KR101745297B1 - 비만 진단용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비만 진단용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 정상인과 비교하여 비만인 들에게서 발현이 변화된 RAB6A 및 PPHLN1 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비만 진단용 조성물, 진단을 위한 정보제공방법, 및 비만 치료 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 비만군에서 발현이 변화한 유전자는 비만 및 관련 합병증의 예방 및 치료를 위한 진단과 약물반응 진단에 중요한 바이오 마커로써 활용될 수 있을 것이며, 이에 더하여 비만 및 관련 합병증 질환의 예방 또는 치료용 물질의 타겟 및 개발을 위한 바이오 마커로써도 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

비만 진단용 조성물 및 이의 용도 {Composition for diagnosis of obesity and uses thereof}
본 발명은 비만 진단용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 정상인과 비교하여 비만인 들에게서 발현이 변화된 RAB6A 및 PPHLN1 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비만 진단용 조성물, 진단을 위한 정보제공방법, 및 비만 치료 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.
비만은 체내에 지방조직이 과다한 상태로 정신 및 사회적 요인, 유전, 질병, 약물 등의 다양한 원인으로 섭취하는 열량이 소비하는 열량보다 많을 경우 발생한다. 세계보건기구(WHO)는 비만을 단순히 체형문제를 넘어서 사망률을 높이는 질병으로 규정했고, 미국의사협회도 2013년 비만을 질병으로 선언했다. 국내의 경우 2013년도 통계청 자료에 따르면 성인 비만 유병률은 2012년 기준 32.8%로 전년도에 비해 증가했다고 보고된 바 있다.
1980년~2014년 사이 2배 이상 증가한 비만 인구로 인하여 전 세계 인구의 약 40%가 비만이 된 데 따라, 2016년부터 전 세계 50개 지역의 비만 관련 단체가 세계비만연맹을 구성, 10월 11일을 세계 비만의 날(World Obesity)로 지정해 비만의 예방, 감소, 치료를 위한 다양한 활동을 펼치고 있다. 특히 세계보건기구(WHO)는 2016년 '세계 비만의 날'을 맞아 비만, 당뇨, 충치와 싸우기 위한 효과적 방안으로 탄산음료, 스포츠 드링크, 심지어 100% 과일주스까지 가격을 올리기 위해 더 높은 세금을 부과하도록 권하였다
우리나라 정부도 2020년까지 제4차 국민건강증진종합계획에 따라 비만을 억제하고자 나섰고, 국민건강보험공단이 최근 내놓은 '2016 비만백서'에 따르면 비만으로 인한 경제적 비용이 연간 6조7695억 원에 달하는 것으로 조사됐다. 이는 음주, 흡연 피해에 이어 세 번째를 차지하는 것으로서, 특히 건강보험정책연구원은 비만으로 인한 건강보험진료비가 연간 2조1000억~2조5000억 원에 이르는 것으로 추산한다.
이처럼 비만은 생명을 위협하고 삶의 질을 떨어뜨리는 하나의 질병으로써 전 세계적으로 비만의 예방 및 치료에 대한 관심과 그 중요성이 커지고 있는데, 그 자체의 위험성보다 비만으로 인해 유발될 수 있는 고혈압, 고지혈증, 당뇨병 등의 대사증후군과 지방간, 관절 이상, 및 암 발병 등의 여러 합병증 때문에 그 심각성이 더욱 크게 인식되고 있다. 2010년 세계보건기구에서 발표한 바에 따르면, 정상 체중인 사람에 비해 비만인 사람에게서 고혈압, 당뇨병, 이상지질혈증이 동반될 위험이 2배 이상(고혈압 2.5배, 당뇨병 2배, 고콜레스테롤혈증 2.3배, 고중성지질혈증 2.4배) 높게 나타났다. 상기 질환들 이외에도 여성의 경우 체지방이 과다하면 성호르몬의 균형이 깨져 심한 경우 불임증을 초래할 수 있고, 자궁내막암과 유방암의 위험성이 높아진다고 알려져 있다.
더불어 비만은 신체적인 질환뿐만 아니라. 사회적 고립감이나 소외, 자신감 결여, 및 우울감과 같은 정신적 질환을 유발할 수 있으므로 비만의 예방 및 치료에 대한 필요성은 매우 중요하게 인식되고 있다. 따라서 비만으로 인한 대사증후군 및 관련 합병증의 예방을 위해서는 무엇보다 비만을 조기 진단함으로써 관련 질병들의 발병위험을 낮추는 것이 중요하다.
이에 본 발명자들은 비만의 진단 및 치료를 위한 유전자 마커를 발굴하고자 예의 노력하여, 비만인 들에게서 특이적으로 발현이 변화된 유전자들을 발견(한국등록특허 KR 10-1620274 및 KR 10-1594735 참조)한 바 있다. 그러나 보다 더 빠르고 정확하게 비만을 진단할 수 있는 또 다른 유전자 마커를 개발하기 위하여 연구를 거듭한 결과, RAB6A 및 PPHLN1 유전자를 발굴하여, 상기 유전자들이 비만 진단용 마커로 우수한 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 비만과 관련 합병증의 진단을 위한 유전자 마커를 발굴하기 위해 안출된 것으로, 한국 성인 남녀를 대상으로 체질량지수에 따라 정상대조군(Nomal)과 비만군(Obese)으로 분류한 후 이들의 혈액 내 말초혈액단핵세포와 내장지방조직의 유전자 전사체를 비교 분석하여 비만도에 따라 발현이 변화하는 유전자들을 발굴함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 RAB6A 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비만 진단용 조성물 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 RAB6A 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 비만 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 RAB6A 유전자를 이용하여 비만 치료 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 RAB6A (NCBI 접근(accession) 번호: NM_198896) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비만 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 PPHLN1 (NCBI 접근(accession) 번호: NM_001143787) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 비만 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 RAB6A 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 비만 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 방법은 PPHLN1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 mRNA의 발현수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단백질 발현수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescnce), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 비만 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
(a) RAB6A 유전자를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 세포에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 유전자의 발현수준을 비교하는 단계.
본 발명의 일 구현예로, 상기 방법은 PPHLN1 유전자를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 시험물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 RAB6A 및 PPHLN1 유전자는 체질량지수를 기준으로 분류한 정상군과 비교하여 비만군의 말초혈액단핵세포 및 내장지방에서 공통적으로 발현이 증가되었다. 따라서 상기 비만군에서 발현이 증가한 RAB6A 및 PPHLN1 유전자는 비만 및 관련 합병증의 예방 및 치료를 위한 진단 및 약물 반응 진단, 치료용 물질의 타겟 및 치료 물질 개발 스크리닝을 위한 바이오마커로써 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 한국 성인 남녀 지원자들을 체질량지수(BMI)에 따라 분류한 정상대조군(Normal)과 비만군(Obese)의 말초혈액단핵세포와 내장지방조직에서 발현이 변화하는 유전자를 발굴하기 위한 개략적인 실험디자인을 그림으로 도시한 것이다.
도 2는 정상대조군과 비교하여 비만군에서 말초혈액단핵세포와 내장지방조직 각각 또는 공통적으로 발현이 변화한 유전자의 개수를 그림으로 나타낸 것이다.
도 3은 정상대조군과 비만군의 말초혈액단핵세포와 내장지방조직에서 유전자 전사체의 발현을 분석한 결과, RAB6A 및 PPHLN1 유전자의 발현이 공통적으로 증가하였음을 나타낸 것이다.
본 발명자들은 비만과 관련 합병증의 조기진단을 위한 유전자 마커를 발굴하기 위해 연구한 결과, 정상대조군과 비교하여 비만군에서만 발현이 유의하게 증가하는 유전자를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 RAB6A 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비만 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 진단 대상 질병인 "비만(obesity)"은 대사 장애로 인하여 체내에 지방세포가 증식 분화하고 이로 인하여 지방이 과잉으로 축적된 상태를 의미하며, 고혈압, 당뇨, 및 이상지질혈증 등을 동반하는 대사증후군을 포함하여 관련 합병증을 유발할 수 있다. 에너지 흡수량이 소비량에 비해 상대적으로 증가하는 경우, 지방세포의 수와 부피가 증가되는 과정을 거쳐 결과적으로 지방조직의 질량이 증가된다. 본 발명에서 비만은 체질량지수(BMI) 25 ㎏/m2 이상을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "진단"이란 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 합병증의 유무, 및 예후 등이다. 본 발명에서 진단은 비만의 발병 여부 및 비만 수준 등을 판단하는 것이다.
본 발명의 일실시예에서는, 한국인 성인 남녀를 대상으로 체질량 지수에 따라 정상대조군(Normal) 및 비만군(Obese)으로 분류하고 이들에게서 채취한 말초혈액단핵세포(PBMCs)와 내장지방조직(Omental AT)로부터 RNA를 추출하여 이를 이용해 mRNA 염기서열 분석을 수행한 후 도출된 데이터를 표준화하였다. 그 결과 정상대조군에 비하여 비만군에서 발현이 변화하는 유전자들을 발굴하였다(실시예 1 및 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 발현이 변화된 유전자들 중 RAB6A 및 PPHLN1 유전자를 선정하여 그 발현의 증가 수준을 확인하였다. 그 결과, 정상대조군(Normal)에 비하여 비만군(Obese)에서, PPHLN1 유전자가 말초혈액단핵세포 (PBMCs)에서는 fold change (FC) 1.80, 내장지방조직 (Omental AT)에서는 FC 1.87 수준으로 증가하였으며, RAB6A 유전자는 PBMCs에서는 FC 2.12, Omental AT에서는 FC 7.21 수준으로 발현이 유의적으로 증가하였음을 확인하였다(실시예 3 참조).
따라서 상기 조성물은 PPHLN1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프라이머"란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프로브"란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.
상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 단클론(monoclonal) 항체 및 다클론(polyclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다. 단클론항체는 하이브리도마 세포를 이용한 방법, 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 상기 과정에 필요한 기술은 당업계에 잘 알려져 있어 용이하게 실시할 수 있다. 다클론항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 비만 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 진단 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.
예컨대, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량구조 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 마커 유전자가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이 형태일 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함하며, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 상기 ELISA 키트는 항원-항체 복합체를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소, 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항원-항체 복합체"란 유전자가 코딩하는 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미한다. 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미세입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 RAB6A 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 비만 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
상기 방법은 PPHLN1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 피검체 유래의 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨 등을 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 혈액일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 혈액 내 말초혈액단핵세포일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
상기 mRNA의 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 또는 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 또는 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "비만의 진단을 위한 정보제공방법"은 진단을 위한 예비적 단계로써 비만의 진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 RAB6A 유전자를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 상기 세포에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 유전자의 발현수준을 비교하는 단계를 포함하는 비만 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 방법은 PPHLN1 유전자를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 시험물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 유전자는 본 발명의 일실시예를 통해 비만군에서 발현이 변화하는 유전자를 포함하며, 상기 시험물질 처리 후 유전자의 발현수준을 정상대조군과 비교하여 비만군에서 발현이 감소되어 있는 유전자의 발현을 증가시키거나, 비만군에서 발현이 증가되어 있는 유전자의 발현을 감소시키는 시험물질을 비만 치료 물질로 선정할 수 있다.
상기 세포는 상기 유전자를 발현할 수 있는 세포라면 그 종류에 제한 없이 당업자가 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 실험준비 및 실험방법
1-1. 실험 디자인
한국인 성인 남녀를 대상으로 혈액 내 말초혈액단핵세포와 내장지방조직의 유전자 전사체를 비교 분석함으로써 비만도에 따라 발현이 변화하는 유전자들을 발굴하기 위하여, 도 1에 나타낸 바와 같이 지원자를 모집하여 실험을 디자인하고 진행하였다.
구체적으로, 27-56세 연령대의 남녀 지원자들을 대상으로 1차 스크리닝을 통해 총 15명의 대상자를 선정하였으며, 도 1에 나타낸 바와 같이, 체질량지수 (body mass index; BMI)를 기준으로 2그룹 즉, 체질량지수가 18.5 이상 23 미만 (18.5≤BMI<23 kg/m2, n=6)인 지원자를 정상대조군 (Normal), 체질량 지수가 25.5 이상 31미만 (25.5≤BMI<31 kg/m2, n=9)인 지원자를 비만군 (Obese)으로 분류하였다.
1-2. 말초혈액단핵세포 (PBMCs) 분리 및 RNA 추출
상기 실시예 1-1에서 분류한 정상대조군 (Normal) 및 비만군 (Obese)의 지원자들 중 6명 (Normal=3을 Obese=3)을 선정하고, 이들로부터 혈액을 채취하여 헤파린이 코팅된 튜브에 담은 후, FicollPaque 시약 (GE Healthcare)을 이용한 밀도구배 침전법(density gradient sedimentation)을 통해 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMCs)를 분리하였다. 이후 분리된 PBMCs에 TRIzol(Invitrogen)을 처리하고 제조사의 프로토콜에 준하여 PBMCs로부터 total RNA를 추출하였다.
1-3. 복부 내장지방 분리 및 RNA 추출
상기 실시예 1-1에서 분류한 정상대조군 (Normal) 및 비만군 (Obese)의 지원자들 중 9명(Normal=3을 Obese=6)을 선정하여 이들로부터 복부 장간막 내장지방을 채취하여 TRIzol (Invitrogen)을 처리하고, 제조사의 프로토콜에 준하여 상기 내장지방조직으로부터 total RNA를 추출하였다.
1-4. mRNA 염기서열 분석 (mRNA sequencing)
상기 실시예 1-2 및 1-3의 방법에 따라, 각 그룹 지원자들의 말초혈액단핵세포와 내장지방조직으로부터 RNA를 추출하고, mRNA 염기서열을 분석하였다.
구체적으로 Tecan F200 (Nanodrop)장비를 사용하여 샘플의 농도 (260/280 Ratio = 1.7~2.0 범위)를 정량하고 Bioanalyzer를 이용하여 RNA의 quality를 판정 (RNA Integrity Number 7이상, 28s/18s ratio 1.7 이상)한 후 분석에 이용하였다. Total 1 ug으로부터 oligodT를 이용하여 mRNA를 분리하였다. Libary는 paierdend 100bp로 진행되었으며, Illumina사의 Truseq RNA sample Prep Kit를 이용하여 cDNA를 얻었다. 최종 산물은 2100 Bioananlyzer를 이용하여 확인하였고 Hiseq 2100을 이용하여 서열해독을 실시하였다. 생산된 서열은 quality check를 하기 위해 FastQC v0.10.0을 이용하였고, Tophat V.1.3.3을 이용하여 유전체 서열에 정렬되었으며, 참조된 유전체는 Homo sapiens (hg19)의 서열이 사용되었다. 유전자 별 발현량의 측정은 Cufflinks v.2.0.2를 이용하여 계산되었다. 추출된 유전자는 표준화(normalization) 과정을 거친 후, 유의하게 발현이 변화된 유전자 (p value of <0.05 및 fold change of >1.5)를 추출하였다.
실시예 2. 비만군에서 발현이 변화된 유전자 확인
정상대조군(Normal)에 비하여 비만군(Obese)에서 발현이 변화한 유전자를 검출하기 위하여, 실시예 1-1의 방법에 따라 분류된 각 그룹의 지원자에서 실시예 1-2 및 1-3의 방법으로 PBMCs와 내장지방을 분리하여 이로부터 RNA를 추출하고, 실시예 1-4의 방법에 따라 mRNA 시퀀싱을 수행한 후, 도출된 데이터를 표준화하였다. 유의하게 발현된 유전자를 선별하기 위해 p value 0f < 0.05 및 fold change of > 1.5를 충족하는 조건에서 변화한 유전자를 추출하여 분석하였다.
분석결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 정상대조군(Normal)에 비하여 비만군(Obese)에서, 말초혈액단핵세포 (PBMCs)에서는 274개의 유전자 발현이 증가하였고, 내장지방조직 (Omental AT)에서는 286개의 유전자 발현이 증가하였다.
상기 결과를 바탕으로, 공통적으로 7개의 유전자의 발현이 증가한 것을 알 수 있었다.
실시예 3. 비만군에서 발현이 변화된 유전자 발굴 ; RAB6A 및 PPHLN1
상기 실시예 2의 결과를 바탕으로, 말초혈액단핵세포와 내장지방조직에서 정상대조군(Normal)군에 비하여 비만군(Obese)군에서 공통적으로 변화된 유전자 7개 중 PPHLN1 및 RAB6A 유전자 2개를 선정하여 그 발현의 증가 수준을 확인하였다.
그 결과 도 3에 나타낸바와 같이, 정상대조군(Normal)에 비하여 비만군(Obese)에서, PPHLN1 (periphilin1) 유전자가 말초혈액단핵세포 (PBMCs)에서는 fold change (FC) 1.80, 내장지방조직 (Omental AT)에서는 FC 1.87 수준으로 증가하였으며, RAB6A (member RAS oncogene family) 유전자는 PBMCs에서는 FC 2.12, Omental AT에서는 FC 7.21 수준으로 발현이 유의적으로 증가하였다.
상기 결과들을 통해 정상대조군에 비하여 비만군에서만 발현이 변화하는 유전자 RAB6A 및 PPHLN1를 발굴하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (12)

  1. RAB6A (NCBI 접근(accession) 번호: NM_198896) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비만 진단용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 PPHLN1 (NCBI 접근(accession) 번호: NM_001143787) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만 진단용 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 프라이머와 안티센스 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항의 조성물을 포함하는, 비만 진단용 키트.
  6. 피검체 유래의 생물학적 시료에서 RAB6A (NCBI 접근(accession) 번호: NM_198896) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 비만 진단을 위한 정보제공방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 방법은 PPHLN1 (NCBI 접근(accession) 번호: NM_001143787) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    상기 mRNA의 발현 수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  9. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    상기 단백질 발현수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  10. 하기의 단계를 포함하는, 비만 치료 물질의 스크리닝 방법:
    (a) RAB6A (NCBI 접근(accession) 번호: NM_198896) 유전자를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 세포에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 유전자의 발현수준을 비교하는 단계.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 방법은 PPHLN1 (NCBI 접근(accession) 번호: NM_001143787) 유전자를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
    상기 시험물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
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