JP6441080B2 - 単一ホルモンのインスリン陽性細胞へのヒト胚性幹細胞の分化 - Google Patents
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Description
本出願は、2011年12月22日に出願された、米国特許仮出願第61/579,351号の利益を主張するものであり、当該出願を、本明細書にその全容において、かつあらゆる目的について援用するものである。
本発明は、細胞分化の分野にある。より具体的には、本発明は、段階的分化の各工程で定義された条件を用いて、多能性幹細胞から分化した単一ホルモンのインスリン産生細胞を提供する。その集団において分化したインスリン産生細胞の10%以上は、単一ホルモンの膵臓β細胞に特徴的なマーカーを発現する。
幹細胞は、単一細胞レベルでの自己再生能及び分化能の両方によって定義される未分化細胞である。幹細胞は、自己再生前駆細胞、非再生性前駆細胞、及び最終分化細胞を含む子孫細胞を生成することができる。幹細胞はまた、複数の胚葉(内胚葉、中胚葉及び外胚葉)から様々な細胞系統の機能性細胞へとインビトロで分化する能力を特徴とする。幹細胞はまた、移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞に注入後、実質的に(全てではないとしても)ほとんどの組織に寄与する。
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原(SSEA)3及び4、並びにTra−1−60及びTra−1−81と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーのうちの1つ以上を発現している(Thomsonら、Science 282:1145,1998)。インビトロでの多能性幹細胞の分化は、SSEA−4、Tra−1−60、及びTra−1−81の発現の消失をもたらす。未分化多能性幹細胞は、一般にアルカリホスファターゼ活性を有し、これは、製造業者(米国カリフォルニア州Vector Laboratories)により説明されているように、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定した後、基質としてVector Redを使用して現像することにより検出することができる。未分化の多能性幹細胞はまた、RT−PCRにより検出されるように、一般にOCT4及びTERTも発現する。
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期(必ずしもではないが、通常は妊娠約10〜12週よりも前)に採取した前胚性組織(例えば胚盤胞など)、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例は、ヒト胚性幹細胞(hESCs)又はヒト胚生殖細胞の樹立株であり、例えば、ヒト胚性幹細胞株H1、H7、及びH9(米国ウィスコンシン州MadisonのWiCell Research Institute)などである。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。また、OCT4、Nanog、Sox2、KLF4、及びZFP42など多数の多能性に関係する転写因子の強制発現を用いて、成体体細胞から誘導することができる誘導性多能性細胞(IPS)又は再プログラム化された多能性細胞も好適である(Annu Rev Genomics Hum Genet,2011,12:165〜185)。本発明の方法に使用されるヒト胚性幹細胞は、Thomsonらによって記述されたように調製してもよい(米国特許第5,843,780号;Science,1998,282:1145;Curr.Top.Dev.Biol.,1998,38:133;Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1995:92:7844)。
多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。多能性幹細胞のマーカーとして、例えば、以下のもの、すなわち、ABCG2、cripto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA−3、SSEA−4、Tra 1−60、Tra 1−81の1つ以上の発現が挙げられる。
a)グルコース、TGF−Bリガンド、及びWNT活性化剤を含む培地中で多能性細胞を培養する工程を含む、未分化ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉(DE)細胞の生成。
b)グルコース、ビタミンC、及びFGFリガンドを含む培地中でDE細胞を培養する工程を含む、腸管細胞へのDE細胞の分化。
c)PDX−1及びSOX2を発現する後方前腸内胚葉細胞への腸管細胞の分化。この分化は、shh阻害剤、BMP阻害剤、TGF−Bリガンド、FGFリガンド、レチノイン酸、ビタミンC、及びPKC活性化剤の存在下で腸管細胞を培養することによって達成される。
d)後方前腸細胞を、PDX−1及びNKX6.1を発現し、かつ後方前腸細胞と比較して低いレベルのSOX2を発現する膵臓前腸細胞に分化する工程。この分化は、shh阻害剤、BMP阻害剤、低用量のレチノイン酸、ビタミンC、及びPKC活性化剤の存在下で後方前腸細胞を培養することによって達成される。
e)膵臓前腸細胞を、PDX−1及び、膵臓前腸細胞と比較して高いレベルのNKX6.1並びに低いレベルのSOX2を発現する膵臓内胚葉細胞に分化する工程。この分化は、shh阻害剤、TGF−B阻害剤、低用量のレチノイン酸、及びビタミンCを追補した倍地中で膵臓前腸細胞を培養することにより達成される。
f)膵臓内胚葉細胞を、膵内分泌前駆細胞に分化し、続いて、単一ホルモンの膵内分泌細胞に分化する工程。この分化は、shh阻害剤、低用量のレチノイン酸、及びビタミンCを追補した倍地中で膵臓内胚葉細胞を培養することにより達成される。
ウシ胎児血清の非存在下での、膵内分泌前駆細胞への細胞株H1のヒト胚性幹細胞の分化−BMP/TGF−B経路の調節は膵臓内胚葉集団の産生の改善及びSOX2+集団の百分率の低下をもたらす。
この実施例は、CDX2及びSOX2の低レベルの発現を有する一方でPDX−1及びNKX6.1の非常に高い発現レベルを有する膵臓内胚葉培養物が生成され得ることを示すために実施した。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−3日):ステージ1の培地(0.1%の無脂肪酸BSA(カタログ番号68700、米国アイオワ州のProliant)、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム(カタログ番号S3187、米国ミズーリ州のSigmaAldrich)、1X GlutaMax(商標)(カタログ番号35050−079、Invitrogen)、5mMのD−グルコース(カタログ番号G8769、米国ミズーリ州のSigmaAldrich)が追補された、100ng/mLのGDF8(米国ミネソタ州R&D Systems)及び1μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤、14−Prop−2−エン−1−イル−3,5,7,14,17,23,27−ヘプタアザテトラシクロ[19.3.1.1〜2,6〜.1〜8,12〜]ヘプタコサ−1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23−ノナエン−16−オン、米国特許出願第12/494,789号、参照によりその全容が本明細書に援用される)を含有するMCDB−131培地(カタログ番号10372−019、米国カリフォルニア州のInvitrogen)中で、細胞を1日培養した。次いで、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF8、及び100nMのMCX化合物を追補したMCDB−131倍地中で細胞を1日培養した。次いで、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMのD−グルコース、及び100ng/mLのGDF8を追補したMCDB−131倍地中で細胞を1日培養した。
b.ステージ2(原腸管−2日):ステージ1の細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMのD−グルコース、及び25ng/mLのFGF7を追補したMCDB−131倍地で2日間処理した。
c.ステージ3(前腸−2日):ステージ2の細胞を、ステージ3の培地(ITS−X(Invitrogen)の1:200希釈液)、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、25ng/mLのFGF7、10ng/mLのアクチビン−A(R & D systems)、0.25μMのSANT−1(shh阻害剤、SigmaAldrich)、1μMのレチノイン酸(RA)(SigmaAldrich)、及び200nMのTPB(PKC活性化剤、カタログ番号565740;米国ニュージャージー州のEMD)を追補した、100nMのLDN−193189(BMP受容体阻害剤;カタログ番号04−0019;米国カリフォルニア州のStemgent)を含有するMCDB−131倍地)中で、1日培養した。次いで、それらの細胞を、10nMのLDN−193189を追補したステージ3の培地中で更に1日培養した。
d.ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−2日):ステージ3の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1XのGlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50nMのRA、200nMのTPB、及び50nMのLDN−193189を追補したMCDB−131倍地中で2日培養した。
e.ステージ5(膵臓内胚葉−2〜7日):ステージ4の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1XのGlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、及び50nMのRAを追補したMCDB−131倍地中で2〜7日培養した。
BMPの阻害及びPKC活性化がS3〜S4でSOX2の発現に与える影響
本実施例で概説したプロトコルは、BMPの阻害、FGF7の添加、及びPKCの活性化がS3〜S4でのSOX2の発現に与える影響を明らかにするために行った。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−3日):DEの開始の前に、培養物を洗浄し、不完全なPBS(Mg又はCaなし)で30秒間インキュベートし、次いで、ステージ1の培地を加えた。MATRIGEL(商標)被覆皿上で単一細胞として培養したヒト胚性幹細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF8、1.5μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤)を追補したMCDB−131培地で1日処理した。次いで、2日目〜3日目にかけて、細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのグルコース、及び100ng/mLのGDF8を追補したMCDB−131倍地で処理した。
b.ステージ2(原腸管−3日):ステージ1の細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、及び50ng/mLのFGF7を追補したMCDB−131倍地で3日間処理した。
c.ステージ3(前腸−3日):ステージ2の細胞を、50ng/mLのFGF7、50nM又は200nMのLDN−193189、及び/又は200nMのTPBの存在下若しくは非存在下で、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、20ng/mLのアクチビン−A、2μMのRAを追補したMCDB−131倍地で処理した。下の表IIに記載した組み合わせを用いた培地にて細胞を3日間インキュベートした。
続いて内分泌マーカーを誘導するには、前腸ステージでのBMPの早期阻害が必要である。
本実施例は、続いて内分泌マーカーを誘導するにはS3でBMPシグナル伝達を早期に阻害する必要があることを示す。しかし、ステージ3でのBMPの持続的な阻害もまた、SOX2の強発現を結果としてもたらす。内分泌マーカーの高発現及びSOX2の低発現の両方を得るためには、SXO2及びCDX2の低発現を有する一方でプロ膵内分泌マーカーを誘導するBMP阻害の勾配が必要である。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−4日):DEの開始の前に、細胞を洗浄し、不完全なPBS(Mg又はCaなし)で30秒間インキュベートし、次いで、S1の培地にてインキュベートした。MATRIGEL(商標)被覆皿上で単一細胞として培養したヒト胚性幹細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF8、1.5μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤)を追補したMCDB−131培地で1日処理した。次いで、細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのグルコース、及び100ng/mLのGDF8を追補したMCDB−131倍地で2日間(2〜4日目)処理した。
b.ステージ2(原腸管−3日):ステージ1の細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、及び50ng/mLのFGF7を追補したMCDB−131倍地で3日間処理した。
c.ステージ3(前腸−3日):ステージ2の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、20ng/mLのアクチビン−A、2μMのRA、50ng/mLのFGF7、100nMのLDN−193189(1日目のみ又はステージ3の期間中)、及び200nMのTPBを追補したMCDB−131倍地で処理した。いくつかの培地では、LDN−193189をステージ3から除去した。
d.ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−3日):ステージ3の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、100nMのTPB、200nMのLDN−193189、2μMのALk5阻害剤、及び100nMのCYP26A阻害剤を追補したMCDB−131倍地で3日間処理した。
e.ステージ5(膵臓内胚葉/内分泌−4日):ステージ4の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、200nMのLDN−193189、及び2μMのALk5阻害剤を追補したMCDB−131倍地で4日間処理した。
ステージ3の1日目でのBMPシグナル伝達の阻害は、ステージ4で膵臓前駆細胞を生成するために十分であり、一方、ステージ3の最終日でのBMPシグナル伝達の阻害は、内分泌マーカーの発現の有意な低下をもたらす。
本実施例は、ステージ3でのBMPシグナル伝達の早期阻害が、膵内分泌前駆細胞マーカーの誘導を可能にし、一方、ステージ3の後期でのBMPシグナル伝達の阻害が、ステージ4での内分泌前駆細胞マーカーの発現レベルを有意に低下させることを示している。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−4日):DEの開始の前に、培養物を洗浄し、不完全なPBS(Mg又はCaなし)で30秒間インキュベートし、次いで、ステージ1の培地を加えた。MATRIGEL(商標)被覆皿上で単一細胞として培養したヒト胚性幹細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF8、及び1.5μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤)を追補したMCDB−131培地で1日処理した。次いで、細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのグルコース、及び100ng/mLのGDF8を追補したMCDB−131倍地で3日間処理した。
b.ステージ2(原腸管−3日):ステージ1の細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、及び50ng/mLのFGF7を追補したMCDB−131倍地で3日間処理した。
c.ステージ3(前腸−3日):ステージ2の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50ng/mLのFGF7、2μMのRA、及び下の表IIIに記載した混合物を追補したMCDB−131倍地で3日間処理した。
膵臓前腸ステージ(ステージ4)でのBMP阻害の最適用量
前述の実施例では、ステージ3でのBMP阻害の最適な期間について説明した。本実施例では、S4の培地でのBMP阻害剤の最適な用量を特定する。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−4日):DEの開始の前に、培養物を洗浄し、不完全なPBS(Mg又はCaなし)で30秒間インキュベートし、次いで、ステージ1の培地を加えた。MATRIGEL(商標)被覆皿上で単一細胞として培養したヒト胚性幹細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF8、1μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤)を追補したMCDB−131培地で1日処理した。次いで、2日目〜4日目にかけて、細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのグルコース、及び100ng/mLのGDF8を追補したMCDB−131倍地で処理した。
b.ステージ2(原腸管−3日):ステージ1の細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、及び50ng/mLのFGF7を追補したMCDB−131倍地で3日間処理した。
c.ステージ3(前腸−4日):ステージ2の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50ng/mLのFGF7、2μMのRA、20ng/mLのアクチビン−A、100nMのLDN−193189、及び100nMのTPBを追補したMCDB−131倍地で1日処理した。次いで、細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50ng/mLのFGF7、2μMのRA、20ng/mLのアクチビン−A、及び100nMのTPBを追補したMCDB−131倍地中で3日間処理した。
d.ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−4日):ステージ3の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、200nMのLDN−193189、2μMのALk5阻害剤、100nMのCYP26A阻害剤、及び表IV(下記)に記載した濃度のLDN−193189(LDN-193189-193189)を追補したMCDB−131倍地で、ステージ4の1〜4日目にかけて処理した。
前腸ステージ(ステージ3)でのBMP阻害の最適用量
本実施例は、ステージ3でのBMP阻害の最適用量、及びその後のステージ6での内分泌マーカーへの影響を特定する。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−4日):DEの開始の前に、培養物を洗浄し、不完全なPBS(Mg又はCaなし)で30秒間インキュベートし、次いで、ステージ1の培地を加えた。MATRIGEL(商標)被覆皿上で単一細胞として培養したヒト胚性幹細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF8、及び1.5μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤)を追補したMCDB−131培地で1日処理した。次いで、2日目〜4日目にかけて、細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのグルコース、及び100ng/mLのGDF8を追補したMCDB−131倍地で処理した。
b.ステージ2(原腸管−3日):ステージ1の細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、及び50ng/mLのFGF7を追補したMCDB−131倍地で3日間処理した。
c.ステージ3(前腸−3日):ステージ3の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50ng/mLのFGF7、2μMのRA、20ng/mLのアクチビン−A、100nMのTPB、及び10〜50nMのLDN−193189を追補したMCDB−131倍地で1日処理した。次いで、細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50ng/mLのFGF7、2μMのRA、20ng/mLのアクチビン−A、及び100nMのTPBを追補したMCDB−131倍地で2日間処理した。
d.ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−3日):ステージ3の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、20nMのLDN−193189、2μMのALk5阻害剤、100nMのCYP26A阻害剤、及び100nMのTPBを追補したMCDB−131倍地で3日間処理した。
e.ステージ5(膵臓内胚葉/内分泌前駆細胞−3日):ステージ4の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、+/−25nMのLDN−193189、及び/又は2μMのALk5阻害剤を追補したMCDB−131倍地で3日間処理した。
f.ステージ6(膵内内分泌ホルモン生成−3日):ステージ5の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、及び2%の無脂肪酸BSAを追補したMCDB−131倍地で3日間処理した。
S3(前腸ステージ)でのBMP阻害の最適な時間枠
本実施例は、後のステージでの内分泌の誘導を保持しかつSOX2の発現を減少させながら、BMPシグナル伝達を阻害するための、ステージ3における最適な時間枠を特定する。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−4日):DEの開始の前に、培養物を洗浄し、不完全なPBS(Mg又はCaなし)で30秒間インキュベートし、次いで、ステージ1の培地を加えた。MATRIGEL(商標)被覆皿上で単一細胞として培養したヒト胚性幹細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF8、及び1.5μMのMCX化合物を追補したMCDB−131培地で1日処理した。次いで、2日目〜4日目にかけて、細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのグルコース、及び100ng/mLのGDF8を追補したMCDB−131倍地で処理した。
b.ステージ2(原腸管−3日):ステージ1の細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、及び50ng/mLのFGF7を追補したMCDB−131倍地で3日間処理した。
c.ステージ3(前腸−3日):ステージ2の細胞を、ステージ3の最初の2時間のみ又は6時間のみ又は24時間のみ、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50ng/mLのFGF7、2μMのRA、20ng/mLのアクチビン−A、及び100nMのTPBを追補した、100nMのLDN−193189を含有するMCDB−131倍地で処理した。
d.ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−3日):ステージ3の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、25nMのLDN−193189、2μMのALk5阻害剤、100nMのCYP26A阻害剤、及び100nMのTPBを追補したMCDB−131倍地で3日間処理した。
e.ステージ5(膵臓内胚葉/内分泌前駆細胞−3日):ステージ4の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、及び2μMのALk5阻害剤を追補したMCDB−131倍地で3日間処理した。
ステージ3(前腸段階)及びステージ4(膵臓前腸前駆細胞ステージ)の最適な期間
本実施例は、膵内分泌系統の細胞集団への多能性細胞の段階的分化におけるS3及びS4の最適な期間を決定するために実施した。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−4日):DEの開始の前に、培養物を洗浄し、不完全なPBS(Mg又はCaなし)で30秒間インキュベートし、次いで、ステージ1の培地を加えた。MATRIGEL(商標)被覆皿上で単一細胞として培養したヒト胚性幹細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF8、1.5μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤)を追補したMCDB−131培地で1日処理した。次いで、2日目〜4日目にかけて、細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのグルコース、及び100ng/mLのGDF8を追補したMCDB−131倍地で処理した。
b.ステージ2(原腸管−2日):ステージ1の細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、及び50ng/mLのFGF7を追補したMCDB−131倍地で2日間処理した。
c.ステージ3(前腸−2〜3日):ステージ2の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50ng/mLのFGF7、2μMのRA、20ng/mLのアクチビン−A、100nMのTPBを追補した、100nMのLDN−193189を含有するMCDB−131倍地で1日処理した。次いで、細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50ng/mLのFGF7、2μMのRA、20ng/mLのアクチビン−A、及び100nMのTPBを追補したMCDB−131倍地で処理した。
d.ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−2〜3日):ステージ3の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、25nMのLDN−193189、100nMのCYP26A阻害剤、及び100nMのTPBを追補したMCDB−131倍地で2〜3日間処理した。
e.ステージ5(膵臓内胚葉/内分泌前駆細胞−2日):ステージ4の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、及び1μMのALk5阻害剤を追補したMCDB−131倍地で2日間処理した。
f.ステージ6(膵内分泌前駆細胞/ホルモン−2日):ステージ5の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、及び2%の無脂肪酸BSAを追補したMCDB−131倍地で2日間処理した。
高グルコース及びB27サプリメントの存在下での、BMPの阻害への長時間の曝露は、S3及びS4のSOX2の発現を有意に増加させる。
このプロトコルは、ホルモン産生細胞への多能性細胞の段階的分化の間にS3及びS4でのSOX2の発現に影響を与える因子を決定するために行った。
a.未分化細胞を、0.2% FBS、100ng/mLのアクチビンA、20ng/mLのWNT−3aが追補されたRPMI培地(Invitrogen)中で1日培養した。次いで、細胞を、0.5% FBS、100ng/mLのアクチビンAが追補されたRPMI培地で更に2日間処理した(ステージ1)。
b.ステージ1の細胞を、2%FBS、50ng/mLのFGF7を添加したDMEM/F12培地で3日間処理した(ステージ2)。
c.ステージ2の細胞を、1%のB27、0.25%のSANT−1、2μMのRA、100ng/mLのノギン(米国ミネソタ州のR & D systems)が追補されたDMEM−高グルコース培地中で4日間培養した(ステージ3)。
d.ステージ3の細胞を、1%のB27、100ng/mLのノギン、1μMのALK5阻害剤II(米国カリフォルニア州のAxxora)、及び50nMのTPBが追補されたDMEM−高グルコース培地にて4日間処理した(ステージ4)。
これまでに公開されたプロトコルは、ステージ3〜4で有意な数のSOX2+の集団の形成をもたらす。
Kroonらは、ヒト胚性幹細胞からの膵臓内胚葉系統の細胞を調製するためのプロトコルを公開している(Nature Biotech 2008,26:443〜452、これ以降においては「Kroon」)。本明細書において提供される実施例においては、ヒト胚性幹細胞は、Kroonのプロトコルに従って分化させ、分化の異なる段階に特徴的なマーカーの発現についてアッセイした。
a)未分化細胞を、0.2%のFBS、100ng/mLのアクチビンA、20ng/mLのWNT−3aが追補されたRPMI培地に1日曝露した後、0.5%のFBS、100ng/mLのアクチビンAが追補されたRPMI培地にて更に2日間処理した(ステージ1)。
b)ステージ1の細胞を、2%のFBS、50ng/mLのFGF7を添加したRPMI培地で3日間処理した(ステージ2)。
c)ステージ2の細胞を、1%のB27、0.25μMのSANT−1、2μMのRA、50ng/mLのノギン(ミネソタ州のR & D systems)が追補されたDMEM−高グルコース培地にて3日間処理した(ステージ3)。
d)ステージ3の細胞を、1%のB27が追補されたDMEM−高グルコース培地中で3日間培養した(ステージ4)。
e)ステージ4の細胞をウェルから掻き取り、1%のB27が追補されたDMEM−高グルコース培地中にクラスターとして2日間再懸濁した。
アスコルビン酸の添加は、多ホルモン細胞数を有意に減少させ、単一ホルモンのインスリン陽性細胞数を同時に増加させた。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−3日):DEの開始の前に、培養物を洗浄し、不完全なPBS(Mg又はCaなし)で30秒間インキュベートし、次いで、ステージ1の培地を加えた。MATRIGEL(商標)被覆皿上で単一細胞として培養したヒト胚性幹細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF8、及び1μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤)を追補したMCDB−131培地で1日処理した。次いで、細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMのグルコース、100ng/mLのGDF8、及び100nMのMCX化合物が追補されたMCDB−131倍地で2日目に処理し、続いて、更に1日、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMのグルコース、及び100ng/mLのGDF8が追補されたMCDB−131倍地にて処理した。
b.ステージ2(原腸管−2日):ステージ1の細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMのD−グルコース、及び25ng/mLのFGF7を追補したMCDB−131倍地で2日間処理した。
c.ステージ3(前腸−2日):ステージ2の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、10ng/mLのアクチビン−A、25ng/mLのFGF7、0.25μMのSANT−1、1μMのRA、200nMのTPB(PKC活性剤)、100nMのLDN−193189(BMP受容体阻害剤)を追補したMCDB−131倍地で1日処理した。次いで、細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、10ng/mLのアクチビン−A、25ng/mLのFGF7、0.25μMのSANT−1、1μMのRA、200nMのTPB(PKC活性剤)、10nMのLDN−193189を追補したMCDB−131倍地で更に1日処理した。いくつかの培養物は、ステージ3の期間中、0.25mMのアスコルビン酸(カタログ番号A4544、Sigma、米国ミズーリ州)で処理した。
d.ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−2日):ステージ3の細胞を、0.25mMのアスコルビン酸あり又はなしで、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50nMのRA、200nMのTPB、50nMのLDN−193189を追補したMCDB−131倍地で2日間処理した。
e.ステージ5(膵臓内胚葉−2〜7日):ステージ4の細胞を、0.25mMのアスコルビン酸あり又はなしで、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50nMのRAを追補したMCDB−131倍地で2〜7日間処理した。
ステージ3でのアスコルビン酸の最適用量
本実施例は、単一ホルモン、PDX−1陽性、かつNKX6.1陽性のインスリン陽性細胞を生成するために使用するアスコルビン酸の最適用量を決定するために実行した。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−3日):DEの開始の前に、培養物を洗浄し、不完全なPBS(Mg又はCaなし)で30秒間インキュベートし、次いで、ステージ1の培地を加えた。MATRIGEL(商標)被覆皿上で単一細胞として培養したヒト胚性幹細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMのD−グルコース、及び100ng/mLのGDF8と1μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤)を追補したMCDB−131培地で1日処理した。次いで、細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMのグルコース、100ng/mLのGDF8、及び100nMのMCX化合物が追補されたMCDB−131倍地で2日目に処理し、続いて、更に1日、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMのグルコース、及び100ng/mLのGDF8が追補されたMCDB−131倍地にて処理した。
b.ステージ2(原腸管−2日):ステージ1の細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMのD−グルコースが追補されたMCDB−131倍地で、0.25mMのアスコルビン酸及び25ng/mLのFGF7あり又はなしで、2日間処理した。
c.ステージ3(前腸−2日):ステージ2の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、10ng/mLのアクチビンA、25ng/mLのFGF7、0.25μMのSANT−1、+/−0.25mMのアスコルビン酸、1μMのRA、及び200nMのTPB、並びに1日目については100nMのLDN−193189が追補されたMCDB−131倍地で処理し、続いて、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、10ng/mLのアクチビンA、25ng/mLのFGF7、0.25μMのSANT−1、+/−0.25mMのアスコルビン酸、1μMのRA、及び200nMのTPB、並びに更に1日は10nMのLDN−193189が追補されたMCDB−131倍地で処理した。
d.ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−2日):ステージ3の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50nMのRA、200nMのTPB、及び50nMのLDN−193189を追補したMCDB−131倍地にて、0.25mM〜1mMのアスコルビン酸の添加あり又はなしで、2日間処理した。
e.ステージ5(膵臓内胚葉−2〜9日):ステージ4の細胞を、0.25mMのアスコルビン酸の添加あり又はなしで、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、及び50nMのRAを追補したMCDB−131倍地で2〜9日間処理した。
レチノイン酸及びアスコルビン酸の組み合わせは、単一ホルモンのインスリン陽性細胞を生成するために必要である。
この実施例は、多能性細胞の分化中に単一ホルモンのインスリン陽性細胞を生成するための要件を明らかにするために実施した。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−3日):DEの開始の前に、培養物を洗浄し、不完全なPBS(Mg又はCaなし)で30秒間インキュベートし、次いで、ステージ1の培地を加えた。MATRIGEL(商標)被覆皿上で単一細胞として培養したヒト胚性幹細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF8、1μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤)を追補したMCDB−131培地で1日処理した。次いで、細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、重炭酸ナトリウム、GlutaMax(商標)、更に5mMのグルコース、100ng/mLのGDF8、及び100nMのMCX化合物が追補されたMCDB−131倍地で2日目に処理し、続いて、更に1日、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMのグルコース、及び100ng/mLのGDF8が追補されたMCDB−131倍地にて処理した。
b.ステージ2(原腸管−2日):細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMのD−グルコース、0.25mMのアスコルビン酸、及び25ng/mLのFGF7が追補されたMCDB−131倍地で2日間処理した。
c.ステージ3(前腸−2日):細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、10ng/mLのアクチビンA、25ng/mLのFGF7、0.25mMのアスコルビン酸、0.25μMのSANT−1、1μMのRA、200nMのTPB、及び1日目については100nMのLDN−193189が追補されたMCDB−131倍地で処理し、続いて、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、10ng/mLのアクチビンA、25ng/mLのFGF7、0.25mMのアスコルビン酸、0.25μMのSANT−1、1μMのRA、及び200nMのTPB、並びに更に1日については10nMのLDN−193189が追補されたMCDB−131倍地で処理した。
d.ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−2日):細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50nMのRA、200nMのTPB、50nMのLDN−193189、及び0.1mMのアスコルビン酸が追補されたMCDB−131倍地で2日間処理した。
e.ステージ5(膵臓内胚葉−3日):細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、及び2%の無脂肪酸BSAを追補したMCDB−131倍地にて、以下の培養条件で3日間処理した。
・+0.1mMのアスコルビン酸
・0.1mMのアスコルビン酸+50nMのRA
・0.1mMのアスコルビン酸+50nMのRA+0.25μMのSANT−1
・0.1mMのアスコルビン酸+50nMのRA+0.25μMのSANT−1+50nMのLDN−193189
・0.1mMのアスコルビン酸+50nMのRA+0.25μMのSANT−1+1μMのAlk5 inh
・0.1mMのアスコルビン酸+50nMのRA+0.25μMのSANT−1+1μMのAlk5 inh+50nMのLDN−193189
本発明は、以下の態様を包含し得る。
[1]
多能性細胞の段階的分化から得られる、膵臓内胚葉細胞のインビトロ分化集団であって、分化の各段階の細胞が、5mM〜20mMのグルコースを含む培地中で培養される、膵臓内胚葉細胞の分化集団。
[2]
前記分化された膵臓内胚葉細胞の30%超が、PDX−1+NKX6.1+、SOX2−、及びCDX2−である、上記[1]に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。
[3]
前記分化集団の細胞の10%超が単一ホルモンのインスリン陽性細胞である、上記[1]又は[2]に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。
[4]
前記段階的分化が、未分化のヒト胚性幹細胞をTGF−Bリガンドが更に追補された培地中で培養する工程を含む、上記[1]〜[3]のいずれか一項に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。
[5]
前記段階的分化が、未分化のヒト胚性幹細胞をWNT活性化剤が更に追補された培地中で培養する工程を含む、上記[1]〜[4]のいずれか一項に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。
[6]
前記段階的分化が、胚体内胚葉細胞をFGFリガンドが更に追補された培地中で培養する工程を含む、上記[1]に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。
[7]
前記段階的分化が、shh阻害剤、FGFリガンド、PKC活性化剤、TGF−Bリガンド、レチノイド、及びBMP阻害剤の勾配が更に追補された培地中で腸管細胞を培養する工程を含む、上記[1]〜[4]のいずれか一項に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。
[8]
前記段階的分化が、PKC活性化剤、shh阻害剤、レチノイド、及びBMP阻害剤が更に追補された培地中で後方前腸細胞を培養する工程を含む、上記[5]に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。
[9]
前記段階的分化が、アスコルビン酸が更に追補された培地中で細胞を培養する工程を含む、上記[1]〜[6]のいずれか一項に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。
[10]
膵臓内胚葉系統の細胞の集団への多能性細胞の段階的分化のためのインビトロの方法であって、5mM〜20mMのグルコースを含む培地中での分化の各段階で細胞を培養する工程を含む、方法。
[11]
TGF−Bリガンド及びWNT活性化剤を追補した培地中で前記多能性細胞を培養することによって、前記多能性細胞を胚体内胚葉(DE)細胞に分化する工程を更に含む、上記[10]に記載のインビトロの方法。
[12]
FGFリガンドを追補した培地中で前記DE細胞を培養することによって、前記DE細胞を腸管細胞に分化する工程を更に含む、上記[11]に記載のインビトロの方法。
[13]
shh阻害剤、FGFリガンド、PKC活性化剤、TGF−Bリガンド、レチノイド、及びBMP阻害剤を追補した培地中で腸管細胞を培養することによって、前記腸管細胞を後方前腸内胚葉細胞に分化する工程を更に含む、上記[12]に記載のインビトロの方法。
[14]
PKC活性化剤、shh阻害剤、レチノイド、及びBMP阻害剤を追補した培地中で後方前腸内胚葉細胞を培養することによって、前記後方前腸内胚葉細胞を膵臓前腸細胞に分化する工程を更に含む、上記[13]に記載のインビトロの方法。
[15]
shh阻害剤、TGF−B阻害剤、及びレチノイドを追補した培地中で前記膵臓前腸細胞を培養することによって、前記膵臓前腸細胞を膵臓内胚葉細胞に分化する工程を更に含む、上記[14]に記載のインビトロの方法。
[16]
前記膵臓内胚葉細胞を膵臓β細胞集団に分化する工程を更に含む、上記[15]に記載のインビトロの方法。
[17]
少なくとも一工程において前記培地にアスコルビン酸を更に追補する、上記[10]〜[16]のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
[18]
前記分化集団の細胞の10%超が単一ホルモンのインスリン陽性細胞である、上記[10]〜[17]のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
[19]
培養物の膵臓内胚葉細胞の30%超がPDX−1+、NKX6.1+、SOX2−、及びCDX2−である、上記[18]に記載のインビトロの方法。
[20]
ヒト胚性幹細胞を膵臓β細胞に分化するためのインビトロの方法であって、
a)胚体内胚葉(DE)細胞の集団を生成するために、未分化のヒト胚性幹細胞を、グルコース、TGF−Bリガンド、及びWNT活性化剤を追補した培地中で培養する工程と、
b)腸管細胞の集団を生成するために、前記DE細胞を、グルコース及びFGFリガンドを追補した培地中で培養する工程と、
c)PDX−1及びSOX2を発現する後方前腸内胚葉細胞の集団を生成するために、グルコース、shh阻害剤、FGFリガンド、PKC活性化剤、TGF−Bリガンド、レチノイド、及びBMP阻害剤の勾配を追補した培地中で前記腸管細胞を培養する工程と、
d)PDX−1及びNKX6.1を発現し、かつ前記後方前腸細胞と比較して低いレベルのSOX2を発現する膵臓前腸細胞の集団を生成するために、グルコース、PKC活性剤、shh阻害剤、レチノイド、及びBMP阻害剤を追補した培地中で前記後方前腸細胞を培養する工程と、
e)PDX−1及び膵臓前腸細胞と比較して高いレベルのNKX6.1並びに低いレベルのSOX2を発現する膵臓内胚葉細胞の集団を得るために、グルコース、shh阻害剤、TGF−B阻害剤、及びレチノイドを追補した培地中で前記膵臓前腸細胞を培養する工程と、
f)前記膵臓内胚葉細胞を膵臓β細胞集団に分化する工程と、を含む、方法。
[21]
前記膵臓β細胞集団がPDX−1+、NKX6.1+、SOX2−、及びCDX2−である、上記[20]に記載の方法。
[22]
少なくとも一工程において前記培地にアスコルビン酸が更に追補される、上記[20]又は[21]に記載の方法。
[23]
前記膵臓β細胞が、NKX6.1+及びPDX−1+でもある単一ホルモンのインスリン産生細胞である、上記[22]に記載の方法。
Claims (16)
- 膵臓内胚葉系統の細胞の集団への多能性細胞の段階的分化のためのインビトロの方法であって、5mM〜20mMのグルコースを含む培地中での分化の各段階で細胞を培養する工程を含み、前記段階的分化が、GDF−8及び14−Prop−2−エン−1−イル−3,5,7,14,17,23,27−ヘプタアザテトラシクロ[19.3.1.1〜2,6〜.1〜8,12〜]ヘプタコサ−1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23−ノナエン−16−オンが追補された培地中で、未分化のヒト胚性幹細胞を培養する工程を含む、方法。
- FGF−7を追補した培地中で胚体内胚葉(DE)細胞を培養することによって、前記DE細胞を腸管細胞に分化する工程を更に含む、請求項1に記載のインビトロの方法。
- SANT−1、FGF−7、TPB、アクチビンA、レチノイド、及びLDN−193189を追補した培地中で腸管細胞を培養することによって、前記腸管細胞を後方前腸内胚葉細胞に分化する工程を更に含む、請求項2に記載のインビトロの方法。
- TPB、SANT−1、レチノイド、及びLDN−193189を追補した培地中で後方前腸内胚葉細胞を培養することによって、前記後方前腸内胚葉細胞を膵臓前腸細胞に分化する工程を更に含む、請求項3に記載のインビトロの方法。
- SANT−1、Alk5阻害剤、及びレチノイドを追補した培地中で前記膵臓前腸細胞を培養することによって、前記膵臓前腸細胞を膵臓内胚葉細胞に分化する工程を更に含む、請求項4に記載のインビトロの方法。
- 前記膵臓内胚葉細胞を膵臓β細胞集団に分化する工程を更に含む、請求項5に記載のインビトロの方法。
- 少なくとも一工程において前記培地にアスコルビン酸を更に追補する、請求項1〜6のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
- ヒト胚性幹細胞を膵臓β細胞に分化するためのインビトロの方法であって、
a)未分化のヒト胚性幹細胞を、グルコースと、
(i)アクチビンAおよびWNT−3A、または
(ii)GDF−8および14−Prop−2−エン−1−イル−3,5,7,14,17,23,27−ヘプタアザテトラシクロ[19.3.1.1〜2,6〜.1〜8,12〜]ヘプタコサ−1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23−ノナエン−16−オン
のいずれかとを追補した培地中で培養して、胚体内胚葉(DE)細胞の集団を生成する工程と、
b)前記DE細胞を、グルコース及びFGF7を追補した培地中で培養して、腸管細胞の集団を生成する工程と、
c)グルコース、SANT−1、FGF7、TPB、アクチビンA、レチノイド、及びLDN−193189の勾配を追補した培地中で前記腸管細胞を培養して、PDX−1及びSOX2を発現する後方前腸内胚葉細胞の集団を生成する工程と、
d)グルコース、TPB、SANT−1、レチノイド、及びLDN−193189を追補した培地中で前記後方前腸細胞を培養して、PDX−1及びNKX6.1を発現し、かつ前記後方前腸細胞と比較して低いレベルのSOX2を発現する膵臓前腸細胞の集団を生成する工程と、
e)グルコース、SANT−1、Alk5阻害剤、及びレチノイドを追補した培地中で前記膵臓前腸細胞を培養して、PDX−1及び膵臓前腸細胞と比較して高いレベルのNKX6.1並びに低いレベルのSOX2を発現する膵臓内胚葉細胞の集団を得る工程と、
f)前記膵臓内胚葉細胞を膵臓β細胞集団に分化する工程と、を含む、方法。 - 前記膵臓β細胞集団がPDX−1+、NKX6.1+、SOX2−、及びCDX2−である、請求項8に記載の方法。
- 少なくとも一工程において前記培地にアスコルビン酸が更に追補される、請求項8又は9に記載の方法。
- 前記膵臓β細胞が、NKX6.1+及びPDX−1+でもある単一ホルモンのインスリン産生細胞である、請求項10に記載の方法。
- 少なくとも一工程において前記培地に0.01mM〜1mMのアスコルビン酸が更に追補される、請求項10に記載の方法。
- 工程c)、d)およびe)において前記培地にアスコルビン酸が更に追補される、請求項10に記載の方法。
- 前記方法が、5mM〜20mMのグルコースを含む培地において、分化の各段階の細胞を培養する工程を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記方法が、グルコース、アクチビンAおよびWNT−3Aが追補された培地において、未分化のヒト胚性幹細胞を培養して、DE細胞の集団を生成する工程を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記方法が、グルコースおよびGDF−8および14−Prop−2−エン−1−イル−3,5,7,14,17,23,27−ヘプタアザテトラシクロ[19.3.1.1〜2,6〜.1〜8,12〜]ヘプタコサ−1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23−ノナエン−16−オンが追補された培地において、未分化のヒト胚性幹細胞を培養して、DE細胞の集団を生成する工程を含む、請求項8に記載の方法。
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