CN108699515A - 由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性β细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性β细胞。本发明还涉及通过所述方法产生的功能性β细胞和所述β细胞的用途。

Description

由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性β细胞
技术领域
本发明涉及由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法。
背景技术
胰岛细胞移植已被用于治疗1型糖尿病患者，显示出优于胰岛素疗法的葡萄糖稳态，但是该疗法受到器官捐献的限制。诸如人胚胎干细胞(hESC)的人多能干细胞(hPSC)可以无限增殖并分化成包括β细胞(BC)在内的许多细胞类型，因此可以解决供体胰岛的短缺。在WO 2012/175633、WO 2014/033322和WO 2015/028614中已分别提供了在体外将hPSC分化成定形内胚层(DE)、胰腺内胚层(PE)细胞和内分泌祖细胞(EP)的方案。由hPSC体外制备葡萄糖响应性胰岛素分泌BC是具有挑战性的。大多数方案导致产生胰岛素的细胞不能重现BC的表型，因为这些细胞也共表达其他激素，如胰高血糖素，并且对葡萄糖刺激无响应。
Rezania，A.等人“Reversal of diabetes with insulin-producing cellsderiVed in Vitro from human pluripotent stem cells”Nature Biotechnology 32，1121-1133(2014)和Pagliuca，F.W.等人“Generation of Functional Human Pancreaticb Cells In Vitro”Cell 159(2)，428-439，2014年10月9日，报道了hESC在体外分化成胰岛素分泌细胞。使用静态温育研究，来自两组的细胞都对葡萄糖刺激敏感，显示葡萄糖刺激后胰岛素产量增加大约2倍。然而，这种响应无论是在质量上还是在数量上均与原代成体β细胞的响应不同。作为比较，据报道，人胰岛刺激指数为2至10或更高(Shapiro，J.A.M.等人，“Islet Transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus usinga glucocorticoid-free immunosuppressive regimen”New England JournalofMedicine 343，230-238，7月27日(2000年))。
所报道的干细胞衍生的BC在动态细胞灌注试验中也未能显示出对葡萄糖的胰岛素响应，因此相对于原代人BC其在功能上不成熟。
用于由hPSC衍生的内分泌祖细胞形成能够在动态细胞灌注试验中响应于葡萄糖的功能性成熟BC的有效方案是未知的。改进现有方案以生成全功能性成熟BC用于与人胰岛相似的更一致的细胞产物，以获得移植后的可预测结果以及对于体外筛选目的都是至关重要的。
发明内容
本发明涉及由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的改进的方法。本发明还涉及完全分化的葡萄糖响应性β细胞。本发明还涉及可通过本发明的方法获得的功能性成熟β细胞。本发明还涉及所述细胞的医学应用，尤其是在1型糖尿病的治疗上。本发明也可以解决从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出的其他问题。
附图说明
图1示出了筛选途径，其中未分化的人胚胎干细胞(hESC)分化成定形内胚层(DE)并重新接种在T75烧瓶中，在其中细胞进一步分化为胰腺内胚层(PE)和内分泌祖细胞(EP)。在EP阶段开始β细胞(BC)步骤1筛选，并持续4-7天，并通过对NKX6.1+/INS+/GCG-细胞数目的qICC监测和/或流式细胞术进行分析。在BC步骤1筛选结束时开始BC步骤2筛选，并在3D悬浮培养物中持续3-7天的时间，这是通过在BC步骤1结束时解离成单细胞并在定轨摇床上以50rpm重新聚集成簇而实现的。通过静态和/或动态GSIS、INS蛋白质含量、ICC和qPCR对细胞进行分析。
图2示出了化合物对通过流式细胞术(FC)测量的在BC步骤1第4天的INS+/NKX6.1+/GCG-表达的影响。
图3示出了在BC步骤1期间组合选中物(hit)时对INS+/NKX6.1+细胞数目的累加影响。
图4示出了BC步骤1方法的时间研究。
图5示出了在BC步骤2方法期间添加7天的化合物对静态GSIS的影响。
图6A示出了在BC步骤2的第3天存在葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞。
图6B示出了在BC步骤2的第7天存在葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞。
图7示出了通过剂量依赖性葡萄糖和磺酰脲介导的胰岛素的动态方式释放所证明的，hESC衍生的β细胞的功能性。
图8示出了从独立的多能细胞系诱导功能性β细胞的稳健方案。
图9示出了在BC步骤2的第9天在干细胞衍生的β细胞中表达的β细胞特异性基因。
图10示出了通过针对INS+/NKX6.+细胞进行分选对β细胞标志物的富集。
图11示出了移植了干细胞衍生的β细胞的糖尿病小鼠显示出血糖的快速降低和糖尿病逆转。
图12示出了移植细胞的腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)。
图13示出了干细胞衍生的β细胞防止在链脲佐菌素治疗后的高血糖症。
图14示出了在移植的小鼠中的高水平循环人C-肽。
发明描述
本发明的发明人已经进行了大量的小分子筛选，并确定了一种由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞阶段生成功能性成熟β细胞(BC)的新颖且简单的两步方法。所述方案的第一步(BC步骤1)诱导高比例的INS+和NKX6.1+双阳性细胞以及仅少量GCG阳性细胞。该方案的第二步(BC步骤2)生成在体外对反复的葡萄糖攻击有强烈响应的功能性成熟BC。重要的是，所述hPSC衍生的BC细胞在动态灌注试验中响应于反复的葡萄糖+/-毒蜥外泌肽4攻击。得到的功能性成熟BC也在移植到非糖尿病小鼠的肾囊3周后对体内升高的葡萄糖水平有响应。
本发明的发明人已经发现，在细胞移植后体内施用γ-氨基丁酸(GABA)可以潜在地增强移植的BC的功能效应。所得的全功能性BC群体可用作基于体外的BC产物来研究人BC功能，筛选化合物以用于调节胰岛素分泌、胰岛素蛋白质加工、胰岛素分泌和机制、GSIS研究、钙流入信号传导、自身免疫BC破坏以及BC转分化。贯穿本申请的术语方法或方案或过程可以互换使用。
具体实施方式
1.由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其包括以下步骤：(1)在基础培养基中包含组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂、转化生长因子β(TGF-β)信号通路抑制剂、肝素和烟酰胺的培养基中培养干细胞衍生的内分泌祖细胞，以获得INS+和NKX6.1+双阳性未成熟β细胞，以及(2)用12％KOSR和GABA培养步骤(1)中获得的β细胞，以获得功能性成熟β细胞。
2.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂为3-去氮腺嘌呤A(DZNep)。
3.根据实施方案2的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中DZNep的浓度低于1μM。
4.根据实施方案2的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中DZNep的浓度为1μM。
5.根据实施方案2的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中DZNep的浓度在1μM至10μM的范围内。
6.根据实施方案2的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中DZNep的浓度为10μM。
7.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中转化生长因子β(TGF-β)信号通路抑制剂为Alk5iII。
8.根据实施方案7的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中Alk5iII的浓度低于1μM。
9.根据实施方案7的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中Alk5iII的浓度为1μM。
10.根据实施方案7的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中Alk5iII的浓度在1μM至10μM的范围内。
11.根据实施方案7的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中Alk5iII的浓度为10μM。
12.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中肝素的浓度低于1μg/ml。
13.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中肝素的浓度为1μg/ml。
14.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中肝素的浓度在1μg/ml至10μg/ml的范围内。
15.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中肝素的浓度为10μg/ml。
16.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中烟酰胺的浓度低于1mM。
17.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中烟酰胺的浓度为1mM。
18.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中烟酰胺的浓度在1mM至10mM的范围内。
19.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中烟酰胺的浓度为10mM。
20.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其包括步骤(1)：在包含DZNep、Alk5iII、肝素和烟酰胺的培养基中培养所述干细胞衍生的内分泌祖细胞。
21.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其包括步骤(1)：在包含1μM DZNep、10μM Alk5iII、10μg/ml肝素和10mM烟酰胺的培养基中培养所述干细胞衍生的内分泌祖细胞。
22.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其包括与一种或者多种附加剂组合的步骤(1)。
23.根据实施方案22的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中所述附加剂选自γ-分泌酶抑制剂、cAMP升高剂(cAMP elevating agent)、甲状腺激素信号通路激活剂及其组合。
24.根据实施方案23的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中附加剂为γ-分泌酶抑制剂。
25.根据实施方案24的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中γ-分泌酶抑制剂为N-[(3，5-二氟苯基)乙酰基]-L-丙氨酰基-2-苯基]甘氨酸-1，1-二甲基乙酯(DAPT)。
26.根据实施方案25的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中DAPT的浓度低于2.5μM。
27.根据实施方案25的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中DAPT的浓度为2.5μM。
28.根据实施方案25的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中DAPT的浓度在2.5μM至10μM的范围内。
29.根据实施方案25的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中DAPT的浓度为5μM。
30.根据实施方案25的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中DAPT的浓度为10μM。
31.根据实施方案23的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中所述附加剂为cAMP升高剂。
32.根据实施方案31的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中cAMP升高剂为二丁酰基-cAMP(dbcAMP)。
33.根据实施方案32的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中dbcAMP的浓度低于250μM。
34.根据实施方案32的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中dbcAMP的浓度为250μM。
35.根据实施方案32的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中dbcAMP的浓度在250μM至500μM的范围内。
36.根据实施方案32的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中dbcAMP的浓度为500μM。
37.根据实施方案23的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中所述附加剂为甲状腺激素信号通路激活剂。
38.根据实施方案37的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中甲状腺激素信号通路激活剂为T3。
39.根据实施方案38的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中T3的浓度低于1μM。
40.根据实施方案38的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中T3的浓度为1μM。
41.根据实施方案38的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中T3的浓度在1μM至10μM的范围内。
42.根据实施方案38的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中T3的浓度为10μM。
43.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其包括步骤(1)：在包含DZNep、Alk5iII、肝素和烟酰胺与DAPT的组合的培养基中培养所述干细胞衍生的内分泌祖细胞。
44.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其包括步骤(1)：在包含1μM DZNep、10μM Alk5iII、10μg/ml肝素和10mM烟酰胺与2.5μM DAPT的组合的培养基中培养所述干细胞衍生的内分泌祖细胞。
45.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其包括步骤(1)：在包含DZNep、Alk5iII、肝素和烟酰胺与dbcAMP的组合的培养基中培养所述干细胞衍生的内分泌祖细胞。
46.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其包括步骤(1)：在包含1μM DZNep、10μM Alk5iII、10μg/ml肝素和10mM烟酰胺与250μM dbcAMP的组合的培养基中培养所述干细胞衍生的内分泌祖细胞。
47.根据实施方案23的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性β细胞的方法，其中附加剂γ-分泌酶抑制剂与甲状腺激素信号通路激活剂组合。
48.根据实施方案47的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中附加剂DAPT与T3组合。
49.根据实施方案48的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中DAPT的浓度为2.5μM且T3的浓度为1μM。
50.根据实施方案23的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中附加剂γ-分泌酶抑制剂与cAMP升高剂组合。
51.根据实施方案50的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中附加剂DAPT与dbcAMP组合。
52.根据实施方案51的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中DAPT的浓度为2.5μM且dbcAMP的浓度为250μM。
53.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中所述干细胞衍生的内分泌祖细胞在步骤(1)中培养1-4天。
54.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中所述干细胞衍生的内分泌祖细胞在步骤(1)中培养4天。
55.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中所述干细胞衍生的内分泌祖细胞在步骤(1)中培养4-7天。
56.根据前述任一实施方案的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中在步骤1中获得10％-60％INS+和NKX6.1+双阳性未成熟β细胞。
57.根据前述任一实施方案的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中在步骤(1)中获得20％-50％INS+和NKX6.1+双阳性未成熟β细胞。
58.根据前述任一实施方案的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中在步骤1中获得25％-45％INS+和NKX6.1+双阳性未成熟β细胞。
59.根据前述任一实施方案的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中在步骤1中获得30％-40％INS+和NKX6.1+双阳性未成熟β细胞。
60.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其包括用与一种或多种附加剂组合的12％KOSR和GABA培养步骤(1)中获得的β细胞，以获得功能性成熟β细胞。
61.根据实施方案60的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中GABA的浓度为50μM。
62.根据实施方案60的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中GABA的浓度在50μM至250μM的范围内。
63.根据实施方案60的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中GABA的浓度为250μM。
61.根据实施方案60的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中附加剂为TGF-β信号通路抑制剂。
62.根据实施方案61的来自人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞的功能性成熟β细胞的生成的方法，其中TGF-β信号通路抑制剂为Alk5iII。
63.根据实施方案62的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中Alk5iII的浓度低于1μM。
64.根据实施方案62的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中Alk5iII的浓度为1μM。
65.根据实施方案62的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中Alk5iII的浓度在1μM至10μM的范围内。
66.根据实施方案62的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中Alk5iII的浓度为10μM。
67.根据实施方案60的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中附加剂为甲状腺激素信号通路激活剂。
68.根据实施方案67的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中甲状腺激素信号通路激活剂为T3。
69.根据实施方案68的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中T3的浓度低于1μM。
70.根据实施方案68的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中T3的浓度为1μM。
71.根据实施方案68的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中T3的浓度在1μM至10μM的范围内。
72.根据实施方案68的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中T3的浓度为10μM。
73.根据实施方案60的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中附加剂为组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂。
74.根据实施方案73的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂为DZNep。
75.根据实施方案74的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中DZNep的浓度低于1μM。
76.根据实施方案74的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中DZNep的浓度在1μM至10μM的范围内。
77.根据实施方案74的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中DZNep的浓度为10μM。
78.根据实施方案60的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中附加剂TGF-β信号通路抑制剂与甲状腺激素信号通路激活剂组合，并且组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂为DZNep。
79.根据实施方案78的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中附加剂Alk5iII与T3和DZNep组合。
80.根据实施方案79的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中附加剂10μM Alk5iII与1μM T3和1μM DZNep组合。
81.根据实施方案60的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中附加剂TGF-β信号通路抑制剂与甲状腺激素信号通路激活剂组合。
82.根据实施方案81的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中附加剂Alk5iII与T3组合。
83.根据实施方案82的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中10μM Alk5iII与1μM T3组合。
84.根据实施方案60的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中附加剂TGF-β信号通路抑制剂与组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂组合，并且组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂为DZNep。
85.根据实施方案84的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中附加剂Alk5iII与DZNEP组合。
86.根据实施方案85的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中10μM Alk5iII与1μM DZNEP组合。
87.根据前述实施方案60-86中任一项的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中步骤(1)中获得的INS+和NKX6.1+双阳性未成熟β细胞在步骤(2)中培养3-7天。
88.根据前述实施方案60-86中任一项的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中步骤(1)中获得的INS+和NKX6.1+双阳性未成熟β细胞在步骤(2)中培养7-11天。
89.根据实施方案60-86中任一项的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中在步骤2中获得10％-60％的功能性成熟β细胞。
90.根据实施方案60-86中任一项的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中在步骤2中获得20％-50％的功能性成熟β细胞。
91.根据实施方案60-86中任一项的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中在步骤2中获得25％-45％的功能性成熟β细胞。
92.根据实施方案60-86中任一项的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中在步骤2中获得30％-40％的功能性成熟β细胞。
93.可通过根据实施方案1-92中任一项的方法获得的功能性成熟β细胞。
94.在实施方案93中获得的功能性成熟β细胞，其表达MAFA、IAPP和G6PC2。
在一个实施方案中，通过根据本发明的方法可获得的细胞是产生胰岛素的细胞，可选地还有向产生胰高血糖素、促生长素抑制素、胰多肽和/或生长素释放肽的细胞分化的细胞。如本文所用，“产生胰岛素的细胞”是指产生并储存或分泌可检测量的胰岛素的细胞。“产生胰岛素的细胞”可以是单个细胞或细胞集合。
在另一个实施方案中，包含胰腺细胞的细胞群体从体细胞群体中获得。在一些方面，体细胞群体已被诱导而去分化成胚胎样干(ES，例如多能)细胞。这类去分化的细胞也被称为诱导多能干细胞(iPSC)。
在另一个实施方案中，包含胰腺细胞的细胞群体从胚胎干(ES，例如多能)细胞获得。在一些方面，包含胰腺细胞的细胞群体是多能细胞，如ES样细胞。
在另一个实施方案中，包含胰腺细胞的细胞群体是胚胎分化的干(ES或多能)细胞。分化发生在胚状体和/或单层细胞培养物或其组合中。
在另一个实施方案中，所述细胞群体是干细胞群体。在一些方面，所述细胞群体是分化成胰腺内分泌谱系的干细胞群体。
干细胞是由其在单细胞水平上自我更新和分化以产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，所述子代细胞包括自我更新的祖细胞、非更新的祖细胞以及最终分化的细胞。干细胞的特征还在于其由多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)体外分化成各种细胞谱系的功能性细胞的能力，以及其在移植后产生多个胚层的组织并且在注射到胚泡中后对大多数(如果不是全部的话)组织有显著贡献的能力。
干细胞按其发育潜能分类为：(1)全能的，意思是能够产生所有胚胎细胞类型和胚胎外细胞类型；(2)多能的(pluripotent)，意思是能够产生所有胚胎细胞类型；(3)多潜能的(multi-potent)，意思是能够产生细胞谱系的子集，但是全部都在特定组织、器官或生理***内(例如，造血干细胞(HSC)可以产生包括HSC(自我更新)、血细胞限制性寡能祖细胞以及作为血液正常组分的所有细胞类型和元素(例如血小板)在内的子代)；(4)寡能的，意思是能够产生比多潜能干细胞更受限制的细胞谱系子集；以及(5)单能的，意思是能够产生单细胞谱系(例如生精干细胞)。
如本文所用，“分化”是指细胞从未分化状态进展至分化状态、从未成熟状态进展至较成熟状态或从未成熟状态进展至成熟状态的过程。例如，早期未分化的胚胎胰腺细胞能够增殖并表达特征性标志物，如PDX1、NKX6.1和PTFla。成熟的或分化的胰腺细胞不增殖并且能分泌高水平的胰腺内分泌激素或消化酶。例如，完全分化的β细胞响应于葡萄糖以高水平分泌胰岛素。当细胞失去未分化细胞的标志物或获得分化细胞的标志物时，发生细胞相互作用和细胞成熟的变化。单个标志物的丢失或获得可以表明细胞已经“成熟或完全分化”。术语“分化因子”是指添加到胰腺细胞中以增强其向成熟内分泌细胞(也包含产生胰岛素的β细胞)分化的化合物。示例性分化因子包括肝细胞生长因子、角质形成细胞生长因子、毒蜥外泌肽-4、碱性成纤维细胞生长因子、***-1、神经生长因子、表皮生长因子、血小板衍生的生长因子和胰高血糖素样肽1。在一些方面，细胞的分化包括在包含一种或多种分化因子的培养基中培养细胞。
如本文所用，“人多能干细胞”(hPSC)是指可来自任何来源的并且在适当条件下能够产生不同细胞类型的人子代的细胞，所述细胞类型是所有3个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物。hPSC可具有在8-12周龄的SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力和/或在组织培养中形成所有三个胚层的可识别细胞的能力。在人多能干细胞的定义中包括各种类型的胚胎细胞，包括人胚泡衍生的干(hBS)细胞，它们在30篇文献中通常表示为人胚胎干(hES)细胞(参见，例如，Thomson等人(1998)、Heins等人(2004))以及诱导多能干细胞(参见，例如，Yu等人(2007)；Takahashi等人(2007))。本文描述的各种方法和其他实施方案可能需要或利用来自多种来源的hPSC。例如，适合使用的hPSC可以从发育中的胚胎中获得。附加地或备选地，合适的hPSC可以从已建立的细胞系和/或人诱导多能干(hiPS)细胞获得。
如本文所用，“hiPSC”是指人诱导多能干细胞。
如本文所用，术语“胚泡衍生的干细胞”表示为BS细胞，而人形式被称为“hBS细胞”。在文献中，该细胞通常被称为胚胎干细胞，更具体地称为人胚胎干细胞(hESC)。因此，本发明中使用的多能干细胞可以是由胚泡制备的胚胎干细胞，如在例如WO 03/055992和WO2007/042225中所述，或者是可商购的hBS细胞或细胞系。然而，进一步想到任何人多能干细胞均可用于本发明，包括通过例如用某些转录因子(例如，Yu等人(2007)、Takahashi等人(2007)以及Yu等人(2009)所公开的OCT4、SOX2、NANOG和LIN28)处理成体细胞而重新编程为多能细胞的分化成体细胞。
本文中引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均在此通过引用以其全文并入本文，并且其程度如同单独地且特别地指出每篇参考文献均通过引用而并入且在本文中以其全文进行阐述(在法律允许的最大程度上)。
本文中使用的所有标题和小标题仅仅是为了方便起见，而不应解释为以任何方式限制本发明。
除非另有声明，否则任何和全部实例或本文提供的示例性措辞(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并不造成对本发明范围的限制。说明书中的任何措辞均不应被解释为表示任何未请求保护的要素对本发明的实践是必不可少的。
虽然本发明的某些特征已在本文中说明和描述，但本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、变化和等同物。因此，应当理解，所附的权利要求书旨在涵盖落在本发明的真正精神内的所有这些修改和变化。
缩写列表
AA：激活蛋白A
BC：β细胞
bFGF：碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)
D’Am：D’Amour方案(Kroon等人，2008)
DAPT：N-[(3，5-二氟苯基)乙酰基]-L-丙氨酰基-2-苯基]甘氨酸-1，1-二甲基乙酯
DE：定形内胚层
DZNep：3-去氮腺嘌呤A
EP：内分泌祖细胞
FC：流式细胞术
GABA：γ-氨基丁酸
GSIS：葡萄糖刺激的胰岛素分泌
hESC：人胚胎干细胞
hIPSC：人诱导多能细胞
hPSC：人多能干细胞
KOSR：敲除(knockout)血清替代品
PE：胰腺内胚层
RNA：核糖核酸
PCR：聚合酶链反应
PS：原条
实施例
一般而言，将hPSC分化为功能性成熟β细胞的过程经历各个阶段。图1中概述了在体外由hPSC生成功能性β细胞的示例性方法。
实施例1：内分泌祖细胞的制备
在补充有30ng/mL bFGF(Peprotech#100-18B)和10ng/mL头蛋白(Peprotech#120-10C)的DEF培养基(Cellectis)中培养hESC(SA121)。
对于贴壁培养物，使用在WO 2012/175633中的基于Chir99021和激活蛋白A的方案，在T75烧瓶中将hESC分化成DE。使用TrypleSelect(Invitrogen#12563-029)对DE进行胰蛋白酶化，并且作为单细胞以200K/cm2重新接种于T75烧瓶中补充有100ng/ml激活蛋白A(Peprotech#120-14E)、2％B27(Invitrogen#17504-044)和0.1％PEST(Gibco#15140)的RPMI1640中。使用在WO 2014/033322中的基于LDN、AM508的方案后接着使用在WO 2015/028614中的4天EP方案，使DE细胞附着并分化成PE。
为了产生大量的β细胞，通过使用在WO 2012/175633中的基于Chir99021和激活蛋白A的方案，利用基于悬浮液的可放大培养***，以70RPM作为悬浮培养物(1百万个/ml)在Multitron Standard培养箱(Infors)中的摇瓶中将hESC簇分化成DE，而不需要重新接种步骤。使用在WO 2014/033322中的基于LDN、AM508的方案将DE细胞进一步分化为PE，其中对该方案进行以下微小修改：在PE的第4-10天不添加LDN。在产生PE后进行WO 2015/028614中的4天EP方案。
实施例2：在BC步骤1期间针对诱导INS+/NKX6.1+共表达的因子进行筛选
作为旨在生成完全功能性成熟β细胞的第一步，我们针对生成最大数目的未成熟INS+/NKX6.1+细胞的因子进行了筛选(BC步骤1筛选)。在EP阶段，使用添加在RPMI1640+2％B27+10mM烟酰胺顶部的、补充有一些基于文献的化合物(总共650种感兴趣的化合物)的激酶抑制剂、表观遗传调节剂、氧化还原和生物活性脂质的文库，开始BC步骤1筛选。
针对在7天期间内诱导INS+、NKX6.1+双阳性未成熟BC和少量GCG阳性细胞的能力筛选化合物。每天进行培养基更换。在BC步骤1的第4天和第7天固定细胞，并使用流式细胞术对INS、NKX6.1和GCG表达进行分析(参见表1和图2)。简而言之，通过与TrypLEExpress在37℃下温育10分钟将细胞分散成单细胞悬浮液。将细胞重悬浮于4％低聚甲醛中，在PBS中洗涤，之后接着与第一抗体一起温育过夜，然后与第二抗体一起温育1小时。分化的hPSC共表达C-肽+/NKX6-1+，几乎没有细胞表达α-细胞激素胰高血糖素(图2)。当通过流式细胞术定量时，48％的细胞共表达C-肽+/NKX6-1，这比先前对于干细胞衍生的β细胞所报道的(参考文献Melton，Kieffer)更多。
表1.BC第7天的BC步骤1方法的FC分析
#1
INS+/NKX6.1+ 20.8％
INS+/NKX6.1- 19.8％
INS-/NKX6+ 16.4％
INS/GCG 12.3％
INS+/GCG- 25.6％
INS-/GCG+ 2％
#1：DZNEP 1μM+Alk5i 10μM+10μg/ml肝素
然后将在初级筛选中鉴别的选中物单独组合，并添加到BC步骤1培养基的顶部(参见表2和图3)。时间研究显示，基于Ins和Gcg的mRNA表达，BC步骤1具有4-7天的最优时间长度(参见图4)。表2：示出了BC步骤1培养基中的选中化合物
实施例3：从BC步骤1产生葡萄糖感应胰岛素分泌β细胞
全功能性成熟β细胞的关键功能特征是执行葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)的能力。我们针对在BC步骤2中可以从来自BC步骤1的未成熟INS+/NKX6.1+细胞诱导功能性β细胞的因子进行了筛选。
在悬浮培养物中进行BC步骤2筛选。对于贴壁培养物，在BC步骤1结束时使用Tryple Select对T75烧瓶中的细胞进行胰蛋白酶化，并将细胞用含有12％KOSR(ThermoFisher#10828028)和0.1％PEST(Gibco#15140)的RPMI1640培养基(Gibco#61870)以悬浮液转移到低附着9cm培养皿中。
然后针对在静态GSIS设置中对葡萄糖响应性细胞的诱导，持续7天测试选定的化合物的效果(参见图5)。简而言之，对细胞簇进行采样，并在2.8mM葡萄糖培养基中温育过夜以去除残留的胰岛素。将细胞簇在Krebs缓冲液中洗涤两次，在2.8mM Krebs缓冲液中温育30分钟，收集上清液。随后将细胞簇在16mM葡萄糖Krebs缓冲液中温育30分钟，收集上清液。重复该系列步骤。最后，将细胞簇在含有2.8mM葡萄糖的Krebs缓冲液中温育30分钟，随后收集上清液。使用人胰岛素ELISA(Mercodia)处理含有分泌的胰岛素的上清液样品。
随后将在初级筛选中鉴别的选中物单独组合，并添加到12％KOSR培养基的顶部，以生成最优7天的BC步骤2方案(参见表3)。
表3：示出了BC步骤2培养基中的选中化合物
实施例4：用来测定体外动态人胰岛素分泌的灌注试验
成熟β细胞在功能上通过它们对升高的葡萄糖的快速响应来定义。测量在灌注***内对20mM葡萄糖±1μM毒蜥外泌肽-4或±抗糖尿病磺酰脲化合物甲苯磺丁脲的重复应答作为BC步骤2结束时β细胞的人胰岛素分泌。
简而言之，在Biorep PERFUSION SYSTEM(Biorep#PERI-4.2)的塑料腔室中，用珠子(Bio-Rad#150-4124)悬浮成组的300个手工挑选的hESC-簇或hiPSC-衍生的细胞簇。在控制温度和CO2的条件下，用Krebs缓冲液以0.5ml min-1灌注细胞。在样品收集之前，将细胞在基础(2mM葡萄糖)条件下平衡1小时。在灌注期间，将细胞暴露于20mM葡萄糖±1μM毒蜥外泌肽-4或±100μM甲苯磺丁脲的反复攻击。在灌注结束时，将细胞暴露于20mM葡萄糖顶部的cAMP升高剂。通过人胰岛素ELISA(Mercodia)测量胰岛素分泌。
通过灌注分析，我们的干细胞衍生的β细胞表现出快速且稳定的胰岛素释放，胰岛素分泌的第一阶段和第二阶段与葡萄糖浓度的变化高度同步(参见图6)。GLP-1类似物毒蜥外泌肽-4增加了hPSC衍生的β细胞中的胰岛素分泌水平。重要的是，在体外观察到葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞存在了至少4天，如在BC步骤2的第3天(图6A)和第7天(图6B)所测量的。
在BC步骤2的第7天对我们的干细胞衍生的β细胞进行的灌注分析的另一个实例证明了磺酰脲甲苯磺丁脲对胰岛素分泌的显著的累加效应(图7)。通过从独立的多能细胞系诱导功能性β细胞证明了该方案的稳健性(参见图8)。这些数据共同证明了同先前的报道(Rezania，2014；Paglucia，2014和review Johnson-J，2016Diabetologia)相比，用于生成干细胞衍生的β细胞的该方案的优越性，所述β细胞显示出通过灌注测量的葡萄糖刺激的胰岛素释放动力学。
实施例5：基因表达分析显示干细胞衍生的β细胞与人胰岛物质的高度相似性
收集步骤2的BC第7天的分化细胞簇或人胰岛，并使用来自Qiage(Cat No./ID：74134)的RNeasy试剂盒纯化RNA。使用RNA 6000Nano试剂盒和2100Bianalyser仪器(Agilent)评估质量。根据Nanostring Technology的说明对100ng RNA进行nCounter试验。图9示出了来自人胰岛的以及由hiPSC和两种不同hESC系生成的β细胞的β细胞相关基因的表达谱。该基因表达分析显示了所述干细胞衍生的β细胞与人胰岛具有密切的分子相似性。
通过FACS细胞分选对特定干细胞衍生的INS+/NKX6.1+细胞进行其他基因表达分析。在BD FACSARIA fusionTM仪器上分选之前，解离细胞簇，并使用近红外染料(ThermoScientific)对其进行染色以便分离活细胞和死细胞。固定并透化后，使用细胞内标志物NKX6.1和C-肽对细胞进行染色。使用RNeasy FFPE试剂盒(QIAGEN)纯化RNA，并使用RNA6000Nano试剂盒和2100Bianalyser仪器(Agilent)评估质量。图10示出了对NKX6.1/CPEP双阳性细胞进行细胞分选后关键β细胞成熟基因的富集。将Nanostring数据相对于未分选的细胞群体进行归一化。
实施例6：来自步骤2的干细胞衍生的β细胞在移植后起作用
为了评估体内功能性，将来自BC步骤2的第3-10天的干细胞衍生的β细胞移植到链脲佐菌素诱发的糖尿病小鼠模型中。简而言之，使用多次低剂量(5×70mg/kg)链脲佐菌素(STZ)在免疫受损的scid-beige小鼠(Taconic)中诱发糖尿病，在STZ给药前4小时使小鼠禁食。在接下来的几周内对小鼠的血糖、体重和HbAlc进行监测。当血糖持续高于16mM时认为发生了糖尿病。
在完全麻醉和镇痛下，将5×106个人胚胎干细胞衍生的β细胞(未分选的群体)移植到糖尿病小鼠的肾囊下。通过该动物左后侧的皮肤和肌肉的小切口暴露出肾脏，在肾实质与肾囊之间形成小袋，在其中注射细胞簇。闭合腹壁和皮肤，并使小鼠恢复。
在未来几周内在血糖、体重、HbAlc和人c-肽/胰岛素分泌方面监测细胞功能。我们的干细胞衍生的β细胞在移植后的前两周内导致糖尿病的快速逆转(图11)，这比先前的报道(Rezania，2014)更快。重要的是，所有小于85％BW的小鼠每天接受胰岛素注射，即非移植的糖尿病对照组。用葡萄糖对移植细胞的体内攻击证明了我们的干细胞衍生的β细胞的体内功能性，其具有比对照小鼠更好的葡萄糖清除率和在葡萄糖注射60分钟内升高的循环人c-肽水平(图12)。在另一种糖尿病模型中，将500万个分化细胞移植到非糖尿病SCID/Beige小鼠的肾囊中。随后在移植后8周用链脲佐菌素处理这些小鼠。图13表明，与未移植的对照小鼠相比，预先移植的小鼠免遭在施用链脲佐菌素后的高血糖症，而移植物的去除导致小鼠中的快速高血糖症(参见图13)。从第一个数据点直到研究结束，在所有移植的小鼠中均测量到高水平的循环人c-肽(参见图14)。

Claims (14)

1.由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其包括以下步骤：(1)在基础培养基中包含组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂、TGF-β信号通路抑制剂、肝素和烟酰胺的培养基中培养干细胞衍生的内分泌祖细胞，以获得INS+和NKX6.1+双阳性未成熟β细胞，以及(2)用12％KOSR和GABA培养在步骤(1)中获得的β细胞以获得功能性成熟β细胞。
2.根据权利要求1所述的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂为3-去氮腺嘌呤A(DZNep)。
3.根据权利要求1所述的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中TGF-β信号通路抑制剂为Alk5iII。
4.根据权利要求1所述的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其包括与选自γ-分泌酶抑制剂、cAMP升高剂、甲状腺激素信号通路激活剂及其组合的一种或多种附加剂组合的步骤(1)。
5.根据权利要求4所述的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中γ-分泌酶抑制剂为DAPT。
6.根据权利要求4所述的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中cAMP升高剂为dbcAMP。
7.根据权利要求4所述的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中甲状腺激素信号通路激活剂为T3。
8.根据权利要求4所述的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中所述附加剂为与T3组合的DAPT。
9.根据权利要求4所述的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中所述附加剂为与dbcAMP组合的DAPT。
10.根据权利要求1所述的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其包括用与一种或多种附加剂组合的12％KOSR+GABA培养步骤(1)中获得的β细胞，以获得功能性成熟β细胞。
11.根据权利要求10所述的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中附加剂为Alk5iII。
12.根据权利要求10所述的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中附加剂为T3。
13.根据权利要求10所述的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中附加剂Alk5iII与T3组合。
14.能通过根据权利要求1-13所述的方法获得的功能性成熟β细胞。
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