CN114786682A

CN114786682A - 结合cd71的纤维粘连蛋白iii型结构域

Info

Publication number: CN114786682A
Application number: CN202080080929.3A
Authority: CN
Inventors: R·C·阿迪斯; Z·德鲁齐娜; R·科拉科夫斯基; S·库尔卡尼; S·G·纳德勒; K·奥尼尔; 忻尧
Original assignee: Aro Biotherapeutics Co
Current assignee: Aro Biotherapeutics Co
Priority date: 2019-10-14
Filing date: 2020-10-14
Publication date: 2022-07-22
Also published as: JP2022551204A; EP4045061A4; US20210145976A1; EP4045061A1; WO2021076546A1; US11628222B2; WO2021076546A9

Abstract

本公开涉及可结合CD71的多肽(诸如纤维粘连蛋白III型(FN3)结构域)、它们的缀合物、分离的编码分子的核苷酸、载体、宿主细胞以及它们的制备和使用方法。在一些实施方式中，FN3结构域是非天然存在的。在一些实施方式中，FN3结构域在CD71上不与转铁蛋白竞争结合CD71的位点处与人CD71结合。

Description

结合CD71的纤维粘连蛋白III型结构域

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年10月14日提交的美国临时申请号62/914,643和2019年12月17日提交的美国临时申请号62/949,020的优先权，其各自的全部内容通过援引并入本文。

技术领域

本实施方式涉及特异性结合分化簇71(CD71)的纤维粘连蛋白III型结构域(FN3)以及制备和使用这些分子的方法。

背景技术

CD71(也称为转铁蛋白受体1)是跨膜的，对于铁转运到细胞中至关重要。它在许多肿瘤类型上和血脑屏障处高度表达，因此已成为用于药物递送的重要靶标。在与负载铁的转铁蛋白结合后，CD71被迅速内吞并有效地循环回细胞表面。对CD71抗体药物缀合物的研究表明，靶向CD71可以改善药物递送的特异性和选择性，并扩大治疗指数。此外，使用抗CD71单克隆抗体的研究表明，结合亲和力可能在实现血脑屏障转胞吞作用中发挥重要作用。对CD71具有高亲和力的抗体会被迅速内化并改变正常的受体运输，因此受体不会再循环，而是靶向溶酶体进行降解。相比之下，对CD71具有低亲和力的抗体允许受体再循环和更高的脑暴露。

虽然当需要对靶分子具有高亲和力和特异性时，抗体或抗体片段是最广泛使用的治疗蛋白类型，但非抗体蛋白也可以被设计成与这些靶标结合。这些“替代支架”蛋白具有优于传统抗体的优势，因为它们尺寸小、缺乏二硫键、稳定性高、能够在原核宿主中表达、易于纯化，并且它们易于与药物/毒素缀合，有效渗透到组织中并且易于格式化成多特异性粘结剂。

一种这样的替代支架是免疫球蛋白(Ig)折叠。这种折叠存在于抗体的可变区以及数以千计的非抗体蛋白中。已经表明，一种这样的Ig蛋白(来自人纤维粘连蛋白的第十个纤维粘连蛋白III型(FN3)重复)，可以耐受表面暴露环中的许多突变，同时保留整体Ig折叠结构。因此，需要可以特异性结合CD71的FN3结构域，以及使用这种分子进行癌症治疗的方法。

发明内容

在一些实施方式中，提供了特异性结合CD71蛋白的FN3结构域(例如多肽)。在一些实施方式中，所述FN3结构域是分离的。在一些实施方式中，所述FN3结构域是重组的。在一些实施方式中，所述FN3结构域是非天然存在的。

在一些实施方式中，提供了包括SEQ ID NO:33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62的氨基酸序列的FN3结构域。在一些实施方式中，提供了包括SEQ ID NO:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85或149的氨基酸序列的FN3结构域。在一些实施方式中，提供了包括SEQ ID NO:81-309的氨基酸序列的FN3结构域：在一些实施方式中，所述FN3结构域与CD71结合。在一些实施方式中，所述FN3结构域在CD71上不与转铁蛋白竞争结合CD71的位点处与人CD71结合。在一些实施方式中，提供了包括SEQ ID NO:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85或149的氨基酸序列的FN3结构域。在一些实施方式中，所述FN3结构域与CD71特异性结合。在一些实施方式中，提供了包括通过接头(例如柔性接头)连接的多于一个FN3结构域的所述多肽。在一些实施方式中，所述多肽包括2、3或4个FN3结构域，这些结构域通过所述结构域之间的一个或多个接头彼此连接。

在一些实施方式中，提供了编码本文所述的FN3结构域的分离的多核苷酸。

在一些实施方式中，提供了包括本文所述的多核苷酸的载体。

在一些实施方式中，提供了包括本文所述的载体的宿主细胞。

在一些实施方式中，提供了产生所述FN3结构域的方法。在一些实施方式中，该方法包括培养包括编码或表达所述FN3结构域的载体的宿主细胞。在一些实施方式中，该方法还包括纯化所述FN3结构域。在一些实施方式中，所述FN3结构域特异性结合CD71。

在一些实施方式中，提供了包括与CD71结合的FN3结构域和药学上可接受的载体的药物组合物。

在一些实施方式中，提供了结合与CD71结合的FN3结构域的抗独特型抗体。

在一些实施方式中，提供了包括一个或多个FN3结构域的试剂盒。

在一些实施方式中，提供了检测肿瘤组织中表达CD71的癌细胞的方法。在一些实施方式中，该方法包括从受试者获得所述肿瘤组织的样品并通过使所述肿瘤组织的所述样品与包括SEQ ID NO:33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309中之一的氨基酸序列的结合CD71蛋白的所述FN3结构域接触以及检测CD71蛋白与所述FN3结构域之间的结合来检测所述肿瘤组织中是否表达CD71蛋白。

在一些实施方式中，提供了分离表达CD71的细胞的方法。在一些实施方式中，该方法包括从受试者获得样品；使所述样品与包括SEQ ID NO:33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309中之一的氨基酸序列的结合CD71蛋白的所述FN3结构域接触以及分离与所述FN3结构域结合的所述细胞。

在一些实施方式中，提供了检测肿瘤组织中表达CD71的癌细胞的方法。在一些实施方式中，该方法包括使包括SEQ ID NO:33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309中之一的氨基酸序列的结合CD71蛋白的FN3结构域与可检测标记缀合以形成缀合物；向受试者给药所述缀合物；以及使与所述缀合物结合的表达CD71的癌细胞可视化。

在一些实施方式中，提供了在有此需要的受试者中治疗癌症的方法。在一些实施方式中，该方法包括给药与CD71结合的多肽。在一些实施方式中，所述多肽是与CD71结合的FN3结构域。在一些实施方式中，所述多肽包括与治疗剂联接或缀合的包括诸如SEQ ID NO:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85、149、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309的序列或如本文所提供的多肽。

在一些实施方式中，提供了治疗神经病症和/或脑肿瘤的方法。在一些实施方式中，所述方法包括向所述受试者给药本文提供的多肽或所述药物组合物。在一些实施方式中，所述脑肿瘤选自由非恶性、良性和恶性脑肿瘤组成的组。

在一些实施方式中，提供了将目标药剂递送至CD71阳性细胞的方法。在一些实施方式中，所述方法包括使细胞与偶联至结合CD71的FN3结构域(例如本文提供的多肽)的目标药剂接触。在一些实施方式中，所述目标药剂是化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素、放射性同位素、抗微管蛋白剂、多核苷酸、siRNA分子、反义分子、RNA分子、DNA分子、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢药、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂或长春花生物碱。

在一些实施方式中，所述多肽是在不竞争或抑制转铁蛋白与CD71结合的位点处与CD71结合的FN3蛋白。

在一些实施方式中，提供了鉴定在不竞争或抑制转铁蛋白与CD71结合的位点处与CD71结合的FN3蛋白的方法。

具体实施方式

如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式的“一个/种”(“a”、“an”)和“所述”(“the”)包括复数指示物，除非内容另有明确规定。因此，例如，提及“一个/种细胞”包括两个/种或更多个/种细胞的组合等。

“纤维粘连蛋白III型(FN3)结构域”(FN3结构域)是指在包括纤维粘连蛋白、生腱蛋白、细胞内细胞骨架蛋白、细胞因子受体和原核酶在内的蛋白质中频繁出现的结构域(Bork and Doolittle,Proc Nat Acad Sci USA 89:8990-8994,1992；Meinke et al.,JBacteriol 175:1910-1918,1993；Watanabe et al.,J Biol Chem 265:15659-15665,1990)。示例性的FN3结构域是存在于人生腱蛋白C中的15个不同FN3结构域、存在于人纤维粘连蛋白(FN)中的15个不同FN3结构域和非天然合成FN3结构域，如例如美国专利号8,278,419中描述的。单个FN3结构域由结构域编号和蛋白质名称表示，例如，生腱蛋白的第3个FN3结构域(TN3)，或纤维粘连蛋白的第10个FN3结构域(FN10)。

术语“捕获剂”是指与特定类型细胞结合并能够将该细胞与其他细胞分离的物质。示例性的捕获剂是磁珠、铁磁流体、包封试剂、结合特定细胞类型的分子等。

“样品”是指从受试者中分离的类似流体、细胞或组织的集合，以及存在于受试者体内的流体、细胞或组织。示例性样品是组织活检、细针抽吸、手术切除的组织、器官培养物、细胞培养物和生物体液诸如血液、血清和浆液、血浆、淋巴液、尿液、唾液、囊液、泪珠、粪便、痰液、分泌组织和器官的粘膜分泌物、***分泌物、腹水，胸膜、心包、腹膜、覆膜和其他体腔的流体，通过支气管灌洗收集的流体、滑液、与受试者或生物源接触的液体溶液，例如、细胞和器官培养基，包括细胞或器官条件培养基和灌洗液等。

“替换”或“替换的”或“突变”或“突变的”是指在多肽或多核苷酸序列中改变、缺失或***一个或多个氨基酸或核苷酸以产生该序列的变体。

“变体”是指多肽或多核苷酸，其与参考多肽或参考多核苷酸的区别在于一个或多个修饰，例如替换、***或缺失。

“特异性地结合”或“特异性结合”是指FN3结构域以约1x10^-6M或更小，例如约1x10^-7M或更小、约1x10^-8M或更小、约1x10^-9M或更小、约1x10^-10M或更小、约1x10^-11M或更小、约1x10^-12M或更小、或约1x10^-13M或更小的解离常数(K_D)与其靶标诸如CD71结合的能力。替代地，“特异性结合”是指在标准ELISA测定中FN3结构域以比阴性对照高至少5倍与其靶标(例如CD71)结合的能力。在一些实施方式中，阴性对照是不结合CD71的FN3结构域。在一些实施方式中，特异性结合CD71的FN3结构域可以与其他相关抗原具有交叉反应性，例如与来自其他物种(同源物)诸如Macaca Fascicularis(食蟹猴、cyno)或Pan troglodytes(黑猩猩)的相同预定抗原。

“文库”是指变体的集合。文库可以由多肽或多核苷酸变体构成。

“稳定性”是指分子在生理条件下维持折叠状态，以使其保持其正常功能活性中的至少一种，例如与预定抗原诸如CD71结合的能力。

“CD71”是指具有SEQ ID NO:32或80的氨基酸序列的人CD71蛋白。在一些实施方式中，SEQ ID NO:32是全长人CD71蛋白。在一些实施方式中，SEQ ID NO:80是人CD71的细胞外结构域。

“Tencon”是指合成纤维粘连蛋白III型(FN3)结构域，其具有SEQ ID NO:1中所示并在美国专利公开号2010/0216708中描述的序列。

“癌细胞”或“肿瘤细胞”是指体内、离体和组织培养中的癌细胞、癌前细胞或转化细胞，其具有自发或诱导的表型变化，不一定涉及摄取新的遗传物质。尽管转化可以由转化病毒的感染和新基因组核酸的掺入或外源核酸的摄取引起，但其也可以自发发生或在暴露于致癌物后发生，从而使内源基因发生突变。转化/癌症由例如以下举例说明：形态变化、细胞永生化、异常生长控制、病灶形成、增殖、恶性、肿瘤特异性标志物水平、侵袭性、合适的动物宿主诸如裸鼠等中、体外、体内和离体的肿瘤生长或抑制(Freshney,Culture of AnimalCells:A Manual of Basic Technique(3rd ed.1994))。

“载体”是指能够在生物***内复制或可以在这样的***之间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常包含元件，诸如复制起点、多聚腺苷酸化信号或选择标记，其作用是促进这些多核苷酸在生物***中的复制或维持。这样的生物***的实例可以包括细胞、病毒、动物、植物和利用能够复制载体的生物组分的重构生物***。包括载体的多核苷酸可以是DNA或RNA分子或它们的杂合体。

“表达载体”是指可用于生物***或重构的生物***中以指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列编码的多肽的翻译的载体。

“多核苷酸”是指包括通过糖-磷酸骨架或其他等效共价化学共价连接的核苷酸的链的合成分子。cDNA是多核苷酸的典型实例。

“多肽”或“蛋白质”是指包含通过肽键连接以形成多肽的至少两个氨基酸残基的分子。少于约50个氨基酸的小多肽可称为“肽”。

“价”是指分子中存在特定数量的对抗原特异性的结合位点。因此，术语“单价”、“二价”、“四价”和“六价”是指在分子中分别存在对分子中的抗原特异的一个、两个、四个和六个结合位点。

“受试者”包括任何人类或非人类动物。“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人类灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。除非另有说明，否则术语“患者”或“受试者”可以互换使用。

“分离的”是指已从产生分子的***(诸如重组细胞)的其他组分中基本上分离和/或纯化的同质分子群(诸如合成多核苷酸或多肽，诸如FN3结构域)，以及经过至少一个纯化或分离步骤的蛋白质。“分离的FN3结构域”是指基本上不含其他细胞材料和/或化学物质的FN3结构域，并且包括分离到更高纯度，诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度的FN3结构域。

物质组成

在一些实施方式中，提供了蛋白质，包括多肽，其包括SEQ ID NO:33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309的氨基酸序列。在一些实施方式中，蛋白质包括多肽，其包括与SEQ ID NO:33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309的序列至少62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，蛋白质与SEQ ID NO:33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309的序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些实施方式中，蛋白质与SEQ ID NO:33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。.在一些实施方式中，蛋白质与SEQ IDNO:33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309的序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同。

本文提供的多肽可以是较大多肽的一部分并且可以称为结构域。不同多肽中两个结构域之间的同源性或同一性是基于相似的结构域而不是整个多肽。例如，如果一个多肽包括了包含含有SEQ ID NO:81的FN3结构域的多肽并且所述结构域缀合至scFV抗体，则具有与SEQ ID NO:81相似但不相同的结构域的另一种蛋白质可以至少90％相同，即使scFV没有同源性。因此，％同一性可以基于结构域或多肽的全长。确定％同一性的方法在本文中提供或为本领域技术人员已知的。

在一些实施方式中，提供了结合或特异性结合人CD71蛋白(SEQ ID NO:32或80)的纤维粘连蛋白III型(FN3)结构域。如本文所提供的，FN3结构域可以与CD71蛋白结合。还提供了，即使没有明确说明，这些结构域也可以与CD71蛋白特异性结合。因此，例如，与CD71结合的FN3结构域也将包括与CD71特异性结合的FN3结构域蛋白。这些分子可用于例如治疗和诊断应用以及成像。在一些实施方式中，提供了编码本文公开的FN3结构域的多核苷酸或其互补核酸、载体、宿主细胞以及制备和使用它们的方法。

在一些实施方式中，提供了结合或特异性结合CD71的分离的FN3结构域。

在一些实施方式中，FN3结构域包括通过接头连接的两个FN3结构域。接头可以是柔性接头。接头可以是短肽序列，诸如本文所述的那些。例如，接头可以是G/S接头等。

在一些实施方式中，FN3结构域可以以小于约1x10^-7 M、例如小于约1x10^-8 M、小于约1x10^-9 M、小于约1x10^-10 M，小于约1x10^-11 M，小于约1x10^-12 M、或小于约1x10^-13 M的解离常数(K_D)结合CD71，如本领域技术人员通过表面等离激元共振或Kinexa方法测定的。如果在不同条件(例如，渗量、pH)下测量，特定FN3结构域-抗原相互作用的测量的亲和力可能会有所不同。因此，亲和力和其他抗原结合参数(例如，K_D、K_on、K_off)的测量是用蛋白质支架和抗原的标准化溶液以及标准化缓冲液(诸如本文所述的缓冲液)进行的。

在一些实施方式中，在标准ELISA测定中，FN3结构域可以以比阴性对照获得的信号高至少5倍结合CD71。

在一些实施方式中，结合或特异性结合CD71的FN3结构域包括连接至分子的N末端的起始甲硫氨酸(Met)。在一些实施方式中，结合或特异性结合CD71的FN3结构域包括连接至FN3结构域的C末端的半胱氨酸(Cys)。N末端Met和/或C末端Cys的添加可促进半衰期延长分子的表达和/或缀合。

FN3结构域还可以包括半胱氨酸替换，诸如在美国专利号10,196,446中描述的那些，其全部内容通过援引并入本文。简而言之，在一些实施方式中，本文提供的多肽可以在选自由以下组成的组的某个位置处包括至少一个半胱氨酸替换：基于美国专利号10,196,446的SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:1的FN3结构域的残基6、8、10、11、14、15、16、20、30、34、38、40、41、45、47、48、53、54、59、60、62、64、70、88、89、90、91和93，以及相关FN3结构域中的等效位置。在一些实施方式中，替换在残基6处。在一些实施方式中，替换在残基8处。在一些实施方式中，替换在残基10处。在一些实施方式中，替换在残基11处。在一些实施方式中，替换在残基14处。在一些实施方式中，替换在残基15处。在一些实施方式中，替换在残基16处。在一些实施方式中，替换在残基20处。在一些实施方式中，替换在残基30处。在一些实施方式中，替换在残基34处。在一些实施方式中，替换在残基38处。在一些实施方式中，替换在残基40处。在一些实施方式中，替换在残基41处。在一些实施方式中，替换在残基45处。在一些实施方式中，替换在残基47处。在一些实施方式中，替换在残基48处。在一些实施方式中，替换在残基53处。在一些实施方式中，替换在残基54处。在一些实施方式中，替换在残基59处。在一些实施方式中，替换在残基60处。在一些实施方式中，替换在残基62处。在一些实施方式中，替换在残基64处。在一些实施方式中，替换在残基70处。在一些实施方式中，替换在残基88处。在一些实施方式中，替换在残基89处。在一些实施方式中，替换在残基90处。在一些实施方式中，替换在残基91处。在一些实施方式中，替换在残基93处。

结构域或蛋白质中某个位置的半胱氨酸替换包括将现有氨基酸残基替换为半胱氨酸残基。半胱氨酸修饰的其他实例可以在例如美国专利申请公开号20170362301中找到，其全部内容通过援引并入本文。序列的比对可以使用例如NCBI网站的BlastP使用默认参数执行。

在一些实施方式中，结合CD71的FN3结构域被内化到细胞中。在一些实施方式中，FN3结构域的内化可以促进可检测标记或治疗剂递送到细胞中。在一些实施方式中，FN3结构域的内化可以促进细胞毒剂递送到细胞中。细胞毒剂可以作为治疗剂。在一些实施方式中，FN3结构域的内化可促进本文公开的任何可检测标记、治疗剂和/或细胞毒剂递送到细胞中。在一些实施方式中，细胞是肿瘤细胞。在一些实施方式中，细胞是肝细胞。

在一些实施方式中，结合CD71的FN3结构域基于SEQ ID NO:1的Tencon序列或SEQID NO:4的Tencon 27序列，任选地在残基位置11、14、17、37、46、73或86(对应于SEQ ID NO:4的残基编号)处具有替换。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或61的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:33的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:35的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:37的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:41的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:45的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:49的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:50的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:52的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:53的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:54的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:55的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:56的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:57的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:59的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:60的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:61的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:62的氨基酸序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:81的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:83的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:84的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:85的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:86的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:87的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:89的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:90的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:91的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ IDNO:92的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:93的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:94的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:95的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:96的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:97的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:98的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:99的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:100的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:101的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:102的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:103的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:104的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:105的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:106的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:107的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQID NO:108的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ IDNO:109的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:110的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:111的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:112的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:113的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:114的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:115的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:116的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:117的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:118的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:119的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:120的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:121的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:122的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:123的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:124的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:125的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:126的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQID NO:127的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ IDNO:128的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:129的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:130的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:131的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:132的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:133的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:134的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:135的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:136的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:137的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:138的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:139的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:140的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:141的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:142的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:143的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:144的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:145的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQID NO:146的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ IDNO:147的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:148的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:149的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:150的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:151的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:152的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:153的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:154的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:155的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:156的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:157的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:158的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:159的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:160的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:161的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:162的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:163的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:164的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQID NO:165的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ IDNO:166的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:167的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:168的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:169的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:170的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:171的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:172的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:173的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:174的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:175的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:176的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:177的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:178的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:179的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:180的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:181的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:182的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:183的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQID NO:184的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ IDNO:185的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:186的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:187的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:188的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:189的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:190的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:191的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:192的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:193的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:194的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:195的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:197的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:198的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:199的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:200的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:201的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:202的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQID NO:203的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ IDNO:204的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:205的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:206的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:207的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:208的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:209的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:210的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:211的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:212的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:213的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:214的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:215的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:216的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:217的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:218的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:219的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:220的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:221的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQID NO:222的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ IDNO:223的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:224的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:225的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:226的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:227的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:228的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:229的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:230的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:231的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:232的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:233的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:234的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:235的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:236的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:237的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:238的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:239的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:240的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQID NO:241的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ IDNO:242的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:243的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:244的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:245的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:246的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:247的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:248的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:249的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:250的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:251的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:252的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:253的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:254的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:255的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:256的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:257的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:258的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:259的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQID NO:260的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ IDNO:261的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:262的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:263的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:264的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:265的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:266的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:267的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:268的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:269的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:270的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:271的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:272的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:273的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:274的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:275的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:276的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:277的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:278的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQID NO:279的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ IDNO:280的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:281的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:282的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:283的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:284的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:285的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:286的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:287的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:288的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:289的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:290的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:291的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:292的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:293的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:294的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:295的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:296的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:297的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQID NO:298的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ IDNO:299的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:300的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:301的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:302的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:303的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:304的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:305的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:306的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:307的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:308的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括SEQ ID NO:309的氨基酸序列。

在一些实施方式中，FN3结构域在CD71上不与转铁蛋白竞争结合CD71的位点处与人CD71结合。在一些实施方式中，FN3结构域包括SEQ ID NO:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85或149的序列。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括连接至分子的N末端的起始甲硫氨酸(Met)。

在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括与SEQ ID NO:33-50的氨基酸序列中之一62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括与SEQ ID NO:51-61或62的氨基酸序列中之一62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括与SEQ ID NO:81-309的氨基酸序列中之一62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，结合CD71的分离的FN3结构域包括与SEQ ID NO:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85或149的氨基酸序列中之一62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

百分比同一性可以使用默认参数使用可通过NCBI网站获得的BlastP比对两个序列来确定。

本公开的结合CD71的FN3结构域的缀合物

在一些实施方式中，提供了与异源分子缀合的结合CD71的分离的FN3结构域。

在一些实施方式中，FN3结构域与寡核苷酸缀合。例如，寡核苷酸可用于抑制基因或mRNA转录物的表达。寡核苷酸可以是siRNA、miRNA、反义寡核苷酸等。

在一些实施方式中，肽与脂质纳米颗粒缀合，该脂质纳米颗粒可用于例如细胞特异性靶向。

在一些实施方式中，蛋白质与靶向CD71或用于蛋白质降解的另一种蛋白质的结合部分缀合。例如，蛋白质可以与PROTACS(E3泛素连接酶的结合部分)缀合，从而将蛋白质递送至E3连接酶。这些可以通过接头(诸如甘氨酸-丝氨酸接头等)连接。

与CD71结合的FN3结构域也可以缀合或连接到结合CD71以外的不同靶标的另一个FN3结构域。这将使肽具有多特异性(例如双特异性、三特异性等)，从而使其与CD71和另一种例如蛋白质结合。在一些实施方式中，CD71 FN3结合结构域连接至与由肿瘤细胞表达的抗原(肿瘤抗原)结合的另一个FN3结构域。

在一些实施方式中，FN3结构域可以通过接头连接在一起以形成二价FN3结构域。接头可以是柔性接头。在一些实施方式中，接头是G/S接头。在一些实施方式中，接头具有1、2、3或4个G/S重复。G/S重复单元是四个甘氨酸然后丝氨酸，例如GGGGS。

在一些实施方式中，异源分子是可检测标记或治疗剂，例如但不限于细胞毒剂。

在一些实施方式中，提供了与可检测标记缀合的结合CD71的FN3结构域。本文提供了可检测标记的非限制性实例。

在一些实施方式中，提供了与治疗剂缀合的结合CD71的FN3结构域。本文提供了治疗剂的非限制性实例，例如但不限于细胞毒剂。

与可检测标记缀合的结合CD71的FN3结构域可用于评估体内或体外样品(诸如肿瘤组织)上的CD71表达。

可检测标记包括当与结合CD71的FN3结构域缀合时通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或其他化学方法使CD71可检测的组合物。

示例性的可检测标记包括但不限于放射性同位素、磁珠、金属珠、胶体颗粒、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，如ELISA中常用的)、生物素、地高辛、半抗原、发光分子、化学发光分子、荧光染料、荧光团、荧光猝灭剂、有色分子、放射性同位素、闪烁料、抗生物素蛋白、链霉亲和素、蛋白A、蛋白G、抗体或其片段、聚组氨酸、Ni²⁺、Flag标签、myc标签、重金属、酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、荧光素酶、电子供体/受体、吖啶酯和比色底物。

可检测标记可自发地发射信号，诸如当可检测标记是放射性同位素时。在一些实施方式中，可检测标记由于受到外部刺激诸如磁场或电场或电磁场的刺激而发射信号。

示例性放射性同位素可以是γ发射、螺旋发射、β发射、α发射或正电子发射放射性同位素。示例性放射性同位素包括³H、¹¹C、¹³C、¹⁵N、¹⁸F、¹⁹F、⁵⁵Co、⁵⁷Co、⁶⁰Co、⁶¹Cu、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Ga、⁷²As、⁷⁵Br、⁸⁶Y、⁸⁹Zr、⁹⁰Sr、^94mTc、^99mTc、¹¹⁵In、¹²³1、¹²⁴1、¹²⁵I、¹³¹1、²¹¹At、²¹²Bi、²¹³Bi、²²³Ra、²²⁶Ra、²²⁵Ac和²²⁷Ac。

示例性金属原子是原子序数大于20的金属，例如钙原子、钪原子、钛原子、钒原子、铬原子、锰原子、铁原子、钴原子、镍原子、铜原子、锌原子、镓原子、锗原子、砷原子、硒原子、溴原子、氪原子、铷原子、锶原子、钇原子、锆原子、铌原子、钼原子、锝原子、钌原子、铑原子、钯原子、银原子、镉原子、铟原子、锡原子、锑原子、碲原子、碘原子、氙原子、铯原子、钡原子、镧原子、铪原子、钽原子、钨原子、铼原子、锇原子、铱原子、铂原子、金原子、汞原子、铊原子、铅原子、铋原子、钫原子、镭原子、锕原子、铈原子、镨原子、钕原子、钷原子、钐原子、铕原子、钆原子、铽原子、镝原子、钬原子、铒原子、铥原子、镱原子、镥原子、钍原子、镤原子、铀原子、镎原子、钚原子、镅原子、锔原子、锫原子、锎原子、锿原子、镄原子、钔原子、锘原子或铹原子。

在一些实施方式中，金属原子可以是原子序数大于二十的碱土金属。

在一些实施方式中，金属原子可以是镧系元素。

在一些实施方式中，金属原子可以是锕系元素。

在一些实施方式中，金属原子可以是过渡金属。

在一些实施方式中，金属原子可以是贫金属。

在一些实施方式中，金属原子可以是金原子、铋原子、钽原子和钆原子。

在一些实施方式中，金属原子可以是原子序数为53(即碘)至83(即铋)的金属。

在一些实施方式中，金属原子可以是适用于磁共振成像的原子。

金属原子可以是+1、+2或+3氧化态形式的金属离子，诸如Ba²⁺、Bi³⁺、Cs⁺、Ca²⁺、Cr²⁺、Cr³⁺、Cr⁶⁺、Co²⁺、Co³⁺、Cu⁺、Cu²⁺、Cu³⁺、Ga³⁺、Gd³⁺、Au⁺、Au³⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、F³⁺、Pb²⁺、Mn²⁺、Mn³⁺、Mn⁴⁺、Mn⁷⁺、Hg²⁺、Ni²⁺、Ni³⁺、Ag⁺、Sr²⁺、Sn²⁺、Sn⁴⁺和Zn²⁺。金属原子可以包括金属氧化物，例如氧化铁、氧化锰或氧化钆。

合适的染料包括任何可商购的染料，诸如例如5(6)-羧基荧光素、IRDye680RD马来酰亚胺或IRDye 800CW、聚吡啶钌染料等。

合适的荧光团是异硫氰酸荧光素(FITC)、氨基硫脲荧光素、罗丹明、德克萨斯红、CyDye(例如，Cy3、Cy5、Cy5.5)、Alexa Fluors(例如，Alexa488、Alexa555、Alexa594；Alexa647)、近红外(NIR)(700-900nm)荧光染料，以及羰花青和氨基苯乙烯基染料。

与可检测标记缀合的特异性结合CD71的FN3结构域可用作例如评估肿瘤分布、诊断肿瘤细胞存在和/或肿瘤复发的显像剂。

在一些实施方式中，特异性结合CD71的FN3结构域与治疗剂(诸如但不限于细胞毒剂)缀合。

在一些实施方式中，治疗剂是化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放射性缀合物)。

本文公开的与治疗剂缀合的结合CD71的FN3结构域可用于将治疗剂靶向递送至表达CD71的细胞(例如肿瘤细胞)，并在其中进行细胞内积累。尽管不受任何特定理论的束缚，但在这些非缀合剂的全身给药可能导致对正常细胞的毒性水平不可接受的情况下，这种类型的递送可能是有益的。

在一些实施方式中，治疗剂可以通过以下机制引发它们的细胞毒性和/或细胞抑制作用，诸如但不限于微管蛋白结合、DNA结合、拓扑异构酶抑制、DNA交联、螯合、剪接体抑制、NAMPT抑制和HDAC抑制。

在一些实施方式中，治疗剂是剪接体抑制剂、NAMPT抑制剂或HDAC抑制剂。在一些实施方式中，药剂是免疫***激动剂，例如，TLR7、8、9、RIG-I(dsRNA)和STING(CpG)激动剂。在一些实施方式中，药剂是道诺霉素、多柔比星、甲氨蝶呤、长春地辛、细菌毒素诸如白喉毒素、蓖麻毒蛋白、格尔德霉素、美登素或卡奇霉素。

在一些实施方式中，治疗剂是酶促活性毒素，诸如白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆蛋白A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-八叠球菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthin)、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素或单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。

在一些实施方式中，治疗剂是放射性核素，诸如²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Y或¹⁸⁶Re。

在一些实施方式中，治疗剂是多拉司他汀(dolastatin或dolostatin)肽类似物和衍生物、奥瑞他汀或单甲基奥瑞他汀苯丙氨酸。示例性分子在美国专利号5,635,483和5,780,588中公开。多拉司他汀和奥瑞他汀已显示干扰微管动力学、GTP水解以及核和细胞***(Woyke et al(2001)Antimicrob Agents and Chemother.45(12):3580-3584)，并具有抗癌和抗真菌活性。多拉司他汀或奥瑞他汀药物部分可以通过肽药物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端连接到FN3结构域(WO 02/088172)，或通过工程化到FN3结构域中的任何半胱氨酸连接到FN3结构域。

在一些实施方式中，治疗剂可以是例如奥瑞他汀、喜树碱、倍癌霉素(duocarmycin)、依托泊苷、美登素和美登素类、紫杉烷、苯二氮

类或含苯二氮

类药物(例如吡咯并[1,41-苯二氮

类(PBD)、吲哚并苯二氮

类和恶唑烷苯二氮杂

类)或长春花生物碱。

可使用已知方法将特异性结合CD71的FN3结构域与可检测标记缀合。

在一些实施方式中，可检测标记与螯合剂络合。

在一些实施方式中，可检测标记通过接头与结合CD71的FN3结构域缀合。

可检测标记、治疗剂化合物或细胞毒性化合物可以使用已知方法直接或间接连接至结合CD71的FN3结构域。合适的接头是本领域已知的并且包括例如辅基、非酚类接头(N-琥珀酰亚胺基苯甲酸酯的衍生物；十二硼酸酯)、大环和无环螯合剂的螯合部分，诸如1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10,四乙酸(DOTA)的衍生物、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)的衍生物、S-2-(4-异硫氰酸苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)的衍生物以及1,4,8,11-四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯基)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)的衍生物,亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯HCl)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮基衍生物(诸如双(对重氮基苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)和其他螯合部分。合适的肽接头是众所周知的。

在一些实施方式中，结合CD71的FN3结构域通过肾清除从血液中去除。

CD71结合FN3结构域从基于Tencon序列的文库中的分离

Tencon(SEQ ID NO:1)是一种非天然存在的纤维粘连蛋白III型(FN3)结构域，由来自人生腱蛋白-C的15个FN3结构域的共有序列设计而成(Jacobs et al.,ProteinEngineering,Design,and Selection,25:107-117,2012；美国专利公开号2010/0216708)。Tencon的晶体结构显示了如对于FN3结构域所表征的连接七个β链的六个表面暴露的环，β链称为A、B、C、D、E、F和G，并且环称为AB、BC、CD、DE、EF和FG环(Bork and Doolittle,ProcNatl Acad Sci USA 89:8990-8992,1992；美国专利号6,673,901)。这些环或每个环内的选定残基可以随机化以构建纤维粘连蛋白III型(FN3)结构域文库，该文库可用于选择结合CD71的新分子。表1示出了Tencon中每个环和β链的位置和序列(SEQ ID NO:1)。

因此，基于Tencon序列设计的文库可能具有随机化的FG环，或随机化的BC和FG环，例如如下文所述的文库TCL1或TCL2。Tencon BC环的长度为7个氨基酸，因此可以在BC环多样化并基于Tencon序列设计的文库中使1、2、3、4、5、6或7个氨基酸随机化。Tencon FG环的长度为7个氨基酸，因此可以在FG环多样化并基于Tencon序列设计的文库中使1、2、3、4、5、6或7个氨基酸随机化。Tencon文库中环处的进一步多样性可以通过环处残基的***和/或缺失来实现。例如，FG和/或BC环可以延长1-22个氨基酸，或减少1-3个氨基酸。Tencon中FG环的长度为7个氨基酸，而抗体重链中相应的环范围为4-28个残基。为了提供最大的多样性，FG环可以在序列和长度上多样化以对应于4-28个残基的抗体CDR3长度范围。例如，可以通过将环延长额外的1、2、3、4或5个氨基酸使FG环的长度进一步多样化。

基于Tencon序列设计的文库还可以具有随机的替代表面，这些表面在FN3结构域的一侧形成并包括两条或多条β链和至少一个环。一种这样的替代表面由C和Fβ-链以及CD和FG环中的氨基酸形成(C-CD-F-FG表面)。一种基于Tencon替代C-CD-F-FG表面的文库设计在美国专利公开号2013/0226834中进行了描述。基于Tencon序列设计的文库还包括基于Tencon变体设计的文库，例如在残基位置11、14、17、37、46、73或86(残基编号对应于SEQ IDNO:1)处具有替换的Tencon变体，以及显示哪些变体改善热稳定性。示例性的Tencon变体描述于美国专利公开号2011/0274623中，并且包括与SEQ ID NO:1的Tencon相比具有替换E11R、L17A、N46V和E86I的Tencon27(SEQ ID NO:4)。

表1.Tencon拓扑结构

基于Tencon和其他FN3序列的文库可以使用随机或限定的氨基酸组在选定的残基位置随机化。例如，文库中具有随机替换的变体可以使用编码所有20种天然存在的氨基酸的NNK密码子产生。在其他多样化方案中，DVK密码子可用于编码氨基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly和Cys。替代地，NNS密码子可用于产生所有20种氨基酸残基，同时降低终止密码子的频率。可以例如使用

技术(http:_//www_sloning_com)合成在要多样化的位置处具有偏向氨基酸分布的FN3结构域文库。该技术使用预制双链三联体文库，其作为通用构建块，足以满足数千个基因合成过程。三联体文库代表了构建任何期望DNA分子所需的所有可能的序列组合。密码子名称是根据众所周知的IUB代码。

特异性结合CD71的FN3结构域可以通过使用顺式展示产生FN3文库(例如Tencon文库)来分离，以将编码支架蛋白的DNA片段连接到编码RepA的DNA片段以产生在体外翻译后形成的蛋白质-DNA复合物的池，其中每种蛋白质都与编码它的DNA稳定缔合(美国专利号7,842,476；Odegrip et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 101,2806-2810,2004)，并且通过本领域已知和实施例中描述的任何方法测定文库与PSMA的特异性结合。可以使用的示例性众所周知的方法是ELISA、夹心免疫测定以及竞争性和非竞争性测定(参见，例如，Ausubelet al.,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。进一步表征了鉴定出的特异性结合CD71的FN3结构域，其与CD71的结合、CD71活性的调节、内化、稳定性和其他期望特征。

可使用任何FN3结构域作为模板产生特异性结合CD71的FN3结构域，以生成文库并使用其中提供的方法筛选文库中特异性结合CD71的分子。可以使用的示例性FN3结构域是腱生蛋白C的第3个FN3结构域(TN3)、Fibcon和纤维粘连蛋白的第10个FN3结构域(FN10)。因此，PCT申请WO 2010/051274、WO 2011/137319和WO 2013/049275以其整体并入本文。标准克隆和表达技术用于将文库克隆到载体中或合成文库的双链cDNA盒，以在体外表达或翻译文库。可以使用例如核糖体展示(Hanes and Pluckthun,Proc Natl Acad Sci USA,94,4937-4942,1997)、mRNA展示(Roberts and Szostak,Proc Natl Acad Sci USA,94,12297-12302,1997)或其他无细胞***(美国专利号5,643,768)。FN3结构域变体的文库可以表达为展示在例如任何合适的噬菌体表面上的融合蛋白。用于在噬菌体表面上展示融合多肽的方法是众所周知的(美国专利公会开号2011/0118144；国际专利公开号WO2009/085462；美国专利号6,969,108；美国专利号6,172,197；美国专利号5,223,409；美国专利号6,582,915；美国专利号6,472,147)。

在一些实施方式中，结合CD71的FN3结构域基于SEQ ID NO:1的Tencon序列或SEQID NO:4的Tencon27序列、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4，任选在残基位置11、14、17、37、46、73和/或86处具有替换。

在一些实施方式中，FN3蛋白或多肽是在CD71上不与转铁蛋白竞争结合CD71的位点处与人CD71结合的蛋白或多肽。如本文所用，CD71上不与转铁蛋白竞争结合CD71的位点是指其中FN3蛋白的结合不竞争或抑制转铁蛋白与CD71结合的CD71表位或部分。竞争或缺乏竞争可以是完全的或部分的。在一些实施方式中，该结合也不抑制转铁蛋白通过其与CD71的相互作用而内化到细胞中。

在一些实施方式中，提供了用于鉴定在不竞争或抑制转铁蛋白与CD71结合的位点处与CD71结合的FN3蛋白的方法。在一些实施方式中，所述方法包括在转铁蛋白或与CD71转铁蛋白结合位点结合的试剂的存在下使CD71与测试FN3蛋白接触；以及鉴定在转铁蛋白或与CD71转铁蛋白结合位点结合的试剂的存在下与CD71结合的测试FN3蛋白。在一些实施方式中，所述方法包括分离在转铁蛋白或与CD71转铁蛋白结合位点结合的试剂的存在与CD71结合的测试FN3蛋白。在一些实施方式中，所述方法包括对在转铁蛋白或与CD71转铁蛋白结合位点结合的试剂的存在下与CD71结合的测试FN3蛋白进行测序。在一些实施方式中，所述方法包括制备或获得编码在转铁蛋白或与CD71转铁蛋白结合位点结合的试剂的存在下与CD71结合的测试FN3蛋白的核酸序列。在一些实施方式中，所述方法包括由编码在转铁蛋白或与CD71转铁蛋白结合位点结合的试剂的存在下与CD71结合的测试FN3蛋白的核酸序列表达在转铁蛋白或与CD71转铁蛋白结合位点结合的试剂的存在下与CD71结合的测试FN3蛋白。在一些实施方式中，测试FN3蛋白在细胞中表达。在一些实施方式中，所述方法包括分离和/或纯化表达的测试FN3蛋白。

在一些实施方式中，提供了FN3蛋白，其中根据本文提供的任何方法鉴定FN3蛋白。

可以修饰特异性结合CD71的FN3结构域以改善其性质，诸如改善热稳定性和热折叠和解折叠的可逆性。已经应用了几种方法来增加蛋白质和酶的表观热稳定性，包括基于与高度相似的热稳定序列比较的合理设计、稳定二硫键的设计、增加α-螺旋倾向的突变、盐桥的工程化、蛋白质表面电荷的改变、定向进化和共有序列的组成(Lehmann and Wyss,Curr.Opin.Biotechnol.,12,371-375,2001)。高热稳定性可以提高表达的蛋白质的产量，改善溶解度或活性，降低免疫原性，以及最大限度地减少制造过程中对冷链的需求。可被替换以改善Tencon(SEQ ID NO:1)的热稳定性的残基是残基位置11、14、17、37、46、73或86，并且描述于美国专利公开号2011/0274623中。对应于这些残基的替换可以引入本文公开的含有FN3结构域的分子中。

蛋白质稳定性和蛋白质不稳定性的测量可以被视为蛋白质完整性的相同或不同方面。蛋白质对以下敏感或“不稳定”：由热、紫外线或电离辐射引起的变性、如果在液体溶液中则环境渗量和pH的变化、小孔径过滤施加的机械剪切力、紫外线辐射、电离辐射(诸如γ辐射)、化学或热脱水，或任何其他可能导致蛋白质结构破坏的作用或力。可以使用标准方法确定分子的稳定性。例如，分子的稳定性可以通过使用标准方法测量热熔化(“T_m”)温度(即一半分子展开的以摄氏度(℃)为单位的温度)来确定。通常，T_m越高，分子越稳定。除了热量，化学环境也会改变蛋白质维持特定三维结构的能力。

在一些实施方式中，结合CD71的FN3结构域可表现出增加的稳定性，与工程化之前的相同结构域相比，通过T_m增加测量的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多。

化学变性同样可以通过多种方法测量。化学变性剂包括盐酸胍、硫氰酸胍、脲、丙酮、有机溶剂(DMF、苯、乙腈)、盐(硫酸铵、溴化锂、氯化锂、溴化钠、氯化钙、氯化钠)；还原剂(例如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、二硝基苯和氢化物，诸如硼氢化钠)、非离子和离子去污剂、酸(例如盐酸(HCl)、乙酸(CH₃COOH)、卤代乙酸)、疏水分子(例如磷脂)和靶向变性剂。变性程度的定量可以依赖于功能特性(诸如结合靶分子的能力)的丧失，或依赖于物理化学特性，诸如聚集倾向、原来溶剂无法接近的残基的暴露，或二硫键的破坏或形成。

结合CD71的FN3结构域可以以单体、二聚体或多聚体的形式产生，例如，作为增加靶分子结合的价并因此增加亲和力的手段，或产生同时结合两种或更多种不同靶分子的双特异性或多特异性支架的手段。二聚体和多聚体可以通过连接单特异性、双特异性或多特异性蛋白质支架来产生，例如通过包括氨基酸接头，例如包含聚甘氨酸、甘氨酸和丝氨酸、或丙氨酸和脯氨酸的接头。示例性接头包括(GS)₂(SEQ ID NO:63)、(GGGS)₂(SEQ ID NO:64)、(GGGGS)₅(SEQ ID NO:65)、(AP)₂(SEQ ID NO:66)、(AP)₅(SEQ ID NO:67)、(AP)₁₀(SEQID NO:68)、(AP)₂₀(SEQ ID NO:69)和A(EAAAK)₅AAA(SEQ ID NO:70)。二聚体和多聚体可以在N-至C-方向上彼此连接。使用天然和人工肽接头将多肽连接成新的连接的融合多肽在文献中是众所周知的(Hallewell et al.,J Biol Chem 264,5260-5268,1989；Alfthan etal.,Protein Eng.8,725-731,1995；Robinson&Sauer,Biochemistry 35,109-116,1996；以及美国专利号5,856,456)。

半衰期延长部分

特异性结合CD71的FN3结构域可以引入其他亚基，例如通过共价相互作用。在一些实施方式中，特异性结合CD71的FN3结构域还包括半衰期延长部分。示例性的半衰期延长部分是白蛋白、白蛋白变体、白蛋白结合蛋白和/或结构域、转铁蛋白及其片段和类似物，以及Fc区。人Fc区的氨基酸序列是众所周知的，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE的Fc区。在一些实施方式中，特异性结合CD71的FN3结构域可以引入第二FN3结构域，该第二FN3结构域结合延长整个分子的半衰期的分子，诸如但不限于本文所述的任何半衰期延长部分。在一些实施方式中，第二FN3结构域结合白蛋白、白蛋白变体、白蛋白结合蛋白和/或结构域、及其片段和类似物。

抗体恒定区的全部或部分可以连接到结合CD71的FN3结构域以赋予抗体样特性，尤其是与Fc区相关的那些特性，诸如Fc效应物功能，诸如C1q结合、补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调，并且可以通过修饰Fc中负责这些活性的残基来进一步修饰(供审查；参见Strohl,Curr Opin Biotechnol.20,685-691,2009)。

额外的部分可以被引入到特异性结合CD71的FN3结构域中，诸如聚乙二醇(PEG)分子，诸如PEG5000或PEG20,000，不同链长的脂肪酸和脂肪酸酯，例如月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、硬脂酸酯、廿酸酯、山嵛酸酯、油酸酯、花生四烯酸酯、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等、聚赖氨酸、辛烷、碳水化合物(葡聚糖、纤维素、寡糖或多糖)以获得所需的特性。这些部分可以与蛋白质支架编码序列直接融合，并且可以通过标准克隆和表达技术产生。替代地，可以使用众所周知的化学偶联方法将部分连接到本文公开的重组产生的分子上。

可以例如通过将半胱氨酸残基引入分子的C末端，或将半胱氨酸工程改造到背离分子的CD71结合面的残基位置，并使用众所周知的方法将聚乙二醇基团连接到半胱氨酸，来将聚乙二醇部分添加到结合CD71的FN3结构域。

可以通过几种众所周知的测定比较引入了额外部分的特异性结合CD71的FN3结构域的功能。例如，由于引入Fc结构域和/或Fc结构域变体而改变的特性可以通过以下来评估：在Fc受体结合测定中使用可溶形式的受体，诸如FcγRI、FcγRII、FcγRIII或FcRn受体，或使用众所周知的测量例如ADCC或CDC的基于细胞的测定，或在体内模型中评估本文公开的分子的药代动力学性质的测定。

多核苷酸、载体、宿主细胞

在一些实施方式中，提供了编码特异性结合CD71的FN3结构域的核酸，作为分离的多核苷酸，或作为表达载体的部分或作为线性DNA序列(包括用于体外转录/翻译的线性DNA序列)的部分，与组合物或其定向诱变剂的原核、真核或丝状噬菌体表达、分泌和/或展示相容的载体。本文公开了某些示例性多核苷酸，然而，考虑到给定表达***中遗传密码的简并性或密码子偏好，编码本文公开的FN3结构域的其他多核苷酸也在本公开的范围内。

在一些实施方式中，分离的多核苷酸编码特异性结合CD71的FN3结构域，该结构域包括SEQ ID NO:33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309的氨基酸序列.

本文公开的多核苷酸可以通过化学合成诸如自动化多核苷酸合成仪上的固相多核苷酸合成来产生并且组装成完整的单链或双链分子。替代地，本文公开的多核苷酸可通过其他技术诸如PCR随后常规克隆产生。用于产生或获得给定已知序列的多核苷酸的技术是本领域众所周知的。

本文公开的多核苷酸可包括至少一种非编码序列，诸如启动子或增强子序列、内含子、多腺苷酸化信号、促进RepA结合的顺式序列等。多核苷酸序列还可包括编码额外氨基酸的额外序列，其编码例如标志物或标签序列诸如组氨酸标签或HA标签以促进蛋白质的纯化或检测、信号序列、融合蛋白伴侣诸如RepA、Fc或噬菌体外壳蛋白，诸如pIX或pIII。

在一些实施方式中，提供了包括至少一种本文公开的多核苷酸的载体。这样的载体可以是质粒载体、病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或适合通过任何方式将本文公开的多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的任何其他载体。这样的载体可以是包括核酸序列元件的表达载体，所述核酸序列元件可以控制、调节、引起或允许由这样的载体编码的多肽表达。这样的元件可包括转录增强子结合位点、RNA聚合酶起始位点、核糖体结合位点和其他促进编码多肽在给定表达***中表达的位点。这样的表达***可以是本领域熟知的基于细胞的或无细胞的***。

在一些实施方式中，提供了包括所述载体的宿主细胞。特异性结合CD71的FN3结构域可以任选地由本领域公知的细胞系、混合细胞系、永生化细胞或永生化细胞的克隆群产生。参见例如Ausubel,et al.,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY,NY(1987-2001)；Sambrook,et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2^nd Edition,Cold Spring Harbor,NY(1989)；Harlow and Lane,Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NY(1989)；Colligan,et al.,eds.,Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,Inc.,NY(1994-2001)；Colligan et al.,Current Protocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY,NY,(1997-2001)。

选择用于表达的宿主细胞可以是哺乳动物来源的或可以选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、He G2、SP2/0、HeLa、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞，或其任何衍生的、永生化的或转化的细胞。替代地，宿主细胞可以选自不能使多肽糖基化的物种或生物体，例如原核细胞或生物体，诸如BL21、BL21(DE3)、BL21-GOLD(DE3)、XL1-Blue、JM109、HMS174、HMS174(DE3)，以及任何天然或工程化的大肠杆菌属、克雷伯氏菌属或假单胞菌属菌株。

在一些实施方式中，产生结合CD71的分离的FN3结构域的方法，包括在使得结合CD71的分离的FN3结构域表达的条件下培养分离的宿主细胞，以及纯化FN3结构域。

可以通过众所周知的方法从重组细胞培养物中纯化结合CD71的FN3结构域，例如通过蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱、或高效液相色谱(HPLC)。

抗独特型抗体

在一些实施方式中，抗独特型抗体结合FN3结构域。

在一些实施方式中，结合FN3结构域的抗独特型抗体包括SEQ ID NO:33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309中之一的氨基酸序列。

试剂盒

在一些实施方式中，提供了包括结合CD71的FN3结构域的试剂盒。

试剂盒可用于治疗用途和作为诊断试剂盒。

在一些实施方式中，试剂盒包括结合CD71的FN3结构域和用于检测FN3结构域的试剂。在一些实施方式中，该试剂盒包括二价FN3结构域。试剂盒可以包括一种或多种其他元素，包括：使用说明；其他试剂，例如标记、用于螯合或以其他方式偶联的试剂、辐射防护组合物；用于制备结合CD71的FN3结构域以给药用于成像、诊断或治疗目的的装置或其他材料；药学上可接受的载体；以及用于对受试者给药的装置或其他材料。

在一些实施方式中，试剂盒包括结合CD71的FN3结构域，其包括SEQ ID NO：33-50中之一的氨基酸序列。

在一些实施方式中，试剂盒包括结合CD71的FN3结构域，其包括SEQ ID NO：51-61中之一的氨基酸序列。

在一些实施方式中，试剂盒包括结合CD71的FN3结构域，其包括SEQ ID NO：81-309中之一的氨基酸序列。

在一些实施方式中，试剂盒包括结合CD71的FN3结构域，其包括SEQ ID NO:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85或149中之一的氨基酸序列。

CD71结合FN3结构域的用途

特异性结合CD71的FN3结构域或其缀合物可用于诊断、监测、调节、治疗、缓解、帮助预防发生或减轻(症状)人类疾病或细胞、组织、器官、体液或通常宿主中的特定病理学。

在一些实施方式中，特异性结合CD71的FN3结构域或其缀合物也可用于对受试者中的CD71阳性肿瘤组织进行成像。本文公开的方法可用于属于任何分类的动物患者。这样的动物的实例包括哺乳动物，诸如人类、啮齿动物、狗、猫和农场动物。

在一些实施方式中，提供了基于癌症组织细胞的CD71表达诊断患有或可能发展组织癌症的受试者的方法、预测免疫疗法成功的方法、预后方法和治疗方法。

在一些实施方式中，提供了一种检测肿瘤组织中的表达CD71的癌细胞的方法，所述方法包括：从受试者获得所述肿瘤组织的样品；通过使肿瘤组织的样品与包括SEQ IDNO:33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309中之一的氨基酸的结合CD71的FN3结构域接触以及检测CD71与FN3结构域之间的结合来检测所述肿组织中是否表达CD71。

在一些实施方式中，CD71细胞是涉及CNS疾病、炎症/免疫疾病，诸如脑部的MS和感染性疾病的细胞。

在一些实施方式中，组织可以是任何器官或解剖***的表达CD71的组织。

在一些实施方式中，可以使用已知方法诸如免疫组织化学或ELISA来评估CD71表达。

在一些实施方式中，提供了一种分离表达CD71的细胞的方法，该方法包括：从受试者获得样品；使样品与包括SEQ ID NO：33-50中之一的氨基酸序列的结合CD71的FN3结构域接触，以及分离与FN3结构域结合的细胞。

在一些实施方式中，提供了一种分离表达CD71的细胞的方法，该方法包括：从受试者获得样品；使样品与包括SEQ ID NO：51-61中之一的氨基酸序列的结合CD71的FN3结构域接触，以及分离与FN3结构域结合的细胞。

在一些实施方式中，提供了一种检测肿瘤组织中表达CD71的癌细胞的方法，该方法包括：使包括SEQ ID NO：33-50中之一的氨基酸序列的结合CD71的FN3结构域与可检测标记缀合以形成缀合物；向受试者给药缀合物；以及使缀合物结合的表达CD71的癌细胞可视化。

在一些实施方式中，提供了一种检测肿瘤组织中表达CD71的癌细胞的方法，该方法包括：使包括SEQ ID NO：51-62或81-309中之一的氨基酸序列的结合CD71的FN3结构域与可检测标记缀合以形成缀合物；向受试者给药缀合物；以及使缀合物结合的表达CD71的癌细胞可视化。

在一些实施方式中，提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者给药结合CD71的FN3结构域。在一些实施方式中，FN3结构域与治疗剂(例如细胞毒剂、寡核苷酸、结合另一靶标的FN3结构域等)缀合。

在一些实施方式中，受试者具有实体瘤。

在一些实施方式中，实体瘤是黑素瘤。

在一些实施方式中，实体瘤是肺癌。在一些实施方式中，实体瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方式中，实体瘤是鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方式中，实体瘤是非鳞状NSCLC。在一些实施方式中，实体瘤是肺腺癌。

在一些实施方式中，实体瘤是肾细胞癌(RCC)。

在一些实施方式中，实体瘤是间皮瘤。

在一些实施方式中，实体瘤是鼻咽癌(NPC)。

在一些实施方式中，实体瘤是结直肠癌。

在一些实施方式中，实体瘤是***癌。在一些实施方式中，实体瘤是去势抵抗性***癌。

在一些实施方式中，实体瘤是胃癌。

在一些实施方式中，实体瘤是卵巢癌。

在一些实施方式中，实体瘤是胃部癌。

在一些实施方式中，实体瘤是肝癌。

在一些实施方式中，实体瘤是胰腺癌。

在一些实施方式中，实体瘤是甲状腺癌。

在一些实施方式中，实体瘤是头颈部鳞状细胞癌。

在一些实施方式中，实体瘤是食道癌或胃肠道癌。

在一些实施方式中，实体瘤是乳腺癌。

在一些实施方式中，实体瘤是输卵管癌。

在一些实施方式中，实体瘤是脑癌。

在一些实施方式中，实体瘤是尿道癌。

在一些实施方式中，实体瘤是泌尿生殖系癌。

在一些实施方式中，实体瘤是子宫内膜异位症。

在一些实施方式中，实体瘤是***。

在一些实施方式中，实体瘤是癌症的转移性病变。

在一些实施方式中，受试者患有血液恶性肿瘤。

在一些实施方式中，血液恶性肿瘤是淋巴瘤、骨髓瘤或白血病。在一些实施方式中，血液恶性肿瘤是B细胞淋巴瘤。在一些实施方式中，血液恶性肿瘤是伯基特淋巴瘤。在一些实施方式中，血液恶性肿瘤是霍奇金淋巴瘤。在一些实施方式中，血液恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤。

在一些实施方式中，血液恶性肿瘤是骨髓增生异常综合征。

在一些实施方式中，血液恶性肿瘤是急性髓性白血病(AML)。在一些实施方式中，血液恶性肿瘤是慢性髓性白血病(CML)。在一些实施方式中，血液恶性肿瘤是慢性粒细胞白血病(CMML)。

在一些实施方式中，血液恶性肿瘤是多发性骨髓瘤(MM)。

在一些实施方式中，血液恶性肿瘤是浆细胞瘤。

在一些实施方式中，本文提供的组合物或药物组合物可以单独给药或与其他治疗剂组合给药，即同时或依次给药。在一些实施方式中，其他或另外的治疗剂是其他抗肿瘤剂或治疗剂。不同肿瘤类型和肿瘤阶段可能需要使用对治疗癌症有用的各种辅助化合物。例如，本文提供的组合物可以与各种化疗剂(诸如泰素、酪氨酸激酶抑制剂、甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶、伊立替康、磷酸酶抑制剂、MEK抑制剂等)组合使用。该组合物还可与调节对肿瘤的免疫反应的药物(诸如抗PD-1或抗CTLA-4等)组合使用。其他治疗可以是调节免疫***的药物，诸如靶向PD-1或PD-L1的抗体。

在一些实施方式中，针对人类疾病或细胞、组织、器官、体液或通常宿主中的特定病理学，可用于其诊断、监测、调节、治疗、减轻、帮助预防发生或减轻症状的特异性结合CD71的FN3结构域或其缀合物也表现出能够穿过血脑屏障的特性。血脑屏障(BBB)阻止大多数大分子(例如DNA、RNA和多肽)和许多小分子进入脑。BBB主要由具有高度限制性紧密连接的特化内皮细胞构成，因此，小物质和大物质从血液进入中枢神经***的通道由BBB控制。这种结构使得神经***疾病和疾患(例如脑癌)患者的治疗和管理变得困难，因为许多治疗剂无法以理想的效率通过BBB输送。涉及BBB破坏的其他病症包括：卒中、糖尿病、惊厥、高血压脑病、获得性免疫缺陷综合征、颅脑损伤、多发性硬化、帕金森病(PD)和阿尔茨海默病。这种能力对于治疗脑癌特别有用，包括例如：星形细胞瘤、髓母细胞瘤、胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤(松果体瘤)、多形性胶质母细胞瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤和先天性肿瘤；或脊髓癌，例如神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤和肉瘤。在某些实施方式中，包括SEQ ID NO:33-50中之一的氨基酸序列的特异性结合CD71的FN3结构域或其缀合物可用于递送治疗剂或细胞毒剂，例如，穿过血脑屏障。在某些实施方式中，包括SEQ ID NO:51-61中之一的氨基酸序列的特异性结合CD71的FN3结构域或其缀合物可用于递送治疗剂或细胞毒剂，例如，穿过血脑屏障。在一些实施方式中，蛋白质包括以下的序列：SEQ ID NO:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85、149、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309。

在一些实施方式中，可促进治疗剂运输运穿过BBB的多肽是包括以下的序列的蛋白质：SEQ ID NO:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85或149。

“治疗(Treat)”或“治疗(treatment)”是指治疗性治疗和预防措施，其中目的是预防或减缓(减轻)不希望的生理变化或疾患，诸如癌症的发展或扩散。在一些实施方式中，有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的缓解、疾病程度的降低、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分的还是完全的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以意味着与未接受治疗的预期生存期相比延长生存期。需要治疗的人包括已经患有病症或疾患的人以及倾向于患有病症或疾患的人或要预防病症或疾患的人。

“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效达到所需治疗结果的量。特异性结合CD71的FN3结构域的治疗有效量可能根据因素诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重而变化。结合CD71的有效FN3结构域的示例性指标是改善患者的幸福感、肿瘤大小的减小或缩小、肿瘤的生长停滞或减慢、和/或不存在癌细胞转移到身体的其他部位。

给药/药物组合物

在一些实施方式中，提供了本文公开的任选地与可检测标记、治疗剂或细胞毒剂缀合的特异性结合CD71的FN3结构域以及药学上可接受的载体的药物组合物。对于治疗用途，可将特异性结合CD71的FN3结构域制备成药物组合物，该药物组合物在药学上可接受的载体中包含有效量的结构域或分子作为活性成分。“载体”是指与活性化合物一起给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或负载体。这样的负载体可以是液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可以使用0.4％的盐水和0.3％的甘氨酸。这些溶液是无菌的，通常不含颗粒物质。它们可以通过常规的、众所周知的灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可以根据需要包含药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。在这样的药物制剂中本文公开的分子的浓度可以广泛变化，即从按重量计小于约0.5％、通常至少约1％至多达15或20％，并且将根据所选择的特定给药方式，主要基于所需剂量、流体体积、粘度等来选择。合适的负载体和制剂，包括其他人蛋白质，例如人血清白蛋白，描述于例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21^st Edition,Troy,D.B.ed.,Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006,Part 5,PharmaceuticalManufacturing第691-1092页，尤其参见第958-989页。

用于本文公开的FN3结构域的治疗用途的给药方式可以是将药剂递送至宿主的任何合适途径，诸如肠胃外给药，例如真皮内、肌内、腹腔内、静脉内或皮下、肺；经粘膜(口服、鼻内、***内、直肠)，使用片剂、胶囊、溶液、粉末、凝胶、颗粒中的制剂；以及包含在注射器、植入装置、渗透泵、药筒、微型泵中；或本领域公知的本领域技术人员理解的其他方式。可以通过例如关节内、支气管内、腹腔内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、***内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、宫内、血管内、膀胱内、病灶内、***、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮递送来实现位点特异性给药。

药物组合物可以作为试剂盒提供，该试剂盒包括包含如本文所述的药物组合物的容器。药物组合物可以例如以用于单剂量或多剂量的可注射溶液的形式提供，或作为将在注射前重构的无菌粉末提供。或者，这样的试剂盒可以包括用于药物组合物给药的干粉分散器、液体气溶胶发生器或雾化器。这样的试剂盒可以进一步包括关于药物组合物的适应症和用途的书面信息。

实施例

以下实施例用于说明本文所公开的实施方式。提供这些实施例仅用于说明的目的，并且实施方式绝不应被解释为限于这些实施例，而是应被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变体。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生基本相似的结果的各种非关键参数。

实施例1.具有随机化环的Tencon文库的构建

Tencon(SEQ ID NO:1)是一种免疫球蛋白样支架纤维粘连蛋白III型(FN3)结构域，由来自人生腱蛋白-C的15个FN3结构域的共有序列设计而成(Jacobs et al.,ProteinEngineering,Design,and Selection,25:107-117,2012；美国专利号8,278,419)。Tencon的晶体结构显示了连接七个β链的六个表面暴露环。这些环或每个环内的选定残基可以随机化以构建纤维粘连蛋白III型(FN3)结构域文库，该文库可用于选择结合特定靶标的新分子。

Tencon:

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT(SEQ ID NO 1)

使用Tencon支架和各种设计策略生成了各种文库。一般来说，文库TCL1和TCL2产生了良好的粘结剂。TCL1和TCL2文库的生成在国际专利公开号WO/2014081944A2中有详细描述。

TCL1文库的构建

构建了设计为仅使Tencon(SEQ ID NO:1)的FG环随机化的文库TCL1,以用于顺式展示***(Jacobs et al.,Protein Engineering,Design,and Selection,25:107-117,2012)。在该***中，产生了掺入有Tac启动子、Tencon文库编码序列、RepA编码序列、顺式元件和ori元件的序列的单链DNA。在体外转录/翻译***中表达后，产生了Tencon-RepA融合蛋白与编码它的DNA顺式结合的复合物。然后分离并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增与靶分子结合的复合物，如下所述。

用于顺式展示的TCL1文库的构建是通过连续几轮PCR以产生两半的最终线性双链DNA分子来实现的；5’片段包含启动子和Tencon序列，而3'片段包含repA基因和cis-和ori元件。这两半通过限制性消化组合起来，以产生整个构建体。TCL1文库被设计为仅在Tencon的FG环中引入随机氨基酸。NNS密码子用于该文库的构建，从而可能将所有20种氨基酸和一个终止密码子引入FG环中。TCL1文库包括六个独立的子库，每个子库具有不同的随机FG环长度(7至12个残基)，以进一步增加多样性。

TCL1文库(SEQ ID NO:2)

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX_7-12PLSAEFTT；

其中

X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇是任何氨基酸；并且

X₈、X₉、X₁₀、X₁₁和X₁₂是任何氨基酸或缺失

TCL2文库的构建

构建TCL2文库，其中Tencon的BC和FG环二者均随机化，并严格控制每个位置的氨基酸分布。表2示出了TCL2文库中期望环位置的氨基酸分布。设计的氨基酸分布有两个目的。首先，基于对Tencon晶体结构的分析和/或同源性建模，文库偏向于预测在结构上对Tencon折叠和稳定性重要的残基。例如，位置29固定为仅疏水氨基酸的子集，因为该残基掩埋在Tencon折叠的疏水核心中。第二层设计包括使氨基酸分布偏向优先在抗体的重链HCDR3中发现的残基，以有效地产生高亲和力结合物(Birtalan et al.,J Mol Biol 377:1518-28,2008；Olson et al.,Protein Sci 16:476-84,2007)。为实现这一目标，表2中的“设计分布”指的是如下分布：6％丙氨酸、6％精氨酸、3.9％天冬酰胺、7.5％天冬氨酸、2.5％谷氨酸、1.5％谷氨酰胺、15％甘氨酸、2.3％组氨酸、2.5％异亮氨酸、5％亮氨酸、1.5％赖氨酸、2.5％苯丙氨酸、4％脯氨酸、10％丝氨酸、4.5％苏氨酸、4％色氨酸、17.3％酪氨酸和4％缬氨酸。这种分布没有甲硫氨酸、半胱氨酸和终止密码子。

TCL2文库(SEQ ID NO:3)

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈SFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃SX₁₄X₁₅LSAEFTT；其中

X₁是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；

X₂是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；

X₃ Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；

X₄是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；

X₅是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；

X₆是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；

X₇是Phe、Ile、Leu、Val或Tyr；

X₈是Asp、Glu或Thr；

X₉是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；

X₁₀是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；

X₁₁是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；

X₁₂是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；

X₁₃是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；

X₁₄是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；以及

X₁₅是Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。

表2.TCL2文库中的残基分布

残基位置*	WT残基	TCL2文库中的分布
			22	T	设计的分布
23	A	设计的分布
			24	P	50％P+设计的分布
25	D	设计的分布
			26	A	20％A+20％G+设计的分布
27	A	设计的分布
			28	F	20％F、20％I、20％L、20％V、20％Y
29	D	33％D、33％E、33％T
			75	K	设计的分布
76	G	设计的分布
			77	G	设计的分布
78	H	设计的分布
			79	R	设计的分布
80	S	100％S
			81	N	设计的分布
82	P	50％P+设计的分布

*残基编号基于SEQ ID NO:1的Tencon序列

随后，通过各种方式改进这些文库，包括在与野生型Tencon相比引入了替换E11R/L17A/N46V/E86I(Tencon27；SEQ ID NO:4)的稳定的Tencon框架(美国专利号8,569,227)上构建文库以及在BC和FG环中随机化位置的改变。Tencon27描述在国际专利申请号WO2013049275中。由此，生成了被设计为仅使Tencon的FG环(文库TCL9)或使BC和FG环的组合(文库TCL7)随机化的新文库。这些文库构建用于顺式展示***(Odegrip et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:2806-2810,2004)。该设计的详细信息如下所示：

稳定的Tencon(Tencon27)(SEQ ID NO:4)

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT

TCL7(随机化FG和BC环)(SEQ ID NO:5)

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWX₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉FDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉SNPLSAIFTT；

其中

X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅和X₁₆是A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；并且

X₇、X₈、X₉、X₁₇、X₁₈和X₁₉是A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y或缺失。

TCL9(随机化FG环)(SEQ ID NO:6)

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂SNPLSAIFTT；

X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆和X₇是A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；并且

X₈、X₉、X₁₀、X₁₁和X₁₂是A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y或缺失。

对于文库构建，使用Slonomics技术(Sloning Biotechnology GmbH)合成编码随机BC环(长度6-9个位置)或FG环(长度7-12个位置)的DNA片段，以控制文库的氨基酸分布并消除终止密码子。独立合成使BC环或FG环随机化的两组不同的DNA分子，然后使用PCR组合以产生完整的文库产物。

FG环文库(TCL9)的构建

产生了一组合成DNA分子，其由5'Tac启动子后跟Tencon的完整基因序列(FG环中的随机密码子除外)组成(SEQ ID NO:26-31)。对于FG环随机化，除了半胱氨酸和甲硫氨酸以外的所有氨基酸以相等的百分比编码。多样化部分的长度使得它们编码FG环中的7、8、9、10、11或12个氨基酸。以2ug的规模单独合成每个长度变化的子文库，然后使用寡核苷酸Sloning-FOR(SEQ ID NO:9)和Sloning-Rev(SEQ ID NO:10)通过PCR扩增。

文库的3’片段是恒定DNA序列，包含用于展示的元件，包括PspOMI限制性位点、repA基因的编码区以及cis-和ori元件。使用质粒(pCR4Blunt)(Invitrogen)作为模板，使用M13正向和M13反向引物进行PCR反应以扩增该片段。将所得PCR产物用PspOMI消化过夜并进行凝胶纯化。为了将文库DNA的5’部分连接到包含repA基因的3'DNA，在NotI和PspOMI酶和T4连接酶的存在下，将2pmol(～540ng至560ng)的5’DNA与等摩尔(～1.25μg)的3’repADNA在37℃下连接过夜。连接的文库产物通过使用寡核苷酸POP2250(SEQ ID NO:11)和DigLigRev(SEQ ID NO:12)的12个PCR循环进行扩增。对于每个子库，将来自12个PCR反应的所得DNA合并并通过Qiagen离心柱纯化。TCL9的每个子文库的产量范围为32-34μg。

FG/BC环文库(TCL7)的构建

TCL7文库提供了具有随机化Tencon BC和FG环的文库。在该文库中，长度为6-9个氨基酸的BC环与长度为7-12个氨基酸的随机化FG环组合混合。产生了合成Tencon片段BC6、BC7、BC8和BC9(分别为SEQ ID NO:13-16)以包括Tencon基因，该基因编码蛋白质的N末端部分直至并包括残基VX，使得BC环被替换为6、7、8或9个随机氨基酸，其由本文提供的序列中的“N”串表示。这些片段是在发现L17A、N46V和E83I突变(CEN5243)之前合成的，但是在下面描述的分子生物学步骤中引入了这些突变。为了将该片段与编码随机化FG环的片段组合，采取了以下步骤。

首先，使用寡核苷酸POP2222ext(SEQ ID NO:18)和LS1114(SEQ ID NO:19)通过PCR产生编码Tac启动子和Tencon的5'序列直至编码氨基酸A17的核苷酸的DNA片段(130mer-L17A，SEQ ID NO:17)。这样做是为了在文库中包括L17A突变(CEN5243)。接下来，使用BC6、BC7、BC8或BC9作为模板和寡核苷酸LS1115(SEQ ID NO:20)和LS1117(SEQ ID NO:21)，通过PCR扩增编码包括随机化BC环的Tencon残基R18-V75的DNA片段。该PCR步骤在3'端引入了BsaI位点。随后使用寡核苷酸POP2222ext和LS1117作为引物，通过重叠PCR将这些DNA片段连接起来。将所得240bp的PCR产物汇集并通过Qiagen PCR纯化试剂盒进行纯化。将纯化的DNA用BsaI-HF消化并进行凝胶纯化。

使用FG7、FG8、FG9、FG10、FG11和FG12作为模板，使用寡核苷酸SDG10(SEQ ID NO:22)和SDG24(SEQ ID NO:23)通过PCR扩增编码FG环的片段，以引入BsaI限制性位点和N46V和E86I变体(CEN5243)。

消化的BC片段和FG片段使用3路连接在一个步骤中连接在一起。设置了16种可能的组合中的四种连接反应，每种连接反应组合了两种BC环长度和2种FG环长度。每种连接包含～300ng的总BC片段和300ng的FG片段。然后使用寡核苷酸POP2222(SEQ ID NO:24)和SDG28 SEQ ID NO:25)通过PCR扩增这4个连接池。然后将7.5μg的每种反应产物用Not1消化，并用Qiagen PCR纯化柱进行净化。将5.2μg该DNA连接到用PspOMI消化的等摩尔量的RepA DNA片段(～14μg)，并使用寡核苷酸POP2222通过PCR扩增产物。

实施例2:具有替代结合表面的Tencon文库的产生

在特定文库设计中随机化的残基的选择决定了所产生的相互作用表面的整体形状。对从文库(其中BC、DE和FG环随机化)选择的FN3结构域(其包含结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的支架蛋白)进行X射线晶体学分析,显示了具有适合MBP的活性位点的大部分弯曲界面(Koide et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104:6632-6637,2007)。相反，发现选择与MBP结合的锚蛋白重复支架蛋白具有更平坦的相互作用表面并结合MBP的远离活性物质的外表面(Binz等人，Nat.Biotechnol.22:575-582，2004)。这些结果表明，支架分子结合表面的形状(弯曲与平坦)可能决定了哪些靶蛋白或所述靶蛋白上的特定表位能够被支架有效结合。围绕对包含FN3结构域的蛋白质支架进行工程化以用于蛋白质结合的已公开的努力，依赖于对相邻环进行工程化以用于靶标结合，从而产生弯曲的结合表面。这种方法可能会限制通过这样的支架可访问的靶标和表位的数量。

Tencon和其他FN3结构域包含位于分子相对面上的两组CDR样环，第一组由BC、DE和FG环形成，第二组由AB、CD和EF环形成。两组环由形成FN3结构中心的β链分开。如果将Tencon的图像旋转90度，则可以看到替代表面。该略微凹入的表面由CD和FG环以及两条反平行的β链(C和Fβ链)形成，在本文中称为C-CD-F-FG表面。C-CD-F-FG表面可用作模板，通过使形成表面的残基子集随机化来设计蛋白质支架相互作用表面的文库。β-链具有重复结构，每个其他残基的侧链都暴露在蛋白质表面。因此，可以通过使β链中的一些或所有表面暴露残基随机化来构建文库。通过在β链中选择适当的残基，Tencon支架的固有稳定性应受到最小程度的损害，同时为与其他蛋白质的相互作用提供独特的支架表面。

文库TCL14(SEQ ID NO:7)被设计成Tencon27支架(SEQ ID NO:4)。

用于构建该文库的方法的完整描述在美国专利公开号2013/0226834中进行了描述。

TCL14文库(SEQ ID NO:7):

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX₁IX₂YX₃EX₄X₅X₆X₇GE AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX₈VX₉IX₁₀GVKGGX₁₁X₁₂SX₁₃PLSAIFTT；

其中

X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀、X₁₁、X₁₂和X₁₃是A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、C或M。

在Tencon27中形成C-CD-F-FG表面的两条β链共有9个可随机化的表面暴露残基；C链：S30、L32、Q34、Q36；F链：E66、T68、S70、Y72和V74，而CD环具有6个潜在残基：S38、E39、K40、V41、G42和E43，并且FG环具有7个潜在残基：K75、G76、G77、H78、R79、S80和N81。选择了选择的残基以包含在TCL14设计中，因为如果所有22种残基都随机化，则文库的理论大小较大。

选择Tencon中的13个位置进行随机化：C链中的L32、Q34和Q36，CD环中的S38、E39、K40和V41，F链中的T68、S70和Y72，以及FG环中的H78、R79和N81。在C和F链中，S30和E66不进行随机化，因为它们刚好位于CD和FG环之外，并且看起来不像是C-CD-F-FG表面的一部分。对于CD环，G42和E43不随机化为甘氨酸，提供了柔韧性，在环区域可能很有价值，并且E43位于表面的连接处。FG环排除了K75、G76、G77和S80。由于上述原因，排除了甘氨酸，而对晶体结构的仔细检查显示S80与核心进行关键接触以帮助形成稳定的FG环。K75远离面对C-CD-F-FG表面的表面，并且对于随机化来说是不太吸引人的候选。尽管上述残基在最初的TCL14设计中没有随机化，但它们可以包括在随后的文库设计中，以为从头选择或为针对例如选择的TCL14靶标特异性命中物的亲和力成熟文库提供额外的多样性。

在产生TCL14之后，又产生了类似设计的3个额外Tencon文库。这两个文库TCL19、TCL21和TCL23在与TCL14相同的位置处随机化(见上文)，但是在这些位置发生的氨基酸分布发生了变化(表3)。TCL19和TCL21设计为在每个位置包括了18种天然氨基酸的相等分布(每种约5.55％)，仅排除半胱氨酸和甲硫氨酸。TCL23被设计为使得每个随机化位置接近于在功能性抗体的HCDR3环中发现的氨基酸分布(Birtalan et al.,J.Mol.Biol.377:1518-1528,2008)，如表3中所述。与TCL21文库一样,排除了半胱氨酸和甲硫氨酸。

构建了第三个额外文库以扩展其他文库文库的潜在靶结合表面。在这个文库TCL24中，与文库TCL14、TCL19、TCL21和TCL23相比，4个额外的Tencon位置被随机化。这些位置包括来自D链的N46和T48以及来自G链的S84和I86。特别选择位置46、48、84和86，因为这些残基的侧链是从β链D和G中暴露的表面，并且在结构上与C和F链的随机化部分相邻，从而增加可与靶蛋白结合的表面积。TCL24在每个位置使用的氨基酸分布与表3中对于TCL19和TCL21描述的相同。

TCL24文库(SEQ ID NO:8)

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX₁IX₂YX₃EX₄X₅X₆X₇GEAIX₈LX₉VPGSERSYDLTGLKPGTEYX₁₀VX₁₁IX₁₂GVKGGX₁₃X₁₄SX₁₅PLX₁₆AX₁₇FTT；

其中

X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆和X₁₇是A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、Y或W。

表3.在TCL21、TCL23和TCL24的每个随机化位置处的氨基酸频率(％)。

TCL21、TCL23和TCL24文库的产生

使用Colibra文库技术(Isogenica)产生TCL21文库以控制氨基酸分布。使用Slonomics技术(Morphosys)产生TCL19、TCL23和TCL24基因片段以控制氨基酸分布。PCR用于在初始合成后扩增每个文库，然后连接到RepA的基因，以便在使用CIS展示***的选择中使用(Odegrip et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:2806-2810,2004),如上文对于文库的描述。

实施例3:结合CD71的纤维粘连蛋白III型(FN3)结构域的选择

淘洗和生化筛选

通过CIS-Display(Odegrip et al 2004)使用具有N末端6H标签的重组生物素化CD71胞外结构域(Sino Biologics)选择对人CD71具有特异性的FN3结构域。对于体外转录和翻译(ITT)，使用来自FN3结构域文库TCL18、TCL19、TCL21、TCL23和TCL24的3μg DNA，通过洗涤去除未结合的文库成员。将DNA通过加热从靶蛋白中洗脱出来，并使用KOD聚合酶通过PCR进行扩增，用于进一步的淘选轮次。通过在每轮中连续将靶标CD71的浓度从400nM降低到100nM并增加洗涤严格性来分离高亲和力结合物。对来自第五轮淘选的输出进行四轮额外的解离率选择。生物素化的靶抗原浓度从第6轮和第7轮的25nM降低到第8轮和第9轮的2.5nM。

淘选后，通过PCR扩增编码选择的FN3结构域的基因，亚克隆到经过修饰以包含连接酶独立克隆位点的pET载体中，并转化到BL21(DE3)(Stratagene)细胞中，用于使用标准分子生物学技术在大肠杆菌中进行可溶性表达。将编码C末端聚组氨酸标签的基因序列添加到每个FN3结构域以实现纯化和检测。

为了筛选特异性结合CD71的FN3结构域，将链霉亲和素包被的Maxisorp板(Nunc目录436110)在起始块T20(Pierce)中封闭1小时，然后用生物素化的CD71(使用与淘选中相同的抗原)或阴性对照(不相关的Fc融合重组蛋白和人血清白蛋白)包被1小时。用TBST冲洗板并将稀释的裂解物施加到板上1小时。额外冲洗后，将孔用HRP缀合的抗V5标签抗体(Abcam,ab1325)处理1小时，然后用POD(Roche,11582950001)进行测定。对来自信号比链霉亲和素对照的ELISA信号高至少10倍的FN3结构域裂解物的DNA进行测序，从而产生从第9轮筛选中分离的23个独特、可读的FN3结构域序列(表4)。

表4.筛选命中物总结

尺寸排阻色谱法分析

尺寸排阻色谱法用于确定抗CD71 FN3结构域的聚集状态。在PBS pH 7.4的流动相中，以0.3mL/min的流速将每种纯化的FN3结构域的等分样品(10μL)进样到Superdex 75 5/150柱(GE Healthcare)上。通过280nm处的吸光度监测柱的洗脱。在每次运行中包括Tencon蛋白作为对照。Agilent ChemStation软件用于分析洗脱曲线。表5列出了18个已鉴定的FN3结构域的选择的SEC参数。

表5.尺寸排阻色谱法分析总结

高通量表达和缀合

鉴定的克隆在24孔的深块板中以5mL为重复的培养物中生长。简而言之，在5mL/孔的补充有50μg/mL卡那霉素的TB培养基中接种150μL过夜培养物，在37℃下以220rpm(OD600～1)振荡生长约3小时。用IPTG将培养物诱导至终浓度为1mM，在37℃、220rpm下再进行4小时。通过以2250xg离心15分钟回收细菌沉淀。将600μL/孔的补充有0.2mg/mL溶菌酶(Sigma)的BugBuster HT(Novagen)添加到每个孔中；用移液管使沉淀解离，然后在震动平台上剧烈震动约30分钟，直到沉淀溶解。将板在2250xg下旋转15分钟以使裂解物澄清，然后合并每个样品的2600μL等分样品。根据制造商的说明，在His Trap板(GE)上纯化带有His标签的FN3结构域，然后使用Zeba Spin 7K脱盐板(Thermo Scientific)将缓冲液交换到TBS中。通过Nanodrop评估蛋白质浓度。为了与GlyGly-VC-MMAF缀合，在200μL总体积中将FN3结构域(30μM)与150μM GlyGlyVC-MMAF(Concortis)和1μM SortaseA混合。根据制造商的说明，使缀合在室温下进行1.5小时，并使用来自GE Healthcare的96孔His Multitrap HP板再次纯化。使用Zeba脱盐板实现缓冲液交换到PBS中，然后使用Multiscreen HTS GV板(Durapore)进行无菌过滤，并在3000xg下离心2分钟。通过Nanodrop评估浓度。

SK-BR3结合FN3结构域的鉴定

将SK-BR-3细胞培养在McCoy的5a培养基+10％胎牛血清中。在FACS缓冲液中制备FN3稀释液。每孔添加50,000个SK-BR-3细胞；离心后吸出培养基，将细胞重悬于100μL包含HiLyte标记的FN3结构域的FACS缓冲液中。将细胞在37℃、5％CO2下孵育2小时。将细胞用FACS缓冲液冲洗3次，最后重悬于100μL FACS缓冲液中。通过Intellictye检测荧光。细胞群由FSC-SSC点图鉴定，然后记录FL4 MFI。将数据相对于8个未染色细胞的平均值进行归一化，并使用GraphPad拟合剂量反应曲线。

通过剂量反应ELISA的选择的克隆的结合

通过ELISA分析选择的克隆以确定结合的EC50值。简而言之，将Maxisorb板用5μg/ml的链霉亲和素在4C下包被过夜。然后将板在室温下用StartingBlock(ThermoFisher)封闭1小时，然后用TBS-Tween洗涤。将生物素化的CD71(2μg/ml)捕获到链霉亲和素板上，并在室温下将连续稀释的Centyrins添加到适当的孔中1小时。洗涤后，用与HRP和POD底物缀合的抗V5标签抗体检测结合的Centyrin,并通过读板器读取发光。将发光值绘制为浓度的函数，并使用PRISM拟合剂量反应以确定结合的EC50值。

通过毒素缀合物鉴定内化FN3结构域。使用对于NEM缀合描述的方法，通过酶可切割的Val-Cit接头或不可切割的PEG4接头(VC-MMAF)将FN3结构域缀合到细胞毒性微管蛋白抑制剂单甲基奥瑞他汀F(MMAF)。通过测量经暴露于半胱氨酸变体-细胞毒素缀合物后的SKBR-3细胞的活力来评估细胞杀伤。将细胞在50μL/孔的具有10％胎牛血清(Gibco)的酚红RPMI培养基(Gibco,11875093)中以3000个/孔接种在白孔、不透明底、组织培养物处理板(Fisher，PI15042)中。允许细胞在37℃下在湿润的5％CO2气氛中附着过夜。用25uL新鲜培养基和25uL在新鲜培养基中配制的4x抑制剂处理细胞。通过使用Cell TiterGlo(Promega)在72小时时的终点测定来确定细胞生存力。通过使用GraphPad Prism(GraphPadSoftware)将数据拟合到具有可变斜率的S型剂量反应方程来确定的IC50值。结果示出在表6中，并且表明与CD71结合的FN3结构域被内化并具有细胞毒性。

表6:SKBR-3细胞中CD71 FN3-MMAF缀合分子的IC50

二价FN3蛋白

使用通过4重复G/S接头连接的两个FN3结构域产生二价FN3蛋白。如所述使二价FN3蛋白与VC-MMAF缀合，并评估SK-BR3细胞中的细胞毒性。发现二价分子的IC50值更好。

转铁蛋白结合和内化的竞争

使用上述细胞毒性测定法筛选FN3结构域VCMMAF缀合物与人转铁蛋白的竞争。在不存在或存在0.6uM饱和人转铁蛋白(T0665-100MG)的情况下筛选FN3结构域。在不存在或存在竞争物的情况下筛选的SK-BR3细胞上的FN3结构域毒素缀合物的IC50值示出在表7中。

表7:SKBR-3细胞(+/-人转铁蛋白)上的CD71 FN3结构域-MMAF缀合分子的IC50

SEQ ID NO:1＝原始Tencon序列

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT

SEQ ID NO:2＝TCL1文库

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV(X)_7-12PLSAEFTT；

其中

X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇是任何氨基酸；并且

X₈、X₉、X₁₀、X₁₁和X₁₂是任何氨基酸或缺失

SEQ ID NO:3＝TCL2文库

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈SFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃SX₁₄X₁₅LSAEFTT；

其中

X₃Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；

X₇是Phe、Ile、Leu、Val或Tyr；

X₈是Asp、Glu或Thr；

SEQ ID NO:4＝稳定Tencon

SEQ ID NO:5＝TCL7(FG和BC环)

其中

X₇、X₈、X₉、X₁₇、X₁₈和X₁₉是A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y或缺失

SEQ ID NO:6＝TCL9(FG环)

其中

TCL14文库(SEQ ID NO:7)

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX₁IX₂YX₃EX₄X₅X₆X₇GEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX₈VX₉IX₁₀GVKGGX₁₁X₁₂SX₁₃PLSAIFTT；

其中

TCL24文库(SEQ ID NO:8)

其中

SEQ ID NO:9＝Sloning-FOR

GTGACACGGCGGTTAGAAC

SEQ ID NO:10＝Sloning-REV

GCCTTTGGGAAGCTTCTAAG

SEQ ID NO:11＝POP2250

CGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATAC

SEQ ID NO:12＝DigLigRev

CATGATTACGCCAAGCTCAGAA

SEQ ID NO:13＝BC9

GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC(其中N是任何碱基)

SEQ ID NO:14＝BC8

GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC(其中N是任何碱基)

SEQ ID NO:15＝BC7

GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC(其中N是任何碱基)

SEQ ID NO:16＝BC6

GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC(其中N是任何碱基)

SEQ ID NO:17＝130mer-L17A

CGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTG

SEQ ID NO:18＝POP222ext

CGG CGG TTA GAA CGC GGC TAC AAT TAA TAC

SEQ ID NO:19＝LS1114

CCA AGA CAG ACG GGC AGA GTC TTC GGT AAC GCG AGA AAC AAC CAG GTT TTTCGG CGC CGG CAG CAT GGT AGA TCC TGT TTC

SEQ ID NO:20＝LS1115

CCG AAG ACT CTG CCC GTC TGT CTT GG

SEQ ID NO:21＝LS1117

CAG TGG TCT CAC GGA TTC CTG GTA CTG GAT CAG GAA AGA GTC GAA

SEQ ID NO:22＝SDG10

CATGCGGTCTCTTCCGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTCCTGACCGTTCCGGGT

SEQ ID NO:23＝SDG24

GGTGGTGAAGATCGCAGACAGCGGGTTAG

SEQ ID NO:24＝POP2222

CGGCGGTTAGAACGCGGCTAC

SEQ ID NO:25＝SDG28

AAGATCAGTTGCGGCCGCTAGACTAGAACCGCTGCCACCGCCGGTGGTGAAGATCGCAGAC

SEQ ID NO:26＝FG12

GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC(其中N是任何碱基)

SEQ ID NO:27＝FG11

GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC(其中N是任何碱基)

SEQ ID NO:28＝FG10

GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC(其中N是任何碱基)

SEQ ID NO:29＝FG9

GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC(其中N是任何碱基)

SEQ ID NO:30＝FG8

GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC(其中N是任何碱基)

SEQ ID NO:31＝FG7

GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC(其中N是任何碱基)

SEQ ID NO:32＝人成熟CD71

MTKEYQDLQHLDNEESDHHQLRKGPPPPQPLLQRLCSGPRLLLLSLGLSLLLLVVVCVIGSQNSQLQEELRGLRETFSNFTASTEAQVKGLSTQGGNVGRKMKSLESQLEKQQKDLSEDHSSLLLHVKQFVSDLRSLSCQMAALQGNGSERTCCPVNWVEHERSCYWFSRSGKAWADADNYCRLEDAHLVVVTSWEEQKFVQHHIGPVNTWMGLHDQNGPWKWVDGTDYETGFKNWRPEQPDDWYGHGLGGGEDCAHFTDDGRWNDDVCQRPYRWVCETELDKASQEPPLL

SEQ ID NO:80＝人成熟CD71胞外结构域

QNSQLQEELRGLRETFSNFTASTEAQVKGLSTQGGNVGRKMKSLESQLEKQQKDLSEDHSSLLLHVKQFVSDLRSLSCQMAALQGNGSERTCCPVNWVEHERSCYWFSRSGKAWADADNYCRLEDAHLVVVTSWEEQKFVQHHIGPVNTWMGLHDQNGPWKWVDGTDYETGFKNWRPEQPDDWYGHGLGGGEDCAHFTDDGRWNDDVCQRPYRWVCETELDKASQEPPLL

实施例4:结合CD71的纤维粘连蛋白III型(FN3)结构域的选择

用于鉴定与CD71结合但不抑制转铁蛋白与CD71结合的FN3结构域的淘选和生化筛选方法。为了筛选特异性结合CD71并且不抑制转铁蛋白与CD71结合的FN3结构域，将链霉亲和素包被的Maxisorp板(Nunc目录436110)在Starting Block T20(Pierce)中封闭1小时，然后在转铁蛋白的存在下或在与CD71转铁蛋白结合位点结合的FN3蛋白情况下用生物素化的CD71(使用与淘选中相同的抗原)或阴性对照(不相关的Fc融合重组蛋白和人血清白蛋白)包被1小时。转铁蛋白的浓度最高达35μM。不受任何特定理论的束缚，包括转铁蛋白或与CD71转铁蛋白结合位点结合的FN3蛋白将FN3结构域的选择推向那些不竞争或抑制转铁蛋白与CD71结合的结构域。用TBST冲洗板并将稀释的裂解物施加到板上1小时。额外冲洗后，将孔用HRP缀合的抗V5标签抗体(Abcam,ab1325)处理1小时，然后用POD(Roche,11582950001)进行测定。对来自信号比链霉亲和素对照的ELISA信号高至少10倍的FN3结构域裂解物的DNA进行测序，得到从筛选中分离的FN3结构域序列。

实施例5:结合CD71且不与转铁蛋白竞争的纤维粘连蛋白III型(FN3)结构域的选择

为了鉴定与转铁蛋白不竞争或竞争最小的CD71结合FN3结构域，设计了偏向CIS展示策略。简而言之，使用在人CD71的ECD上进行5轮汰选后回收的输出(实施例3)。如实施例3中所述进行额外轮次的解离率选择，其中添加1)使用人饱和转铁蛋白的洗涤步骤以在最终洗脱步骤之前洗脱与转铁蛋白在相同位点结合的Centyrin或2)用单克隆抗体OKT9洗脱FN3结构域结合物。如前所述(实施例3)，对从转铁蛋白洗涤策略和OKT9洗脱策略回收的FN3结构域进行PCR扩增并克隆到pET载体中。通过ELISA确认特异性结合huCD71的228个FN3结构域与huCD71 ECD的结合(表8)。通过SEC(表9)分析独特结合物的子集，与MMAF缀合并通过+/-饱和人转铁蛋白的SKBR-3细胞中的细胞生存力测定评估内化(表10)。发现多肽通过受体内化。命中物的数据和序列在下表中确定。

表8.筛选命中物总结

表9.尺寸排阻色谱法分析总结

表10:SKBR-3细胞上CD71 FN3结构域-MMAF缀合分子5的IC50+/-人转铁蛋白

实施例6.使用CD71 FN3结构域-寡核苷酸缀合物敲减肌肉细胞中的mRNA。使用马来酰亚胺化学通过独特工程化到FN3结构域中的半胱氨酸使muCD71结合FN3结构域与siRNA寡核苷酸或反义寡核苷酸(ASO)缀合。半胱氨酸替换可以是诸如本文所提供的那些以及也如美国专利申请公开号20150104808中所提供的那些，其通过援引整体并入本文。siRNA或ASO使用标准化学修饰进行修饰，并确认能够在体外敲减靶mRNA。将FN3结构域-寡核苷酸偶联物以最高达10mg/kg寡核苷酸载荷的剂量在小鼠中静脉内给药。在给药后的不同时间点处死小鼠；回收骨骼肌、心肌和各种其他组织并储存在RNAlater^TM(Sigma Aldrich)中，直到需要。使用标准qPCRΔΔC_T方法和对靶基因和对照基因特异的引物来评估靶基因敲减。发现肌肉中的靶基因被敲减，并且通过使siRNA或ASO与CD71 FN3结合域缀合增强了这种敲减。

实施例7.一般方法

分子生物学中的标准方法描述于以下中：Sambrook,Fritsch and Maniatis(1982&1989 2^nd Edition,2001 3^rd Edition)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook andRussell(2001)Molecular Cloning,3^rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.217,Academic Press,SanDiego,CA)。标准方法也出现在Ausbel,et al.(2001)Current Protocols in MolecularBiology,Vols.1-4,John Wiley and Sons,Inc.New York,NY中,其描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)和生物信息学(第4卷)。

描述了用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱、电泳、离心和结晶(Coligan,et al.(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白质的糖基化(参见例如,Coligan,et al.(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.2,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel,et al.(2001)Current Protocols inMolecular Biology,Vol.3,John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY,pp.16.0.5-16.22.17；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；pp.45-89；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,pp.384-391)。描述了多克隆和单克隆抗体的生产、纯化和片段化(Coligan,et al.(2001)CurrentProtocols in Immunology,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow andLane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY；Harlow and Lane,同上)。可使用用于表征配体/受体相互作用的标准技术(参见例如,Coligan,et al.(2001)Current Protocols in Immunology,Vol.4,John Wiley,Inc.,New York)。

本文引用的所有参考文献均通过援引并入，程度如同每个单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利被具体地和单独地指示通过援引并入一样。申请人预期，根据37C.F.R.§1.57(b)(1)通过援引并入的该声明涉及各个和每个单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利，其每一个都根据37C.F.R.§1.57(b)(2)明确标识，即使此类引文与通过援引并入的明确声明并不直接相邻。在说明书中包括通过援引并入的专用声明(如果有的话)不会以任何方式削弱通过援引并入的该一般声明。本文引用参考文献并不意味着承认该参考文献是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。

本实施方式的范围不受本文描述的具体实施方式的限制。实际上，除了本文描述的那些之外，实施方式的各种修改通过前面的描述对于本领域技术人员将变得显而易见。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。

前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实践实施方式。除了在此示出和描述的那些之外，实施方式的各种修改通过前面的描述对于本领域技术人员将变得显而易见并且落入所附权利要求的范围内。

Claims

1.一种包括与以下氨基酸序列至少90％的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85、149、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309或其任何组合；或一种包括以下氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85、149、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309或其任何组合。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包括以下中的两种：SEQ ID NO:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85、149、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309。

3.一种多肽，其在CD71上不与转铁蛋白竞争结合CD71的位点处与人CD71结合。

4.根据权利要求3所述的多肽，其中所述多肽包括与具有以下序列的多肽至少90％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85或149。

5.根据权利要求3所述的多肽，其中所述多肽包括以下序列：SEQ ID NO:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85或149。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中所述多肽与可检测标记、寡核苷酸、治疗剂或其任何组合缀合。

7.根据权利要求6所述的多肽，其中所述可检测标记是放射性同位素、磁珠、金属珠、胶体颗粒、荧光染料、电子致密试剂、酶、生物素、地高辛或半抗原。

8.根据权利要求6或7所述的多肽，其中所述可检测标记是奥瑞他汀、单甲基奥瑞他汀苯丙氨酸、多拉司他汀、化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素或放射性同位素。

9.根据权利要求6所述的多肽，其中所述治疗剂是化疗剂、药物、抗体、生长抑制剂、毒素、放射性同位素、抗微管蛋白剂、多核苷酸、siRNA分子或其有义或反义链、反义分子或其链、RNA分子、DNA分子、DNA小沟结合物、DNA复制抑制剂、烷化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢药、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂或长春花生物碱。

10.根据权利要求6所述的多肽，其中所述治疗剂可以通过调节基因表达、RNA表达或水平、微管蛋白结合、DNA结合、拓扑异构酶抑制、DNA交联、螯合、剪接体抑制、NAMPT抑制、或HDAC抑制而引起一种或多种细胞毒性作用。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的多肽，进一步包括在所述多肽的N末端的甲硫氨酸。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的多肽，其中所述多肽与半衰期延长部分偶联。

13.根据权利要求12所述的多肽，其中所述半衰期延长部分是白蛋白结合分子、聚乙二醇(PEG)、白蛋白、白蛋白变体、免疫球蛋白的Fc区的至少一部分。

14.根据权利要求13所述的多肽，其中所述白蛋白结合分子是结合白蛋白或白蛋白变体的第二多肽。

15.一种编码根据权利要求1-14中任一项所述的多肽的分离的多核苷酸。

16.一种包括根据权利要求15所述的多核苷酸的载体。

17.一种包括根据权利要求16所述的载体的宿主细胞。

18.一种生产结合CD71的多肽的方法，包括在表达所述多肽的条件下培养根据权利要求17所述的分离的宿主细胞，以及纯化所述多肽。

19.一种药物组合物，包括根据权利要求1-14中任一项所述的多肽和药学上可接受的载体。

20.一种结合根据权利要求1-14中任一项所述的多肽的抗独特型抗体。

21.一种包括根据权利要求1-14中任一项的多肽的试剂盒。

22.一种在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给药本文提供的多肽，诸如SEQ ID NO:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85、149、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309，或根据权利要求3所述的多肽，以及治疗剂。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述癌症是脑癌。

24.一种在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给药本文提供的多肽，诸如SEQ ID NO:33-62或81-309，或根据权利要求3所述的多肽，其与抗病毒剂、免疫***调节剂或核酸分子缀合。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述癌症疾病是胶质母细胞瘤。

26.一种检测肿瘤组织中的表达CD71的癌细胞的方法，包括

a)从受试者获得所述肿瘤组织的样品；以及

b)通过使所述肿瘤组织的所述样品与包括SEQ ID NO:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85、149、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或81-309中之一的氨基酸序列的多肽接触以及检测CD71与所述多肽之间的结合来检测所述肿瘤组织中是否表达CD71。

27.一种分离表达CD71的细胞的方法，包括

a)从受试者获得样品；

b)使所述样品与包括SEQ ID NO:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85、149、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或81-309中之一的所述氨基酸序列的多肽接触，以及

c)分离与所述多肽结合的所述细胞。

28.一种检测肿瘤组织中的表达CD71的癌细胞的方法，包括

a)使包括SEQ ID NO:33-62或81-309中之一的所述氨基酸序列的肽与可检测标记缀合以形成缀合物；

b)向受试者给药所述缀合物；以及

c)使与所述缀合物结合的所述表达CD71的癌细胞可视化。

29.一种治疗神经病症和/或脑肿瘤的方法，包括向受试者给药根据权利要求19所述的药物组合物。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述脑肿瘤选自由非恶性、良性和恶性脑肿瘤组成的组。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述恶性脑肿瘤选自由以下组成的组：星形细胞瘤、髓母细胞瘤、胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤(松果体瘤)、多形性胶质母细胞瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤或脊髓癌，例如神经纤维瘤、脑膜瘤、胶质瘤和肉瘤。

32.根据权利要求30所述的方法，其中所述脑肿瘤是先天性肿瘤。

33.根据权利要求29所述的方法，其中所述神经病症选自由以下组成的组：卒中、糖尿病、惊厥、高血压脑病、获得性免疫缺陷综合征、颅脑损伤、多发性硬化症、帕金森病(PD)和阿尔茨海默病。

34.一种将目标药剂递送至CD71阳性细胞的方法，所述方法包括使细胞接触与结合CD71的FN3结构域偶联的所述目标药剂，诸如根据权利要求1-14中任一项所述的多肽。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述目标药剂通过所述CD71介导的相互作用被内化到所述细胞中。

36.根据权利要求34所述的方法，其中所述FN3结构域不与转铁蛋白竞争结合CD71。

37.根据权利要求32-36中任一项所述的方法，其中所述目标药剂是化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素、放射性同位素、抗微管蛋白剂、多核苷酸、siRNA分子、反义分子、RNA分子、DNA分子、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢药、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂或长春花生物碱。

38.根据权利要求34-37中任一项所述的方法，其中所述FN3结构域包括SEQ ID NO:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85、149、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、81-309的序列或根据权利要求3所述的多肽。

39.根据权利要求34-38中任一项所述的方法，其中所述细胞是肌肉细胞。

40.根据权利要求34-38中任一项所述的方法，其中所述细胞是脑细胞或血脑屏障内的细胞。

41.一种鉴定在不竞争或抑制转铁蛋白与CD71结合的位点处与CD71结合的FN3蛋白的方法，所述方法包括：

在转铁蛋白或与所述CD71转铁蛋白结合位点结合的试剂的存在下使CD71与测试FN3蛋白接触；以及

鉴定在转铁蛋白或与所述CD71转铁蛋白结合位点结合的试剂的存在下与CD71结合的测试FN3蛋白。

42.根据权利要求40所述的方法，进一步包括分离在转铁蛋白或与所述CD71转铁蛋白结合位点结合的试剂的存在下与CD71结合的所述测试FN3蛋白。

43.根据权利要求40或41所述的方法，进一步包括对在转铁蛋白或与所述CD71转铁蛋白结合位点结合的试剂的存在下与CD71结合的所述测试FN3蛋白进行测序。

44.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，进一步包括制备或获得编码在转铁蛋白或与所述CD71转铁蛋白结合位点结合的试剂的存在下与CD71结合的所述测试FN3蛋白的核酸序列。

45.根据权利要求41-44中任一项所述的方法，进一步包括由编码在转铁蛋白或与所述CD71转铁蛋白结合位点结合的试剂的存在下与CD71结合的所述测试FN3蛋白的核酸序列表达在转铁蛋白或与所述CD71转铁蛋白结合位点结合的试剂的存在下与CD71结合的所述测试FN3蛋白。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述测试FN3蛋白在细胞中表达。

47.根据权利要求45所述的方法，进一步包括分离和/或纯化所述表达的测试FN3蛋白。

48.一种根据权利要求41-47中任一项鉴定的FN3蛋白。

49.一种包括根据权利要求48所述的FN3蛋白的药物组合物。

50.一种编码根据权利要求48所述的多肽的分离的多核苷酸。

51.一种包括根据权利要求49所述的多核苷酸的载体。

52.一种包括根据权利要求51所述的载体的宿主细胞。