CN110964111B - 一种抗pd-l1单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用 - Google Patents

一种抗pd-l1单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体提供了一种抗PD‑L1单克隆抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，该抗PD‑L1单克隆抗体具有较高的亲和力和良好的生物学活性，在体外能够很好地抑制PD‑L1与PD‑1的结合，保证了T细胞的正常增殖、活化和细胞因子的分泌，进而保证了T细胞对肿瘤细胞的识别能力和杀伤能力，避免肿瘤细胞免疫逃逸的发生，能够有效用于治疗癌症疾病，开发前景广阔；癌症疾病包括但不限于膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈部癌、霍奇金淋巴瘤或黑色素瘤等。

Description

一种抗PD-L1单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种全人源的抗PD-L1单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用。
背景技术
近年来，免疫疗法已成为继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗手段，特别是针对免疫检查点分子的治疗在肿瘤的临床治疗上获得了非常积极的治疗效果。程序性死亡分子1(Programmed cell death ligand 1)和它的配体蛋白PD-L1(Programmed celldeath ligand 1)分子均是具有抑制作用的重要的免疫检查点蛋白，PD-1/PD-L1药物是当前备受瞩目的一类新肿瘤疗法药物，也是目前免疫治疗中的主力军。目前，针对这两种蛋白的单克隆抗体上市的药物已有8种，虽然8种单克隆抗体针对的适应症不同，但是在肿瘤治疗过程中均起着相当重要的作用。
程序性死亡受体-1(Programmed death-1，PD-1)是T细胞上的一种抑制性受体，PD-1能够与配体(Programmed death-1ligand，PD-Ls)PD-L1、PD-L2相互作用，抑制T细胞增殖、活化和细胞因子的分泌，因此，PD-1是调节T细胞反应的重要免疫哨卡。在正常机体中，PD-1、PD-Ls信号通路对维持机体的免疫耐受具有重要作用；而在肿瘤发生时，PD-1、PD-Ls信号通路均能抑制T细胞的免疫反应而促进肿瘤免疫逃逸的发生，为此，以PD-1、PD-Ls信号通路为靶标，研发疗效显著且不良反应较低的PD-1或PD-Ls的阻断剂已经成为近年来在肿瘤免疫治疗领域的一大热点。
程序性死亡受体-配体1(programmed cell death-Ligand 1，PD-L1)是大小为40kDa的第一型跨膜蛋白，正常情形下免疫***会对聚集在***或脾脏的外来抗原产生反应，促进具有抗原特异性的T细胞增生，而PD-1与PD-L1的结合，可以传导抑制性的信号，减低T细胞的增生，所以肿瘤细胞逃避T细胞摧毁的一种途径是通过在它表面产生PD-L1，从而使大量的PD-1与PD-L1结合，导致T细胞不能发现肿瘤细胞，进而无法向肿瘤细胞发出攻击信号，为此，阻断PD-L1/PD-1之间结合成为了肿瘤免疫治疗领域一个非常有潜力的方向。
目前，全人源抗体是治疗性抗体发展的主要方向，抗体库技术的出现为全人源抗体的制备筛选提供了良好的技术平台。抗体库技术绕过了以往单抗研制过程中必须的杂交瘤过程，甚至不需要经过免疫过程即可获得各种抗体基因及抗体分子片段。噬菌体抗体库是最早出现也是目前应用最广泛的抗体库。噬菌体抗体库展示技术是由Smith首先建立的一种将编码外源蛋白或多肽的基因***噬菌体衣壳蛋白基因，使外源蛋白或多肽与噬菌体衣壳蛋白融合表达于噬菌体表面的技术。噬菌体抗体库利用了上述原理将不同特异性的抗体或其功能性片段(Fab、Fv、ScFv)表达在噬菌体表面，再用抗原进行筛选。噬菌体抗体库根据抗体基因的来源分为免疫库和非免疫库，非免疫库又包括天然库、半合成库和全合成库。噬菌体抗体库的筛选模拟了抗体亲和力成熟的过程，通常将抗原包被在固相介质上，加入待筛选的噬菌体抗体库，通过数轮“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的过程(即淘选)直至筛选到特异性的高亲和力抗体，本发明通过噬菌体抗体库展示技术筛选出了一种高亲和力、高选择性、高活性的全人源的抗PD-L1单克隆抗体。
发明内容
为了能够满足国内市场的需求，本发明从全合成的噬菌体抗体库中筛选出抗PD-L1的单克隆抗体，然后通过构建小容量合成噬菌体抗体库的方法，对初筛获得的单克隆抗体的轻链CDR123区突变建库，对轻链进行亲和力成熟，通过筛选鉴定，选取亲和力较高的单克隆抗体，再对其重链CDR123区突变建库进行亲和力成熟，最终筛选到了高亲和力、活性更好的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的HCDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3；所述重链可变区的HCDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6；所述重链可变区的HCDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9；所述轻链可变区的LCDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11；所述轻链可变区的LCDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13；所述轻链可变区的LCDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15。
进一步的，所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQID NO:18；所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20。
进一步的，还包括重链恒定区，所述重链恒定区为人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的一种；
优选的，所述重链恒定区为人的IgG1。
进一步的，所述单克隆抗体或其抗原结合片段为全长抗体或抗体片段，所述抗体片段包括Fab、F(ab)2、Fv或ScFv中的一种或几种组合。
本发明还提供了一种多肽或蛋白，所述多肽或所述蛋白包含所述的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种多核苷酸序列或组合，所述多核苷酸序列或组合编码所述的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列。
本发明还提供了一种重组DNA表达载体，所述重组DNA表达载体包含所述的多核苷酸序列或组合。
本发明还提供了一种转染所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；
优选的，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。
本发明还提供了一种药物或药物组合物，所述药物或所述药物组合物包含所述的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种所述的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗癌症疾病药物中的应用；
优选的，所述癌症疾病包括膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈部癌、霍奇金淋巴瘤或黑色素瘤。
本发明的有益效果如下：本发明提供的抗PD-L1单克隆抗体具有较高的亲和力和良好的生物学活性，在体外能够很好地抑制PD-L1与PD-1的结合，保证了T细胞的正常增殖、活化和细胞因子的分泌，进而保证了T细胞对肿瘤细胞的识别能力和杀伤能力，避免肿瘤细胞免疫逃逸的发生，能够有效用于治疗癌症疾病，开发前景广阔；癌症疾病包括但不限于膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈部癌、霍奇金淋巴瘤或黑色素瘤等。
附图说明
图1、为本发明实施例1的pScFvDisb-s质粒图谱；
图2、为本发明实施例3中梯度稀释phage ELISA鉴定phage-Abs的相对亲和力的线条图；
图3、为本发明实施例4中pTSE质粒载体图；
图4、为本发明实施例4中全抗体SDS-PAGE电泳图；
图5、为本发明实施例5中全抗体与PD-L1在分子水平上结合能力对比图；
图6、为本发明实施例6中全抗体与PD-1的竞争抑制能力对比图；
图7、为本发明实施例7中混合淋巴细胞反应(MLR)测试PD-L1单克隆抗体活性对比图。
具体实施方式
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明中，所述CDR为互补决定区(complementarity-determining region)；所述ScFv为单链抗体(single-chain fragment variable)；所述HEK293E细胞为人胚肾293E细胞(human embryonic kidney 293E cell)；CHO细胞为中国仓鼠卵巢细胞(chinesehamster ovary cell)；NS0细胞为小鼠NS0胸腺瘤细胞。
本发明中的“抗原结合片段”一词，指由含有一个或多个CDR的抗体片段或者任何其他结合抗原但不具有完整天然抗体结构的抗体的片段所形成的一种抗体片段。在某些实施方式中，本申请所述的抗体是抗原结合片段。
抗体的“Fab”片段是指抗体的单价抗原结合片段，其由一条轻链(包括可变区和恒定区)和一条重链的可变区和第一恒定区经二硫键结合组成。Fab可以通过在抗体铰链区的重链之间近二硫键N-末端的残基处经由木瓜蛋白酶消化来获得。
“F(ab)2”是指Fab的二聚体，其包含两条轻链和两条重链的一部分。
抗体的“Fv”段指的是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv片段由一条轻链的可变区结合至一条重链的可变区组成。
“scFv”是指由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个多肽连接子序列连接而成的工程化抗体。
实施例1
本发明实施例1提供了一种抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的HCDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:3；重链可变区的HCDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6；重链可变区的HCDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9；轻链可变区的LCDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11；轻链可变区的LCDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13；轻链可变区的LCDR3的氨基酸序列选自SEQID NO:14或SEQ ID NO:15。
优选的，重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ IDNO:18；轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20。
具体的，本发明利用噬菌体抗体库展示技术从全合成的噬菌体抗体库中筛选出抗PD-L1的单克隆抗体，然后通过构建小容量合成噬菌体抗体库的方法，对初筛获得的单克隆抗体的轻链CDR123区突变建库，对轻链进行亲和力成熟，通过筛选鉴定，选取亲和力较高的单克隆抗体，再对其重链CDR123区突变建库进行亲和力成熟，最终筛选到了高亲和力的抗PD-L1的单克隆抗体。具有的生物淘选方法步骤如下：
步骤一：采用一系列基因克隆的方法对载体pComb3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名为pScFvDisb-s，其质粒图谱如图1所示，并以此载体为基础，构建全合成噬菌体抗体库。
步骤二：以PD-L1为抗原包被免疫管，抗原包被量为5μg/500μl/管，4℃包被过夜，再用4％脱脂奶粉/PBST分别封闭免疫管和全合成噬菌体抗体库，室温封闭1h。封闭后的全合成噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，噬菌体投入量约为109～1012个，室温反应1h后，使用PBST-PBS洗去未结合的噬菌体，通过0.1M、pH2.2的Glycine-HCl洗脱，最后使用1.5M pH 8.8的Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至pH7.0左右。
步骤三：将上述中和后的噬菌体感染10ml生长至对数期的TG1菌液，37℃培养箱中静置30min，取出部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG平板上，用于计算噬菌体产出量。剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，吸出后涂布于2YTAG大平板，为下一轮筛选做准备。
步骤四：将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下，接菌至2YTAG液体培养基，摇至对数期后加入M13 KO7辅助噬菌体超感染，28℃，220rpm培养过夜制备噬菌体，PEG/NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选。共进行三轮噬菌体库富集筛选。
步骤五：PD-L1噬菌体单链抗体阳性克隆的筛选：经过三轮筛选后，挑取分隔良好的单克隆菌落，接种于加有2YTAG液体培养基的96孔深孔板，37℃，220rpm的条件下培养至其对数生长期，每孔加入约1010的辅助噬菌体M13KO7，在37℃的温度条件下静止感染30min。在4000rpm，离心15min，弃去上清，菌体用2YTAK重悬沉淀，在28℃且220rpm的条件下培养过夜。在4000rpm，4℃的条件下离心15min后，吸取扩增后的噬菌体上清进行ELISA鉴定，筛选得到亲和力较高的抗PD-L1单链抗体。
步骤六：对步骤五中初筛得到的抗PD-L1单链抗体进行体外亲和力成熟，具体步骤如下：以初筛得到的抗PD-L1单链抗体轻链为基础，首先合成轻链CDR123突变库，按照步骤二-五进行筛选鉴定，得到两种亲和力较高的克隆；再分别对上述两种轻链合成并构建重链CDR123突变库，按照步骤二-五进行筛选鉴定，最终得到六种亲和力较高的单克隆抗体，分别命名为AH10-B11、AC9-B11、BH2-B11、AH10-E3、AC9-E3、BH2-E3，将上述得到的单克隆抗体进行基因测序确定为正确的抗体序列
经过测序，上述筛选到的6株单克隆抗体序列如下：
AH10-B11的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:16，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:19；
AC9-B11的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:17，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:19；
BH2-B11的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:18，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:19；
AH10-E3的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:16，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:20；
AC9-E3的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:17，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:20；
BH2-E3的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:18，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:20。
具体的，SEQ ID NO:16：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGWTLSDSLQHWVRQAPGKGLEWVGFQSAYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHYYTAWDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:17：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGCTWSDSWDHWVRQAPGKGLEWVDYESTYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWNATFDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:18：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTWSDSYKHWVRQAPGKGLEWVHWNSTYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHFASTWDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:19：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIHNSLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQERRVPWTFGQGTKVEIK；
SEQ ID NO:20：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIHNYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASNLPSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGLHTPPTFGQGTKVEIK。
进一步的，上述筛选出来的单克隆抗体还包括重链恒定区，重链恒定区为人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的一种；
优选的，重链恒定区为人的IgG1。
进一步的，单克隆抗体或其抗原结合片段为全长抗体或抗体片段，抗体片段包括Fab、F(ab)2、Fv或ScFv中的一种或几种组合。
实施例2
本发明实施例2在实施例1的基础上还提供了一种多肽或蛋白，多肽或蛋白包含实施例1中的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种多核苷酸序列或组合，多核苷酸序列或组合编码实施例1中的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列。
本发明还提供了一种重组DNA表达载体，重组DNA表达载体包含上述的多核苷酸序列或组合。
本发明还提供了一种转染的重组DNA表达载体的宿主细胞，宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；
优选的，宿主细胞为哺乳动物细胞，哺乳动物细胞为HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。
本发明还提供了一种药物或药物组合物，药物或药物组合物包含实施例1中的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗癌症疾病药物中的应用；
优选的，癌症疾病包括膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈部癌、霍奇金淋巴瘤或黑色素瘤。
实施例3梯度稀释ELISA比较抗PD-L1噬菌体单克隆抗体的亲和力
将实施例1中获得的6株单克隆抗体(AH10-B11，AC9-B11，BH2-B11，AH10-E3，AC9-E3，BH2-E3)进行单克隆噬菌体的展示和纯化，然后进行噬菌体梯度稀释ELISA实验鉴定亲和力，选择上市产品atezolizumab的核心专利CN102245640A提供的抗PD-L1单克隆抗体作为阳性对照，具体方法如下：
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被PD-L1，100ng/孔/100μl，在4℃温度条件下包被过夜，使用PBST洗涤三次，将实施例1中筛选得到的6株噬菌体单克隆抗体和专利CN102245640A提供的抗PD-L1噬菌体单克隆抗体分别用PBST三倍梯度稀释，每孔加入100μl稀释后的样品，在室温下静置1小时。用PBST洗涤ELISA板，将PBST稀释后的HRP-anti-M13单克隆抗体加入ELISA板中，在室温放置1h。TMB显色试剂盒显色，室温显色10分钟，用2M H2SO4终止后，在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
克隆 AH10-B11 AC9-B11 BH2-B11 AH10-E3 AC9-E3 BH2-E3 CN102245640A
EC50 8.134 5.133 2.008 9.191 9.28 5.604 35.46
通过上述数据及如图2所示，筛选出的6株不同的单克隆抗体均能够与PD-L1进行结合，而且相对专利CN102245640A提供的抗PD-L1单克隆抗体，本发明提供的单克隆抗体与PD-L1结合能力更强，具有更高的亲和力。
实施例4抗PD-L1全抗体的制备
将实施例1筛选出来的6株单克隆抗体的重链VH和轻链Vκ基因分别克隆至装有重链和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，重链恒定区为人IgG1恒定区(氨基酸序列见SEQ ID NO:21)，轻链恒定区为κ链恒定区(氨基酸序列见SEQ ID NO:22)，pTSE载体结构如图3所示，制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段。
SEQ ID NO:21(人的IgG1的恒定区序列)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG；
SEQ ID NO:22(κ链的轻链恒定区序列)：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
瞬时转染HEK293E细胞，进行全抗体表达，使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得6株单克隆抗体的全抗体蛋白，同时使用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定，之后通过SDS-PAGE鉴定蛋白大小，结果如图4所示，从左侧到右侧依次为蛋白质分子量Marker、AH10-B11、AC9-B11、BH2-B11、AH10-E3、AC9-E3、BH2-E3及上市产品atezolizumab的核心专利CN102245640A提供的抗PD-L1单克隆抗体，每条带的分子量大小与理论一致。
实施例5全抗体与PD-L1的结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被PD-L1，100ng/孔/100μl，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBS在37℃温度条件下封闭2h，加入不同稀释浓度的全抗AH10-B11、AC9-B11、BH2-B11、AH10-E3、AC9-E3、BH2-E3和专利CN102245640A中的抗PD-L1全抗体，7种全抗体的起始最高浓度均是1μg/ml，分别经过3倍稀释后每个全抗体均做8个梯度，在37℃温度条件下孵育1h。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBS1:10000稀释的Anti-Human Fc-HRP，在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色8min，然后用2M H2SO4终止显色。在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
克隆 AH10-B11 AC9-B11 BH2-B11 AH10-E3 AC9-E3 BH2-E3 CN102245640A
EC50(ng/ml) 1.425 0.5744 0.5351 1.909 2.174 1.228 12.26
通过上述数据及实验结果如图5所示，筛选出来的6株不同的单克隆抗体的全抗体均能与PD-L1进行结合，本发明提供的6株不同的单克隆抗体的全抗体的EC50值均明显低于专利CN102245640A中的抗PD-L1全抗体，说明本发明提供的单克隆抗体与PD-L1结合的亲和力较高，具有较好的活性，此外，从图5及上述数据中还可以得出，这6株不同的单克隆抗体中BH2-B11的全抗体的活性最好，而且EC50值最低，说明其与PD-L1结合能力最好，亲和力最高，活性最好。
实施例6全抗体竞争抑制PD-L1与PD-1结合
用pH9.6的碳酸盐包被PD-L1-Fc 200ng/孔/100μl，在4℃的温度条件下包被过夜，用PBST洗涤五次，在37℃温度条件下，在1％BSA-PBS中封闭2h，用5μg/ml的PD-1-His分别稀释AH10-B11、AC9-B11、BH2-B11、AH10-E3、AC9-E3、BH2-E3全抗体及专利CN102245640A提供的全抗体，所有抗体的起始最高浓度均是50μg/ml，分别经过3倍梯度稀释后，每个全抗体均做12个稀释梯度，在37℃温度条件下孵育1h，用PBST洗涤五次，加入用1％BSA-PBS稀释的HRP标记的小鼠抗His抗体，在37℃温度条件下孵育1h，经过TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色8min，最后用10％H2SO4终止显色，在450nm/630nm下读数，数据如下：
克隆 AH10-B11 AC9-B11 BH2-B11 AH10-E3 AC9-E3 BH2-E3 CN102245640A
IC50(ng/ml) 108.2 82.04 61.18 136 138 92.73 510
通过上述数据及结果如图6所示，7种全抗均能抑制PD-L1与PD-1的结合，但本发明中筛选出的6株全抗体抑制能力明显强于专利CN102245640A中的全抗体，此外，从图6及上述数据中还可以得出，这6株不同的单克隆抗体中BH2-B11对于PD-L1与PD-1结合的抑制能力最强。
实施例7、混合淋巴细胞反应(MLR)测试抗PD-L1单克隆抗体活性
按密度梯度离心法分离新鲜外周血PBMC，磁珠分选CD14+T细胞；用20ng/mL GM-CSF与10ng/mL IL-4的培养基培养CD14+T细胞，每2天换液，7-10天后诱导成为树突状DC细胞。在树突状DC细胞使用前两天，加入25ng/mL的TNF-α诱导树突状DC细胞为成熟的DC细胞，收集成熟的DC细胞，配制成细胞密度为1x105个/mL细胞悬液。从新鲜PBMC中磁珠分选出CD4+T细胞，计数，制成细胞密度为1x106个/mL细胞悬液。将CD4+T细胞与DC细胞各取100μl，按比例5∶1加入96孔板。
将实施例4制备的6株抗PD-L1全抗体、专利CN102245640A提供的抗PD-L1全抗体作为阳性对照和用人的IgG(hIgG)作为同型对照，分别进行4倍梯度稀释，每株全抗体均设置6个梯度，各取50μl加入到96孔板中，5天后，cck8测试CD4+T细胞增殖，在450nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
克隆 AH10-B11 AC9-B11 BH2-B11 AH10-E3 AC9-E3 BH2-E3 CN102245640A hlgG
EC50(ng/ml) 9.876 7.576 6.728 11.37 11.87 7.706 22.57 -
通过上述数据及如图7所示，本发明筛选出的6株不同的抗PD-L1全抗体的EC50值均明显低于专利CN102245640A提供的抗PD-L1的全抗体，说明本发明提供的抗PD-L1全抗体的活性均高于专利CN102245640A提供的抗PD-L1全抗体。说明本发明提供的抗PD-L1单克隆抗体的活性较好，亲和力较强。此外，从图7及上述数据中还可以看出，本发明筛选出的6株单克隆抗体中，BH2-B11的活性最高。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京东方百泰生物科技有限公司
<120> 一种抗PD-L1单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 1
Gly Trp Thr Leu Ser Asp Ser Leu Gln His
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 2
Gly Cys Thr Trp Ser Asp Ser Trp Asp His
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 3
Gly Leu Thr Trp Ser Asp Ser Tyr Lys His
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 4
Gly Phe Gln Ser Ala Tyr Gly Gly Ser Thr
1 5 10
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 5
Asp Tyr Glu Ser Thr Tyr Gly Gly Ser Thr
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 6
His Trp Asn Ser Thr Tyr Gly Gly Ser Thr
1 5 10
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 7
Ala Arg Arg His Tyr Tyr Thr Ala Trp Asp Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 8
Ala Arg Arg His Trp Asn Ala Thr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 9
Ala Arg Arg His Phe Ala Ser Thr Trp Asp Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 10
Gln Asn Ile His Asn Ser Leu
1 5
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 11
Gln Ser Ile His Asn Tyr Leu
1 5
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 12
Gly Ala Ser Ser Leu Glu
1 5
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 13
Ser Ala Ser Asn Leu Pro
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 14
Gln Gln Glu Arg Arg Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 15
Gln Gln Gly Leu His Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 16
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Trp Thr Leu Ser Asp Ser
20 25 30
Leu Gln His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Gln Ser Ala Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Tyr Tyr Thr Ala Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Cys Thr Trp Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Asp His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Asp Tyr Glu Ser Thr Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Asn Ala Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Trp Ser Asp Ser
20 25 30
Tyr Lys His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
His Trp Asn Ser Thr Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Phe Ala Ser Thr Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile His Asn Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu Arg Arg Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Leu His Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 21
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 21
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 22
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (11)

1.一种抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18；所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20。
2.如权利要求1所述的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，还包括重链恒定区，所述重链恒定区为人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的一种。
3.如权利要求2所述的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链恒定区为人的IgG1。
4.如权利要求2所述的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段为全长抗体或抗体片段，所述抗体片段包括Fab、F(ab)2、Fv或ScFv中的一种或几种组合。
5.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白为权利要求1-4任一项所述的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段。
6.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1-4任一项所述的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段。
7.一种重组DNA表达载体，其特征在于，所述重组DNA表达载体包含权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种转染如权利要求7所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。
10.一种药物，其特征在于，所述药物包含如权利要求1-4任一项所述的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段。
11.一种权利要求1-4任一项所述的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗癌症疾病药物中的应用，所述癌症疾病包括膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈部癌、霍奇金淋巴瘤或黑色素瘤。
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PB01 Publication
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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Address after: 406, room 1, building 2, 100176 Jingdong street, Beijing economic and Technological Development Zone, Beijing, Daxing District

Patentee after: Beijing Dongfang Baitai Biotechnology Co., Ltd

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Patentee before: Beijing Dongfang Biotech Co.,Ltd.

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