CN102333862B - 人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化 - Google Patents

人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化 Download PDF

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Abstract

本发明提供了促进多能干细胞分化的方法。具体地讲，本发明提供了一种使用TEF‑β受体激动剂例如激活素A、激活素B、激活素C、GDF‑8、GDF‑11或GDF15来增加与胰腺内分泌谱系相关的标记物的表达的方法。

Description

人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化
本发明要求于2008年10月31日提交的序列号为61/110,278的申请的 优先权。
技术领域
本发明提供了促进多能干细胞分化的方法。具体地讲，本发明提供了一 种增加与胰腺内分泌谱系相关的标记物表达的方法。
背景技术
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注 意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种 方法是从多能干细胞，例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。
在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产 生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群体。诸如甲状腺、胸 腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过 程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞可表达多种标记物，例 如HNF-3β、GATA4、Mixl1、CXCR4和Sox-17。
定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层细胞表达胰- 十二指肠同源盒基因Pdx1。在不存在Pdx1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后 不再发育。因而，Pdx1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了其 他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌 组织来自胰腺内胚层的分化。
据报道，从小鼠的胚胎细胞衍生了带有胰岛细胞特征的细胞。例如， Lumelsky等人(Science 292：1389，2001)报道了小鼠胚胎干细胞向类似胰岛的 胰岛素分泌结构的分化。Soria等人(Diabetes 49：157，2000)报道，衍生自小鼠 胚胎干细胞的胰岛素分泌细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠中的血糖变 正常。
例如，Hori等人(PNAS 99：16105，2002)揭示，用磷酸肌醇3-激酶 (LY294002)的抑制剂处理小鼠胚胎干细胞产生了类似β细胞的细胞。
又如，Blyszczuk等人(PNAS 100：998，2003)报道，从组成型表达Pax4 的小鼠胚胎干细胞产生了胰岛素生成细胞。
Micallef等人报道说，视黄酸可调节胚胎干细胞定向形成Pdx1阳性胰 腺内胚层。在对应于胚胎的原肠胚形成末的期间，加入胚胎干细胞分化第4 天的培养物中时视黄酸是诱导Pdx1最有效的(Diabetes 54：301，2005)。
Miyazaki等人报道了过表达Pdx1的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果显 示，外源Pdx1表达在所得的分化细胞中明显增强了胰岛素、生长抑素、葡 萄糖激酶、神经元素3、P48、Pax6和HNF6基因的表达(Diabetes 53：1030， 2004)。
Skoudy等人报道说，激活素A(TGF-β超家族的成员)能上调小鼠胚 胎干细胞中的胰腺外分泌基因(p48和淀粉酶)和内分泌基因(Pdx1、胰岛 素和胰高血糖素)的表达。使用1nM激活素A时观察到最大的效果。他们 还观察到，胰岛素和Pdx1 mRNA的表达水平不受视黄酸的影响；然而，3nM FGF7处理导致Pdx1的转录水平升高(Biochem.J.379：749，2004)。
Shiraki等人研究了能特征性增强胚胎干细胞分化成Pdx1阳性细胞的生 长因子的效果。他们观察到，TGF-β2可再现地产生更高比例的Pdx1阳性细 胞(Genes Cells.2005年6月；10(6)：503-16)。
Gordon等人阐明了在不存在血清的情况下和在存在激活素连同Wnt信 号转导抑制剂的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导brachyury+/HNF-3β+内胚层细 胞(US 2006/0003446A1)。
Gordon等人(PNAS，第103卷，第16806页，2006年)声称：“Wnt 和TGF-β/nodal/激活素信号转导同时为前原条的产生所必需”。
然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型可能不会完全模拟高等哺乳动物(例 如人)中的发育程序。
Thomson等人从人胚泡分离了胚胎干细胞(Science 282：114，1998)。同 时，Gearhart和其同事从胎儿生殖腺组织衍生了人胚胎生殖(hEG)细胞系 (Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998)。与可简单通 过与白血病抑制因子(LIF)一起培养来防止分化的小鼠胚胎干细胞不一样，人 胚胎干细胞必须维持在非常特殊的条件下(美国专利No.6,200,806、WO 99/20741、WO 01/51616)。
D’Amour等人描述了在高浓度激活蛋白和低血清的存在下产生人胚胎 干细胞衍生的定形内胚层的富集培养物(Nature Biotechnology 2005)。将这些 细胞移植到小鼠的肾囊下，导致分化成具有某些内胚层器官的特性的更成熟 细胞。在加入FGF-10之后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞可进一步 分化成Pdx1阳性细胞(US 2005/0266554A1)。
D’Amour等人(Nature Biotechnology-24，1392-1401(2006))声称：“我 们已开发出一种将人胚胎干(hES)细胞转化成能够合成胰腺激素即胰岛素、 胰高血糖素、生长抑素、胰多肽和生长素释放肽(ghrelin)的内分泌细胞的分 化方法。该方法通过引导细胞经过通向能表达内分泌激素的细胞的类似定形 内胚层、肠管内胚层、胰腺内胚层和内分泌前体的各阶段，来模拟体内胰腺 器官发生。”
又如，Fisk等人报道了用于从人胚胎干细胞产生胰岛细胞的*** (US2006/0040387A1)。在该情形中，分化途径分成三个阶段。首先用丁酸钠 和激活素A的组合使人胚胎干细胞分化成内胚层。然后将细胞与TGF-β拮 抗剂(例如成头蛋白(Noggin))结合EGF或β细胞素一起进行培养，以产生 Pdx1阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。
在一个例子中，Benvenistry等人声称：“我们得出结论认为，Pdx1的过 量表达增强了胰腺富集基因(pancreatic enriched genes)的表达，胰岛素表达的 诱导可能需要另外的仅存在于体内的信号(Benvenistry等人，Stem Cells 2006； 24：1923-1930)”。
因此，仍明显需要开发用于建立能扩增以满足目前临床需要，同时又保 持分化成胰腺内分泌细胞、胰腺激素表达细胞或胰腺激素分泌细胞的潜力的 多能干细胞系的条件。我们采取了替代方法来改善使人胚胎干细胞向胰腺内 分泌细胞分化的效率。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供使多能干细胞分化的方法，该方法包括以 下步骤：
a.培养多能干细胞，
b.使所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞，
c.使所述表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞分化成表达胰腺内 胚层谱系特征性标记物的细胞，以及
d.使所述表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞分化成表达胰腺内 分泌谱系特征性标记物的细胞。
在一个实施例中，本发明提供了一种用于增加与胰腺内分泌谱系相关的 标记物的表达的方法，所述方法包括用包含量足以引起与胰腺内分泌谱系相 关的标记物表达增加的TGF-β受体激动剂的培养基处理表达胰腺内分泌谱 系特征性标记物的细胞。
附图说明
图1示出本发明所采用的分化方案的略图。
图2示出与本发明所采用的分化方案的各个阶段相关的标记物的表达。 分图a)示出在已分化至第1阶段的人胚胎干细胞系H1的细胞中通过FACS 确定的CXCR4的表达。分图b)示出在已分化至第1阶段的人胚胎干细胞 系H1的细胞中通过实时PCR确定的与第1阶段相关的标记物的表达。
图3示出分化至本发明所采用的分化方案的第6阶段并随后用激活素A 处理(第7阶段)的人胚胎干细胞系H1的细胞的双硫腙染色。分图a)示 出在通过40μm细胞过滤网之前用双硫腙染色的细胞的相差。分图b)示出 能够通过40μm细胞过滤网的用双硫腙染色的细胞的相差。分图c示出未能 通过40μm细胞过滤网的用双硫腙染色的细胞的相差。
图4示出根据实例2所述的方法，在分化至本发明所采用分化方案的第 6阶段并在分化至第6阶段之后用激活素A处理的人胚胎干细胞系H1的细 胞中，通过实时PCR确定的pdx-1(分图a)、nkx6-1(分图b)、Pax4(分 图c)、nkx2.2(分图d)、胰岛素(分图e)和胰高血糖素(分图f)的表 达。
具体实施方式
将本发明的具体实施方式部分分成以下几个分部分，来描述或举例说明 本发明的某些特征、实施例或应用，这是为了使公开内容清楚起见，并非限 制本发明。
定义
干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能 力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细 胞。干细胞的特征还在于：其具有在体外由多种胚层(内胚层、中胚层和外 胚层)分化成各种细胞谱系的功能细胞以及移植后产生多种胚层的组织和注 入胚泡后基本上有助于大部分(如果不是所有的话)组织形成的能力。
干细胞根据其发育潜能分为：(1)全能，指能够产生所有的胚胎和胚胎 外细胞类型；(2)多能，指能够产生所有的胚胎细胞类型；(3)专能，指能够 产生细胞谱系的亚群，但在特定组织、器官或生理***内能产生所有的细胞 (例如造血干细胞(HSC)可产生的后代细胞包括：HSC(自我更新型)、局 限于血细胞的寡能祖细胞以及作为血液正常组分的所有细胞类型和成分(如 血小板))；(4)寡能，指能够产生比多能干细胞更有限的细胞谱系亚群；以 及(5)单能，指能够产生单一细胞谱系(如生精干细胞)。
分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(如神 经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化的细胞或诱导分化的细胞是已经在 细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用到 分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环 境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，且在正常环境下不 能分化成另一细胞类型或回复到分化程度较低的细胞类型。去分化指细胞回 复到细胞的谱系当中特化(或定向)程度较低的地位的过程。如本文所用， “细胞的谱系”限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细 胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。谱系特异性标记物是 指与所关注谱系的细胞表型特异性相关并能够用于评价非定向细胞向所关 注谱系的分化的特征。
“β-细胞谱系”是指对于转录因子PDX-1和下列转录因子中的至少一种 具有阳性基因表达的细胞：NGN-3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl-1、HNF-3 β、MAFA、Pax4和Pax6。表达β细胞谱系特征性标记物的细胞包括β细胞。
如本文所用，“表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞”或“第1阶段 细胞”或“第1阶段”是指表达至少一种下列标记物的细胞：SOX-17、GATA-4、 HNF-3β、GSC、Cer1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4 CD48、脱中胚蛋白(eomesodermin，EOMES)、DKK4、FGF17、GATA-6、 CXCR4、C-Kit、CD99或OTX2。表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞 包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和定形内胚层细胞。
如本文所用，“表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞”是指表达至少 一种下列标记物的细胞：PDX-1、HNF-1β、PTF-1α、HNF-6或HB9。表达 胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞包括胰腺内胚层细胞、原肠管细胞和后 前肠细胞。
如本文所用，“表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞”或“第5阶段 细胞”或“第5阶段”是指表达至少一种下列标记物的细胞：NGN-3、NeuroD、 Islet-1、PDX-1、NKX6.1、Pax-4、Ngn-3或PTF-1α。表达胰腺内分泌谱系 特征性标记物的细胞包括胰腺内分泌细胞、胰腺激素表达细胞、胰腺激素分 泌细胞和β细胞谱系的细胞。
如本文所用，“定形内胚层”指具有在原肠胚形成过程中从上胚层产生的 细胞的特性并形成胃肠道及其衍生物的细胞。定形内胚层细胞表达下列标记 物：HNF-3β、GATA-4、SOX-17、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99 和Mixl1。
如本文所用，“胚外内胚层”是指表达至少一种下列标记物的细胞群： SOX-7、AFP和SPARC。
如本文所用，“标记物”是在所关注细胞中差异表达的核酸或多肽分子。 关于这一点，差异表达意指阳性标记物的水平增加，而阴性标记物的水平降 低。与其他细胞相比，所关注细胞中的核酸或多肽标记物的可检测水平足够 高或足够低，使得可以使用本领域已知的多种方法识别所关注细胞，并将所 关注细胞与其他细胞区相区分。
如本文所用，“中内胚层细胞”是指表达至少一种下列标记物的细胞： CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、SOX-17、DKK4、HNF-3β、GSC、FGF17、 GATA-6。
如本文所用，“胰腺内分泌细胞”或“胰腺激素表达细胞”是指能够表达至 少一种下列激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。
如本文所用，“胰腺内胚层细胞”或“第4阶段细胞”或“第4阶段”是指能 够表达至少一种下列标记物的细胞：NGN-3、NeuroD、Islet-1、PDX-1、PAX-4、 NKX2.2。
如本文所用，“胰腺激素生成细胞”指能够生成至少一种下列激素的细 胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。
如本文所用，“胰腺激素分泌细胞”或“第6阶段细胞”或“第6阶段”是指 能够分泌至少一种下列激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多 肽。
如本文所用，“后前肠细胞”或“第3阶段细胞”或“第3阶段”是指能够分 泌至少一种下列标记物的细胞：PDX-1、HNF-1、PTF-1A、HNF-6、HB-9、 PROX-1。
如本文所用，“前原条细胞”指表达至少一种下列标记物的细胞：Nodal 或FGF8。
如本文所用，“原肠管细胞”或“第2阶段细胞”或“第2阶段”是指能够分 泌至少一种下列标记物的细胞：HNF-1或HNF-4A。
如本文所用，“原条细胞”指表达至少一种下列标记物的细胞：Brachyury、 Mix样同源盒蛋白或FGF4。
多能干细胞的分离、扩增和培养
多能干细胞的特性描述
多能干细胞可表达阶段特征性胚胎抗原(SSEA)3和4以及可用称为 Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的标记物中的一种或多种(Thomson等人， Science 282：1145，1998)。多能干细胞体外分化导致丧失SSEA-4、Tra-1-60 和Tra-1-81的表达(如果存在的话)，并增加SSEA-1的表达。未分化的多 能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，该酶可通过用4％多聚甲醛固定细胞， 然后用Vector Red作为底物显影来检测，如生产商所描述的(VectorLaboratories，Burlingame Calif)。未分化的多能干细胞通常还表达Oct-4和 TERT，这可由RT-PCR检测。
增殖的多能干细胞的另一理想表型是分化成所有三个胚层即内胚层、中 胚层和外胚层组织的细胞的潜能。多能干细胞的多能性可例如通过这样来证 实：将细胞注射进重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中，用4％多聚甲醛固定所 形成的畸胎瘤，然后对它们进行组织学检验以确定是否存在来自三个胚层的 细胞类型。或者，可通过产生拟胚体并评估拟胚体的与三个胚层相关的标记 物的存在来确定多能性。
可以使用标准G带技术并比较已公布的相应灵长类物种的核型来分析 增殖的多能干细胞系的核型。希望获得具有“正常核型”的细胞，其意指细胞 为整倍体，其中所有人染色体都存在并且没有明显的改变。
多能干细胞的来源
多能干细胞选自人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCell)以及突变型人 胚胎干细胞系BG01v(BresaGen，Athens，GA)。
多能干细胞的培养
在一个实施例中，通常在饲养细胞层上培养多能干细胞，饲养细胞可以 多种方式支持多能干细胞。或者，在培养***中培养多能干细胞，所述培养 ***基本上不含饲养细胞，但同样支持多能干细胞的增殖而不会进行显著的 分化。使用通过此前培养另一细胞类型而调理过的培养基来支持多能干细胞 在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。作为另一种选择，用化学成分确定 的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。
例如，Reubinoff等人(Nature Biotechnology 18：399-404(2000))和 Thompson等人(Science，1998年11月6日：第282卷，第5391期，第 1145-1147页)公开了用小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层来培养来自人胚泡 的多能干细胞系。
Richards等人(Stem Cells 21：546-556，2003)对一组11种不同的成人、胎 儿和新生儿饲养细胞层支持人多能干细胞培养的能力进行了评价。Richards 等人声称：“在成人皮肤成纤维细胞饲养层上培养的人胚胎干细胞系保持了 人胚胎干细胞形态并保持了多能性”。
US20020072117公开了可产生支持灵长类多能干细胞在无饲养细胞的 培养物中生长的培养基的细胞系。所采用的细胞系是从胚胎组织获得或从胚 胎干细胞分化而来的***系和成纤维细胞样细胞系。US20020072117还 公开了所述细胞系作为原代饲养细胞层的用途。
又如，Wang等人(Stem Cells 23：1221-1227，2005)公开了用于人多能干 细胞在衍生自人胚胎干细胞的饲养细胞层上长期生长的方法。
又如，Stojkovic等人(Stem Cells 2005 23：306-314，2005)公开了一种衍生 自人胚胎干细胞的自发分化的饲养细胞***。
在另一例子中，Miyamoto等人(Stem Cells 22：433-440，2004)公开了从人 胎盘获得的饲养细胞的来源。
Amit等人(Biol.Reprod 68：2150-2156，2003)公开了衍生自人***的饲养 细胞层。
又如，Inzunza等人(Stem Cells 23：544-549，2005)公开了来自人出生后 ***成纤维细胞的饲养细胞层。
US6642048公开了可支持灵长类多能干(pPS)细胞在无饲养细胞的培养 物中生长的培养基以及可用于产生这种培养基的细胞系。US6642048声称： “本发明包括从胚胎组织获得或从胚胎干细胞分化而来的***系和成纤 维细胞样细胞系。在本公开中描述并阐明了用于衍生这种细胞系、处理培养 基以及用该调理培养基培育干细胞的方法”。
又如，WO2005014799公开了用于哺乳动物细胞维持、增殖和分化的条 件培养基。WO2005014799声称：“通过鼠细胞(特别是分化并永生化的转 基因肝细胞，称为MMH(Met鼠肝细胞))的细胞分泌活性对根据本发明 制备的培养基进行调理”。
又如，Xu等人(Stem Cells 22：972-980，2004)公开了一种从人胚胎干细胞 衍生物获得的调理培养基，所述干细胞衍生物已经过遗传修饰而过表达人端 粒酶逆转录酶。
又如，US20070010011公开了一种用于维持多能干细胞的化学成分确定 的培养基。
一种可供选择的培养***采用补充有能促进胚胎干细胞增殖的生长因 子的无血清培养基。例如，Cheon等人(BioReprod DOI：10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日)公开了一种无饲养 细胞的无血清培养***，其中胚胎干细胞维持在补充有能引发胚胎干细胞自 我更新的不同生长因子的未经调理的血清替代(SR)培养基中。
又如，Levenstein等人(Stem Cells 24：568-574，2006)公开了使用补充有 bFGF的培养基，在不存在成纤维细胞或调理培养基的情况下长期培养人胚 胎干细胞的方法。
又如，US20050148070公开了一种在无血清且无成纤维细胞饲养细胞的 成分确定的培养基中培养人胚胎干细胞的方法，该方法包括：在含有白蛋白、 氨基酸、维生素、矿物质、至少一种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、至少一种 胰岛素或胰岛素替代品的培养基中培养干细胞，该培养基基本上无哺乳动物 胎血清且含有至少约100ng/ml能激活成纤维细胞生长因子信号转导受体的 成纤维细胞生长因子，其中该生长因子的供给来源不是仅为成纤细胞饲养 层，该培养基支持干细胞在无饲养细胞或调理培养基的情况下以未分化状态增殖。
又如，US20050233446公开了一种用于培养干细胞，包括未分化的灵长 类原始干细胞的限定培养基。在溶液中，此培养基较于在培养的干细胞基本 上是等渗的。在给定的培养物中，特定的培养基包含基础培养基和各为一定 量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸，所述bFGF、胰岛素和抗坏血酸为支持胚性 干细胞进行基本上非分化性生长所必需。
又如，US6800480描述“在一个实施例中，提供了用于以基本上未分化 状态培养灵长类来源的原始干细胞的细胞培养基，其包括低渗透压、低内毒 素基础培养基，此培养基可有效用于支持灵长类来源的原始干细胞的生长。 基础培养基混合了可有效支持灵长类来源的原始干细胞生长的营养血清和 选自饲养细胞和衍生自饲养细胞的胞外基质组分的基底。该培养基还包括非 必需氨基酸、抗氧化剂和选自核苷和丙酮酸盐的第一生长因子”。
又如，US20050244962描述：“在一个方面，本发明提供了一种培养灵 长类胚胎干细胞的方法。在基本上不含哺乳动物胎血清(优选也基本上不含 任何动物血清)的培养物中，并在存在由除仅成纤维细胞饲养层之外的来源 提供的成纤维细胞生长因子情况下培养干细胞。在一种优选的形式中，通过 添加足够的成纤维细胞生长因子，使得成纤维细胞饲养层(以前是维持干细 胞培养物所需的)变成了非必需的”。
在又一个例子中，WO2005065354公开了一种基本上无饲养细胞和无血 清的成分确定的等渗培养基，其包含：a.基础培养基；b.一定量的bFGF， 该量足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长；c.一定量的胰岛素，该 量足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长；和d.一定量的抗坏血酸， 该量足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长。
又如，WO2005086845公开了一种维持未分化的干细胞的方法，所述方 法包括使干细胞暴露于转化生长因子-β(TGF-β)蛋白家族的成员、成纤维细 胞生长因子(FGF)蛋白家族的成员或烟酰胺(NIC)，所述成员或烟酰胺的量足 以维持细胞处于未分化状态达足以实现所需结果的一段时间。
可将多能干细胞接种至合适的培养基质上。在一个实施例中，合适的培 养基质是胞外基质成分，例如衍自基底膜的成分，或者可形成黏着分子受体 -配体偶联物的一部分的成分。在一个实施例中，合适的培养基质是 MATRIGEL(Becton Dickenson)。MATRIGEL是得自Engelbreth-Holm Swarm肿瘤细胞的可溶性制品，其在室温下胶凝而形成重构的基底膜。
其他的细胞外基质组分和组分混合物适合作为替代物。取决于所扩增的 细胞类型，这可包括单独的层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫 酸乙酰肝素等或者它们的各种组合。
可在存在可促进细胞存活、增殖和保持理想特性的培养基存在的情况 下，以合适的分布将多能干细胞接种于所述基质上。所有这些特性可得益于 对接种分布的认真考虑并可容易地由本领域技术人员确定。
合适的培养基可用如下组分制备，例如达尔伯克氏改良伊格尔培养基 (DMEM)，Gibco # 11965-092；Knockout达尔伯克氏改良伊格尔培养基(KO DMEM)，Gibco # 10829-018；Ham′s F12/50％DMEM基础培养基；200mM L- 谷氨酰胺，Gibco # 15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050；β-巯 基乙醇，Sigma # M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco # 13256-029。
从多能干细胞形成胰腺激素生成细胞
在一个实施例中，本发明提供一种从多能干细胞产生胰腺激素生成细胞 的方法，该方法包括如下步骤：
a.培养所述多能干细胞，
b.使所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞，
c.使所述表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞分化成表达胰腺内 胚层谱系特征性标记物的细胞，以及
d.使所述表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞分化成表达胰腺内 分泌谱系特征性标记物的细胞。
在本发明的一个方面，胰腺内分泌细胞是胰腺激素生成细胞。在一个替 代方面，胰腺内分泌细胞是表达β细胞谱系特征性标记物的细胞。表达β细 胞谱系特征性标记物的细胞能表达Pdx1和至少一种下列转录因子：NGN-3、 Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl-1、HNF-3β、MAFA、Pax4和Pax6。在本发 明的一个方面，表达β细胞谱系特征性标记物的细胞是β细胞。
适用于本发明的多能干细胞包括例如人胚胎干细胞系H9(NIH编码： WA09)、人胚胎干细胞系H1(NIH编码：WA01)、人胚胎干细胞系H7(NIH 编码：WA07)和人胚胎干细胞系SA002(Cellartis，瑞典)。能表达至少一种 以下多能细胞特有标记物的细胞也适用于本发明：ABCG2、cripto、CD9、 FoxD3、连接蛋白43、连接蛋白45、Oct4、Sox2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、Tra1-81。
定形内胚层谱系特征性标记物选自SOX-17、GATA4、Hnf-3beta、GSC、 Cer1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4 CD48、脱中胚 蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99和OTX2。 适用于本发明的是表达至少一种定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。在本 发明的一个方面，表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞为原条前体细胞。在一个替代方面，表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞为中内胚层 细胞。在一个替代方面，表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞为定形内 胚层细胞。
胰腺内胚层谱特征性标记物选自Pdx1、HNF-1β，PTF1a、HNF-6、HB9 和PROX1。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内胚层谱系特征性标记物 的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞为 胰腺内胚层细胞。
胰腺内分泌谱系特征性标记物选自NGN-3、神经源性分化蛋白 (NeuroD)、Islet-1、Pdx-1、NKX6.1、Pax-4、Ngn-3以及PTF-1α。在一个实 施例中，胰腺内分泌细胞能够表达以下激素中的至少一种：胰岛素、胰高血 糖素、生长抑素和胰多肽。适用于本发明的细胞为表达至少一种胰腺内分泌 谱系特征性标记物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内分泌谱系特征 性标记物的细胞为胰腺内分泌细胞。胰腺内分泌细胞可以是胰腺激素表达细胞。或者，胰腺内分泌细胞可以是胰腺激素分泌细胞。
在本发明的一个方面，胰腺内分泌细胞为表达β细胞谱系特征性标记物 的细胞。表达β细胞谱系特征性标记物的细胞能表达Pdx1和至少一种以下 转录因子：NGN-3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl-1、HNF-3β、MAFA、Pax4 和Pax6。在本发明的一个方面，表达β细胞谱系特征性标记物的细胞是β 细胞。
表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞的形成
可通过本领域的任何方法或通过本发明提出的任何方法，使多能干细胞 分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 23，1534-1541(2005) 中公开的方法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的 细胞。
例如，可根据Shinozaki等人，Development 131，1651-1662(2004)中公 开的方法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细 胞。
例如，可根据McLean等人，Stem Cells 25，29-38(2007)中公开的方法， 使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006) 中公开的方法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的 细胞。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活素A的培养基中在血清不存在 下进行培养，然后将所述细胞与激活素A和血清一起培养，再然后将所述细 胞与激活素A和另一浓度的血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内 胚层谱系特征性标记物的细胞。这个方法的一个例子在Nature Biotechnology 23，1534-1541(2005)中公开。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活素A的培养基中在血清不存在 下进行培养，然后将所述细胞与激活素A和另一浓度的血清一起培养，使多 能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。这个方法的一个 例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2005中公开。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活素A和Wnt配体的培养基中在 血清不存在下进行培养，然后移除Wnt配体并将所述细胞与激活素A和血 清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细 胞。这个方法的一个例子在NatureBiotechnology 24，1392-1401(2006)中公 开。
例如，可通过根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请No.11/736,908 中所公开的方法处理多能干细胞，来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱 系特征性标记物的细胞。
例如，可通过根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请No.11/779,311 中所公开的方法处理多能干细胞，来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱 系特征性标记物的细胞。
例如，可通过根据美国专利申请No.60/990,529中所公开的方法处理多 能干细胞，来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细 胞。
例如，可通过根据美国专利中请No.61/076,889中所公开的方法处理多 能干细胞，来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细 胞。
例如，可以通过根据美国专利申请No.61/076,900中所公开的方法处理 多能干细胞，来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细 胞。
例如，可通过根据美国专利申请No.61/076,908中所公开的方法处理多 能干细胞，来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细 胞。
例如，可以通过根据美国专利申请No.61/076,915中所公开的方法处理 多能干细胞，来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细 胞。
表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞的分化
表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞的形成可通过在进行特定方 案之前或之后检测该标记物的存在来确定。多能干细胞通常不表达这类标记 物。因而，当细胞开始表达它们时即检测到多能细胞的分化。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达定形内胚层谱 系特征性标记物的细胞表达的蛋白质标记物的试剂(例如抗体)来确定分化 效率。
用于评估蛋白质标记物和核酸标记物在培养的或分离的细胞中的表达 的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)、Northern印迹原位杂交(参见例如“Current Protocols in Molecular Biology”(Ausubel等人(编辑)，2001增刊))以及免疫测定法，例如分 段材料的免疫组织化学分析，Western印迹、以及用于完整细胞中容易获得 的标记物的流式细胞分析(FACS)(参见例如Harlow和Lane的“UsingAntibodies：A Laboratory Manual”，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。
多能干细胞的特征是本领域技术人员所熟知的，并且多能干细胞的其他 特征不断地被鉴别。多能干细胞标记物包括(例如)一种或多种如下物质的 表达：ABCG2、cripto、FoxD3、Connexin43、Connexin45、Oct4、Sox2、 Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、Tra1-81。
在用本发明方法处理多能干细胞后，可通过将处理过的细胞群体暴露于 特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞表达的蛋白质标记 物(例如CXCR4)来进行纯化。
表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞的形成
可通过本领域的任何方法或通过本发明提出的任何方法，使表达定形内 胚层谱系特征性标记物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的 细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006) 中公开的方法，使表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞分化成表达胰腺 内胚层谱系特征性标记物的细胞。
可通过用成纤维细胞生长因子和hedgehog信号转导途径抑制剂KAAD- 环巴胺处理表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞，然后移除含有纤维细 胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基，并随后将所述细胞在含有视黄酸、 成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基中进行培养，来使表达定形 内胚层谱系特征性标记物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性 标记物的细胞。这个方法的一个例子在Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中公开。
在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请No. 11/736,908中公开的方法，通过用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处 理表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞一段时间，来使表达定形内胚层 谱系特征性标记物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标记物 的细胞。
在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请No. 11/779,311中公开的方法，通过用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处 理表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞一段时间，来使表达定形内胚层 谱系特征性标记物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标记物 的细胞。
在本发明的一个方面，通过根据美国专利申请No.60/990,529中所公开 的方法处理表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞，来使表达定形内胚层 谱系特征性标记物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标记物 的细胞。
表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞的检测
胰腺内胚层谱系特征性标记物是本领域技术人员所熟知的，并且其他胰 腺内胚层谱系特征性标记物不断被鉴别。这些标记物可用于确定根据本发明 处理过的细胞是否已分化而获得胰腺内胚层谱系特征性特性。胰腺内胚层谱 系的特异性标记物包括一种或多种转录因子，例如Hlxb9、PTF-1a、PDX-1、 HNF-6、HNF-1β的表达。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达胰腺内胚层谱 系特征性标记物的细胞表达的蛋白质标记物的试剂(例如抗体)来确定分化 效率。
用于评估蛋白质标记物和核酸标记物在培养的或分离的细胞中的表达 的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)、Northern印迹原位杂交(参见例如“Current Protocols in Molecular Biology”(Ausubel等人(编辑)，2001增刊))以及免疫测定法，例如分 段材料的免疫组织化学分析，Western印迹、以及用于完整细胞中容易获得 的标记物的流式细胞分析(FACS)(参见例如Harlow和Lane的“UsingAntibodies：A Laboratory Manual”，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。
表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞的形成
可通过本领域的任何方法或通过本发明公开的任何方法，使表达胰腺内 胚层谱系特征性标记物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的 细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006) 中公开的方法，使表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞分化成表达胰腺 内分泌谱系特征性标记物的细胞。
例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞在含有DAPT 和毒蜥外泌肽-4的培养基中进行培养，然后移除含有DAPT和毒蜥外泌肽-4 的培养基，并随后将所述细胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-1和HGF的培养基 中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞进一步分化成表 达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞。这个方法的一个例子在Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开。
例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞在含有毒蜥外 泌肽4的培养基中进行培养，然后移除该含有毒蜥外泌肽4的培养基，并随 后将所述细胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-1和HGF的培养基中进行培养，来 使表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌 谱系特征性标记物的细胞。该方法的一个例子在D’Amour等人， NatureBiotechnology，2006中公开。
例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞在含有DAPT 和毒蜥外泌肽4的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标记 物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞。该方法的 一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中公开。
例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞在含有毒蜥外 泌肽4的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞 进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞。该方法的一个例子 在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中公开。
在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请No. 11/736,908中所公开的方法，通过用抑制Notch信号转导通路的因子处理表 达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标 记物的细胞进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞。
在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请No. 11/779,311中所公开的方法，通过用抑制Notch信号转导通路的因子处理表 达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标 记物的细胞进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞。
在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请No. 60/953,178中所公开的方法，通过用抑制Notch信号转导通路的因子处理表 达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标 记物的细胞进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞。
在本发明的一个方面，根据美国专利申请No.60/990,529中所公开的方 法，通过处理表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞，来使表达胰腺内胚 层谱系特征性标记物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记 物的细胞。
在本发明的一个方面，本发明提供了一种用于增加与胰腺内分泌谱系相 关的标记物的表达的方法，所述方法包括用包含足量的TGF-β受体激动剂的 培养基处理表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞，以引起与胰腺内分泌 谱系相关的标记物表达的增加。
所述TGF-β受体激动剂可以是任何能结合并激活TGF-β受体的任何试 剂。在一个实施例中，所述TGF-β受体激动剂选自激活素A、激活素B和 激活素C。
在一个替代实施例中，所述TGF-β受体激动剂可以是激活素A的肽变 体。这类肽变体的实例公开于转让给Centocor R&D，Inc.的美国专利申请 No.61/076,889中。
在一个实施例中，表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞用其量足以 引起与胰腺内分泌谱系相关的标记物表达的增加的激活素A处理约一至约 五天。作为另外一种选择，表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞用其量 足以引起与胰腺内分泌谱系相关的标记物表达的增加的激活素A处理约三 至约五天。作为另外一种选择，表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞用 其量足以引起与胰腺内分泌谱系相关的标记物表达的增加的激活素A处理 约五天。
在一个替代实施例中，TGF-β受体激动剂选自GDF-8、GDF 11和 GDF-15。在一个实施例中，表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞用选 自GDF-8、GDF 11和GDF-15的TGF-β受体激动剂以及至少一种其他因子 进行处理。在一个实施例中，所述至少一种其他因子是环苯胺-吡啶并三嗪 化合物。这类环苯胺-吡啶并三嗪化合物的实例公开于转让给Centocor R&D， Inc.的美国专利申请No.61/076,900中。在一个替代实施例中，所述至少一种 其他因子是苯胺-吡啶并三嗪化合物。这类苯胺-吡啶并三嗪化合物的实例公 开于转让给Centocor R&D，Inc.的美国专利申请No.61/076,908中。在一个 替代实施例中，所述至少一种其他因子是公开于转让给Centocor R&D，Inc. 的美国专利申请No.61/076,915中的化合物。
在本发明的一个方面，随后将表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞 富集。富集步骤可以在用TGF-β受体激动剂处理表达胰腺内分泌谱系特征性 标记物的细胞之前进行。作为另外一种选择，富集步骤可以在已用TGF-β 受体激动剂处理表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞之后进行。
在一个实施例中，通过获得表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞的 悬浮液并使细胞悬浮液通过40μm细胞过滤网来实现富集。
表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞的检测
胰腺内分泌谱系特征性标记物是本领域技术人员所熟知的，并且其他胰 腺内分泌谱系特征性标记物不断被鉴别。这些标记物可用于确定根据本发明 处理过的细胞是否已分化而获得胰腺内分泌谱系特征性特性。胰腺内分泌谱 系的特异性标记物包括一种或多种转录因子，例如NGN-3、NeuroD、Islet-1 的表达。
β细胞谱系特征性标记物是本领域技术人员所熟知的，并且其他β细胞 谱系特征性标记物不断被鉴别。这些标记物可用于确认根据本发明处理的细 胞已分化，以获得β-细胞谱系特征性的性质。除了别的以外，β细胞谱系特 异性特征包括一种或多种转录因子的表达，这些因子例如为Pdx1(胰腺和十 二指肠同源盒基因-1)、Nkx2.2、Nkx6.1、Isl1、Pax6、Pax4、NeuroD、Hnf1b、 Hnf-6、Hnf-3β和MafA以及其他。这些转录因子在内分泌细胞鉴别领域中 已得到公认。参见例如Edlund(Nature Reviews Genetics 3：524-632(2002))。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达胰腺内分泌谱 系特征性标记物的细胞表达的蛋白质标记物的试剂(例如抗体)来确定分化 效率。作为另一种选择，可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由 表达β细胞谱系特征性标记物的细胞表达的蛋白质标记物的试剂(例如抗体) 来确定分化效率。
用于评估蛋白质标记物和核酸标记物在培养的或分离的细胞中的表达 的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)、Northern印迹原位杂交(参见例如“Current Protocols in Molecular Biology”(Ausubel等人(编辑)，2001增刊))以及免疫测定法，例如分 段材料的免疫组织化学分析，Western印迹、以及用于完整细胞中容易获得 的标记物的流式细胞分析(FACS)(参见例如Harlow和Lane的“UsingAntibodies：A Laboratory Manual”，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。
在本发明的一个方面，通过在处理后测定给定细胞培养物中胰岛素阳性 细胞的百分比来确定分化的效率。在一个实施例中，本发明方法在给定培养 物中产生约100％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在 给定培养物中产生约90％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明 方法在给定培养物中产生约80％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中， 本发明方法在给定培养物中产生约70％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施 例中，本发明方法在给定培养物中产生约60％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约50％的胰岛素阳性细胞。在 一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约40％的胰岛素阳性细 胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约30％的胰岛素 阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约20％的 胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约10％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中 产生约5％的胰岛素阳性细胞。
在本发明的一个方面，通过测定葡萄糖刺激的胰岛素分泌来确定分化的 效率，胰岛素分泌可通过测量由细胞释放的C-肽的量测定。在一个实施例中， 由本发明方法产生的细胞可产生约1000ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例 中，由本发明方法产生的细胞可产生约900ng C肽/pg DNA。在一个替代实 施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约800ngC肽/pg DNA。在一个替 代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约700ng C肽/pgDNA。在一 个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约600ng C肽/pg DNA。 在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约500ng C肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约400ng C肽 /pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约500ng C 肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约400ng C肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约 300ng C肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产 生约200ng C肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞 可产生约100ng C肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的 细胞可产生约90ng C肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生 的细胞可产生约80ng C肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产 生的细胞可产生约70ng C肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法 产生的细胞可产生约60ng C肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方 法产生的细胞可产生约50ng C肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明 方法产生的细胞可产生约40ng C肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发 明方法产生的细胞可产生约30ng C肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本 发明方法产生的细胞可产生约20ng C肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由 本发明方法产生的细胞可产生约10ng C肽/pg DNA。
疗法
在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有1型糖尿病，或有发展1 型糖尿病风险的患者的方法。本方法涉及对多能干细胞进行培养，使该多能 干细胞体外分化成β-细胞谱系，并将该β-细胞谱系的细胞移植进患者中。
在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有2型糖尿病，或有发展 2型糖尿病风险的患者的方法。该方法涉及将多能干细胞进行培养，使该培 养的细胞体外分化成β-细胞谱系，并将该β-细胞谱系的细胞移植进该患者 中。
如果合适，可用有利于该植入细胞存活和功能的药剂或生物活性剂对患 者进行进一步处理。这些试剂可包括(例如)胰岛素、TGF-β家族的成员(包 括TGF-β1、2和3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、 -12和-13)、成纤维细胞生长因子-1和-2、血小板衍生生长因子-AA和-BB、 血小板富集血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(GDF-5、 -6、-7、-8、-10、-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多效蛋白(pleiotrophin)、内皮素等等。其他药物化合物可包括(例如)烟酰胺、胰高 血糖素样肽-I(GLP-1)和胰高血糖素样肽-II、GLP-1和2模拟体、毒蜥外泌肽 -4、视黄酸、甲状旁腺激素、MAPK抑制剂例如美国已公布的专利申请 2004/0209901和美国已公布的专利申请2004/0132729中所公开的化合物。
可使多能干细胞在移植进接受者前分化成胰岛素生成细胞。在一个特定 的实施例中，在移植进接受者之前，使多能干细胞完全分化成β-细胞。作为 另一种选择，可将多能干细胞以未分化状态或部分分化的状态移植进接受者 中。可在该接受者中发生进一步分化。
可将定形内胚层细胞或，作为另一选择，胰腺内胚层细胞，或作为另一 种选择，β细胞作为分散细胞进行移植，或可将这些细胞形成簇，可将这些 细胞簇输注进肝门静脉内。作为另一种选择，可将细胞设置在生物相容性的 可降解聚合物型支持物中、多孔的非可降解性装置中或可进行封装以保护其 免受宿主免疫应答的破坏。可将细胞移植进接受者中的合适位置内。植入位 点包括(例如)肝脏、原来的胰腺、肾包膜下空间、网膜、腹膜、浆膜下空 间、肠、胃或皮下袋。
为了增强植入细胞的进一步分化、存活率或活性，可在施用细胞之前、 与其同时或之后施用额外的因子，例如生长因子、抗氧化剂或抗炎剂。在某 些实施例中，生长因子用于体内分化施用的细胞。这些因子可以由内源细胞 分泌并就地暴露于施用的细胞。可通过本领域已知的内源生长因子或外源施 用的生长因子的任意组合来诱导植入细胞进行分化。
移植中所用的量取决于多种因素，包括患者的状况和对该疗法的响应， 并且可由本领域技术人员确定。
在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有糖尿病，或有发展糖尿病 风险的患者的方法。该方法涉及培养多能干细胞、使该培养的细胞体外分化 成β-细胞谱系，并将该细胞掺入三维的支持物中。在移植进患者前，可将该 细胞在该支持物上体外维持。作为另一种选择，可将包含该细胞的支持物直 接移植进患者中而无需进行额外的体外培养。可任选将至少一种有利于植入 细胞的存活和功能的药剂掺入该支持物中。
适用于本发明目的的支持材料包括可用于组织修复的组织模板、导管、 屏障物和贮器。具体地讲，已经在体外和体内用于生物组织重建或再生，以 及用于递送趋化剂来诱导组织生长的泡沫、海绵、凝胶、水凝胶、纺织物和 非织造结构形式的合成材料和天然材料适用于实践本发明的方法。参见，例 如在美国专利5,770,417、美国专利6,022,743、美国专利5,567,612、美国专 利5,759,830、美国专利6,626,950、美国专利6,534,084、美国专利6,306,424、 美国专利6,365,149、美国专利6,599,323、美国专利6,656,488、美国已公布 的专利申请2004/0062753A1、美国专利4,557,264和美国专利6,333,029中 所公开的材料。
为了形成含有药剂的支承体，可在形成支承体前将药剂与聚合物溶液混 合。作为另一种选择，可将药剂涂覆于制好的支持物上，优选在存在药物载 体的情况下进行。药物可以液体、细分固体或任何其他合适的物理形式存在。 作为另一种选择，可将赋形剂加入支持物中以改变药剂的释放速率。在一个 替代实施例中，将至少一种为抗炎化合物的药物化合物掺入支持物中，例如 在美国专利6,509,369中所公开的化合物。
可将至少一种为抗凋亡化合物的药物化合物掺入支持物中，例如在美国 专利6,793,945中所公开的化合物。
可将至少一种为纤维变性抑制剂的药物化合物掺入支持物中，例如在美 国专利6,331,298中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种能够增强血管生成的药物化合物，例如美国已 公布的专利申请2004/0220393和美国已公布的专利申请2004/0209901中所 公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种为免疫抑制化合物的药物化合物，例如美国已 公布的专利申请2004/0171623中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种为生长因子的药物化合物，例如TGF-β家族 的成员(包括TGF-β1、2和3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、-3、-4、-5、-6、 -7、-11、-12和-13)、成纤维细胞生长因子-1和-2、血小板衍生生长因子-AA 和-BB、血小板富集血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(GDF-5、 -6、-8、-10、-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多效蛋白、内皮 素等等。其他药物化合物可包括(例如)烟酰胺、缺氧诱导因子1-α、胰高 血糖素样肽-I(GLP-1)、GLP-1和GLP-2模拟体、毒蜥外泌肽-4、nodal、成 头蛋白、NGF、视黄酸、甲状旁腺激素、腱生蛋白-C、弹性蛋白原、凝血酶 衍生的肽、凯萨林菌素(cathelicidin)、防御素(defensin)、层粘连蛋白、含有 粘附性细胞外基质蛋白例如纤粘蛋白和玻璃粘连蛋白的细胞结合结构域和 肝素结合结构域的生物肽、MAPK抑制剂(例如在美国已公布的专利申请2004/0209901和美国已公布的专利申请2004/0132729中所公开的化合物)。
可通过将细胞简单地沉积在该支架上来实现将本发明细胞掺入支架中。 细胞可通过简单扩散进入支架中(J.Pediatr.Surg.23(1 Pt 2)：3-9(1988))。已经 发展了若干其他方法来增强细胞接种的效率。例如，已经将转瓶用于将软骨 细胞接种于聚乙醇酸支架上(Biotechnol.Prog.14(2)：193-202(1998))。用于细 胞接种另一种方法是利用离心，这种离心产生最小的应力给接种的细胞并增 强接种效率。例如，Yang等人发展了一种细胞接种方法(J.Biomed.Mater.Res. 55(3)：379-86(2001))，称为离心细胞固定(Centrifugational Cell Immobilization， CCI)。
本发明通过(但不限于)以下实例进一步说明。
实例
实例1
在不存在胎牛血清的情况下细胞系H1的人胚胎干细胞向胰腺内分泌细 胞的分化
将第52代的人胚胎干细胞系H1细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀 释物)的培养皿上培养并暴露于补充有2％BSA(目录号152401，MP Biomedical，Ohio)和100ng/ml激活素A(R&D Systems，MN)+20ng/ml WNT-3a(目录号1324-WN-002，R&D Systems，MN)+8ng/ml的bFGF(目录 号100-18B，PeproTech，NJ)的RPMI培养基一天，然后用补充有2％BSA和 100ng/ml激活素A加8ng/ml bFGF的RPMI培养基再处理两天。接着，将培 养物用DMEM/F12+2％BSA+50ng/ml FGF7+0.25μM环巴胺-KAAD (#239804，Calbiochem，CA)处理两天，然后在DMEM/F12+1％B27 (Invitrogen，CA)+50ng/ml FGF7+0.25μM环巴胺-KAAD+2μM视黄酸(RA) (Sigma，MO)+100ng/ml成头蛋白(R&D Systems，MN)中温育四天。
通过将细胞在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+100ng/ml成头 蛋白+1μM DAPT(γ-分泌酶抑制剂)(目录号565784，Calbiochem，CA)+ 1μM ALK5抑制剂II(目录号616452，Calbiochem，Ca)+100ng/ml导蛋白-4 (R&D Systems，MN)中温育三天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen， CA)+1μM ALK5抑制剂II(Calbiochem，Ca)中再温育七天，来使细胞分化为 胰腺内分泌细胞。增加了最后一个阶段以进一步使内分泌培养物成熟，该阶 段由在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)中处理七天构成。除了该最后 阶段之外，所有其他阶段均包括每日更换培养基。图1概略地描述了该方法。 在每个阶段，用血球计计算细胞数目并收集RNA用于PCR分析。所有样品 均一式三份进行收集。
图2的分图a和分图b示出对应于第1阶段的三天(3D)这一时间点 上的通过FACS测得的细胞中的CXCR4表达和实时PCR的数据。表达的改 变倍数相对于未分化的H1胚胎干细胞示出。
实例2
向第6阶段培养物添加激活素A显著提高胰腺内分泌标记物的表达
将第43代的人胚胎干细胞系H1的细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30 稀释物)的培养皿上培养，并根据实例1所述的方法分化为胰腺内分泌细胞。 在第6阶段，将一些培养物用10ng/ml的激活素A(R&D Systems，MN)处理 七天。在第7天，将细胞在室温下用1X Accutase(Sigma，MO)处理5分钟， 然后移除Accutase并添加DMEM/12+1％B27。将贴壁细胞用细胞刮移除并 轻轻地再悬浮，并使其通过40μm细胞过滤网。液流通过，移出留在过滤网 上的细胞，收集样品以用于PCR和双硫腙染色。双硫腙(DTZ)是选择性结合 锌的染料，已经证明胰岛内存在锌。图3(分图a-c)示出了在使用40μm细 胞过滤网分离之前和之后的DTZ染色的培养物。大部分(大约80％)大于 40μm的细胞簇DTZ染色呈阳性。这提供了一种快速且简单的内分泌富集细 胞簇的富集方法。图4(分图a-f)示出了在第6阶段用+/-10ng/ml的激活素 A处理并随后使用40μm过滤器富集的细胞的基因表达谱。激活素A添加到 第6阶段显著提高了所有关键胰腺内分泌标记物的表达。
藉此将整篇文档中引用的出版物全文以引用方式并入本文。尽管上文已 结合实例和优选实施例描述了本发明的各个方面，但应当理解本发明的范围 不受上述具体实施方式的限定，而受以下在专利法原则下正确解释的权利要 求书的限定。

Claims (4)

1.一种增加与胰腺内分泌谱系相关的标记物的表达的方法，所述方法包括用包含量足以引起与胰腺内分泌谱系相关的标记物表达增加的激活素A的培养基，处理表达与胰腺内分泌谱系相关的标记物的细胞一至五天。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过获得表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞的悬浮液，并使细胞悬浮液通过过滤网分离，来将所述表达与胰腺内分泌谱系相关的标记物的细胞进行富集；其中所述表达内分泌标记物特征性标记物的细胞通过过滤网来保持。
3.一种使多能干细胞分化的方法，所述方法包括如下步骤：
a)培养所述多能干细胞，
b)使所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞，
c)使所述表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞，
d)使所述表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞；以及
e)用包含量足以引起与胰腺内分泌谱系相关的标记物表达增加的激活素A的培养基，处理所述表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞一至五天，
其中所述多能干细胞选自人胚胎干细胞系H1、H7、H9和BG01v。
4.根据权利要求3所述的方法，其中通过获得表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞的悬浮液，并使细胞悬浮液通过过滤网分离，来将所述表达与胰腺内分泌谱系相关的标记物的细胞进行富集；其中所述表达内分泌标记物特征性标记物的细胞通过过滤网来保持。
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