CN111593145A

CN111593145A - 一种CRISPR/Cas12一步核酸检测方法及新型冠状病毒检测试剂盒

Info

Publication number: CN111593145A
Application number: CN202010531548.4A
Authority: CN
Inventors: 汤光辉; 薛良; 代文俊
Original assignee: Decipher Bioscience Shenzhen Co ltd
Current assignee: Decipher Bioscience Shenzhen Co ltd
Priority date: 2020-06-11
Filing date: 2020-06-11
Publication date: 2020-08-28
Anticipated expiration: 2040-06-11
Also published as: CN111593145B

Abstract

本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种CRISPR/Cas12一步核酸检测方法及新型冠状病毒检测试剂盒，其中所述新型冠状病毒检测试剂盒包括crRNA、Cas蛋白、引物、缓冲体系和单链DNA报告分子；所述引物为：在待检测靶标分子区域寻找5’‑TTTN‑3’序列，并在其近5’区域0‑200bp内设计正向引物，在其近3’区域25‑200bp内设计反向引物，所得引物进行化学修饰防止DNA酶或激活后Cas12蛋白降解。本发明有益效果在于：相比于市面上现有的基于PCR核酸检测技术，本申请的核酸检测方法和新型冠状病毒检测试剂盒，使扩增和检测可以同步进行，因而操作更为便捷。

Description

一种CRISPR/Cas12一步核酸检测方法及新型冠状病毒检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种基于CRISPR/Cas12和RPA 等温扩增的一步法核酸检测方法和新型冠状病毒检测试剂盒。

背景技术

2020年1月12日，世界卫生组织命名新型冠状病毒，即“2019-nCoV”。该病毒可由呼吸道飞沫传播亦可通过密切接触传播；人群普遍易感，老年人和有基础疾病者易发展为重症感染。随着春运人口的迁徙，该疾病演变成全国性的大规模恶性传染病，给社会经济造成了巨大的损失。

冠状病毒感染后常见的体征为呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。但由于新型冠状病毒存在初始症状不明显，潜伏期长达14天等相对隐蔽的因素，患者和携带者往往不能及时发现，从而加剧了传播。

采用快速有效的手段对感染者进行早期特异的诊断是及时发现和隔离传染源，有效救治患者，保障社会秩序的重要手段。这就对病原体的快速诊断技术提出了新的要求，但在烈性传染病大规模爆发时，对病原体的快速诊断非常困难，尤其在某些缺乏实验室检测条件的地区这种挑战显得尤为突出。

核酸诊断技术具有快速、灵敏的优势，能够检测处于潜伏期的病原体。目前大多数实验室采用PCR方法对新型冠状病毒进行检测，其灵敏度特异性均较好，但是耗时较长，并且仪器设备价格昂贵，难以在基层检验机构普及。近年来出现了如RPA(RecombinasePolymerase Amplification，重组酶聚合酶等温扩增)，LAMP等多种恒等温扩增技术，可用于现场检测，但如何快速准确地检测扩增产物一直是其发展制约因素。目前RPA扩增可结合探针检测扩增产物，探针的引入可阻碍扩增反应的进行，因此该方法对引物探针组合筛选要求极高，难以达到快速应对突发疫情的目的。并且探针法本身并未改变其单级扩增反应的本质，相较于目前市场上的实时定量PCR(Q-PCR)方法，并未实质性地提升检测灵敏度。因此亟需建立一种可应用于现场、简易、快速、且高灵敏度的检测技术，近年来发展起来的CRISPR/Cas检测技术成为理想的候选方案。

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是大多数细菌及古细菌中抵御病毒入侵的一种获得性免疫方式。当病毒入侵时，细菌生成对应的能识别病毒基因组的crRNA，该crRNA引导具有核酸内切酶活性的Cas 蛋白(CRISPR-associated proteins)对病毒靶标序列进行识别和切割。

2016年6月，张锋课题组发现了一种CRISPR效应蛋白Cas13a。该蛋白是一种在crRNA引导下与靶标RNA结合并降解靶标的核酸内切酶(Makarova et al.，2011)。同年10月Doudna等(East-Seletsky et al.，2016)发现一种叫Leptotrichia buccalis Cas13a(LbuCas13a)的核酸内切酶不仅具有对靶标RNA切割活性，而且还具有切割非靶标RNA的活性，这种非特异性切割称为附属切割。利用这种特性，该研究组将Cas13a用于检测RNA靶标，但其检出限约为10pmol/L。这对核酸检测来说不具有应用价值，因为大多数核酸检测方法，检出限都在 amol/L数量级(Song et al.，2013)。2017年，张锋与Collins合作将Cas13a与重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)结合，开发出了一个高特异性和灵敏性的核酸检测***(Specific High-Sensitivity EnzymaticReporter UnLOCKing，SHERLOCK)(Gootenberg et al.，2017)。该检测***中，靶标经RPA和T7RNA聚合酶转录扩增后，在对应的crRNA的引导下，能特异性地识别并切割靶标RPA分子，同时激活LwCas13a的非特异性单链RNA酶活性，切割底物产生荧光信号。RPA的引入显著地提高了该***的灵敏度，SHERLOCK对靶标的检出限低至2X10³copies/mL(3.2amol/L)，实现了单分子的检测。这项突破性的研究成果再次证实了CRISPR/Cas***在核酸诊断领域的价值，有望在公共卫生领域产生重大影响。但是环境中的核糖核酸酶 (RNase)广泛存在且十分稳定，而SHERLOCK***的关键组分均为RNA，因此该***对操作环境要求较为苛刻。

2015年，张锋等发现一种Ⅱ类Ⅴ型CRISPR效应蛋白Cas12(Zetsche et al.，2015)。Cas12可在crRNA引导下与靶标双链DNA结合并切割基因组DNA。2018 年，Doudna等发现当Cas12特异性结合和切割目标dsDNA后，具有非特异性切割单链DNA(ssDNA)的活性，并利用Cas12的这种活性开发了一个被命名为 DETECTR(DNA Endonuclease TargetedCRISPR Trans Reporter)的核酸检测***。DETECTR将RPA等温扩增技术与Cas12相结合，扩增产物激活Cas12的附属切割活性，切割底物产生荧光信号，并且实现了单分子级别的灵敏度。该***在单核苷酸多态性分析、癌症筛查、细菌和病毒感染检测以及耐药性筛查等方面有广泛的应用潜力。由于cas12的靶标及底物均为DNA，稳定性较强，因此该***对实验操作环境要求低，可应用于现场的快速检测。同时由于Cas12 被靶标特异性激活后，能够非特异性地切割单链报告分子，该步骤具有信号放大作用，因而该技术相较于探针法等传统核酸检测技术具有更高的灵敏度。

尽管该技术可以实现对核酸分子的快速灵敏检测，但由于Cas12会切割RPA 扩增的靶标DNA分子，并且激活后的cas12切割包括引物在内的单链DNA (ssDNA)分子，从而阻碍扩增反应的进行，所以该***中RPA核酸扩增和 CRISPR/Cas12信号检测必须分开进行。但分步进行一方面增加了操作的复杂度，另一方面使整个检测耗时更长，同时开盖操作极易形成气溶胶，造成核酸实验室的污染，不利于临床应用。

另外，现有的CRISPR/cas12检测***仍需要借助荧光检测仪，并且结果不能进行可视化的判读，这对该技术在基层检验机构的普及带来困难。

发明内容

本发明目的在于：提供一种CRISPR/Cas12一步核酸检测方法及新型冠状病毒检测试剂盒。实现核酸扩增和检测同时进行，其采用修饰引物并且设计对应 crRNA使cas12蛋白切割位点位于修饰引物位点上，从而扩增产物不会被cas12 降解，进而实现核酸分子指数型扩增目的。

本发明的提供的一种技术方案为：提供一种CRISPR/Cas12一步核酸检测方法，包括如下步骤：

步骤1)设计合成用于扩增靶基因的RPA上下游引物，并对引物进行防止DNA酶和激活后Cas蛋白降解的化学修饰；

步骤2)针对靶基因设计特异性的crRNA，设计原则应使其对靶基因(具体指靶基因与crRNA的互补链)的切割位点位于步骤1)修饰过的引物序列上。根据设计的crRNA序列，直接化学合成或者构建crRNA体外转录载体并用T7 转录试剂盒进行体外转录和纯化；设计单链DNA报告分子；

步骤3)将包括crRNA，Cas蛋白，单链DNA报告分子，RPA上下游引物，冻干RPA反应颗粒，醋酸镁、RPA水化缓冲液与待测靶标核酸的组分进行混合得反应混合物；

步骤4)所述反应混合物进行反应后，进行检测结果判读。

优选的，上述的CRISPR/Cas12一步核酸检测方法中，所述步骤4)具体为：将反应混合物置于37℃恒温检测仪内进行实时信号监测，反应时间10-30min，，每30s采集一次荧光信号，进行检测结果判读。

优选的，上述的CRISPR/Cas12一步核酸检测方法中，所述步骤4)具体为：将反应混合物37℃孵育20min，再通过核酸试纸条或蓝光激发设备，肉眼观察结果，进行检测结果判读。

优选的，上述的CRISPR/Cas12一步核酸检测方法中，所述Cas蛋白为Cas12，所述的Cas12为FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、 OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、B℃as12a或Lb4Cas12a中一种。

本发明的另一技术方案为：提供一种新型冠状病毒检测试剂盒，包括 crRNA、Cas蛋白、引物、缓冲体系和单链DNA报告分子；

所述引物为：在新型冠状病毒的保守区ORF1ab和N基因区域寻找 5’-TTTN-3’序列，并在其近5’区域0-200bp内设计正向引物，在其近3’区域 25-200bp内设计反向引物，所得引物前三个和最后三个磷酸二酯键进行化学修饰防止DNA酶或激活后Cas蛋白降解。

优选的，上述的新型冠状病毒检测试剂盒中，所述化学修饰为：phosphorothioate，2′-O-methyl或2′-O-methoxyethyl nucleosides修饰。

优选的，上述的新型冠状病毒检测试剂盒中，所述引物序列为：

ORF1ab-F2：SEQ ID NO：12；

ORF1ab-R：SEQ ID NO：13；

N-F2：SEQ ID NO：15；

N-R：SEQ ID NO：16；

所述crRNA序列为：

crRNA-ORF1ab：SEQ ID NO：17；

crRNA-nCOV-N：SEQ ID NO：18。

优选的，上述的新型冠状病毒检测试剂盒中，所述单链DNA报告分子的序列如：SEQID NO：19。

优选的，上述的新型冠状病毒检测试剂盒中，所述单链DNA报告分子的分别带有FAM和BHQ1基团。

优选的，上述的新型冠状病毒检测试剂盒中，所述Cas蛋白为Cas12，所述的Cas12为FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、 TsCas12a、BbCas12a、B℃as12a或Lb4Cas12a中一种。

本发明有益效果在于：1、相比于市面上现有的基于PCR核酸检测技术，本发明的CRISPR/Cas12一步核酸检测方法具有以下优点:

A、快速：从样本到检测结果依据待测模板量，扩增效率和crRNA切割效率只需15-40min，其中样本处理5-10min，扩增检测反应10-30min。

B、准确：本发明具有极高的灵敏度，可以检测到单个核酸分子；同时，由于crRNA对单个碱基错配敏感，因而本发明特异性极好，能够检测样本中的区分中单个核苷酸的突变。

C、便捷：由于本发明在恒温37℃进行，因此对设备要求极低，只需简单的恒温设备甚至利用体温也能使反应进行，有利于在基层检验机构普及。

D、低成本：本发明所用材料和酶都很常见，并且用量较少，可以进行微量化的测试分析，因此成本较低。

2、相比于现有的基于CRISPR/Cas的核酸检测技术，本发明的CRISPR/Cas12 一步核酸检测方法具有以下优点：

A、反应更快：现有CRISPR/Cas技术从样本到结果耗时从1-3h不等，本发明整个过程只需15-40min。

B、操作更简便：由于现有技术必须把核酸扩增和检测分步进行，因而操作较为繁琐，本发明通过创新的RPA引物和crRNA设计，使扩增和检测可以同步进行，因而操作更为便捷。

C、不会污染操作环境：现有技术扩增和检测分步进行，必须进行开盖操作，因而极易形成气溶胶，污染操作环境，造成检测结果的假阳性，不利于临床普及。本发明采用一步法，避免了开盖操作，不会形成气溶胶污染，更利于临床应用。

3、相比于市面上现有的核酸检测技术的新型冠状病毒检测试剂盒，本发明的新型冠状病毒检测试剂盒具有如下优点：

1)反应更快：现有CRISPR/Cas技术从样本到结果耗时从1-3h不等，使用本发明新型冠状病毒检测试剂盒的整个检测过程只需15-40min，且提供可视化结果判读，具体通过蓝光照射肉眼直接观察或核酸检测试纸条可视化结果判读。

2)操作更简便：由于现有技术必须把核酸扩增和检测分步进行，因而操作较为繁琐，本发明通过创新的RPA引物和crRNA设计，使扩增和检测可以同步进行，因而操作更为便捷。

3)不会污染操作环境：现有技术扩增和检测分步进行，必须进行开盖操作，因而极易形成气溶胶，污染操作环境，造成检测结果的假阳性，不利于临床普及。本发明试剂盒可采用一步法操作，避免了开盖操作，不会形成气溶胶污染，更利于临床应用。

附图说明

图1为本发明具体实施方式中的实施例1的荧光信号检测结果图；

图2为本发明具体实施方式中的实施例1的蓝光激发检测结果图；

图3为本发明具体实施方式中的实施例1的核酸试纸检测结果图；

图4为本发明具体实施方式中的实施例2的ORF1ab基因荧光信号检测结果图；

图5为本发明具体实施方式中的实施例2的N基因荧光信号检测结果图；

图6为本发明具体实施方式中的实施例2的ORF1ab基因蓝光激发检测结果图；

图7为本发明具体实施方式中的实施例2的N基因蓝光激发检测结果图；

图8为本发明具体实施方式中的实施例2的ORF1ab基因核酸试纸检测结果图；

图9为本发明具体实施方式中的实施例2的N基因核酸试纸检测结果图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

本发明最关键的构思在于：RPA介导的DNA扩增能够在30-42℃条件下进行，因此摆脱了对较为精密的PCR仪的依赖。同时cas12a对靶标分子的切割也在等温条件下进行。基于以上特点，该***可用于现场的快速检测，对核酸快速检测意义重大，尤其对于缺乏实验室条件的基层临床检验具有重大价值。

但现有CRISPR/cas12技术不能或很难实现核酸扩增和检测同时进行的目的，而本发明提供的基于CRISPR/Cas12和恒温扩增一步进行的核酸检测通用方法和新型冠状病毒检测试剂盒，其采用修饰引物并且设计对应crRNA使其切割位点位于修饰引物上，从而扩增产物不会被cas12降解，进而实现核酸分子指数型扩增目的。

实施例1

一种CRISPR/Cas12一步核酸检测方法，其为一种新型的通用的基于 CRISPR/Cas12的一步核酸检测法，使用了包括crRNA、Cas蛋白、引物、缓冲体系和单链DNA报告分子，RNA酶抑制剂等组分；

以下以检测人源β肌动蛋白(ACTB)为例描述该方法的操作步骤：

1)在人源β肌动蛋白区域寻找5’-TTTN-3’序列，并在其近5’区域0-200bp 内设计正向引物，在其近3’区域25-200bp内设计反向引物。合成并对引物前三个和最后三个磷酸二酯键进行化学修饰。本实施例中可选用引物如下表1所示。

表1

Oligo name	Sequence(5'-3')
		ACTB-F1	TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATGACGAGTCC(SEQ ID NO：1)
ACTB-F2	TGGATCAGCAAGCAGGAGTATGACGAGTCCGG(SEQ ID NO：2)
		ACTB-F3	ATCAGCAAGCAGGAGTATGACGAGTCCGGCCC(SEQ ID NO：3)
ACTB-F4	GATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATGACGAGT(SEQ ID NO：4)
		ACTB-R1	CAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT(SEQ ID NO：5)
ACTB-R2	CATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGGTTTTGTC(SEQ ID NO：6)
		ACTB-R3	TGCCAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTA(SEQ ID NO：7)
ACTB-R4	AAGCCATGCCAATCTCATCTTGTTTTCTGCGC(SEQ ID NO：8)

2)设计并化学合成crRNA：在步骤1)中的5’-TTTN-3’序列下游选取17-25N 作为crRNA序列。本实施例中选用的crRNA如下表2所示。

表2

3)报告分子设计并化学合成：采用两端分别带有FAM和BHQ1基团的12 碱基随机单链DNA分子用于荧光信号检测和蓝光激发可视化检测。本实施例中选用的单链报告分子如下表3所示。

表3

单链DNA报告分子

5’-FAM-ACGTCTTAGTCC-BHQ1-3’(SEQ ID NO：10)

4)用咽拭子取健康志愿者样本，加入到如下表4配方的快速裂解液中，于 80℃裂解5分钟。

表4

试剂	浓度
		胍盐酸	800mM
吐温20	0.5％
		聚乙二醇辛基苯基醚	1％
DEPC水	-

5)取2μL步骤4)中的裂解液产物加入引物组合，crRNA，LbaCas12a，单链DNA报告分子，RPA上下游引物，冻干RPA反应颗粒，醋酸镁、RPA水化缓冲液，NEB buffer2.1，RNaseInhibitor。将反应混合液置于37℃恒温荧光信号检测仪内，每30s采集一次信号，连续检测两小时。结果如图1所示，信号随时间逐渐上升。

本发明采用的各成分的配比如下表5。

表5

6)用步骤5)中扩增效率最高的引物组合，加入如上表5中的反应混合物，置于37℃恒温反应20min，再将反应物用蓝光激发并肉眼进行结果判读，并用手机拍照，结果如图2所示。图2阳性PC颜色很深。

本实施例优选的，检测人源β肌动蛋白(ACTB)的CRISPR/Cas12一步核酸检测方法为：

1)选用引物如下表6所示。

表6

Oligo name	Sequence(5′-3′)
		ACTB-F1	TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATGACGAGTCC(SEQ ID NO：1)
ACTB-R1	CAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT(SEQ ID NO：5)

2)设计并化学合成crRNA：在步骤1)中的5’-TTTN-3’序列下游选取17-25N 作为crRNA序列。本实施例中选用的crRNA如下表7所示。

表7

3)报告分子设计并化学合成：采用两端分别带有FAM和Biotin基团的12 碱基随机单链DNA分子用于核酸试纸条可视化检测。本实施例中选用的单链报告分子如下表8所示。

表8

单链DNA报告分子

5’-FAM-ACGTCTTAGTCC-Biotin-3’(SEQ ID NO：10)

4)用咽拭子取健康志愿者样本，加入到如表9配方的快速裂解液中，于80℃裂解5分钟。

表9

5)取2μL步骤2)中的裂解液产物加入引物组合，crRNA，LbaCas12a，单链DNA报告分子，RPA上下游引物，冻干RPA反应颗粒，醋酸镁、RPA水化缓冲液，NEB buffer2.1，RNaseInhibitor。将反应混合液置于37℃恒温孵育20min。本实施例的各成分的配比如表10所示。

表10

6)取20μL上步骤中的反应液，加入80μL样本稀释液，于室温下层析2min，肉眼进行结果判读，如图3所示，NTC为阴性，PC为阳性，阳性在T线显色，阴性样本在检测线处不显色，本步骤中可以采用英国TwistDx公司HybriDetect 1 lateralflow strips(Milenia)或其他具有相似特性的核酸试纸条。

实施例2

一种新型冠状病毒检测试剂盒，包括crRNA、Cas蛋白、引物、缓冲体系和单链DNA报告分子；上述新型冠状病毒检测试剂盒的最优引物组合的对比确定如下：

1)在新型冠状病毒的保守区ORF1ab和N基因区域寻找5’-TTTN-3’序列，并在其近5’区域0-200bp内设计正向引物，在其近3’区域25-200bp内设计反向引物。合成并对引物前三个和最后三个磷酸二酯键进行化学修饰。本实施例中可选用引物如下表11所示。

表11

Oligo name	Sequence(5′-3′)
		ORF1ab-F1	TTGCCTGGCACGATATTACGCACAACTAATGGT(SEQ ID NO：11)
ORF1ab-F2	ATGGTGACTTTTTGCATTTCTTACCTAGAGTTT(SEQ ID NO：12)
		ORF1ab-R	AAGTCAGTGTACTCTATAAGTTTTGATGGTGTGT(SEQ ID NO：13)
N-F1	CCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT(SEQ ID NO：14)
		N-F2	CAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT(SEQ ID NO：15)
N-R	GTTGGCCTTTACCAGACATTTTGCTCTCAAGCTGG(SEQ ID NO：16)

2)设计并化学合成crRNA：在步骤1)中的5’-TTTN-3’序列下游选取17-25N 作为crRNA序列。本实施例中选用的crRNA如下表12所示。

表12

crRNA-ORF1ab	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUgugcaguugguaacaucuguuac(SEQ ID NO：17)
		crRNA-nCOV-N	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUcugcugcuugacagauugaacc(SEQ ID NO：18)

3)报告分子设计并化学合成：采用两端分别带有FAM和BHQ1基团的12 碱基随机单链DNA分子用于荧光信号检测和蓝光激发可视化检测。本实施例中选用的单链报告分子如下表13所示。

表13

单链DNA报告分子

5’-FAM-ACGTCTTAGTCC-BHQ1-3’(SEQ ID NO：19)

4)用咽拭子取健康志愿者样本，加入到如下表14配方的快速裂解液中，再加入新冠假病毒颗粒，于80℃裂解5分钟。

表14

5)取2μL步骤4)中的裂解液产物加入引物组合，crRNA，LbaCas12a，单链DNA报告分子，RPA上下游引物，冻干RPA反应颗粒，醋酸镁、RPA水化缓冲液，NEB buffer2.1，RNaseInhibitor。将反应混合液置于37℃恒温荧光信号检测仪内，每30s采集一次信号，连续检测两小时。ORF1ab结果如图4所示，N基因结果如图5所示，表现为阳性样本信号随时间逐渐增强，阴性样本信号不随时间变化。

本发明新型冠状病毒检测试剂盒中的各成分的配比如下表15。

表15

6)用步骤5)中扩增效率最高的引物组合，加入如上表15中的反应混合物，置于37℃恒温反应20min，再将反应物用蓝光激发并肉眼进行结果判读，并用手机拍照，结果如图6和图7所示，阳性样本出现信号，阴性样本无信号。

优选的，新型冠状病毒检测试剂盒包括crRNA、Cas蛋白、引物、缓冲体系和单链DNA报告分子；制造方法如下：

1)在新型冠状病毒的保守区ORF1ab和N基因区域寻找5’-TTTN-3’序列，并在其近5’区域0-200bp内设计正向引物，在其近3’区域25-200bp内设计反向引物，所得引物前三个和最后三个磷酸二酯键进行化学修饰。防止DNA酶和激活后Cas蛋白降解。所述化学修饰包括但不限于phosphorothioate，2′-O-methyl或2′-O-methoxyethyl(MOE)nucleosides修饰。

本实施例中选用引物序列如下表16所示。

表16

Oligo name	Sequence(5′-3′)
		ORF1ab-F2	TTGCCTGGCACGATATTACGCACAACTAATGGT(SEQ ID NO：12)
ORF1ab-R	AAGTCAGTGTACTCTATAAGTTTTGATGGTGTGT(SEQ ID NO：13)
		N-F2	AGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGG(SEQ ID NO：15)
N-R	CCTTTACCAGACATTTTGCTCTCAAGCTGGTTC(SEQ ID NO：16)

2)针对靶标基因，设计特异性的crRNA。设计原则应使其对靶基因(具体指靶基因与crRNA的互补链)的切割位点位于步骤1)修饰过的引物序列上。根据设计的crRNA序列，直接化学合成或者构建crRNA体外转录载体并用T7 转录试剂盒进行体外转录和纯化；

在步骤1)中的5’-TTTN-3’序列下游选取17-25N作为crRNA序列。本实施例中所述crRNA序列为：

crRNA-ORF1ab：SEQ ID NO：17；

crRNA-nCOV-N：SEQ ID NO：18；

3)单链DNA报告分子设计并化学合成：采用两端分别带有FAM和Biotin 基团的12碱基随机单链DNA分子用于核酸试纸条可视化检测。本实施例中选用的单链报告分子如表8所示。

4)用咽拭子取健康志愿者样本，加入到表14配方的快速裂解液中，于80℃裂解5分钟。

5)取2μL步骤4)中的裂解液产物加入引物组合，crRNA，LbaCas12a，单链DNA报告分子，RPA上下游引物，冻干RPA反应颗粒，醋酸镁、RPA水化缓冲液，NEB buffer2.1，RNaseInhibitor。将反应混合液置于37℃恒温孵育20min。本实施例的各成分的配比如表10所示。

6)取20μL上步骤中的反应液，加入80μL样本稀释液，于室温下层析2min，肉眼进行结果判读，如图8(1ab基因)和图9(N基因)所示，PC为阳性，阳性在T线显色，NTC阴性样本在检测线处不显色，NTC为阴性，阴性样本不显色。本步骤中可以采用英国TwistDx公司HybriDetect 1lateralflow strips(Milenia) 或其他具有相似特性的核酸试纸条。

本实施例上述新型冠状病毒检测试剂盒的使用：

1)用咽拭子取临床样本，加入到如表14配方的快速裂解液中，于80℃裂解5分钟。

2)取2μL步骤2)中的裂解液产物加入引物组合，crRNA，LbaCas12a，单链DNA报告分子，RPA上下游引物，冻干RPA反应颗粒，醋酸镁、RPA水化缓冲液，NEB buffer2.1，RNaseInhibitor。将反应混合液置于37℃恒温孵育 20min。本实施例的各成分的配比如上表10。

3)取20μL上步骤中的反应液，加入80μL样本稀释液，于室温下层析2min，肉眼进行结果判读，阳性样本在检测线T处显色，阴性样本在T线处不显色。本步骤中可以采用英国TwistDx公司HybriDetect 1lateralflow strips(Milenia)或其他具有相似特性的核酸试纸条。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 亚能生物技术(深圳)有限公司

<120> 一种CRISPR/Cas12一步核酸检测方法及新型冠状病毒检测试剂盒

<130> 2020

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgtggatcag caagcaggag tatgacgagt cc 32

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tggatcagca agcaggagta tgacgagtcc gg 32

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atcagcaagc aggagtatga cgagtccggc cc 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatgtggatc agcaagcagg agtatgacga gt 32

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caggcagcag taggggaact tctcctgcta gaat 34

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

catcttgttt tctgcgcaag ttaggttttg tc 32

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgccaatctc atcttgtttt ctgcgcaagt ta 32

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aagccatgcc aatctcatct tgttttctgc gc 32

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cggtggacga tggaggggcc gg 22

<210> 10

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acgtcttagt cc 12

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttgcctggca cgatattacg cacaactaat ggt 33

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atggtgactt tttgcatttc ttacctagag ttt 33

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aagtcagtgt actctataag ttttgatggt gtgt 34

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ccaggcagca gtaggggaac ttctcctgct agaat 35

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

caggcagcag taggggaact tctcctgcta gaat 34

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gttggccttt accagacatt ttgctctcaa gctgg 35

<210> 17

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

acgtcttagt cc 12

<210> 18

<211> 43

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 18

uaauuucuac uaaguguaga ucugcugcuu gacagauuga acc 43

<210> 19

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 19

uaauuucuac uaaguguaga ugugcaguug guaacaucug uuac 44

Claims

1.一种CRISPR/Cas12一步核酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤2)针对靶基因设计特异性的crRNA，设计单链DNA报告分子；

步骤4)所述反应混合物进行反应后，进行检测结果判读。

2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas12一步核酸检测方法，其特征在于，所述步骤4)具体为：将反应混合物置于37℃恒温检测仪内进行实时信号监测，反应时间10-30min，，每30s采集一次荧光信号，进行检测结果判读。

3.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas12一步核酸检测方法，其特征在于，所述步骤4)具体为：将反应混合物37℃孵育20min，再通过核酸试纸条或蓝光激发设备，肉眼观察结果，进行检测结果判读。

4.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas12一步核酸检测方法，其特征在于，所述Cas蛋白为Cas12，所述Cas12为FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a中一种。

5.一种新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，包括crRNA、Cas蛋白、引物、缓冲体系和单链DNA报告分子；

所述引物为：在新型冠状病毒的保守区ORF1ab和N基因区域寻找5’-TTTN-3’序列，并在其近5’区域0-200bp内设计正向引物，在其近3’区域25-200bp内设计反向引物，所得引物前三个和最后三个磷酸二酯键进行化学修饰防止DNA酶或激活后Cas蛋白降解。

6.根据权利要求5所述的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，所述化学修饰为：phosphorothioate，2′-O-methyl或2′-O-methoxyethyl nucleosides修饰。

7.根据权利要求5所述的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，

所述引物序列为：

ORF1ab-F2：SEQ ID NO：12；

ORF1ab-R：SEQ ID NO：13；

N-F2：SEQ ID NO：15；

N-R：SEQ ID NO：16；

所述crRNA序列为：

crRNA-ORF1ab：SEQ ID NO：17；

crRNA-nCOV-N：SEQ ID NO：18。

8.根据权利要求5所述的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，所述单链DNA报告分子的序列如：SEQ ID NO：19。

9.根据权利要求8所述的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，所述单链DNA报告分子的分别带有FAM和BHQ1基团。

10.根据权利要求5所述的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，所述Cas蛋白为Cas12，所述的Cas12为FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a中一种。