛中代表β细胞的标志INS也被激活开始表达，并且持续维持在较高的水平，除了表达INS基因以外，还表达胰岛另外两种内分泌细胞α细胞以及δ细胞的标志物，GCG和SST的基因。细胞按照胰腺发育的规律，表达相应的基因。

实施例4 葡萄糖刺激胰岛素释放实验

（1）实验分组：胰岛细胞组，iPSC组，人胰腺细胞组。

（2）细胞准备：待检测胰岛细胞组、人胰腺细胞组、和iPSC组去培养上清，加上200uL无糖的KRB buffer，培养1h。

（3）去掉上清，加200uL含2mmol/l（低糖）或者22mmol/l（高糖）葡萄糖的KRBbuffer，继续孵育1h之后，收集上清至EP管中。

（4）用人胰岛素ELISA试剂盒检测上清中胰岛素含量，人胰岛素ELISA试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司。

将诱导成熟的胰岛细胞组与人胰腺细胞相比较，通过ELISA试剂盒测定其细胞上清中胰岛素含量，结果如附图7所示。低糖和高糖刺激下，诱导后的胰岛细胞与正常胰岛细胞的胰岛素分泌水平相当。

实施例5 DTZ染色鉴定胰岛细胞

(1)诱导结束后，弃去培养瓶中细胞诱导液，加入PBS轻柔洗涤3次，弃液。

(2)加入DTZ工作液，37℃避光孵育20min。

(3)弃液，加入PBS轻柔洗涤3次，弃上清。

(4)加入PBS，倒置显微镜下观察并拍照，猩红色细胞即为胰岛素阳性细胞。

iPSC经20天的诱导分化，进行DTZ染色，结果见附图8。分化的胰岛细胞呈致密团样或球样组织，DTZ染色呈猩红色，说明经诱导后的细胞胞浆中含有大量锌离子，而未能成功分化或分化不成熟的细胞(见背景)呈浅粉色或黄棕色。可以看出， iPSC经诱导分化为胰岛细胞。显微镜下计算胰岛细胞的诱导率，即纯度达62.4%。

Claims

1.一种利用自体免疫细胞定向分化为胰岛细胞的方法，其特征在于：所述方法为从患者外周血获取免疫细胞经体外去分化为诱导多能干细胞，再定向分化生成胰岛细胞；

所述定向分化生成胰岛细胞，包括诱导多能干细胞定向分化诱导生成内胚层细胞、诱导分化为原肠管细胞、诱导分化为胰腺祖细胞、诱导分化为胰腺内皮层细胞、诱导分化为胰岛细胞；

所述诱导多能干细胞定向分化诱导生成内胚层细胞，用含CHIR99021化合物的S1培养基进行培养，培养22-26h后，更换新鲜的S1培养基，培养48-70h获得定型内胚层细胞；

所述S1培养基为DMEM低糖培养基，另含有95-105ng/mL的Activin A，体积百分比为1-3%的B27；所述含CHIR99021化合物的S1培养基，CHIR99021化合物的浓度为13-15 ug/ml；

所述诱导分化为原肠管细胞，将内胚层细胞使用S2培养基进行培养，培养68-76h获得原肠管细胞；所述S2培养基，为DMEM低糖培养基，另含有45-55ng/mL的KGF，体积百分比为1-3%的B27；

所述诱导分化为胰腺祖细胞，由原肠管细胞继续诱导分化为胰腺祖细胞，分为两个阶段，第一阶段为诱导早期胰腺祖细胞，先在含有190-210nM LDN193189的S3培养基培养22-26h，更换S3培养基培养24-48h；第二阶段将早期胰腺祖细胞诱导成为胰腺祖细胞，使用S4培养基，培养4-6天；

所述S4培养基为DMEM/F12培养基，另含有45-55ng/mL的KGF、0.24-0.26uM的SANT1、4.5-5.5ng/ml的Activin A、9.5-10.5uM的Y27632、95-105nM的RA、体积百分比为1-3%的B27；

所述诱导分化为胰腺内皮层细胞，将胰腺祖细胞，在S5培养基中培养4-5天，诱导分化为胰腺内皮层细胞；所述S5培养基为DMEM高糖培养基，另含有0.24-0.26uM的SANT1、95-105nM的RA、0.95-1.05uM的XXI、9.5-10.5uM的SB431542、0.9-1.1uM的T3、19-21ng/mL的Betacellulin、体积百分比为1-3%的B27；

所述诱导分化为胰岛细胞，使用的培养基为包含9.5-10.5uM 的SB431542和0.9-1.1uM的T3的CMRL1066培养基，培养4-7天。

2.根据权利要求1所述的一种利用自体免疫细胞定向分化为胰岛细胞的方法，其特征在于：所述诱导多能干细胞，纯度≧95%。