KR101877077B1

KR101877077B1 - 췌호르몬-생성 세포의 제조 방법

Info

Publication number: KR101877077B1
Application number: KR1020137006027A
Authority: KR
Inventors: 마사키 호소야; 마사노부 쇼지
Original assignee: 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
Priority date: 2010-08-09
Filing date: 2011-08-08
Publication date: 2018-07-10
Also published as: NZ607608A; KR20130099035A; AU2011290123A1; RU2013109949A; EP2604685B1; CN103154240B; CN103154240A; CA2807935C; US20130210060A1; WO2012020845A1; EP2604685A1; JP5875517B2; EP2604685A4; RU2576000C2; CA2807935A1; SG187655A1; AU2011290123B2; US9157069B2; JPWO2012020845A1; IL224451A

Abstract

본 발명의 목적은 줄기 세포로부터, 정상적 발현된 췌장 세포의 것과 더 유사한 형태를 갖는 췌호르몬-생성 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 췌호르몬-생성 세포 제조법은 하기 단계 (1) - (6) 에 줄기 세포를 적용하는 것을 특징으로 한다: (1) Rho 키나아제 저해제를 포함하는 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계; (2) 단계 (1) 에서 얻어진 세포를 GSK3 저해제를 포함하는 배양 배지에서 배양하는 단계; (3) 단계 (2) 에서 얻어진 세포를 GSK3 저해제 및 액티빈 수용체형 키나아제 4 및 7 을 활성화시키는 작용제를 포함하는 배양 배지로 배양하는 단계; (4) 단계 (3) 에서 얻어진 세포의 세포 응집물을 형성하고, 그 세포 응집물을 배양 배지 중 부유 상태로 배양하는 단계; (5) 단계 (4) 에서 얻어진 세포를 레티노산 수용체 아고니스트, AMP-활성화 단백질 키나아제 및/또는 액티빈 수용체형 키나아제 2, 3 및 6 저해제, 액티빈 수용체형 키나아제 4, 5 및 7 저해제 및 세포 성장 인자를 포함하는 배지로 배양하는 단계; 및 (6) 단계 (5) 에서 얻어진 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계.

Description

췌호르몬-생성 세포의 제조 방법 {METHOD OF PRODUCING PANCREATIC HORMONE-PRODUCING CELLS}

본 발명은 췌호르몬-생성 세포의 제조법 및 제조법에 의해 얻어진 췌호르몬-생성 세포를 포함하는 약제 등에 관한 것이다.

췌장은 내분비선 (내분비 세포) 및 외분비선 (외분비 세포) 을 갖고, 이들 두 세포에 의해 중요한 역할을 담당하고 있는 기관이다. 외분비 세포는 주로 췌장 리파아제, 트립신, 엘라스타아제, 췌장 아밀라아제 등의 소화 효소를 분비하는 역할을 한다.

내분비 세포는 췌호르몬을 분비하는 역할을 하며, 글루카곤이 췌장 α 세포로부터 분비되고, 인슐린이 췌장 β 세포로부터 분비되고, 소마토스타틴이 췌장 δ 세포로부터 분비되고, 췌장 폴리펩티드 (본 명세서에서 때로는 PP 로 약술됨) 가 PP 세포로부터 분비된다는 것이 공지되어 있다. 최근, 위-분비 호르몬인 그렐린이 또한 췌장으로부터 분비된다는 것이 보고되었다.

인슐린은, 포도당의 이용, 단백질 합성 및 중성 지방의 형성 및 저장을 촉진해서, 혈당치를 저하시키고, 혈당을 정상적 농도로 유지하는 중요한 역할을 한다. 췌장 글루카곤은, 간장 글리코겐 분해, 글루코네오제네시스 작용 등을 통해 고혈당 호르몬으로서 당 대사 조절 메카니즘에서 인슐린과 마찬가지로 중요한 역할을 담당하고 있다. 소마토스타틴은, 소마토스타틴 수용체에 대한 결합에 의해 작용을 발현하고, 췌장에서의 글루카곤, 인슐린 등의 다양한 호르몬 분비를 억제한다. PP는 식사에 반응하여 랑게르한스 섬 (islet of Langerhans) 의 세포로부터 분비되는 호르몬이며, 포식 인자로서 알려져 있고, 음식 섭취 및 체중 증가를 감소시킨다. 그렐린은 음식 섭취를 자극하고, 지방 산화를 저하시켜 체중을 증가시키는 것으로 알려져 있다.

당뇨병은 인슐린이 부족하고 그 기능이 상실됨으로써 발현되는 질환이며, 일단 발현되면 치료하는 것이 어렵다. 당뇨병은, 제 I 형 당뇨병 (인슐린 의존성 당뇨병) 및 제 II 형 당뇨병 (인슐린 비의존성 당뇨병) 의 2 개의 유형으로 크게 분류될 수 있다.

제 II 형 당뇨병은, 인슐린에 대한 저항성에 의해 발현되는 만성 질환이고, 이는 과식 및 운동 부족으로 인한 비만, 스트레스 등과 같은 생활 습관과 관련된 문제가 되고 있다. 제 II 형 당뇨병은 흔히 중년 성인에서 발현되고, 당뇨병 환자의 상당수는 이 유형의 당뇨병에 걸린다.

제 I 형 당뇨병은 자가면역 질환, 바이러스 감염 등에 의해 인슐린-생성 세포가 파괴되어 체내 인슐린 분비를 종료시켜 일어나는 만성 질환이다. 체내에서 지속적으로 변화하는 혈당치를 자동적으로 제어할 수 있고, 환자의 부담을 경감시킬 수 있는 치료법으로서, 제 I 형 당뇨병 환자에 대한 췌장 이식 또는 췌장도 이식이 수행된다. 이러한 치료법에 의해 정상적 혈당치를 달성할 수 있지만, 이식 기술이 충분히 확립되지 않았고, 이식될 수 있는 췌장 및 췌장도가 충분하지 않다. 또한, 이식에 대한 면역 거부 반응을 회피하기 위해서, 환자는 면역 억제제를 일생 동안 복용할 필요가 있어, 감염의 위험성, 면역 억제제에 의한 부작용 등의 문제가 여전히 남아있다.

제 I 형 당뇨병에 대해 시도되고 있는 치료법 중 하나는, 환자 유래된 세포로부터 인슐린-생성 세포 자체를 재생하고 이 세포를 환자 체내에 이식하는 것을 포함하는 방법이다. 이 방법에 따르면, 환자 체내에서 인슐린이 생성될 수가 있다. 또한, 세포가 환자 자신의 세포이므로, 방법은 거부 반응의 문제가 해소될 수 있는 것 등으로 인해 안전성 측면에서 또한 유리하다.

인슐린-생성 세포를 얻는 공지된 방법으로서는, ES 세포를 분화시키는 방법, 환자 췌장의 조직 줄기 세포를 분화시키는 방법, 환자의 췌관 상피 유래의 세포를 체외로 꺼내 분화시키는 방법 등이 알려져 있다. 구체적으로, 액티빈 (activin) 및 레티노산 (RA) 을 이용해 인간 ES 세포로부터 췌장 β 세포 분화를 유도하는 방법 (특허 문헌 1, 비특허 문헌 1 - 4), 인간 ES 세포부터 글루카곤-생성 세포 (α 세포) 분화를 유도하는 방법 (비특허 문헌 8), 인간 iPS 세포로부터 췌장 β 세포 분화를 유도하는 방법 (비특허문헌 5 - 7), 췌장의 발생에 관련된 중요한 전사 인자이고 또한 인슐린-생성 세포의 발생 및 기능 유지의 역할을 담당하고 있는 것으로 공지된 PDX1 을 ES 세포에 도입하고 세포를 배양하는 것을 포함하는 인슐린-생성 세포 분화를 효율적으로 유도하는 방법 (특허 문헌 2) 등이다.

그러나, 이러한 방법에 의해 얻어지는 인슐린-생성 세포는 정상적인 췌장 β 세포에 비해 인슐린-생성 효율이 상당히 낮게 나타나므로, 세포 요법의 응용에 적합화될 수 있는 인슐린-생성 세포를 효율적으로 얻는 방법의 개발이 여전히 요구되고 있다. 또한, 얻어질 수 있는 세포의 수를 당뇨병 치료 등을 위한 실용화 수준으로 증가시키는 것이 요구되고 있다.

[문헌 목록]

[특허 문헌]

[특허 문헌 1] JP-A-2009-225661

[특허 문헌 2] US-B-7534608

[비특허 문헌]

[비특허 문헌 1] E. Kroon et al., "Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.", Nature Biotechnology (2008) Vol. 26, No.4: 443-452

[비특허 문헌 2] K. A D'Amour et al., "Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.", Nature Biotechnology (2006) Vol. 24, No. 11: 1392-1401

[비특허 문헌 3] W. Jiang, "In vitro derivation of functional insulin-producing cells from human embryonic stem cells." Cell Research (2007) 17: 333-344

[비특허 문헌 4] J. H. Shim et al., "Directed differentiation of human embryonic stem cells towards a pancreatic cell fate.", Diabetologia (2007) 50:1228-1238

[비특허 문헌 5] R. Maehra et al., "Generation of pluripotent stem cells from patients with type 1 diabetes.", PNAS (2009), vol. 106, No. 37: 15768-15773

[비특허 문헌 6] MC. Nostro et al., "Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.", Development (2011), 138: 861-871

[비특허 문헌 7] A. Rezania et al., "Production of functional glucagon-secreting alpha-cells from human embryonic stem cells.", Diabetes (2011), 60: 239-247

[비특허 문헌 8] T. Thatava et al., "Indolactam V/GLP-1-mediated differentiation of human iPS cells into glucose-responsive insulin-secreting progeny.", Gene Ther (2011), 18: 283-293

본 발명의 목적은, 세포 요법의 응용에 더 적합한 췌호르몬-생성 세포의 제조법, 제조법에 의해 얻어진 췌호르몬-생성 세포를 포함하는 약제, 및 세포를 사용한 당뇨병 치료 약물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상술된 과제의 관점에서 예의 연구하였고, 단계적으로 분화 유도 인자의 종류 및 그 조합을 바꾸는 것 및 내배엽 세포로부터 세포 덩어리를 형성시킨 후에 현탁 상태로 배양하는 것 등에 의해, 줄기 세포로부터 보다 췌장 발생을 모방한 형태 (삼차원적인 구조를 유지한 형태) 의 췌호르몬-생성 세포가 제조될 수 있다는 것을 밝혀냈고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 이하를 제공한다.

[1] 하기 단계 (1) - (6) 에 줄기 세포를 적용하는 것을 포함하는, 췌호르몬-생성 세포의 제조법:

(1) Rho 키나아제 저해제를 포함하는 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계

(2) 상기 언급된 단계 (1) 에서 얻어진 세포를 GSK3 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계

(3) 상기 언급된 단계 (2) 에서 얻어진 세포를 GSK3 저해제 및 액티빈 수용체형 키나아제-4, 7 의 활성화제를 포함하는 배지로 배양하는 단계

(4) 상기 언급된 단계 (3) 으로 얻어진 세포로부터 세포 덩어리를 형성하고, 그 세포 덩어리를 배지 중 현탁 상태로 배양하는 단계

(5) 상기 언급된 단계 (4) 에서 얻어진 세포를 레티노산 수용체 아고니스트, AMP-활성화 단백질 키나아제 및/또는 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제, 액티빈 수용체형 키나아제-4,5,7 의 저해제 및 세포 성장 인자를 포함하는 배지로 배양하는 단계

(6) 상기 언급된 단계 (5) 에서 얻어진 세포를 배양하는 단계;

[2] 상기 언급된 [1] 에 있어서, 단계 (3) 의 액티빈 수용체형 키나아제-4, 7 의 활성화제가 액티빈인 제조법;

[3] 상기 언급된 [1] 또는 [2] 에 있어서, 단계 (1) 의 Rho 키나아제 저해제가 (+)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산카르복사미드 디히드로클로라이드인 제조법;

[4] 상기 언급된 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 단계 (2) 및 (3) 의 GSK3 저해제가 (i) 6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]니코티노니트릴 및/또는 (ii) (2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심인 제조법;

[5] 상기 언급된 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 단계 (5) 의 레티노산 수용체 아고니스트가 레티노산인 제조법;

[6] 상기 언급된 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 단계 (5) 의 AMP-활성화 단백질 키나아제 및/또는 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제가 도르소모르핀인 제조법;

[7] 상기 언급된 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, 단계 (5) 의 액티빈 수용체형 키나아제-4,5,7 의 저해제가 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드인 제조법;

[8] 상기 언급된 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 단계 (5) 의 세포 성장 인자가 염기성 선유아세포 성장 인자인 제조법;

[9] 상기 언급된 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 있어서, 단계 (1) - (6) 이 피더 세포 (feeder cell) 를 실질적으로 이용하지 않는 제조법;

[10] 상기 언급된 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 단계 (1) - (6) 의 배지가 혈청을 실질적으로 포함하지 않는 제조법;

[11] 상기 언급된 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 있어서, 줄기 세포가 유도 만능 줄기 세포 (iPS 세포), 배아 줄기 세포 (ES 세포) 또는 인간의 체질 줄기 세포인 제조법;

[12] 상기 언급된 [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 있어서, 췌호르몬-생성 세포가 인슐린-생성 세포, 글루카곤-생성 세포, 소마토스타틴-생성 세포, 췌장 폴리펩티드(PP)-생성 세포 및 그렐린-생성 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 제조법;

[13] 내배엽 세포를 하기 단계 (4') 및 (5') 에 적용하는 것을 포함하는 췌호르몬-생성 세포의 제조법:

(4') 내배엽 세포로부터 세포 덩어리를 형성하고, 그 세포 덩어리를 배지 중 현탁 상태로 배양하는 단계

(5') 상기 언급된 단계 (4') 에서 얻어진 세포를 레티노산 수용체 아고니스트, AMP-활성화 단백질 키나아제 및/또는 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제, 액티빈 수용체형 키나아제-4,5,7 의 저해제 및 세포 성장 인자를 포함하는 배지로 배양하는 단계;

[14] 상기 언급된 [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 제조법으로 얻어진 췌호르몬-생성 세포를 포함하는 약제;

[15] 하기 단계 (1) - (6) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 임의의 하나 이상의 단계에 의해 얻어진 세포를 사용하는 것을 포함하는, 당뇨병 치료 약물의 스크리닝 방법:

(1) 줄기 세포를, Rho 키나아제 저해제를 포함하는 배지로 배양하는 단계

(2) 상기 언급된 단계 (1) 에서 얻어진 세포를, GSK3 저해제를 포함하는 배지로 배양하는 단계

(3) 상기 언급된 단계 (2) 에서 얻어진 세포를, GSK3 저해제 및 액티빈 수용체형 키나아제-4, 7 의 활성화제를 포함하는 배지로 배양하는 단계

(4) 상기 언급된 단계 (3) 에서 얻어진 세포로부터 세포 덩어리를 형성시키고, 그 세포 덩어리를 배지 중 현탁 상태로 배양하는 단계

(5) 상기 언급된 단계 (4) 에서 얻어진 세포를, 레티노산 수용체 아고니스트, AMP-활성화 단백질 키나아제 및/또는 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제, 액티빈 수용체형 키나아제-4,5,7 의 저해제 및 세포 성장 인자를 포함하는 배지로 배양하는 단계

(6) 상기 언급된 단계 (5) 에서 얻어진 세포를 배양하는 단계.

본 발명의 제조법에 따르면, 줄기 세포로부터 보다 췌장 발생을 모방한 형태의 췌호르몬-생성 세포가 제조될 수 있다. 또한, 상기 언급된 단계 (1) - (6) 중 하나 이상의 유형의 단계에서 얻어진 세포는, 당뇨병 등과 같이 비정상적 췌호르몬 생성 및/또는 분비에 의해 야기되는 질환의 예방 및/또는 치료에 유용한 화합물의 스크리닝에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 세포는 상기 질환을 치료하기 위한 세포 요법에 사용될 수 있고 이는 삼차원적 구조를 유지하므로, 이는 심지어 종래의 제조 방법에 따라 얻어지는 췌호르몬-생성 세포에 비해서도 세포 요법에 대한 응용에 더 적합하다.

도 1 은 다양한 인자를 이용해 인간 iPS 세포로부터의 분화 유도를 개시하고, 최초 4 일 동안 매일 원시선 마커 (브라키우리 (Brachyury)) 및 내배엽 마커 (SOX17) 의 발현을 정량적 RT-PCR 에 의해 측정함으로써 수득된 결과를 나타낸다. 각 유전자의 발현량은, 하우스키핑 유전자 GAPDH 의 발현량에 대한 상대치로 나타냈다. 배양 제 3 일에, 브라키우리의 발현량이 일시적으로 상승하고, 제 4 일에 SOX17 의 발현량이 현저하게 증가했다.
도 2 는 액티빈 A 및 CHIR99021 을 이용해 4 일 동안 인간 iPS 세포의 분화를 유도하고, 세포를 피브로넥틴으로 코팅된 96-웰 플레이트에 재파종 (re-plating) 하고, 1 일 동안 세포를 배양하여 얻어진 세포의, 항-인간 SOX17 항체를 이용한 면역 형광 염색 결과를 나타낸다. SOX17-양성 세포의 핵은 Alexa 488 에 의해 녹색으로 착색되고 (도면의 SOX17), 세포의 핵은 Hoechst 33342 에 의해 청색으로 착색된다 (도면의 Hoechst). 또한, 두 염색 이미지를 합치고, 통합으로 나타냈다. 대부분의 세포가 SOX17 단백질을 발현하는 것으로 관찰되었다.
도 3 은 정량 RT-PCR 에 의해 매일 측정된, CHIR99021 을 포함하는 배지로 2 일 동안 배양된 후, 액티빈 A 와 CHIR99021, 또한 액티빈 A 와 BIO 를 이용해 배양되는 인간 iPS 세포에 의한 SOX17 발현 결과를 나타낸다. 유전자의 발현량은 하우스키핑 유전자 GAPDH 의 발현량에 대한 상대치로 나타내어진다. CHIR99021 및 BIO 의 어느 쪽을 이용해도, SOX17 발현은 배양 제 4 일부터 경시적으로 상승하고, 유사한 발현 패턴을 나타냈다. DMSO 만 첨가된 대조군에서는, SOX17 발현은 상승되지 않았다.
도 4 는 액티빈 A 및 CHIR99021 을 이용해 4 일 동안 인간 iPS 세포의 분화를 유도하고, 96-웰 타원형 플레이트에 세포를 파종하고, 1 일 동안 세포를 배양하고, 도르소모르핀, 레티노산, SB431542 및 bFGF 를 첨가한 1% B27 을 포함하는 개선된 MEM 아연 옵션 배지로 8 일 동안 배양 한 후, 1% B27 을 포함하는 개선된 MEM 아연 옵션 배지로 배지를 바꾸고, 추가로 세포를 계속 배양함으로써 얻어진 세포에 의한 인슐린 발현의 분석 결과를 나타낸다 (도면의 인슐린). 유전자의 발현량은 하우스키핑 유전자 GAPDH 의 발현량에 대한 상대치로 나타내어진다. 인슐린 발현은 1% B27 을 포함하는 개선된 MEM 아연 옵션 배지에서의 배양 제 13 일부터 증가하였고, 배양 제 23 일까지 경시적으로 증가하였다.
도 5 는 액티빈 A 및 CHIR99021 를 이용해 4 일 동안 인간 iPS 세포 분화를 유도하고, 96-웰 타원형 플레이트에 세포를 파종하고, 세포를 1 일 동안 배양하고, 도르소모르핀, 레티노산, SB431542 및 bFGF 의 조합, 또는 도르소모르핀, 레티노산 및 SB431542 의 조합을 이용해 8 일 동안 세포를 배양한 후, 1 % B27 을 포함하는 개선된 MEM 아연 옵션 배지에서 배양함으로써 얻어진 세포에 의한 배양 제 19 일에서의 인슐린 발현 분석 결과를 나타낸다. 유전자의 발현량은 하우스키핑 유전자 GAPDH 의 발현량에 대한 상대치로 나타냈다. 인슐린의 발현량은 도르소모르핀, 레티노산 및 SB431542 의 조합보다, 도르소모르핀, 레티노산, SB431542 및 bFGF 의 조합을 사용하는 것에 의해 배양 제 19 일에 더 많았다.
도 6 은 도 4 의 방법에서와 동일한 방식으로 분화 유도하여 얻어진 세포의 배양 제 21 일에서의 세포 덩어리 (구형) 로부터 제조된 동결 절편의, 항-인슐린 항체 및 항-글루카곤 항체를 이용한, 면역 형광 염색의 결과를 나타낸다. 인슐린-양성 세포는 Alexa 568 에 의해 적색으로 착색되고 (도면의 인슐린), 글루카곤-양성 세포는 Alexa488 에 의해 녹색으로 착색되고 (도면의 글루카곤), 세포의 핵은 Hoechst 33342 에 의해 청색으로 착색된다 (도면의 Hoechst). 또한, 모든 염색 이미지를 합치고, 통합으로 나타냈다. 인슐린을 발현하는 많은 세포가 세포 덩어리 (구형) 내부에서 발견되었고, 세포의 일부는 글루카곤을 발현하였다.
도 7 은 BD 마트리겔 또는 피브로넥틴을 기질로서, 및 액티빈 A 및 CHIR99021 을 사용하여 인간 iPS 세포를 내배엽으로 유도하여 세포 덩어리 (구형) 를 형성한 후, 추가로 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포로 및 이후 췌호르몬-생성 세포로의 발현을 유도함으로써 얻어진 세포에서의 다양한 분화 마커의 발현 분석 결과를 나타낸다. 각각의 유전자 발현량은 하우스키핑 유전자 GAPDH 의 발현량에 대한 상대치로 나타냈다. SOX17 의 발현은 분화에 따라 현저하게 감소되고, PDX1 및 NGN3 의 발현은 배양 제 17 일까지 점차 증가된다. 인슐린 발현은 배양 제 17 일부터 급격하게 증가된다. 이러한 각종 분화 마커의 경시적인 발현 변화는, BD마트리겔 또는 피브로넥틴을 기질로서 사용하여 유도된 내배엽 세포가 사용되는 한 거의 동일하였다.
도 8 은 내배엽으로부터 세포 덩어리 (구형) 를 형성시켜 분화를 유도하는 단계 [단계 (4)] 를 포함하고 피더 세포 또는 혈청을 사용하지 않는 췌호르몬-생성 세포의 제조법의 개괄을 나타낸다.

이하, 본 발명을 설명한다. 본 명세서에 사용되는 용어는 특별히 언급되지 않는 한, 당업계에서 통상 사용되는 바를 의미한다.

본 발명에 있어서, "췌호르몬-생성 세포" 는 췌호르몬을 생성하는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 췌호르몬-생성 세포는 끊임 없이 췌호르몬을 생성하고 있을 필요는 없고, 췌호르몬의 생성 능력을 가지면 된다. 따라서, 생성되는 췌호르몬량은 특별히 한정되지는 않는다. 췌호르몬으로서는, 예를 들어 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩티드 및 그렐린을 들 수 있다. 췌호르몬-생성 세포의 예는 인슐린-생성 세포 (췌장 β 세포와 동의어), 글루카곤-생성 세포 (췌장 α 세포와 동의어), 소마토스타틴-생성 세포 (췌장 δ 세포와 동의어), 췌장 폴리펩티드 (PP)-생성 세포 및 그렐린-생성 세포를 포함한다. 이들 중에서, 인슐린-생성 세포가 바람직하다.

본 발명에 있어서 "줄기 세포" 는 시험관내에서 배양될 수 있고, 생체를 구성하는 다수의 세포 계통으로 분화될 수 있는 세포를 의미한다. 구체적으로는, 배아 줄기 세포 (ES 세포), 태아의 원시 생식 세포 유래의 다능성 줄기 세포 (EG 세포: Proc Natl Acad Sci U S A. 1998, 95:13726-31), 정소 유래의 다능성 줄기 세포 (GS 세포: Nature. 2008, 456:344-9), 체세포 유래의 유도된 만능 줄기 세포 (유도된 만능 줄기 세포; iPS 세포) 및 인간 체질 줄기 세포 (조직 줄기 세포) 가 언급될 수 있다. 바람직한 것은 iPS 세포, ES 세포 및 인간 체질 줄기 세포, 더 바람직하게는 iPS 세포이다.

ES 세포로서, 임의의 온혈동물, 바람직하게는 포유 동물로부터 유래하는 ES 세포가 사용될 수 있다. 포유 동물의 예는 마우스, 래트, 기니어 피그, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 염소, 원숭이 및 인간을 포함한다. 바람직한 예는 인간으로부터 유래되는 세포이다.

ES 세포의 구체예로서는, 착상 이전의 초기배를 배양함으로써 수립되는 포유 동물 등의 ES 세포, 체세포의 핵을 핵 이식함으로써 제조된 초기배를 배양함으로써 수립되는 ES 세포, 및 유전 공학에 의하여 상기 ES 세포의 염색체 상 유전자를 바꿈으로써 얻어진 ES 세포를 들 수 있다. 각 ES 세포는 당업계에서 또는 공지된 문헌에 따라 일반적으로 수행되는 방법에 의해 제조될 수 있다.

마우스의 ES 세포는, 1981 년에 Evans 등 (Evans et al., 1981, Nature 292: 154-6) 및 Martin 등 (Martin GR. et al., 1981, Proc Natl Acad Sci 78: 7634-8) 에 의해 수립되었고, 예를 들어 Danippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. (Osaka, Japan) 로부터 구입될 수 있다.

인간의 ES 세포는, 1998 년에 Thomson 등 (Thomson et al., Science, 1998, 282: 1145-7) 에 의해 수립되었고, WiCell Research Institute (웹 사이트: http://www. wicell.org/, Madison, Wisconsin, USA), 미국 국립보건원 (National Institute of Health), 교토 대학 (Kyoto University) 등에서 입수 가능하고, 예를 들어 Cellartis AB (웹 사이트: http://www.cellartis.com/, Sweden) 로부터 구입 가능하다.

iPS 세포로서, 임의의 온혈동물, 바람직하게는 포유 동물로부터 유래되는 iPS 세포가 사용될 수 있다. 포유 동물로서는, 예를 들어 마우스, 래트, 기니어 피그, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 염소, 원숭이 및 인간을 들 수 있다. 바람직한 예는 인간으로부터 유래되는 세포를 포함한다.

iPS 세포의 구체예로서는, 피부 세포 등과 같은 체세포에 다수의 유전자를 도입해 얻어지고 ES 세포의 것과 같은 다능성을 획득한 세포 (예를 들어, Oct3/4 유전자, Klf4 유전자, c-Myc 유전자 및 Sox2 유전자를 도입함으로써 얻어지는 iPS 세포 (Nat Biotechnol 2008; 26: 101-106)) 를 들 수 있다. 그 밖에도, 이식 유전자가 보다 감소된 방법 (Nature. 2008 Jul 31; 454(7204): 646-50), 저분자량 화합물을 이용한 방법 (Cell Stem Cell. 2009 Jan 9; 4(1): 16-9, Cell Stem Cell. 2009 Nov 6; 5(5): 491-503), 유전자 대신에 전사 인자 단백질을 이용한 방법 (Cell Stem Cell. 2009 May 8; 4(5): 381-4) 등이 언급될 수 있다. 비록 iPS 세포의 제조 방법에 대한 기술적 개선이 예의 이루어지고 있지만, 제조된 iPS 세포의 기본적 특성, 즉 이것이 다능성을 갖는 것은 제조 방법에 상관 없이 동등하므로, 상기 방법 모두가 본 발명의 제조 방법에 사용될 수 있다.

체질 줄기 세포로서, 인간으로부터 유래되는 것이 사용될 수 있다. 여기서, 체질 줄기 세포란, 췌호르몬-생성 세포로 분화될 수 있는 세포이며, 예를 들어 골수 및 지방으로부터 유래된 간충직 줄기 세포에 존재하는 줄기 세포 및 췌장에 존재하는 줄기 세포이다.

본 발명 방법을 이용하면, 제조 방법이 변화되는 인간 iPS 세포주와 같은 다양한 줄기 세포로부터 췌호르몬-생성 세포가 제조될 수 있다.

1. 췌호르몬-생성 세포의 제조법

본 발명의 제조법은, 줄기 세포로부터 췌호르몬-생성 세포를 제조하는 방법을 포함한다. 본 발명의 제조법은 또한 덜 분화된 상태에 있는 세포 (줄기 세포) 의 보다 분화한 상태 (췌호르몬-생성 세포) 로의 분화를 유도하는 방법을 포함한다.

본 발명의 제조법은 이하의 단계 (1) ~ (6) 을 포함한다.

(4) 상기 언급된 단계 (3) 에서 얻어진 세포로부터 세포 덩어리를 형성하고, 세포 덩어리를 배지 중 현탁 상태로 배양하는 단계

(6) 상기 언급된 단계 (5) 에서 얻어진 세포를 배양하는 단계

단계 (1): 줄기 세포를, Rho 키나아제 저해제를 포함하는 배지로 배양하는 단계

본 단계는, 줄기 세포의 췌호르몬-생성 세포로의 분화 유도를 개시하는 후술하는 단계 (2) 이전의 사전 단계, 즉 줄기 세포의 사전 배양 (파종) 단계에 해당한다.

본 단계의 줄기 세포는 피더 세포 또는 피더 세포 추출물에 의한 공동-배양에 의해서 수득될 수 있다. 여기서 피더 세포란, 공동-배양에 의해 다른 종류의 세포가 성장할 수 있는 환경을 제공하는 세포를 말한다.

본 단계의 줄기 세포는 분산 세포 및 비분산 세포 중 어느 하나 일 수 있지만, 분산 세포가 바람직하다.

분산 세포의 예는 단일 세포, 및 여러 개의 세포 (전형적으로 약 2 ~ 500, 20 ~ 200 또는 50 ~ 100 개 세포) 로 이루어지는 세포 덩어리 [후술 단계 (4) 에서 설명되는 바와 같이, 세포 덩어리란, 다수의 세포가 서로 접착되는 것 등에 의해 덩어리를 형성하는 상태를 말함] 를 형성하는 세포를 포함하는데, 이는 바람직하게는 본 단계에서 세포 덩어리이다.

분산 세포는 공지된 방법 자체에 의해 제조될 수 있다. 상기 방법의 예는 킬레이트제 (예, EDTA), 효소 (예, 트립신, 콜라게나아제) 등에 의한 처리, 및 기계적 분산 (예, 피펫팅) 등의 취급을 포함한다.

분산 세포는, 비접착 세포 [비접착 세포란, 배양기 또는 기질에 접착하고 있지 않은 상태의 세포를 말함], 또는 접착 세포 [접착 세포란, 배양기 또는 기질에 접착하고 있는 상태의 세포를 말함] 일 수 있다.

본 단계에서, 피더 세포 또는 피더 세포 추출물을 제거 (예를 들어, 원심관에 넣고, 2 ~ 10 분간 정치한 후, 상청액을 제거하는 것에 의한 제거) 한 후, 후술되는 Rho 키나아제 저해제를 포함하는 배지로 세포를 배양 (즉, 파종시 및 이후에 피더 세포를 사용하지 않고 분화 유도를 개시함) 하는 것이 바람직하다.

Rho 키나아제 저해제란, Rho 키나아제의 활성을 저해하는 물질을 말한다.

Rho 키나아제란, GTP (구아노신 트리포스페이트) 의 분해 효소인 GTP아제의 부류에 포함되는 작은 GTP-결합 단백질 (소형 G 단백질) 중 1 종이고, 아미노 말단에 세린/트레오닌 키나아제 도메인, 중앙부의 나선 코일 영역 및 카르복시 말단에 Rho 상호작용 도메인을 갖는다 (Amano et al., Exp. Cell. Res., 261, 44-51 (2000)).

본 단계에 사용되는 Rho 키나아제 저해제의 예는, 1-(5-이소퀴놀린술포닐)-2-메틸피페라진(H-7), 1-(5-이소퀴놀린술포닐)-3-메틸피페라진 (이소H-7), N-2-(메틸아미노)에틸-5-이소퀴놀린술폰아미드 디히드로클로라이드 (H-8), N-(2-아미노에틸)-5-이소퀴놀린술폰아미드 디히드로클로라이드 (H-9), N-[2-p-브로모신나밀아미노)에틸]-5-이소퀴놀린술폰아미드 디히드로클로라이드 (H-89), N-(2-구아니디노에틸)-5-이소퀴놀린술폰아미드 히드로클로라이드 (HA-1004), 1-(5-이소퀴놀린술포닐)호모피페라진 디히드로클로라이드 (Fasudil/HA-1077), (S)-(+)-2-메틸-4-글리실-1-(4-메틸이소퀴놀리닐-5-술포닐)호모피페리딘 디히드로클로라이드 (H-1152) 및 (+)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산아미드 디히드로클로라이드 (Y-27632) 를 포함한다.

이들은 모두 상업적으로 입수 가능하다 (예를 들어, SIGMA 및 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 로부터 구입 가능함). 그 중에서도, 특히 Y-27632가 바람직하다.

본 단계에서, 1 종 및 2 종 이상의 Rho 키나아제 저해제의 조합이 사용될 수 있다.

본 단계에서, 줄기 세포는 Rho 키나아제 저해제를 포함하는 배지로 배양된다.

Rho 키나아제 저해제의 배지 중 농도는 줄기 세포의 생존률의 향상 등과 같은 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지는 않지만, 이는 통상 0.01 ~ 1000 μM, 바람직하게는 0.1 ~ 100 μM, 특히 바람직하게는 1.0 ~ 50 μM 이다. Rho 키나아제 저해제로서 Y-27632 가 사용되는 경우, 바람직하게 사뇽되는 농도는 약 1.0 ~ 약 30 μM, 더욱 바람직하게는 약 2.0 ~ 약 20 μM 이다. Rho 키나아제 저해제로서 Fasudil/HA1077 가 사용되는 경우, 농도는 상기 언급된 Y-27632 농도에 비해 약 2 배일 수 있다.

다수의 종류의 Rho 키나아제 저해제가 조합되어 사용되는 경우에는, 각 저해제는 상기 언급된 농도 범위를 기초로 적절히 증감된 농도로 사용된다.

Rho 키나아제 저해제를 포함하는 배지에서의 배양 시간은, 줄기 세포의 생존률의 향상 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지는 않는다. 예를 들어, 줄기 세포가 인간 iPS 세포인 경우, 인간 iPS 세포가 분산되고, 약 12시간 이상 (예, 12 ~ 72 시간) 동안 Rho 키나아제 저해제를 포함하는 배지로 배양하여, 원하는 효과가 충분히 얻어질 수 있다.

Rho 키나아제 저해제를 포함하는 배지 중 줄기 세포의 밀도는, 줄기 세포의 생존률의 향상 등과 같은 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지는 않는다. 이는 바람직하게는 약 1.0×10¹ ~ 1.0×10⁷ 세포/㎖, 보다 바람직하게는 약 1.0×10² ~ 1.0×10⁷ 세포/㎖, 보다 더 바람직하게는 약 1.0×10³ ~ 1.0×10⁷ 세포/㎖, 가장 바람직하게는 약 3.0×10⁴ ~ 1.0×10⁶ 세포/㎖ 이다.

본 단계에서 사용되는 배지는 Rho 키나아제 저해제를 함유하는 한 특별히 제한되지는 않고, 일반적으로 Rho 키나아제 저해제가 첨가된 줄기 세포를 배양하는데 사용되는 배지 (이하, 편의상 기초 배지로 또한 나타내어짐) 이다.

본 단계에 사용되는 기초 배지로서, 영장류 ES/iPS 세포를 위한 배지 (ReproCELL 배지), BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM 배지, 개선된 MEM 아연 옵션 배지, IMDM 배지, 배지 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, ham 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, 이러한 배지로부터 임의 선택되는 2 종 이상의 배지의 혼합물 등이 사용될 수 있다. 배지는 동물 세포를 배양하는데 사용될 수 있는 한 특별히 제한되지는 않는다. 이러한 단계에서, 영장류 ES 세포를 위한 배지 (ReproCELL 배지) 가 특히 바람직하게 사용된다.

이러한 배지는 ReproCELL Inc., Invitrogen, SIGMA, COSMO BIO Co., Ltd. 등으로부터 구입될 수 있다.

본 단계에서 사용되는 배지로서, 혈청 및/또는 혈청 추출물을 실질적으로 포함하지 않는 배지가 바람직하고, 무혈청 배지가 보다 바람직하다.

본 명세서에서, 혈청을 실질적으로 포함하지 않는다는 것은 혈청의 함량이 약 1 부피% 미만, 바람직하게는 약 0.1 부피% 미만, 더 바람직하게는 약 0.01 부피% 미만인 것을 의미한다. 무혈청 배지는 미조정 또는 미정제 혈청을 포함하지 않는 기초 배지를 의미하고, 정제된 혈액 유래 성분 또는 동물 조직 유래 성분(예를 들어, 성장 인자) 과 혼합된 배지가 무혈청 배지인 것으로 여겨진다.

본 단계에 사용되는 배지는 또한 혈청 대체물을 포함할 수 있다. 혈청 대체물로서는, 예를 들어 알부민 (예를 들어, 지질 풍부 알부민), 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소 (예를 들어, 아연, 셀레늄), B-27 보충제, N2 보충제, 녹아웃 혈청 대체물, 2-메르캅토에탄올, 3'-티올글리세롤 또는 이들의 균등물을 들 수 있다. 녹아웃 혈청 대체물은 Invitrogen 으로부터 구입 가능하다. 기타 혈청 대체물은, Invitrogen, SIGMA, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. 등에서 구입 가능하다.

사용되는 경우, B-27 대체물의 배지 중 농도는 0.01 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.1 ~ 2 중량% 이다.

본 단계에서, 피더 세포 및/또는 피더 세포 추출물을 실질적으로 이용하지 않는 것이 바람직하다. 즉, 본 단계에서 사용되는 배지는 바람직하게는 피더 세포 및/또는 피더 세포 추출물을 실질적으로 포함하지 않는 배지이고, 보다 바람직하게는 피더 세포 및/또는 피더 세포 추출물을 전혀 포함하지 않는 배지이다.

본 명세서에서, 피더 세포 및/또는 피더 세포 추출물을 실질적으로 포함하지 않는다는 것은 피더 세포 및/또는 피더 세포 추출물의 배지 중 함량이 약 5 부피%미만, 바람직하게는 약 1 부피% 미만, 더 바람직하게는 약 0.01 부피% 미만인 것을 의미한다.

본 단계에서 피더 세포 및/또는 피더 세포 추출물을 실질적으로 이용하지 않는 경우, 본 발명의 제조법에 의해 제조된 췌호르몬-생성 세포는 거부 반응의 원인 물질 (예, 동물 유래의 세포) 에 의해 더 적게 오염된다.

본 단계에서 배양은 통상 배양기를 이용해 수행된다. 상기 배양기는, 줄기 세포가 배양될 수 있는 한 특별히 제한되지는 않지만, 세포-접착성 배양기가 접착 배양을 수행하는데 바람직하게는 사용되고, 세포 비접착성 배양기가 부유 배양을 수행하는데 바람직하게는 사용된다. 배양기의 예는 플라스크, 조직 배양 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양 디쉬, 멀티디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로웰 플레이트, 멀티플레이트, 멀티웰 플레이트, 마이크로 슬라이드, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백 및 롤러 병을 들 수 있다. 세포-접착성 배양기는 배양기 표면에 대한 세포의 접착성을 향상시키도록, 세포외 매트릭스 (ECM) 등의 임의의 세포 지지성 기질로 코팅된 배양기이다.

접착 배양을 위한 배양기의 예는 디쉬, 플라스크, 마이크로플레이트, 세포 배양 시트 등을 포함한다. 이러한 배양기는 세포에 대한 접착성을 향상시키기 위해 친수성이 부여되거나, 콜라겐, 젤라틴, 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신, 라미닌, 피브로넥틴 등의 세포 지지 기질로 코팅될 수 있다. 세포 배양 시트는 세포를 시트형 형태로 배양하는 것을 목적으로 하는 지지체를 나타내고, 예를 들어 OptiCell (Nunc) 이 시판되고 있다.

본 단계에서 세포 지지 기질로서, 바람직한 것은 유형 I-콜라겐, BD Matrigel (Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.), 피브로넥틴 (Invitrogen) 등이고, 더 바람직한 것은 BD Matrigel 및 피브로넥틴이고, 보다 바람직한 것은 피브로넥틴이다.

부유 배양을 위한 배양기의 예는 디쉬, 플라스크, 마이크로플레이트, 튜브, 롤러 병 등을 포함한다. 이러한 배양기는 소수성 물질로부터 제조되거나 히드로겔, 지질 등과 같은 세포 및 단백질의 흡착을 방지하는 물질로 코팅될 수 있다. U- 또는 V-형상 저면을 갖는 배양기가 바람직하게는 세포의 응집물을 효율적으로 형성하기 위해 사용된다.

기타 배양 조건이 적절히 결정될 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는 사용되는 줄기 세포의 배양에 적절한 한 특별히 제한되는 것은 아니나, 약 30 ~ 40 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃ 일 수 있다. CO₂ 농도는 약 1 ~ 10 %, 바람직하게는 약 2 ~ 5 % 일 수 있다. 산소 분압은 1 ~ 10 % 일 수 있다.

단계 (2): 상기 언급된 단계 (1) 에서 얻어진 세포를, GSK3 저해제를 포함하는 배지로 배양하는 단계

이러한 단계는 상기 언급된 단계 (1) 에 뒤따라 수행되고, 후술 단계 (3) 과 함께 내배엽 세포로의 줄기 세포의 분화를 유도하는 단계에 해당한다.

세린/트레오닌 단백질 키나아제인 GSK3 (글리코겐 신타아제 키나아제 3) 은 글리코겐의 생성 및 아포프토시스 (apoptosis), 줄기 세포의 유지 등에 관계되는 많은 신호 경로에 포함된다. GSK3 은 상이한 유전자에 의해 코딩되고 아미노산 서열 수준에서 높은 상동성을 갖는 GSK3α 및 GSK3β 의 동형을 포함한다. GSK3 가 가 또한 Wnt 신호화에 관여하고, GSK3 의 저해가 Wnt 신호를 활성화한다는 것이 알려져 있다.

GSK3 저해제의 예는 GSK3α 저해제 및 GSK3β 저해제를 포함한다. 이러한 단계에서, GSK3β 저해제가 바람직하다.

GSK3 저해제의 특정예는 CHIR98014 (2-[[2-[(5-니트로-6-아미노피리딘-2-일)아미노]에틸]아미노]-4-(2,4-디클로로페닐)-5-(1H-이미다졸-1-일)피리미딘), CHIR99021, 켄파울론, AR-AO144-18, TDZD-8 (4-벤질-2-메틸-1,2,4-티아디아졸리딘-3,5-디온), SB216763 (3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온), BIO, TWS-119 (3-[6-(3-아미노페닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일옥시]페놀), SB415286 (2-(3-클로로-4-히드록시페닐아미노)-3-(2-니트로페닐)말레이미드 [2-[2,5-디히드로-4-[(3-클로로-4-히드록시페닐)아미노]-2,5-디옥소-1H-피롤-3-일]페닐]옥실레이토이미늄) 등을 포함한다. 이는 Axon Medchem BV, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Enzo Life Sciences, Inc., Merck Biosciences, Tocris bioscience, Stemgent, Sigma 등으로부터 구입할 수 있다.

또한, GSK3 mRNA 를 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등이 또한 GSK3 저해제로서 사용될 수 있다. 이들 모두는 시판되거나 공개된 문헌에 따라 합성될 수 있다.

내배엽 세포로의 줄기 세포의 분화를 유도하기 위한 Wnt-3A 펩티드를 사용하는 방법이 공지되어 있다 (비특허 문헌 1, 2 및 5). 이러한 단계에서, 우수한 작동성, 재현성 및 선택성이 저분자량 화합물인 GSK3 저해제를 사용함으로써 제공될 수 있다.

GSK3 저해제는 바람직하게는 CHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]니코티노니트릴) 또는 BIO ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심) 이다.

이러한 단계에서, 단일 및 임의의 2 종 이상의 GSK3 저해제의 조합이 사용될 수 있다.

배지 중 GSK3 저해제의 농도는 사용되는 저해제의 종류에 따라 적절히 결정될 수 있지만, 이는 일반적으로 0.01 - 100 μM, 바람직하게는 0.1 - 10 μM 이다. CHIR99021 이 사용되는 경우 농도는 일반적으로 0.1 - 20 μM, 바람직하게는 1 - 5 μM 이고, BIO 가 사용되는 경우 농도는 일반적으로 0.01 - 5 μM, 바람직하게는 0.1 - 2 μM 이다.

다수 종류의 GSK3 저해제가 조합으로 사용되는 경우, 각각의 저해제의 양은 상기 언급된 농도 범위를 기초로 적절히 증감된다.

본 단계에 사용되는 배지는, GSK3 저해제를 함유하는 한 특별히 제한되지 않고, 일반적으로 GSK3 저해제가 첨가되는 줄기 세포 배양에 사용되는 배지 (기초 배지) 이다.

상기 언급된 기초 배지는 BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066배지, Glasgow MEM 배지, 개선된 MEM 아연 옵션 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, 무혈청 DMEM/F12 배지, 햄 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지 및 이의 혼합 배지 등을 포함한다. 본 단계에 사용되는 기초 배지는 동물 세포의 배양에 사용될 수 있는 한 특별히 제한되지는 않는다. 이러한 기초 배지는, Invitrogen, SIGMA, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd 등으로부터 구입될 수 있다.

본 단계에서 사용되는 기초 배지는, 바람직하게는 무혈청 DMEM/F12 배지, RPMI 1640 배지 및 개선된 MEM 아연 옵션 배지, 특히 바람직하게는 무혈청 DMEM/F12 배지이다.

본 단계에서, 피더 세포 및/또는 피더 세포 추출물을 실질적으로 이용하지 않는 것이 바람직하고, 피더 세포 및/또는 피더 세포 추출물을 전혀 이용하지 않는 것이 보다 바람직하다.

피더 세포 및/또는 피더 세포 추출물을 실질적으로 이용하지 않는 경우, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 췌호르몬-생성 세포는 거부 반응을 야기하는 물질 (예, 동물 유래의 세포) 을 더 적은 양 함유한다.

본 단계에서 사용되는 배지는, 혈청 대체물을 또한 포함할 수 있다.

혈청 대체물의 예는 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소 (예를 들어 아연, 셀레늄), B-27 보충제, N2 보충제, 녹아웃 혈청 대체물, 2-메르캅토에탄올, 3'-티올글리세롤 또는 이의 균등물을 포함할 수 있다. 본 단계에 사용되는 혈청 대체물은 바람직하게는 B-27 보충제이다.

사용되는 경우 B-27 보충제의 배지 중 농도는, 0.01 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.1 ~ 2 중량% 이다. 이러한 혈청 대체물은 Invitrogen, SIGMA, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. 등으로부터 구입 가능하다.

본 단계에서 배양 온도는 사용되는 줄기 세포의 배양에 적절한 한 특별히 한정되는 것은 아니나, 이는 약 30 ~ 40 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃ 이다.

배양 시간은 약 37 ℃ 의 배양 온도에서 6 ~ 144 시간, 바람직하게는 12 ~ 72 시간이다. 본 단계에서의 배양은 일반적으로 약 1 ~ 10%, 바람직하게는 5 %의 CO₂ 로 환기된 인큐베이터 내에서 수행된다.

단계 (3): 상기 언급된 단계 (2) 에서 얻어진 세포를 GSK3 저해제 및 액티빈 수용체형 키나아제-4, 7 의 활성화제를 포함하는 배지로 배양하는 단계

본 단계는 상기 언급된 단계 (2) 에 뒤따라 수행되고, 내배엽 세포로의 줄기 세포의 분화 유도를 완료시키는 단계에 해당한다.

본 단계에 사용되는 액티빈 수용체형 키나아제 (ALK)-4,7 의 활성화제는 ALK-4 및/또는 ALK-7 에 대한 활성화 작용을 갖는 물질로부터 선택된다.

본 단계에서 사용되는 액티빈 수용체형 키나아제-4, 7 의 활성화제의 예로서는 액티빈, Nodal 및 Myostatin 을 들 수 있다. 이러한 활성화제 모두가 시판된다. 그 중에서도, 액티빈이 본 단계에서 사용되는 액티빈 수용체형 키나아제-4,7 의 활성화제로서 바람직하다.

상기 언급된 액티빈은 TGFβ (전환 성장 인자 β) 계열에 속하는 24 kD 의 펩티드성 세포 증식 및 분화 인자이며, 여기서 2 개의 β 하위단위는 SS 결합을 통해 2량체를 구성한다 (Ling, N., et al., (1986) Nature 321, 779-782; Vale, W., et al., (1986) Nature 321, 776-779). 본 발명에서 액티빈 A, B, C, D 및 AB 중 어느 하나, 및 인간, 마우스 등의 임의의 동물 유래의 액티빈이 사용될 수 있고, 이는 시판된다. 그 중에서도 액티빈 A 가 특히 바람직하게는 사용된다. 분화에 사용되는 줄기 세포와 동일한 동물 종으로부터 유래된 액티빈이 바람직하게는 사용된다. 예를 들어 인간 유래의 줄기 세포가 출발 물질로서 사용되고, 인간 액티빈 A 가 바람직하게는 사용된다.

본 단계에서 배지 중 액티빈 수용체형 키나아제-4,7 의 활성화제의 농도는액티빈 수용체형 키나아제-4,7 의 활성화제 유형에 따라 적절히 결정되고, 액티빈 수용체형 키나아제-4,7 의 활성화제로서 사용되는 인간 액티빈 A 의 농도는 일반적으로 0.1 ~ 200 ng/㎖, 바람직하게는 5 ~ 150 ng/㎖, 특히 바람직하게는 10 ~ 100 ng/㎖ 이다.

본 단계에서, 1종 또는 2종 이상의 액티빈 수용체형 키나아제-4, 7 의 활성화제의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 다수 종의 활성화제를 조합하여 사용하는 경우, 각 활성화제의 양은 상기 언급된 농도 범위에 기초하여 적절히 증감된다. 이러한 단계에서, 액티빈 수용체형 키나아제-4,7 의 활성화제가 GSK3 저해제와 함께 배지에 첨가된다. 액티빈 및 GSK3 저해제의 존재 하에 줄기 세포가 배양되는 경우, 세포는 보다 바람직하게 내배엽 세포로 분화될 수 있다.

이러한 단계에 사용되는 GSK3 저해제의 예는 GSK3α 저해제 및 GSK3β 저해제를 포함한다. 이러한 단계에 사용되는 GSK3 저해제로서, GSK3β 저해제가 바람직하다.

본 단계에 사용되는 GSK3 저해제의 구체적 예는 상기 언급된 단계 (2) 에서 예시된 GSK3 저해제와 유사한 것을 포함한다. 또한 본 단계에서, GSK3 저해제인 CHIR99021 또는 BIO 가 바람직하게는 사용된다. GSK3 저해제의 배지 중 농도는 사용되는 저해제의 종류에 따라 적절히 결정되지만, 사용되는 경우 CHIR99021 의 농도는 통상 0.1 ~ 20 μM, 바람직하게는 1 ~ 5 μM 이고, 사용되는 경우 BIO 의 농도는 통상 0.01 ~ 5 μM, 바람직하게는 0.1 ~ 2 μM 이다.

본 단계에서 1종 및 2종 이상의 GSK3 저해제의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 다수의 종류의 저해제가 조합하여 사용되는 경우, 각 저해제의 양은 상기 언급된 농도 범위에 기초하여 적절히 증감된다.

본 단계에서, 액티빈 수용체형 키나아제-4,7 의 활성화제 및 GSK3 저해제는 배지에 동시에 첨가될 수 있거나, 줄기 세포의 내배엽 세포로의 분화를 유도할 수 있는 한 시차를 두고 별개로 배지에 첨가될 수 있다. 액티빈 수용체형 키나아제-4,7 의 활성화제 및 GSK3 저해제는 배지에 동시에 첨가되는 것이 편리하고 바람직하다.

본 단계에서 사용되는 배지는, 상기 언급된 단계 (2) 에서 예시된 기초 배지에 액티빈 수용체형 키나아제-4,7 의 활성화제 및 GSK3 저해제를 첨가함으로써 제조된다.

본 단계에서 사용되는 배지는, 상기 언급된 단계 (2) 에서 사용된 것과 동일한 종류의 기초 배지를 이용하여, 또는 상이한 종류의 기초 배지를 이용하여 제조될 수 있다. 바람직한 것은 동일한 종류의 기초 배지 (예, 무혈청 DMEM/F12 배지) 를 이용해 제조된 배지이다.

본 단계에서 사용되는 기초 배지는 바람직하게는 무혈청 DMEM/F12 배지, RPMI 1640 배지 및 개선된 MEM 아연 옵션 배지, 특히 바람직하게는 무혈청 DMEM/F12 배지이다.

본 단계에서 사용되는 배지로서는, 혈청 및/또는 혈청 추출물을 실질적으로 포함하지 않는 배지가 바람직하고, 무혈청 배지가 보다 바람직하다.

피더 세포 및 피더 세포 추출물을 실질적으로 이용하지 않는 경우, 본 발명의 제조법에 의해 제조된 췌호르몬-생성 세포는 거부 반응을 야기하는 물질 (예, 동물 유래의 세포) 을 더 적은 양 함유한다.

본 단계에서 사용되는 배지는 또한 혈청 대체물을 함유할 수 있다.

혈청 대체물의 예는 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소 (예를 들어 아연, 셀레늄), B-27 보충제, N2 보충제, 녹아웃 혈청 대체물, 2-메르캅토에탄올, 3'-티올글리세롤 또는 이의 균등물을 포함하고, B-27 보충제가 바람직하다. B-27 보충제의 배지 중 농도는 0.01 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.1 ~ 2 중량% 이다.

본 단계에서 배양 온도는 사용되는 세포의 배양에 적절한 한 특별히 한정되는 것은 아니나, 이는 약 30 ~ 40 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃ 이다.

배양 시간은, 약 37 ℃ 의 배양 온도에서 6 ~ 288 시간, 바람직하게는 12 ~ 124 시간이다. 본 단계에서 배양은 일반적으로 약 1 ~ 10 %, 바람직하게는 5 % 의 CO₂ 로 환기된 인큐베이터 내에서 수행된다.

본 단계에서, 줄기 세포의 내배엽 세포로의 분화 유도는 내배엽 마커를 사용하여 확인된다. 구체적으로는, 내배엽 세포에서 특이적으로 발현되는 단백질 또는 유전자 (내배엽 마커) 의 발현 유무를 평가함으로써 확인이 수행될 수 있다. 단백질의 발현은 항원-항체 반응을 이용한 방법 등에 의해 평가될 수 있고, 유전자의 발현은 RT-PCR 을 이용한 방법 등에 의해 평가될 수 있다. 마커의 예는 SOX17 (성 결정 영역 Y), 구스코이드 (구스코이드 호메오박스 (goosecoid homeobox)), CXCR4 (케모카인 (chemokine) (C-X-C 모티프) 수용체 4) 및 FOXA2 (포크헤드 박스 (forkhead box) A2) 를 포함한다.

단계 (4): 상기 언급된 단계 (3) 에서 얻어진 세포로부터 세포 덩어리 (구형) 를 형성하고, 그 세포 덩어리를 배지 중 현탁 상태로 배양하는 단계

본 단계에서, 내배엽 세포로 분화된 상기 언급된 단계 (3) 에서 얻어진 세포, 즉 내배엽 세포는 세포 덩어리를 형성하고, 그 세포 덩어리는 배지 중 현탁 상태로 배양된다 (재파종 단계).

본 명세서에서, 세포 덩어리는 다수의 세포가 서로 접착되는 등에 의해 하나의 덩어리를 형성하는 상태 (예를 들어, 10 개 이상의 세포가 서로 접착된 상태) 를 나타내고, 단리 세포 및 거의 단리된 세포에 반대되는 개념이다. 단리 세포란, 다른 세포와 접착되지 않고 독립적 상태에 있는 하나의 세포를 나타낸다. 거의 단리된 세포란, 1 또는 2 개의 다른 세포에 접착되거나, 쉽게 서로 분리될 수 있는 약한 접착력에 의해 결합된 여러 세포의 군을 나타낸다.

본 단계에서, 세포 덩어리란 상기 언급된 단계 (3) 에서 얻어진 다수 (예를 들어 10 개 이상) 의 세포 (내배엽 세포) 가 서로 접착하여 하나의 덩어리를 형성하는 상태를 나타낸다.

세포 덩어리, 단리 세포 및 거의 단리된 세포란, 뭉쳐진 세포의 수 (예를 들어, 3 개 이상의 세포가 뭉쳐져 있는 경우 세포 덩어리) 에 의해 구별될 수 있거나, 광학 현미경 등의 하에서 세포 현탁액의 확대 평면 이미지에서의 세포 한 집합의 영역에 의해 구별될 수 있다.

예를 들어, 세포의 크기 (반경) 가 약 10 ㎛ 인 경우, 이의 단면적은 약 300 ㎛² 이다. 따라서, 예를 들어 세포의 한 집합을 형성하는 영역의 면적은 300 ㎛² 미만이고, 이는 단리 세포 또는 거의 단리된 세포로 인식될 수 있으며, 이것이 900 ㎛² 를 초과 (즉, 3 개의 세포에 해당) 하는 경우 이는 세포 덩어리로 인식될 수 있다. 10 개 이상의 세포가 서로 접착되어 세포 덩어리를 형성하는 경우, 이의 단면적은 3000 ㎛² 이상으로 가정된다.

본 명세서에서, 현탁 상태로의 배양은 비접착 조건 하의 배지에서 배양하는 것을 의미한다. 비접착성 조건 하에서의 배양은 배양기 또는 기질에 접착되지 않은 상태 (예를 들어, 비접착성 멀티-웰 플레이트를 사용) 에서의 배양을 의미한다.

비접착성 조건 하에서의 배양은 공지된 방법 자체에 의해 수행될 수 있다. 상기 방법의 예는 기질에 대한 세포 접착을 저해하기 위해 배양기의 표면에 폴리(히드록시에틸메타크릴레이트) 등과 같은 친수성 물질 프로테오글리칸을 적용하는 것을 포함하는 방법 (Cell Struct Funct, 13, 179(1988)), 및 냉각함으로써 배양 배지에 용해되는 합성 중합체 화합물을 배양기의 표면에 적용하고, 세포가 이에 접착되게 하고, 배양기를 냉각해 합성 중합체 화합물을 용해시켜 세포의 시트를 형성하는 방법 (Bio Technology, 8, 854(1990)) 을 포함한다. 이러한 방법은 필요에 따라 개선될 수 있다. 예를 들어 배양 배지의 교환 동안 세포의 손실을 방지하기 위해, 일단 배양기를 원심 작동에 적용하여 배양기의 표면에 세포 덩어리를 강제로 부착시키고 배양 배지를 바꾸거나, 세포를 포함하는 배양 배지를 원심관에 수송하고 원심 작동에 의해 세포를 침전시키고 상청액 중 배양 배지를 교환할 수 있다.

본 단계에서, 세포 덩어리의 형성 전에 상기 언급된 단계 (3) 에서 얻어진 세포 (내배엽 세포) 에 단백질 소화 효소를 첨가해, 각각의 세포를 단일 세포로 분리할 수 있다.

사용가능한 단백질 소화 효소의 예는 트립신, 콜라게나아제, 파파인, 디스파아제, 아큐타아제 (Invitrogen, 상품명) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 단백질 소화 효소는 전형적으로, 소화 효소 저해제인 Ca² ⁺ 및 Mg² ⁺를 킬레이트하기 위해서 EDTA 를 첨가하여, 트립신-EDTA 용액 (예, 0.25 % 트립신-1 mM EDTA) 의 형태로 사용된다.

본 단계에서, 예를 들어 상기 언급된 단계 (3) 에서 얻어진 세포로부터 하기와 같이 세포 덩어리가 제조될 수 있다.

즉, 상기 언급된 단계 (3) 에서 얻어진 세포는 배양기 상에서 적합한 배지 중에서의 부유 배양에 적용된다. 예를 들어, 96-웰 둥근-바닥 디쉬가 저접착성 배양기로서 사용되는 경우, 웰 당 20,000 - 400,000 셀이 파종되고, 형성된 응집물을 저접착성 6 cm-디쉬 등에 수송하면서 또는 수송 없이, 약 6 시간 내지 약 10 일 동안, 바람직하게는 약 6 시간 내지 약 2 일 동안, 더 바람직하게는 1 일 동안 37 ℃ 에서 적합한 배지 중에 배양된다. 저접착성 배양기의 예는 당업계에서 통상 사용되고 저접착성이도록 처리되는 것을 포함한다. 배양기의 예는 배양 디쉬, 배양 플라스크, 회전 배양을 위한 장치 (스피너 플라스크 등) 등, 구체적으로는 타원형 플레이트를 포함한다. 저접착성이도록 하는 처리로서, 히드로겔의 공유 결합을 형성하는 것 (코팅) 에 의한 단백질 및 세포의 접착 억제를 위한 처리가 사용된다.

구체적으로는, 본 단계에서 상기 언급된 단계 (3) 에서 얻어진 세포는 예를 들어 96-웰 타원형 플레이트에 예를 들어 웰 당 2×10⁴ 세포의 밀도로 파종되고, 1 % B-27 보충제가 첨가된 개선된 MEM 아연 옵션 배지에서 1 일 동안 37 ℃ 및 5 % CO₂ 의 조건 하에 배양된다.

본 단계에서, 상기 언급된 바와 같이 얻어진 세포 덩어리는 배지 중 현탁 상태로 배양된다. 상기 언급된 바와 같은 현탁 상태로의 배양은, 배양기 또는 기질에 접착되지 않는 상태로의 배양 (예를 들어, 비접착성 멀티-웰 플레이트를 사용함) 을 의미한다.

본 단계에서 사용되는 배지 (즉, 재파종을 위한 배지) 의 예는 상기 언급된 단계 (2) 에 예시된 기초 배지를 포함한다. 본 단계에서 사용되는 배지는 상기 언급된 단계 (2) ~ (3) 과 동종의 기초 배지를 이용하여, 또는 이종의 기초 배지를 이용하여 제조될 수 있다. 췌호르몬-생성 세포로의 분화 유도가 보다 효율적으로 수행될 수 있으므로, 개선된 MEM 아연 옵션 배지 (Invitrogen) 가 바람직하게는 본 단계에서의 기초 배지로서 사용된다. 배지는 또한 공지 문헌 (Richter A. et al., National Cancer (1972) 49, 1705) 에 따라 제조될 수 있다.

본 단계에서 사용되는 배지는 또한 혈청 대체물을 포함할 수 있다. 혈청 대체물의 예는 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소 (예를 들어, 아연, 셀레늄), B-27 보충제, N2 보충제, 녹아웃 혈청 대체물, 2-메르캅토 에탄올, 3'-티올 글리세롤 또는 이의 균등물을 포함한다. 본 단계에서 사용되는 혈청 대체물로서, B-27 보충제가 바람직하다.

본 단계에서, B-27 보충제가 첨가된 개선된 MEM 아연 옵션 배지 (Invitrogen) 가 특히 바람직하게 사용된다. 배지 중 B-27 보충제의 농도는 0.01 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.1 ~ 2 중량% 이다.

피더 세포 및 피더 세포 추출물을 실질적으로 이용하지 않는 경우, 거부 반응을 야기하는 물질 (예, 동물 유래의 세포) 이 더 적은 양으로 함유된다.

배양 온도는 사용되는 세포의 배양에 적합한 한 특별히 한정되지는 않으나, 이는 약 30 ~ 40 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃ 이다.

배양 시간은 6 ~ 360 시간, 바람직하게는 약 1 일 ~ 약 12 일, 더욱 바람직하게는 약 8 일이다.

세포 덩어리가 현탁 상태로 형성된 경우, 세포 덩어리의 형성 이후 세포 덩어리는 또한 부유 배양에 대한 적용 없이 단계 (5) 에 적용될 수 있다. 이 경우, 단계 (5) 를 수행하기 이전에 형성된 세포 덩어리가 또한 0 ~ 48 시간, 바람직하게는 0 ~ 24 시간 동안 현탁 상태로 배양될 수 있다.

본 단계에서의 배양은 통상 약 1 ~ 10 %, 바람직하게는 5 % 의 CO₂ 로 환기된 인큐베이터 내에서 수행된다.

구체적으로는, 본 단계에서 상기 언급된 단계 (3) 에서 얻어진 세포는 예를 들어 96-웰 타원형 플레이트에 웰 당 2×10⁴ 세포의 밀도로 파종되고, 1 % B-27 보충제가 첨가된 개선된 MEM 아연 옵션 배지에서 1 일 동안 37 ℃ 및 5 % CO₂ 의 조건 하에 배양된다.

본 단계 (4) 에서, 췌호르몬-생성 세포는 또한 상기 언급된 단계 (1) ~ (3) 에 의해 얻어진 내배엽 세포 이외의 내배엽 세포를 출발 물질로서 사용하여 제조될 수 있다. 따라서, 본 단계 (4) 에 의해 본 발명은 또한 내배엽 세포를 출발 물질로서 사용하는 췌호르몬-생성 세포의 제조법, 즉 내배엽 세포로부터 세포 덩어리를 형성하고, 그 세포 덩어리를 배지 중 현탁 상태로 배양하는 것을 포함하는 췌호르몬-생성 세포의 제조법 (본 명세서에서 본 발명의 제조법 2 로 약술되는 경우가 있음) 을 제공한다.

상기 언급된 단계 (1) ~ (3) 에 의해 얻어진 내배엽 세포 이외의 내배엽 세포를 출발 물질로 사용하는 췌호르몬-생성 세포의 제조법은 또한 상기 언급된 단계 (3) 에서 얻어진 세포를 출발 물질로서 사용하는 췌호르몬-생성 세포의 제조법의 단계 (4) 와 동일한 방식으로 수행될 수 있다.

구체적으로는, 본 발명의 제조법 2 는 내배엽 세포를 하기 단계 (4') 및 (5') 에 적용하는 것을 특징으로 한다.

(5') 상기 언급된 단계 (4') 에서 얻어진 세포를, 레티노산 수용체 아고니스트, AMP-활성화 단백질 키나아제 및/또는 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제, 액티빈 수용체형 키나아제-4,5,7 의 저해제 및 세포 성장 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 단계

단계 (4') 는 상기 언급된 단계 (4) 와 동일한 방식으로 수행될 수 있고, 단계 (5') 는 상기 언급된 단계 (5) 와 동일한 방식으로 수행될 수 있다.

췌발생을 더 모방한 형태의 췌호르몬-생성 세포는 이러한 단계, 더 바람직하게는 상기 언급된 단계 (1) ~ (3) 이후 이러한 단계 (4) 에 의해 제조될 수 있다. 이러한 세포는 세포 덩어리의 삼차원 구조를 형성하므로, 단층으로 배양된 세포에 비해 신체 내 상태에 더 가깝고 더 기능적인 것으로 여겨진다. 또한, 삼차원적 구조로 인해, 이러한 세포는 통상의 제조 방법에 의해 얻어진 췌호르몬-생성 세포에 비해 세포 요법에 응용하기에 더 적합한 것으로 여겨진다.

단계 (5): 상기 언급된 단계 (4) 에서 얻어진 세포를, 레티노산 수용체 아고니스트, AMP-활성화 단백질 키나아제 및/또는 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제, 액티빈 수용체형 키나아제-4,5,7 의 저해제 및 세포 성장 인자를 포함하는 배지로 배양하는 단계

본 단계는 상기 언급된 단계 (4) 에서 얻어진 세포, 즉 현탁 상태로 배양된 내배엽 세포의 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포로의 분화를 유도하는 단계에 해당한다.

본 단계에서 사용되는 레티노산 수용체 (RAR) 아고니스트는 천연-발생 레티노이드, 또는 합성 레티노이드, 레티노이드 골격을 갖지 않는 레티노산 수용체 아고니스트 화합물, 또는 동등한 활성을 갖는 천연-발생 물질일 수 있다. 천연-발생 레티노이드의 예는, 레티노산 (완전-트랜스 레티노산 (완전-트랜스 RA) 및 9-시스-레티노산 (9-시스 RA) 의 입체 이성질체가 공지되어 있음) 을 포함한다. 합성 레티노이드는 당업계에 공지되어 있다 (미국 특허 제 5,234,926 호, 미국 특허 제 4,326,055 호 등). 레티노이드 골격을 갖지 않는 레티노산 수용체 아고니스트의 예는 Am80, TTNPB 및 AC-55649 를 포함한다. 천연-발생 물질의 예는 호노키올 및 마그놀롤을 포함한다 (Annual Report of Research Institute for Biological Function 9:55-61, 2009). 본 단계에서 사용되는 RAR 아고니스트는 바람직하게는 레티노산이다. RAR 아고니스트의 배지 중 농도는 사용되는 RAR 아고니스트의 종류에 따라 적절히 결정되지만, 사용되는 경우 레티노산의 농도는 통상 0.1 ~ 100 μM, 바람직하게는 0.5 ~ 10 μM 이다.

본 단계에서 사용되는 AMP-활성화 단백질 키나아제 및/또는 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제는 AMP-활성화 단백질 키나아제 (AMPK) 에 대한 저해 활성을 갖는 화합물, 액티빈 수용체형 키나아제 (ALK)-2,3,6 에 대한 저해 활성을 갖는 화합물, 및 조합으로 AMP-활성화 단백질 키나아제에 대한 저해 활성 및 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 에 대한 저해 활성을 갖는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

AMPK 저해 활성을 갖는 화합물의 예는, 도르소모르핀 (6-[4-(2-피페리딘-1-일에톡시)페닐]-3-피리딘-4-일피라졸롤[1,5-a]피리미딘), araA (아데닌-9-β-d-아라비노 푸라노시드), C75 등을 포함한다. 액티빈 수용체형 키나아제 (ALK) 는 몇 개의 유형으로 분류되며, ALK-2,3,6 은 BMP 유형 I 수용체 키나아제로서 공지되어 있고, 하기 언급되는 ALK-4,5,7 은 TGF-β 슈퍼패밀리 (superfamily) 유형 I 수용체 키나아제로서 공지되어 있다. ALK-2,3,6 저해 활성을 갖는 화합물로서, 도르소모르핀, LDN-193189 (6-(4-피페라지노페닐)-3-(퀴놀린-4-일)피라졸로[1,5-a]피리미딘) 등이 언급될 수 있다. 도르소모르핀은 AMPK 저해 활성 및 ALK-2,3,6 저해 활성을 모두 갖는다. AMP-활성화 단백질 키나아제 및/또는 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제로서, 도르소모르핀이 바람직하다.

이러한 화합물은 SIGMA, Tocris bioscience, Stemgent, Merck Bioscience 등에서 구입 가능하다.

또한, AMP-활성화 단백질 키나아제 또는 ALK-2,3,6 에 관한 mRNA 의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRAN 등은 또한 AMP-활성화 단백질 키나아제 및/또는 ALK-2,3,6 의 저해제로서 사용될 수 있다. 또한 본 단계에서, 배양 하에 있는 세포로부터 배지에, BMP 부류에 속하는 인자의 분화 증가 또는 이러한 분화 인자의 분비가 확인되는 경우, 이러한 분화 인자의 활성을 중화하는 항체 또는 BMP 에 결합되어 그 작용을 저해하는 것으로 공지된 Noggin, Chordin, Cerberus, Gremlin 등이 AMP-활성화 단백질 키나아제 및/또는 ALK-2,3,6 의 저해제로서 또한 사용될 수 있다.

본 단계에서 배양 하에 있는 세포에 의하여 액티빈 수용체형 키나아제-4,7 의 활성화제로서 상기 언급된 단계 (3) 에 예시된 액티빈의 증가 또는 분비가 배지에서 확인되는 경우, 액티빈의 활성을 중화하는 것으로 공지된 항체 또는 액티빈에 결합해 그 작용을 저해하는 것으로 공지된 폴리스타틴이 AMP-활성화 단백질 키나아제 및/또는 ALK-2,3,6 의 저해제로서 또한 사용될 수 있다.

AMP-활성화 단백질 키나아제 및/또는 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제의 배지 중 농도는 사용되는 저해제의 종류에 따라 적절히 결정되지만, 사용되는 경우 도르소모르핀의 농도는 통상 0.1 ~ 20 μM, 바람직하게는 0.2 ~ 5 μM 이다.

본 단계에서 사용되는 액티빈 수용체형 키나아제 (ALK)-4,5,7 의 저해제로서, SB-431542, SB-505124 (2-(5-벤조[1,3]디옥솔-5-일-2-tert-부틸-3H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 히드로클로라이드), SB-525334 (6-[2-tert-부틸-5-(6-메틸-피리딘-2-일)-1H-이미다졸-4-일]-퀴녹살린), A-83-01 (3-(6-메틸-2-피리딜)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-티오카르복사미드), GW6604, LY-580276 (2-(6-메틸-2-피리디닐)-3-(4-플루오로페닐)-5,6-디히드로-4H-피롤로[1,2-b]피라졸) 및 SD-208 (2-(5-클로로-2-플루오로페닐)-N-(피리딘-4-일)피리도[2,3-d]피리미딘-4-아민) 등이 언급될 수 있다.

이는 SIGMA, Tocris bioscience, Wako Pure Chemical Inustries, Ltd. 등에서 구입 가능하다. 또한, ALK-4,5,7 에 관한 mRNA 의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA 가 ALK-4,5,7 저해제로서 또한 사용될 수 있다.

본 단계에서 사용되는 ALK-4,5,7 의 저해제로서, SB-431542 (4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드 또는 이의 수화물) 이 바람직하다. 액티빈 수용체형 키나아제-4,5,7 의 저해제의 배지 중 농도는 사용되는 저해제의 종류에 따라 적절히 결정되지만, 사용되는 경우 SB-431542 의 농도는 통상 0.1 ~ 50 μM, 바람직하게는 1 ~ 20 μM 이다.

본 단계에서 사용되는 세포 성장 인자의 예는 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), 간 세포 성장 인자 (HGF), 줄기 세포 성장 인자 (SCF), 상피 세포 성장 인자 (EGF), 다양한 섬유아세포 성장 인자 (a/bFGF) 등을 포함한다. 특히 바람직한 것은 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF) 이다.

세포 성장 인자의 배지 중 농도는 사용되는 인자의 종류에 따라 적절히 결정되지만, 사용되는 경우 bFGF 의 농도는 통상 1 ~ 200 ng/㎖, 바람직하게는 20 ~ 100 ng/㎖ 이다.

본 단계는 상기 언급된 레티노산 수용체 아고니스트, AMP-활성화 단백질 키나아제 및/또는 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제, 액티빈 수용체형 키나아제-4,5,7 의 저해제 및 세포 성장 인자의 4 종류의 성분 모두를 포함하는 배지에서 수행된다.

본 단계에서, 레티노산 수용체 아고니스트, AMP-활성화 단백질 키나아제 및/또는 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제, 액티빈 수용체형 키나아제-4,5,7 의 저해제 및 세포 성장 인자는 배지에 동시에 첨가될 수 있거나, 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포로의 분화가 유도될 수 있는 한 특정 시간차를 두고 배지에 첨가될 수 있다. 레티노산 수용체 아고니스트, AMP-활성화 단백질 키나아제 및/또는 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제, 액티빈 수용체형 키나아제-4,5,7 의 저해제 및 세포 성장 인자는 배지에 동시에 첨가되는 것이 편리하고 바람직하다.

본 단계에서 사용되는 배지는 상기 언급된 단계 (2) 에서 예시된 기초 배지에 레티노산 수용체 아고니스트, AMP-활성화 단백질 키나아제 및/또는 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제, 액티빈 수용체형 키나아제-4,5,7 의 저해제 및 세포 성장 인자를 첨가함으로써 제조된다.

본 단계에서 사용되는 배지는 상기 언급된 단계 (4) 와 동종의 기초 배지를 이용해, 또는 이종의 기초 배지를 이용해 제조될 수 있다. 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포로의 분화 유도가 보다 효율적으로 수행될 수 있기 때문에, 개선된 MEM 아연 옵션 배지 (Invitrogen) 가 바람직하게는 본 단계를 위한 기초 배지로서 사용된다.

본 단계에서 피더 세포 및/또는 피더 세포 추출물을 실질적으로 이용하지 않는 것이 바람직하고, 피더 세포 및/또는 피더 세포 추출물을 전혀 이용하지 않는 것이 보다 바람직하다.

피더 세포 및 피더 세포 추출물이 실질적으로 이용되지 않는 경우, 거부 반응을 야기하는 물질 (예, 동물 유래의 세포) 이 더 적은 양으로 함유된다.

본 단계에서 사용되는 배지는 혈청 대체물을 또한 포함할 수 있다.

혈청 대체물의 예는 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소 (예를 들어 아연, 셀레늄), B-27 보충제, N2 보충제, 녹아웃 혈청 대체물, 2-메르캅토 에탄올, 3'-티올글리세롤 또는 이의 균등물을 포함한다. 본 단계에서 사용되는 혈청 대체물은 바람직하게는 B-27 보충제이다.

혈청 대체물의 배지 중 농도는, B-27 이 사용되는 경우 0.01 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.1 ~ 2 중량% 이다.

본 단계는, 사용되는 내배엽 세포의 배양에 적절한 배양 온도, 통상 30 ~ 40 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃ 에서, 72 ~ 288 시간, 바람직하게는 120 ~ 216 시간 동안, 1 ~ 10 %, 바람직하게는 5 % 의 이산화탄소로 환기된 CO₂ 인큐베이터 내에서 배양 함으로써 수행된다.

본 단계에서, 내배엽 세포의 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포로의 분화 유도는, 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포-특이적 발현을 나타내는 단백질 및 유전자 (췌호르몬-생성 세포의 전구 세포를 위한 마커) 의 발현 유무를 평가함으로써 확인될 수 있다. 단백질의 발현은 항원 항체 반응을 이용한 방법 등에 의해 평가될 수 있고, 유전자의 발현은 RT-PCR 을 이용한 방법 등에 의해 평가될 수 있다. 마커의 예는 NGN3, HNF6 (간세포 핵 인자 6, 별칭: 원컷 호메오박스 1 (one cut homeobox 1)), PDX1 (췌장 및 십이지장 호메오박스 1) 등을 포함한다.

단계 (6): 상기 언급된 단계 (5) 에서 얻어진 세포를 배양하는 단계

본 단계는 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포의 췌호르몬-생성 세포로의 분화를 유도하는 단계에 해당한다.

본 단계에서 사용되는 기초 배지는 상기 언급된 단계 (2) 에서 예시된 기초 배지일 수 있다. 본 단계에서 사용되는 기초 배지는 상기 언급된 단계 (5) 와 동종의 기초 배지를 이용해, 또는 이종의 기초 배지를 이용해 제조될 수 있다. 췌호르몬-생성 세포로의 분화 유도가 보다 효율적으로 수행될 수 있으므로, 개선된 MEM 아연 옵션 배지 (Invitrogen) 가 바람직하게는 본 단계를 위한 기초 배지로서 사용된다.

피더 세포 및 피더 세포 추출물을 실질적으로 이용하지 않는 경우, 거부 반응을 야기하는 물질 (예, 동물 유래의 세포) 가 더 적은 양으로 함유된다.

본 단계에서 사용되는 배지는 또한 혈청 대체물을 포함할 수 있다. 혈청 대체물의 예는, 알부민 (예를 들어, 지질 풍부 알부민), 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소 (예를 들어, 아연, 셀레늄), B-27 보충제, N2 보충제, 녹아웃 혈청 대체물, 2-메르캅토에탄올, 3'-티올글리세롤 또는 이의 균등물을 포함한다. 그 중에서, B-27 보충제가 바람직하다. 특히, B-27 보충제가 첨가된 개선된 MEM 아연 옵션 배지 (Invitrogen) 가 바람직하게는 사용된다. 배지 중 B-27 보충제의 농도는 0.01 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.1 ~ 2 중량% 이다. 또한, 세포의 생존률을 향상시키는 첨가제가 개선된 MEM 아연 옵션 배지에 첨가될 수 있다. 상기 첨가제의 예는 녹아웃 혈청 대체물, N2 보충제 등과 같은 혈청 대체물 등을 포함한다. 배지 중 상기 언급된 첨가제의 농도는 0.01 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.1 ~ 2 중량% 이다.

바람직하게는, 본 단계에서 사용되는 배지는 레티노산 수용체 아고니스트, AMP-활성화 단백질 키나아제 및/또는 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제, 액티빈 수용체형 키나아제-4,5,7 의 저해제 및 세포 성장 인자를 포함하지 않는다. 따라서, 단계 (5) 와 단계 (6) 사이에 배지를 교환하는 것이 바람직하다.

본 단계는 사용되는 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포의 배양에 적절한 배양 온도, 통상 30 ~ 40 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃ 에서, 24 ~ 240 시간, 바람직하게는 72 ~ 192 시간 동안, 1 ~ 10 %, 바람직하게는 5 % 의 이산화탄소로 환기된 CO₂ 인큐베이터 내에서 배양함으로써 수행된다.

본 단계에서, 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포의 췌호르몬-생성 세포로의 분화 유도는, 췌호르몬-생성 세포-특이적 발현을 나타내는 단백질 및 유전자 (췌호르몬-생성 세포 마커) 의 발현을 평가함으로써, 또는 배지에 분비되는 췌호르몬의 양을 측정함으로써 확인될 수 있다. 마커의 예는 인슐린, 글루카곤, 췌장 폴리펩티드, 소마토스타틴, PCSK1 (전구단백질 전환 효소 서브틸리신/케신 유형 1), SUR1 (술포닐우레아 수용체 1, 별칭: ATP-결합 카세트, 하위부류 C (CFTR/MRP), 멤버 8), NKX6.1 (NK6 호메오박스 1), PAX6 (쌍을 이룬 박스 6), NEUROD (신경 분화 1), ARX (아리스탈레스 관련 호메오박스 (aristaless related homeobox)) 등을 포함한다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 줄기 세포로부터 췌호르몬-생성 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 동일한 방법, 즉 덜 분화된 상태에 있는 세포의 보다 분화된 상태로의 분화 유도 방법에 의해, 줄기 세포의 다양한 분화 상태에 있는 세포 (내배엽 세포, 췌관 세포, 췌내분비 세포, 췌외분비 세포, 이에 공통되는 세포 전구체 등) 로의 분화가 유도될 수 있다. 유도된 분화 정도도는 각 세포에 특이적으로 발현하는 단백질 또는 유전자의 발현 유무를 확인함으로써 알 수 있다.

본 발명의 제조법을 사용하여, 줄기 세포의 췌호르몬-생성 세포로의 분화가 효율적으로 유도되므로, 높은 췌호르몬 분비 능력를 갖는 췌호르몬-생성 세포가 다량 공급될 수 있다. 이 췌호르몬-생성 세포는 약제 (특히 세포 요법을 위한 약제) 또는 당뇨병 치료 약물을 개발하기 위한 도구로서 이용될 수 있다.

2. 본 발명의 세포를 포함하는 약제

본 발명은 상기 언급된 본 발명의 제조법 또는 본 발명의 제조법 2 에 의해 제조된 췌호르몬-생성 세포 (본 발명의 세포) 를 포함하는 약제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 언급된 본 발명의 제조법 (바람직하게는 단계 (1) ~ (5)) 또는 본 발명의 제조법 2 에 의해 제조된 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포를 포함하는 약제 (본 명세서에서, 본 발명의 약제로서 약술되는 경우가 있음) 를 제공한다.

본 발명의 약제에서, 췌호르몬-생성 세포 또는 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포는 그 자체로, 또는 필터 여과 등에 의해 농축 펠릿과 같은 세포 덩어리 등으로서 사용된다. 또한, DMSO (디메틸 술폭시드) 등의 보호제가 첨가된 약제는 또한 동결 보존될 수 있다. 약제로서 보다 안전한 이용을 위해, 이의 췌호르몬-생성 세포로서의 기능 또는 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포로서의 기능을 유지하면서 병원체 단백질이 변성하는 조건 하에서, 가열 처리, 방사선 처리 등과 같은 처리에 적용될 수 있다. 췌호르몬-생성 세포 또는 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포가 필요보다 많은 양으로 성장하는 것을 방지하기 위해서, 세포는 상기 언급된 처리와 조합된 처리, 예컨대 미토마이신 C 를 사용한 전처리 등에 의한 성장 억제, 포유 동물에 자연적으로는 부재하는 대사 효소 유전자를 세포에 도입하고, 필요에 따라 비활성 약물을 투여하여 포유 동물에 자연적으로는 부재하는 대사 효소 유전자가 도입된 세포에서만 약물을 독소로 변화시켜 세포의 사멸을 야기하는 방법 (자살 유전자 요법) 등에 적용될 수 있다.

본 발명의 약제는 안전하고 저독성이며, 포유 동물 (예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 기니어 피그, 돼지, 원숭이 등, 바람직하게는 인간) 에 투여 (이식) 될 수 있다.

본 발명의 약제의 투여량 (이식되는 양) 은 예를 들어 1×10⁵ ~ 1×10¹⁰ 세포/개체, 바람직하게는 5×10⁷ ~ 1×10¹⁰ 세포/개체, 더욱 바람직하게는 1×10⁹ ~ 1×10¹⁰ 세포/개체이다. 본 발명의 약제의 경우, 환자 본인의 세포 또는 환자에게 용인될 수 있는 세포적합성 또는 조직적합성 유형을 나타내는 공여자의 세포를 사용하여 제조되는 췌호르몬-생성 세포가 바람직하게는 사용된다. 충분한 세포가 연령, 체질 등으로 인해 달성될 수 없는 경우, 이식은 또한 폴리에틸렌글리콜 및 규소와 같은 캡슐, 다공성의 용기 등에 세포를 포매하여 거부 반응을 회피하는 것에 의해 가능하다. 이러한 경우, 복강내 또는 피하 이식이 또한 가능하다. 본 발명의 약제의 투여량 (이식되는 양) 은 투여받는 환자의 연령, 체중, 증상 등에 따라 적절히 변경될 수 있다.

본 발명의 약제 중, 췌호르몬-생성 세포를 포함하는 약제는 이의 투여 (이식) 에 의해 환자의 신체에서 췌호르몬의 생성 (분비) 을 가능하게 하고, 췌호르몬의 감소된 생성 (분비) 에 의해 야기되는 질환의 치료에 유용하다. 예를 들어, 인슐린-생성 세포를 포함하는 약제는 당뇨병 (I 형 및 II 형, 바람직하게는 I 형 또는 저하된 인슐린 수준을 갖는 II 형, 특히 바람직하게는 I 형) 의 치료에 유용하다. 다른 한편으로는, 본 발명의 약제 중에서 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포를 포함하는 약제는 환자에게 투여 (이식) 된 이후 적당한 조건 하에서 췌호르몬-생성 세포로의 분화가 유도되고, 여기서 췌호르몬이 생성 (분비) 된다.

3. 스크리닝 방법

본 발명은 하기 단계 (1) ~ (6) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 임의의 하나 이상의 단계에 의해 얻어진 세포를 사용하는 것을 포함하는, 약제 (바람직하게는 당뇨병 치료 약물) 의 스크리닝 방법을 제공한다:

(4) 상기 언급된 (3) 에서 얻어진 세포로부터 세포 덩어리를 형성하고, 그 세포 덩어리를 배지 중 현탁 상태로 배양하는 단계

(6) 상기 언급된 단계 (5) 에서 얻어진 세포를 배양하는 단계.

상기 언급된 단계 (1) ~ (6) 은 상기 언급된 본 발명의 췌호르몬-생성 세포의 제조법의 단계 (1) ~ (6) 과 동일한 방식으로 수행될 수 있다.

스크리닝에 사용되는 세포로서, 상기 언급된 단계 (1) ~ (6) 을 통해 얻어지는 췌호르몬-생성 세포; 상기 언급된 단계 (1) ~ (5) 를 통해 얻어지는 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포; 상기 언급된 단계 (1) ~ (4) 또는 상기 언급된 단계 (1) ~ (3) 을 통해 얻어지는 내배엽 세포; 상기 언급된 단계 (1) ~ (2) 를 통해 얻어지는 세포; 상기 언급된 단계 (1) 을 통해 얻어지는 세포가 언급될 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법은 구체적으로는 이하와 같이 수행된다 (구현예 1). (a) 시험 화합물 존재 하에서 췌호르몬-생성 세포가 배양되고 (b) 시험 화합물 부재 하에서 췌호르몬-생성 세포가 배양되고, 세포내 췌호르몬 발현량 및 세포외 췌호르몬 분비량이 각각 측정되고, 비교되는 방법.

췌호르몬의 발현량으로서, 췌호르몬 단백질의 발현량, 췌호르몬 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예, mRNA 등) 의 발현량 등이 언급될 수 있다. 췌호르몬의 발현량 및 분비량은 공지된 방법에 의해 측정될 수 있는데, 예를 들어 세포 추출물, 배지 등에 존재하는 상기 언급된 췌호르몬은 췌호르몬을 인식하는 항체를 이용하고 웨스턴 블로팅 분석 (Western blotting analysis), ELISA 방법 등과 같은 방법 또는 이와 유사한 방법 등에 따라서 측정될 수 있다.

mRNA 량은 공지된 방법, 예를 들어 노던 교잡 (Northern hybridization), S1매핑법, PCR 방법, DNA 칩 또는 배열법 또는 이와 유사한 방법에 의해 측정될 수 있다.

췌호르몬-생성 세포의 배양은, 췌호르몬이 발현 및/또는 분비되는 조건 하에서 수행되고 공지된 방법에 따라 수행될 수 있는 한 특별히 제한되지는 않는다. 사용가능한 배지의 예는 약 1 ~ 20 % 의 소태아 혈청을 포함하는 MEM 배지 [Science, 122, 501(1952) 등], DMEM 배지 [Virology, vol. 8, 396(1959)] , RPMI 1640배지 [The Journal of the American Medical Association 199, 519(1967)] 및 199 배지 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1(1950)] 를 포함한다. 배지의 pH 는 바람직하게는 약 6 ~ 8 이다. 배양은 통상 약 30 ℃ ~ 40 ℃ 에서 약 15 시간 ~ 5 일 동안 필요에 따라 환기 또는 교반과 함께 수행된다.

시험 화합물의 예는 펩티드, 단백질, 항체, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출물, 식물 추출물, 동물 조직 추출물, 혈장을 포함한다. 여기서, 시험 화합물은 염을 형성할 수 있다. 염으로서, 생리학적으로 허용가능한 산, 염기 (예, 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염, 알루미늄 염) 등과의 염이 사용된다. 상기 염의 예는 무기산 (예를 들어, 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산) 과의 염, 유기산 (예를 들어, 아세트산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 벤조산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산) 과의 염, 나트륨 염, 칼륨 염, 칼슘 염, 마그네슘 염, 바륨 염 및 알루미늄 염을 포함한다.

예를 들어, 상기 언급된 (a) 에서 췌호르몬의 발현량 또는 분비량이 상기 언급된 (b) 의 것에 비해 약 20% 이상, 바람직하게는 약 30% 이상, 보다 바람직하게는 약 50% 이상으로 억제 (저해) 되는 시험 화합물은 췌호르몬-생성 세포에서의 췌호르몬 발현을 억제 (저해) 하는 화합물로서 선택될 수 있다.

상기 언급된 (a) 에서 췌호르몬 발현량 또는 분비량이 상기 언급된 (b) 의 것에 비해 약 20% 이상, 바람직하게는 약 30% 이상, 보다 바람직하게는 약 50% 이상으로 향상되는 시험 화합물은 췌호르몬-생성 세포에서 췌호르몬의 발현 또는 분비를 향상시키는 화합물로서 선택될 수 있다.

췌호르몬-생성 세포가 인슐린-생성 세포인 경우, 인슐린 발현을 향상시키는 화합물은 당뇨병 치료 약물로서 유용하다. 췌호르몬-생성 세포가 글루카곤-생성 세포인 경우, 글루카곤 발현을 억제 (저해) 하는 화합물은 당뇨병 치료 약물로서 유용하다.

본 발명의 스크리닝 방법의 또다른 구현예는 (a) 시험 화합물 존재 하에서 췌호르몬-생성 세포가 배양되고 (b) 시험 화합물 부재 하에서 췌호르몬-생성 세포가 배양되고, 세포의 증식 능력이 측정되고, 비교되는 방법이다 (구현예 2). 사용되는 시험 화합물로서, 상기 언급된 구현예 1 에서 사용되는 시험 화합물과 유사한 것이 언급될 수 있다. 본 구현예에서의 세포 배양은 상기 언급된 구현예 1 에서와 동일한 방식으로 수행될 수 있다. 세포의 증식 능력을 측정하는 방법으로서, 통상 당업계에서 사용되는 방법이 사용될 수 있고, 예를 들어 세포 수를 계수하는 방법, ³H, 5-브로모-2'-데옥시-우리딘 (BrdU) 등의 흡수, ATP 량, 테트라졸륨 화합물의 포르마잔 생성물로의 전환량을 평가하는 방법 등을 포함한다.

예를 들어, 췌호르몬-생성 세포가 인슐린-생성 세포인 경우 유의하게 인슐린-생성 세포의 성장을 향상시키는 화합물은 당뇨병 치료 약물로서 유용하다. 췌호르몬-생성 세포가 글루카곤-생성 세포인 경우, 유의하게 글루카곤-생성 세포의 성장을 억제 (저해) 하는 화합물은 당뇨병 치료 약물로서 유용하다.

본 발명의 스크리닝 방법의 또다른 구현예는 (a) 시험 화합물의 존재 하에서 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포가 배양되고 (b) 시험 화합물의 부재 하에서 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포가 배양되고, 세포의 분화 수준이 측정되고, 비교되는 방법이다 (구현예 3). 사용되는 시험 화합물로서, 상기 언급된 구현예 1 에서 사용된 시험 화합물과 유사한 것이 언급될 수 있다. 이러한 구현예에서 세포 배양은 상기 언급된 구현예 1 과 동일한 방식으로 수행될 수 있다. 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포의 분화 수준은, 예를 들어 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포 및/또는 췌호르몬-생성 세포에 특이적인 마커의 발현의 유무에 의해 시험될 수 있다. 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포에 특이적인 마커의 예는 NGN3 (뉴로제닌 3), PAX4 (쌍을 이룬 박스 4) 를 포함하고, 췌호르몬-생성 세포에 특이적인 마커의 예는 인슐린, 글루카곤, 췌장 폴리펩티드, 소마토스타틴, 그렐린, PCSK1 (전구 단백질 전환 효소 서브틸리신/케신 유형 1), SUR1 (술포닐우레아 수용체 1, 별칭 ATP-결합 카세트, 하위 부류 C (CFTR/MRP), 멤버 8), 글루코키나아제, MAFA (v-maf 근건막 섬유육종 종양 유전자 상동체 A), IAPP (췌도 아밀로이드 폴리펩티드) 등을 포함한다.

예를 들어, 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포가 인슐린-생성 세포의 전구 세포인 경우, 유의하게 인슐린-생성 세포의 전구 세포의 분화를 향상시키는 화합물은 당뇨병 치료 약물으로서 유용하다. 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포가 글루카곤-생성 세포의 전구 세포인 경우, 유의하게 글루카곤-생성 세포의 전구 세포의 분화를 억제 (저해) 하는 화합물은 당뇨병 치료 약물로서 유용하다.

본 발명의 스크리닝 방법의 또다른 구현예는 (a) 시험 화합물 존재 하에서 내배엽 세포가 배양되고 (b) 시험 화합물 부재 하에서 내배엽 세포가 배양되고, 그 세포의 증식 혹은 분화 능력이 측정되고, 비교되는 방법이다 (구현예 4). 사용되는 시험 화합물로서, 상기 언급된 구현예 1 에서 사용된 시험 화합물과 유사한 것이 언급될 수 있다. 본 구현예에서의 세포 배양은 상기 언급된 구현예 1 과 동일한 방식으로 수행될 수 있다. 세포 증식 능력을 측정하는 방법으로서, 당업계에서 통상 사용되는 방법이 사용될 수 있고, 예를 들어 세포 수를 계수하는 방법, ³H, 5-브로모-2'-데옥시-우리딘 (BrdU) 등의 흡수, ATP 량, 테트라졸륨 화합물의 포르마잔 생성물로의 전환량을 평가하는 방법 등을 포함한다. 내배엽 세포의 분화 능력은 예를 들어 내배엽 세포에 특이적인 마커의 발현 유무에 의해 시험될 수 있다. 내배엽 세포 특이적 마커의 예는, α-태아단백질, 알부민, 펩신, 폐 계면활성 단백질 등을 포함한다. 일반적으로, 내배엽 세포의 분화 유도 및 배양은 중배엽 또는 외배엽 세포에 비해 기술적으로 어렵고, 스크리닝 방법에 의해 얻어진 화합물을 이용해 제조된 세포 및/또는 내배엽 분화 유도 시스템은 약제의 신규 스크리닝 시스템에 이용될 수 있다.

췌호르몬-생성 세포의 기능을 보호 (유지) 하는 약제 등은 본 발명의 스크리닝 방법에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있다. 본 발명의 스크리닝 방법의 또다른 구현예는 (a) 시험 화합물의 존재 하에서 췌호르몬-생성 세포가 배양되고, (b) 시험 화합물의 부재 하에서 췌호르몬-생성 세포가 배양되고, 생존 가능한 세포의 수 또는 기능이 각각 측정되고, 비교되는 방법이다 (구현예 5). 사용되는 시험 화합물로서, 상기 언급된 구현예 1 에서 사용된 시험 화합물과 유사한 것이 언급될 수 있다. 본 구현예에서 세포 배양은 상기 언급된 구현예 1 과 동일한 방식으로 수행될 수 있다. 생존 가능한 세포를 계수하는 방법으로서, 통상 당업계에서 사용되는 방법이 이용될 수 있고, 예를 들어 세포 수를 계수하는 방법, ³H, 5-브로모-2'-데옥시-우리딘 (BrdU) 등의 흡수, ATP 량, 테트라졸륨 화합물의 포르마잔 생성물로의 전환량을 평가하는 방법 등을 포함한다. 또한, 아포프토시스의 유도 이후 세포의 수는 형태학적 특징 (크로마틴 응집, 핵 절편화, 세포 수축 등) 을 나타내는 세포의 계수 이외에, TUNNEL (TdT-중개 dUTP 닉 말단 라벨화 (Tdt-mediated dUTP nick end labeling)) 방법에 의한 단편화 DNA 의 검출 및 활성 카스파제 유무의 검출 및 7-AAD (7-아미노-액티노마이신 D) 등과 같은 살아있는 세포 불투과성 염료에 의한 핵 염색, 세포 표면에 대한 포스파티딜세린의 노출, 미토콘드리아 막의 탈분극화, 특정 세포간 단백질의 절단 및 분해의 측정 등에 의해 정량화될 수 있다. 세포 기능의 측정 방법으로서, 포도당 농도에 해당하는, 인슐린 또는 C-펩티드의 분비량 및 세포 막 전위 변화를 측정하는 방법 등이 언급될 수 있다. 본 구현예에서, 췌호르몬-생성 세포에 장애를 야기하는 것으로 공지된 인자, 예를 들어 염증성 사이토카인, 활성 산소 및 이의 생성 유도 물질, 고농도의 지방산, 포도당 등이 세포 배양 동안 첨가되고, 생존 가능한 세포의 수 또는 세포의 기능이 측정되고, 비교된다.

췌호르몬-생성 세포가 인슐린-생성 세포인 경우, 췌호르몬-생성 세포의 장애를 야기하는 것으로 공지된 인자에 대항해 인슐린-생성 세포 생존 또는 기능 유지를 유의하게 향상시키는 화합물은 당뇨병 치료 약물으로서 유용하다.

본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 약제는 통상적 방법에 의해 및 생리학적으로 허용될 수 있는 첨가제 (예, 담체, 향미제, 부형제, 방부제, 안정화제, 결합제) 를 사용해 제형화될 수 있다.

이에 따라 얻어진 제제의 투약 형태의 예는 경구 제제 예컨대 필요에 따라 당 코팅이 적용된 정제, 캡슐, 엘릭시르, 마이크로캡슐 등; 및 비경구제 예컨대 주사 등을 포함한다. 이러한 제제 중 활성 성분의 함량은 예를 들어 0.1 - 90 중량% 이다.

상기 언급된 첨가제의 예는, 젤라틴, 옥수수 전분, 트라가칸트, 아라비아 검 등의 결합제; 결정질 셀룰로오스등의 부형제; 옥수수 전분, 젤라틴, 알긴산 등의 팽윤제; 마그네슘 스테아레이트 등의 윤활제; 수크로오스, 락토오스, 사카린 등의 감미제; 페퍼민트, 가울테리아 아데노트릭스 (Gaultherial adenothrix) 오일, 체리 등의 향미제; 지방 및 오일, 주사용수, 식물성 오일 (예를 들어, 참기름, 야자유, 대두유), 완충제 (예를 들어, 포스페이트 완충액, 나트륨 아세테이트 완충액) 등의 액상 담체; 용해제 (예를 들어, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜); 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 80^TM, HCO-50); 용해제 (예를 들어, 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올); 습윤제 (예를 들어, 벤잘코늄 클로라이드, 프로카인 히드로클로라이드); 안정화제 (예를 들어, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌 글리콜); 보존제 (예를 들어, 벤질 알코올, 페놀); 및 산화 방지제를 포함한다.

상기 언급된 주사용수의 예는 생리 식염수; 및 포도당, D-소르비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등을 포함하는 등장성 용액을 포함한다.

본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 약제 (바람직하게는 당뇨병 치료 약물) 는 안전하고 저독성이므로, 이는 예를 들어 포유 동물 (예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 말, 고양이, 개, 원숭이, 침팬지) 에 대해 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다.

약제의 투약량은 그 작용, 대상 질환, 투여 대상, 투여 경로 등에 따라 적절히 결정된다.

실시예

하기 실시예를 나타내어 본 발명을 상세히 설명하나, 이는 제한적으로 나타내어지는 것은 아니다.

실시예 1 (1):

인간 iPS 세포의 내배엽 세포로의 분화 유도 [단계 (1) ~ (3)]

인간 iPS 세포의 내배엽 세포로의 분화 유도를 하기 방법에 의해 수행하였다.

먼저, 피더 세포와 함께 세포 덩어리 상태로 배양 및 유지된 인간 iPS 세포 (Oct3/4유전자, Klf4 유전자 및 Sox2 유전자를 도입함으로써 얻어지는 iPS 세포: Nat Biotechnol 2008; 26:101-106 참조) 를 영장류 ES 세포용 세포 박리 용액 (ReproCELL Inc.) 을 이용해 세포 덩어리 상태로 박리시키고, 이러한 세포를 15 ㎖원심관으로 옮기고, 5 분간 정치시켰다. 상청액을 제거하는 것에 의해 피더 세포를 제거했다.

원심관에 침전된 인간 iPS 세포에, 0.25 % 트립신-1 mM EDTA 용액 (GIBCO) 을 첨가하고, 이것이 단일 세포를 형성할 때까지 해리시켰다. 이후, 배지에 분산된 인간 iPS 세포를, BD Matrigel (Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.) 로 코팅된 한 100 mm 디쉬 당 15×10⁴ 세포의 밀도로 파종하였고, 37 ℃, 5 % CO₂ 에서 1 일 동안 배양하였다. 사용된 100 mm 디쉬는 3 시간 이상 동안 실온에서, 무혈청 DMEM/F12 배지 (Invitrogen) 를 이용해 40 배 희석된 BD Matrigel 로 코팅된 것이었다. 분산 및 파종을 위한 배지로서는, 10 μM 의 Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 가 첨가된 영장류 ES 세포용 배지였다. 파종 1 일 후에, GSK3β 저해제 CHIR99021 (3 μM) 및 2% B-27 보충제 (GIBCO) 를 포함하는 DMEM/F12 배지와 배지를 교환하고 2 일 동안 배양했다. 이후, 액티빈 A (50 ng/㎖) 및 CHIR99021 (1 μM) 을 포함하는 DMEM/F12 배지와 배지를 교환하고 2 일 동안 배양했다.

인간 iPS 세포 배양시의 내배엽 분화 마커의 발현 변동을 시험하기 위해, 분화 유도 이후의 세포를 경시적으로 회수하고, RNeasy96 (Qiagen) 을 이용해 전체 RNA 분획을 정제하였다. PrimeScriptRT 시약 키트 (Takara Bio Inc.) 를 이용하여 cDNA 를 합성하고, 정량 RT-PCR 을 수행하고, 원시선 마커 브라키우리 및 내배엽 마커 SOX17 의 유전자 발현량을 측정하였다. 발현 분석 결과를 도 1 에 나타낸다. 배양 제 3 일에, 브라키우리의 발현량이 일시적으로 증가하였고, 제 4 일에는 SOX17 의 발현량이 현저하게 증가했다.

이로부터, 원시선으로의 분화를 통해 내배엽 마커의 발현이 효율적으로 유도된다는 것이 명백해졌다.

SOX17 단백질의 발현을 시험하기 위해, 항-SOX17 항체를 사용한 면역 형광 염색을 수행하였다. 100 mm 디쉬에서 분화 유도에 의해 얻어진 내배엽 세포를 Accutase (Invitrogen) (상품명) 를 이용해 단일 세포로 해리시키고, 피브로넥틴-코팅된 96-웰 플레이트에 4×10⁴ 세포의 밀도로 파종하고, 37℃, 5% CO₂ 에서 1 일 동안 배양했다. DMEM/F12 를 이용해 피브로넥틴 (BD) 을 20 배 희석하고, 실온에서 3 시간 동안 정치시킴으로써 피브로넥틴 코팅을 수행하였다. 파종을 위한 배양 배지로서, 1% B-27 보충제를 포함하는 개선된 MEM 아연 옵션 배지 (Invitrogen) 를 사용했다. 배양 후, 4% 파라-포름알데히드를 첨가하고 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하여 세포를 고정시켰다. 배양 이후 세포를 연속하여 1 차 항체로서 항-인간 SOX17 항체 (AF1924, R＆D) 와 반응시키고, 이후 2 차 항체로서 Alexa488-표지 2 차 항체 (Invitrogen) 와 반응시키고, 세포 핵을 Hoechst 33342 를 이용해 염색하고, 형광 현미경으로 관찰하였다. 결과를 도 2 에 나타낸다. 그 결과, 대부분의 세포가 SOX17 단백질을 발현하였다. 상기 연구로부터, CHIR99021 및 B-27 보충제를 첨가한 DMEM/F12 배지에서 2 일 동안, 추가로 액티빈 A 및 CHIR99021 을 첨가한 DMEM/F12 배지에서 2 일 동안 배양함으로써, 피더 세포 및 혈청을 사용하지 않고 내배엽 세포로의 분화가 효율적으로 유도될 수 있다는 것이 명백해졌다.

실시예 1 (2):

단계 (2) 에서의 CHIR99021 이외의 GSK3 저해제 (BIO) 에 의한 내배엽 유도를 연구하였다.

인간 iPS 세포의 파종 1 일 후에, CHIR99021 (3 μM) 및 2% B-27 보충제 (GIBCO) 를 포함하는 DMEM/F12 배지와 배지를 교환하고, 2 일 동안 배양했다.

이후, 하나는 GSK3 저해제로서 CHIR99021 (3 μM) 및 액티빈 A (100 ng/㎖) 및 2% B-27 보충제 (GIBCO) 를 포함하는 DMEM/F12 배지와 교환하고, 배양을 계속 했다 (도 3 에서는 "액티빈 A + CHIR99021" 로 표기).

다른 하나는 GSK3 저해제로서 BIO (0.5 μM) 및 액티빈 A (100 ng/㎖) 및 2% B-27 보충제 (GIBCO) 를 포함하는 DMEM/F12 배지와 교환하고, 배양을 계속 했다 (도 3 에서는 "액티빈 A + BIO" 로 표기).

인간 iPS 세포 배양시의 SOX17 의 유전자 발현량을 경시적으로 측정하였다. 발현 분석의 결과를 도 3 에 나타낸다. CHIR99021 또는 BIO 중 어느 것을 이용해도, 배양 제 4 일부터 SOX17 의 발현량이 현저하게 증가하고, 유사한 발현 패턴이 관찰되었다. 이 결과로부터 심지어 CHIR99021 이외의 GSK3 저해제를 이용해도 내배엽이 유도될 수 있다는 것이 명백해졌다.

실시예 2:

내배엽 세포의 췌호르몬-생성 세포로의 분화 유도 [단계 (4) ~ (6)]

내배엽 세포로 분화된 세포로부터 세포 덩어리를 형성시키고, 그 후 추가로 췌호르몬-생성 세포의 선구 세포, 이후 췌호르몬-생성 세포로 분화 유도하였다.

100 mm 디쉬에서 분화 유도한 사용된 내배엽 세포를 Accutase (Invitrogen) (상품명) 을 이용해 단일 세포를 형성할 때까지 해리시켰다. 이후, 배지에 분산된 내배엽 세포를 96-웰 타원형 플레이트 (SUMITOMO BAKELITE) 에서 웰 당 2×10⁴ 세포의 밀도로 파종하고, 1 일 동안 37 ℃, 5% CO₂ 에서 배양하여, 세포 덩어리를 형성하였다. 분산 및 파종을 위한 배지로서, 1% B-27 보충제를 포함하는 개선된 MEM 아연 옵션 배지를 사용했다. 내배엽 세포 파종 1 일 이후, 도르소모르핀 (1 μM), 레티노산 (2 μM), SB431542 (10 μM) 및 bFGF (50 ng/㎖) 를 첨가하고 1% B-27 보충제를 포함하는 개선된 MEM 아연 옵션 배지와 배지를 교환하고, 37 ℃, 5% CO₂ 의 조건 하에서 8 일 동안 배양하였다. 배지 교환은 제 4 일에 수행하였다. 8 일 동안 배양한 후, 1% B-27 보충제를 포함하는 개선된 MEM 아연 옵션 배지와 배지를 교환하고 세포를 추가로 배양하였다. 이후, 배지 교환을 3 일 ~ 4 일 마다 수행하였다.

내배엽 파종 1 일 후에, 도르소모르핀, 레티노산, SB431542 및 bFGF 의 조합으로 세포를 8 일 동안 배양하고, 1% B-27 보충제를 포함하는 개선된 MEM 아연 옵션 배지와 배지를 교환하고 배양을 계속하였다. 이때의 인슐린 발현 분석 결과를 도 4 에 나타낸다. 1% B-27 보충제를 포함하는 개선된 MEM 아연 옵션 배지와 배지를 교환한 이후 배양 제 13 일의 시점에서 인슐린 발현은 거의 관찰되지 않았지만, 배양 15 일 이후부터 급격하게 증가했다.

비교예로서, 내배엽 세포를 파종하고, 1 일 후에 도르소모르핀, 레티노산 및 SB431542 의 조합물을 이용해 세포를 8 일 동안 배양하고, 1% B-27 보충제를 포함하는 개선된 MEM 아연 옵션 배지와 배지를 교환하고, 세포를 추가로 배양하였다. 배양 제 19 일의 발현 분석 결과를 도 5 에 나타낸다. 인슐린 발현은 도르소모르핀, 레티노산 및 SB431542 의 조합물을 이용하여 배양했을 경우보다, 도르소모르핀, 레티노산, SB431542 및 bFGF의 조합물을 사용하여 배양했을 때 배양 제 19 일에 더 높은 값을 나타냈다.

이후, 인슐린 및 글루카곤의 단백질의 발현을 시험하기 위해, 항-인슐린 항체를 사용한 면역 형광 염색을 수행했다. 내배엽 세포를 파종한 1 일 후에, 도르소모르핀, 레티노산, SB431542 및 bFGF 를 첨가하고, 세포를 8 일 동안 배양하였다. 이후, 배지는 Matrigel (Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.) 였고, 1 일 동안 37 ℃, 5 % CO₂ 에서 배양하였다. 사용된 100 mm 디쉬는 3 시간 이상 동안 실온에서, 무혈청 DMEM/F12 배지 (Invitrogen) 를 이용해 40 배 희석된 BD Matrigel 로 코팅된 것이었다 (도 7 에 "Matrigel" 로 표기).

분산 및 파종을 위한 배지로서는 10 μM Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 가 첨가된 영장류 ES 세포 (ReproCELL Inc.) 를 위한 배지였다. 파종 1 일 이후, GSK3β 저해제 CHIR99021 (3 μM) 및 2 % B-27 보충제 (GIBCO) 를 함유하는 DMEM/F12 배지와 배지를 교환하고, 2 일 동안 배양하였다. 이후, 액티빈 A (50 ng/㎖) 및 CHIR99021 (1 μM) 을 함유하는 DMEM/F12 배지와 배지를 교환하고, 2 일 동안 배양하였다.

내배엽 세포로 분화된 세포로부터 실시예 2 에서와 동일한 방식으로 세포 덩어리가 형성되었고, 그 후 추가로 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포, 이후 췌호르몬-생성 세포로의 분화를 유도하였다.

실시예 2 에서와 동일한 방식으로, 내배엽 세포 파종 1 일 이후에 세포를 도르소모르핀, 레티노산, SB431542 및 bFGF 의 조합물로 8 일 동안 배양하고, 1% B-27 을 포함하는 개선된 MEM 아연 옵션 배지와 배지를 교환하여, 분화를 유도하고, 다양한 분화 마커의 경시적 발현 분석을 수행하였다. 발현 분석 결과를 도 7 에 나타냈다.

내배엽 마커인 SOX17 의 발현은 분화에 따라 현저하게 감소하였고, 췌장 전구 세포 마커 (PDX1) 및 췌호르몬-생성 세포의 전구 세포 마커 (NGN3) 의 발현은 배양 17 일까지 점차 증가하였다. 배양 제 17 일 이후부터 인슐린 발현이 크게 증가하였다. 상기 다양한 분화 마커 발현의 경시적 변화는 1 % B-27 보충제를 포함하는 개선된 MEM 아연 옵션 배지와 교환되고 8 일 동안 배양되는 사이에 거의 동일하였다. 배양 이후, 4% 파라-포름알데히드를 이용해 3 시간 동안 4 ℃ 에서 세포를 고정하였고, 배양된 세포를 OCT 화합물 (Tissue-tek) 에 포매하여, 두께 10 ㎛ 의 동결 절편을 제조하였다. 세포를 연속하여 1차 항체로서 항-인슐린 항체 (A0564, DAKO) 또는 항-글루카곤 항체 (G2654, SIGMA) 와 반응시킨 후, 2 차 항체로서 Alexa568-표지 2 차 항체 (Invitrogen) 또는 Alexa488-표지 2 차 항체 (Invitrogen) 와 반응시키고, 세포 핵을 Hoechst 33342 를 이용해 염색하고, 형광 현미경으로 관찰했다. 면역 형광 염색의 결과를 도 6 에 나타낸다. 인슐린을 발현하는 세포 다수가 구형 내부에서 발견되었고, 또한 글루카곤을 발현하는 세포가 일부 발견되었다.

실시예 3: 인간 iPS 세포의 췌호르몬-생성 세포로의 분화 유도

[단계 (1) ~ (6); BD Matrigel 또는 피브로넥틴을 사용한 내배엽 세포로의 분화 유도 및 췌호르몬-생성 세포로의 분화 유도]

먼저, 세포 덩어리 상태로 유지되는 인간 iPS 세포를 실시예 1 에서와 동일한 방식으로 이것이 단일 세포를 형성할 때까지 해리시켰다.

이후, 배지에 분산시킨 인간 iPS 세포를 피브로넥틴 (Invitrogen) 으로 코팅된 100 mm 디쉬 하나 당 60×10⁴ 세포의 밀도로 파종하고, 37 ℃, 5% CO₂ 하에서 1 일 동안 배양했다. 100 mm 디쉬는 실온에서 3 시간 이상 동안 무혈청 DMEM/F12 배지 (Invitrogen) 를 이용해 40 배 희석된 피브로넥틴으로 코팅된 것이었다 (도 7 에서는 "피브로넥틴" 으로 표기).

BD Matrigel 을 기질로서 사용하여 유도된 BD 내배엽 세포 및 피브로넥틴을 기질로서 사용하여 유도된 내배엽 세포로 코팅된 100 mm 디쉬 하나 당 15×10⁴ 세포의 밀도로, 배지에 분산시킨 인간 iPS 세포를 파종하였다. BD Matrigel 은 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 마우스 육종 세포로부터 추출된 기초 절편 생성물이다. 다른 한편으로는, 본 실시예에서 사용된 피브로넥틴은 친화성 크로마토그래피에 의해 인간 혈장으로부터 추출하였다. 이로부터 심지어 피브로넥틴을 사용했을 경우에도, BD Matrigel (실시예 1 및 2) 의 경우와 같은 췌호르몬-생성 세포로의 분화가 유도될 수 있다는 것이 명백해졌다.

상기 실시예 1 ~ 3 의 연구에 의해, 구형이 내배엽 세포로부터 형성되고, 이 세포가 도르소모르핀, 레티노산, SB431542 및 bFGF 를 첨가한 1% B-27 보충제를 포함하는 개선된 MEM 아연 옵션 배지로 8일간 배양된 후, 1% B-27 보충제를 포함하는 개선된 MEM 아연 옵션 배지와 배지를 교환하고 세포를 배양하는, 도 8 에 나타낸 췌장 분화 유도 시스템을 사용하여 췌호르몬-생성 세포로의 분화가 유도될 수 있다는 것이 명백해졌다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 췌호르몬-생성 세포는 다른 방법에 의해 제조된 췌호르몬-생성 세포보다 인슐린 생성량이 더 우수하다.

본 발명의 제조법에 따르면, 줄기 세포로부터 보다 췌발생을 모방한 형태의 췌호르몬-생성 세포를 제조 할 수 있다. 또한, 본 발명의 세포는 당뇨병 등의 비정상적 췌호르몬-생성 및/또는 분비에 기인하는 질환의 예방 및/또는 치료에 유용한 화합물을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 세포는 상기 질환을 치료하기 위한 세포 요법에 사용될 수 있고 삼차원적 구조를 유지하므로, 이는 심지어 종래의 제조 방법에 따라 얻어지는 췌호르몬-생성 세포와 비교해도 세포 요법을 위한 적용에 더 적합하다.

본 출원은 일본에 출원된 특허 출원 제 2010-178523 호를 기초로 하고 있고, 그 내용은 본원에서 전문 참조 인용된다.

Claims

하기 단계 (1) - (6) 에 유도 만능 줄기 세포 (iPS 세포) 또는 배아 줄기 세포 (ES 세포)를 적용하는 것을 포함하는, 췌호르몬-생성 세포의 제조 방법:
(1) Rho 키나아제 저해제를 포함하는 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계
(2) 상기 언급된 단계 (1) 에서 얻어진 세포를 GSK3 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계
(3) 상기 언급된 단계 (2) 에서 얻어진 세포를 GSK3 저해제 및 액티빈 수용체형 키나아제-4, 7 의 활성화제를 포함하는 배지로 배양하는 단계
(4) 상기 언급된 단계 (3) 에서 얻어진 세포로부터 세포 덩어리를 형성하고, 그 세포 덩어리를 배지 중 현탁 상태로 배양하는 단계
(5) 상기 언급된 단계 (4) 에서 얻어진 세포를 (i) 레티노산 수용체 아고니스트, (ii) AMP-활성화 단백질 키나아제의 저해제, 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제, 또는 AMP-활성화 단백질 키나아제 및 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제, (iii) 액티빈 수용체형 키나아제-4,5,7 의 저해제 및 (iv) 염기성 섬유아세포 성장 인자를 포함하는 배지로 배양하는 단계
(6) 상기 언급된 단계 (5) 에서 얻어진 세포를 배양하는 단계.
제 1 항에 있어서, 단계 (3) 의 액티빈 수용체형 키나아제-4,7 의 활성화제가 액티빈인 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 (1) 의 Rho 키나아제 저해제가 (+)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산카르복사미드 디히드로클로라이드인 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 (2) 및 (3) 의 GSK3 저해제가 (i) 6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]니코티노니트릴, (ii) (2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심 또는 (iii) 6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]니코티노니트릴 및 (2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심인 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 (5) 의 레티노산 수용체 아고니스트가 레티노산인 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 (5) 의 AMP-활성화 단백질 키나아제의 저해제, 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제, 또는 AMP-활성화 단백질 키나아제 및 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제가 도르소모르핀인 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 (5) 의 액티빈 수용체형 키나아제-4,5,7 의 저해제가 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드인 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
단계 (3) 의 액티빈 수용체형 키나아제-4,7 의 활성화제가 액티빈이고,
단계 (1) 의 Rho 키나아제 저해제가 (+)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산카르복사미드 디히드로클로라이드이고,
단계 (2) 및 (3) 의 GSK3 저해제가 (i) 6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]니코티노니트릴, (ii) (2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심 또는 (iii) 6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]니코티노니트릴 및 (2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심이고,
단계 (5) 의 레티노산 수용체 아고니스트가 레티노산이고,
단계 (5) 의 AMP-활성화 단백질 키나아제의 저해제, 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제, 또는 AMP-활성화 단백질 키나아제 및 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제가 도르소모르핀이고,
단계 (5) 의 액티빈 수용체형 키나아제-4,5,7 의 저해제가 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드인 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 (1) - (6) 이 피더 세포 (feeder cell) 를 실질적으로 이용하지 않는 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 (1) - (6) 의 배지가 혈청을 실질적으로 포함하지 않는 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 췌호르몬-생성 세포가 인슐린-생성 세포, 글루카곤-생성 세포, 소마토스타틴-생성 세포, 췌장 폴리펩티드(PP)-생성 세포 및 그렐린-생성 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 제조 방법.
내배엽 세포를 하기 단계 (4') 및 (5') 에 적용하는 것을 포함하는 췌호르몬-생성 세포의 제조 방법:
(4') 내배엽 세포로부터 세포 덩어리를 형성하고, 세포 덩어리를 배지 중 현탁 상태로 배양하는 단계
(5') 상기 언급된 단계 (4') 에서 얻어진 세포를, (i) 레티노산 수용체 아고니스트, (ii) AMP-활성화 단백질 키나아제의 저해제, 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제, 또는 AMP-활성화 단백질 키나아제 및 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제, (iii) 액티빈 수용체형 키나아제-4,5,7 의 저해제 및 (iv) 염기성 섬유아세포 성장 인자를 포함하는 배지로 배양하는 단계.
하기 단계 (1) - (6) 에 의해 얻어진 세포를 사용하는 것을 포함하는, 당뇨병 치료 약물의 스크리닝 방법:
(1) 유도 만능 줄기 세포 (iPS 세포) 또는 배아 줄기 세포 (ES 세포)를, Rho 키나아제 저해제를 포함하는 배지로 배양하는 단계
(2) 상기 언급된 단계 (1) 에서 얻어진 세포를, GSK3 저해제를 포함하는 배지로 배양하는 단계
(3) 상기 언급된 단계 (2) 에서 얻어진 세포를, GSK3 저해제 및 액티빈 수용체형 키나아제-4, 7 의 활성화제를 포함하는 배지로 배양하는 단계
(4) 상기 언급된 단계 (3) 에서 얻어진 세포로부터 세포 덩어리를 형성시키고, 그 세포 덩어리를 배지 중 현탁 상태로 배양하는 단계
(5) 상기 언급된 단계 (4) 에서 얻어진 세포를, (i) 레티노산 수용체 아고니스트, (ii) AMP-활성화 단백질 키나아제의 저해제, 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제, 또는 AMP-활성화 단백질 키나아제 및 액티빈 수용체형 키나아제-2,3,6 의 저해제, (iii) 액티빈 수용체형 키나아제-4,5,7 의 저해제 및 (iv) 염기성 섬유아세포 성장 인자를 포함하는 배지로 배양하는 단계
(6) 상기 언급된 단계 (5) 에서 얻어진 세포를 배양하는 단계.
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