CN110894557A

CN110894557A - 基于CRISPR方式检测非洲猪瘟病毒的crRNA及试剂盒

Info

Publication number: CN110894557A
Application number: CN201911380405.1A
Authority: CN
Inventors: 殷昊; 步志高; 赵东明; 芦舒涵; 张楹; 段鈞译; 李芳�
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2019-09-20
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2020-03-20

Abstract

本发明涉及生物化学中核酸检测的技术领域，具体涉及一种基于CRISPR方式检测非洲猪瘟病毒的crRNA及试剂盒。所述crRNA根据如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示的靶向位点设计得到。一种基于CRISPR方式检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其包括所述的crRNA、单链DNA报告序列、缓冲液、试纸条、分析缓冲液及Cas蛋白。利用Cas蛋白在crRNA指导下切割非洲猪瘟病毒双链DNA底物后释放PAM远端产物，激活非特异性切割单链DNA活性的特点而设计的一种高灵敏度，高特异性的快速检测非洲猪瘟病毒的试剂盒。

Description

基于CRISPR方式检测非洲猪瘟病毒的crRNA及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物化学中核酸检测的技术领域，具体涉及一种基于CRISPR方式检测非洲猪瘟病毒的crRNA及试剂盒。

背景技术：

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，简称ASFV)是引起非洲猪瘟的病原体。ASFV通过引起烈性出血性传染病，具有极高的死亡率，能够在感染后一周使家猪迅速死亡。其给全球养猪产业造成严重的威胁，因此被OIE列为需要通报疾病，被我国列为一类动物疫病。ASFV通过自然宿主携带、受感染物质的机械携带、受感染动物之间的接触等多种途径进行传播。非洲猪瘟目前尚无有效商业化疫苗，只能采取扑杀净化措施。为防止疫病的传播，建立快速、灵敏、特异的检测方法对于ASFV的防控至关重要。快速检测要求检测过程能在样品采集地完成，而不依赖于实验室大型仪器设备。

病毒检测的原理是可以识别特异性抗原、抗体和其遗传物质(对于ASFV来说是其基因组DNA的片段)。目前的实验室中的病毒检测方法主要有：用于检测抗体和抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)和直接荧光抗体测试(FAT)；用于检测基因组DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)和实时聚合酶链式反应(qPCR)。ELISA检测血清中抗体含量，其局限性是大量的急性感染的家猪在血清中出现ASFV抗体前既发病死亡，从而出现大量假阴性的结果。FAT可以用来检测急性感染猪组织中的ASFV抗原，但在亚急性与慢性感染中，FAT的敏感性明显降低。PCR和qPCR扩增ASFV基因组DNA的片段，并读取DNA信号来实现检测。因为PCR和qPCR的高敏感性和非特异性扩增，使其有容易发生交叉污染和***稳定性不够高的问题，有较高的假阳性和假阴性的概率。以上几种常规方法都依赖专业人员和实验室仪器设备，无法做到在样品采集地完成快速检测。而及时的获取检测结果是控制非洲猪瘟发生的关键环节。因此，急需一种能够快速的，不依赖于实验室设备的，且特异性和灵敏度都高的检测ASFV方法。

ASFV是大型双链DNA病毒，能够在被感染家猪细胞中进行复制。其基因组大小在170k到193k之间，编码至少150个基因，不同的病毒分离株之间基因组的大小和基因数量有所不同。ASFV颗粒直径约200纳米，从内到外依次为内核、核壳、内膜、衣壳，细胞外的病毒粒子还存在一层外包膜结构。核壳是围绕内核的一个宽蛋白层，主要成分之一是多聚蛋白pp220，在ASFV形态和病毒包装过程发生中具有重要作用。已有研究报道说明，缺失pp220的，能够降低病毒滴度，并且产生缺失主要核心蛋白和无病毒DNA的空载病毒颗粒。因为DNA聚合酶在DNA复制中的关键作用，ASFV的DNA聚合酶(DNA Pol)也是其生存周期中的基本原件。

CRISPR是一种细菌和古菌的防御及适应性免疫***，其能够切割和消除病毒入侵和其他外源核酸(核酸指DNA和RNA)的威胁。CRISPR***利用自身的RNA来和目标DNA进行序列配对，从而识别特异性序列。另外，对于双链DNA来说，CRISPR***需要额外识别目标DNA上的一个protospacer adjacent motif(PAM)序列。我们可以相对容易的使用CRISPR***去识别不同的核酸序列。比如，只要变化指导RNA(guide RNA,是指代sgRNA或者crRNA)就可识别含有和指导RNA序列匹配的，并带有PAM序列的双链DNA。S.pyogenes Cas9(SpCas9，一般简称Cas9)，因为其具有简单的PAM序列和在细胞内较高的基因编辑效率，因而是应用最广泛的Cas蛋白。Cas12a(又称为Cpf1)是和Cas9不同的CRISPR***。Cas12a的PAM是AT偏好，而Cas9是GC偏好。而且，Cas12a不仅特异性的精准的切割和其crRNA匹配的并含有PAM序列的双链DNA。它在切割序列特异性的目标双链DNA之后，它的单链DNA的酶活性被激活，变成一种单链DNA切碎机，将切割它附近的任何单链DNA。它对单链DNA切割速度极快，达到大于1000个分子每秒，且可以持续数小时以上。因此，Cas12a识别一个特异性双链DNA序列，可以切割数以百万计的非特异性的单链DNA分子。利用此特性，可将发光分子通过单链DNA与一种阻止这种发光分子发光的抑制分子连接在一起(简称为报告序列)。当Cas12a被序列特异性的双链DNA激活后，它会切割将这种发光分子和这种抑制分子连接在一起的单链DNA，这就移除了发光抑制分子，让发光分子发光，从而检测到光信号。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种基于CRISPR方式检测非洲猪瘟病毒的crRNA。

本发明的目的之二在于提供一种基于CRISPR方式检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，灵敏度高、特异性高，能快速的检测非洲猪瘟病毒。

本发明实现目的之一所采用的方案是：一种基于CRISPR方式检测非洲猪瘟病毒的crRNA，所述crRNA根据如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6所示的靶向位点设计得到。

优选地，所述crRNA的指导序列为GUGAGUUUUGUUUGACCCUGCUU或AAAGUCGACGAUAUACUGCUUCA；所述crRNA的非指导序列为UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU或与其序列相似性大于75％的序列。另一优选地，所述crRNA的指导序列的核苷酸数量为17-5；所述crRNA的非指导序列的核苷酸数量为17-100。

优选地，所述crRNA的序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:17所示。

优选地，所述crRNA可通过Cas蛋白剪切成多条crRNA的RNA形式，另一优选地，所述crRNA可通过Cas12a剪切成多条crRNA的RNA形式。

本发明实现目的之二所采用的方案是：一种基于CRISPR方式检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其包括所述的crRNA、单链DNA报告序列、缓冲液、试纸条、分析缓冲液及Cas蛋白。

所述缓冲液为NEBuffer2.1缓冲液，磷酸盐缓冲液，碳酸钠缓冲液，碳酸氢钠缓冲液，硼酸盐缓冲液、Tris缓冲液，MOPS缓冲液，HEPES缓冲液。优选为NEBuffer2.1缓冲液(其配方为50mM NaCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、100μg/ml BSA pH 7.9)。

优选地，所述单链DNA报告序列为含有T和A的富集序列。

优选地，所述单链DNA报告序列含有TTATT、TTTTA、AAAAT、ATATAT中的至少一种。

优选地，所述单链DNA报告序列的5’端用FAM、FITC、RB200、TRITC、TET、PE、PI、AMCA、Atto425、PerCP、APC、Alexa Fluor 488、JOE、VIC、HEX、NED、Cy3、TAMRA、ROX、Texasred、Cy5、Quasar 670、Cy5.5和Cy7中的任意一种进行修饰；且所述单链DNA报告序列的3’端用quencher或生物素修饰。

更为优选地，所述单链DNA报告序列为：(1)在TTATT的5’端用FAM修饰，3’端用quencher修饰，即FAM-TTATT-quencher；或(2)在TTATT，5’端FAM修饰，3’端生物素修饰，即FAM-TTATT-Biotin。

优选地，所述Cas蛋白为Cas12、Cas13或Cas14；所述Cas12为Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d或Cas12e；所述试纸条按液流方向依次包括样品垫、耦连抗所述单链DNA报告序列的5’端的修饰标记抗体的金属颗粒的结合垫、链霉亲和素及二抗；所述分析缓冲液为HybriDetect assay buffer。

更为优选地，所述Cas12a更具体为来自于Lachnospiraceae bacterium、Acidaminococcus sp.、Francisella tularensis subsp.、Prevotella disiens、Porphyromonas macacae、Lachnospiraceae bacterium MA2020、CandidatusMethanoplasma termitum、Moraxella bovoculi 237的Cas12a基因，如Lb Cas12a基因、AsCpf1、FnCpf1基因。最优选地，所述Cas12a基因是Lb Cas12a的DNA片段。当本发明采用Cas13蛋白时，需要将报告序列改为RNA序列；需要在样品等温或PCR反应后进行RNA转录。当采用Cas14蛋白时，样品准备为单链DNA。

更为优选地，所述金属颗粒为金纳米颗粒或银纳米颗粒；所述二抗为兔抗羊二抗、鼠抗羊二抗或人抗鼠二抗；另一优选地，所述试纸条按液流方向依次包括样品垫、耦连抗FITC抗体的金纳米颗粒的结合垫、链霉亲和素及兔抗羊二抗。

优选地，所述试剂盒的检测反应体系用量为：50-500ng Cas蛋白，4-8ng crRNA，0.5-1.5uM单链DNA报告序列，分析缓冲液80-200μl，缓冲液NEBuffer2.1为10×，用量视反应体系确定，稀释为1×即可。另一优选地，所述试剂盒的检测反应体系用量为：120-180ngCas12a，4-8ng crRNA，0.5-1.5uM FAM-TTATT-Biotin报告序列。

更优选地，所述试剂盒的检测反应体系用量为：150ng LbCas12a，6ng crRNA，1uMFAM-TTATT-Biotin报告序列。

基于Cas12a的核酸检测相对于常规方法有几个优势：Cas12a的报告序列是单链DNA，Cas13的报告序列是单链RNA。DNA的稳定性远高于RNA，因此，Cas12a的检测***的稳定性高于Cas13；相对于Cas12a，Cas13对于DNA检测需要额外的体外转录，对于RNA检测需要额外的体外逆转录再加体外转录。因此，Cas12a的样品制备流程比Cas13简单很多。因此，单链DNA报告序列的稳定性高于CRISPR-Cas13的RNA报告序列，且不需要额外的体外转录以及体外逆转录，使得Cas12a检测试纸的实用性比基于CRISPR-Cas13的试纸更高。

本发明的试剂盒用于检测时，样品为含有ASFV的基因组DNA的生物样品，通过等温扩增或PCR反应以及其他扩增方式后的产生的DNA片段，长度可以是50-10000核苷酸，可以是双链DNA或者是单链DNA。通常一般检测中的样品是ASFV的基因组DNA。另外，Cas12a的检测目前仅有在实验室条件下读取荧光信号的方法的报道，本发明人研究通过优化反应条件，首次将基于Cas12a的检测实现试纸化检测，因而更适合于采样后在野外直接使用，更快速提供准确结果。

本发明的试剂盒以ASFV基因组中DNA聚合酶，多聚蛋白P220这两个基因的保守区为Cas蛋白靶向的位点，首先通过Recombinase Polymerase Amplification(RPA)的方法恒温快速的特异扩增目标片段，获得目标双链DNA，然后Cas12蛋白被crRNA(CRISPR RNA)引导，特异性的切割目标双链DNA，从而激发Cas12蛋白非特异性单链切割活性的特性。因而，加入单链DNA报告后，DNA报告序列被切割，其含有的FAM被释放，在实验室条件下可被荧光检测仪直接读取。在此仪器的条件下，也可用检测试纸，其释放的FAM和试纸条中含FITC抗体的金纳米颗粒结合(FITC抗体可特异性识别结合FAM)，在相应control和test区域的显色指示样品中ASFV的阴性或阳性。当采用Cas13时，Cas13在crRNA指导下切割目标RNA后也能激发其非特异性切割RNA的能力，样品等温或PCR反应，T7RNA聚合酶体外转录后与Cas13反应，加入RNA报告序列即可进行荧光或试纸检测。当采用Cas14基因时，样品等温或PCR反应后T7外切酶消化掉未被修饰保护的非靶向链，形成单链DNA作为激发非特异性切割单链DNA活性的底物，加入单链DNA报告序列也可进行上述检测。

本发明具有以下优点和有益效果：选取ASFV基因组复制的关键蛋白DNA聚合酶和外壳蛋白组装多聚蛋白P220两个基因的保守区作为检测靶标，确保检测准确性和针对各个ASFV基因型的广谱性，因而也首次使用基于CRISPR方式检测ASFV。本发明的试剂盒与PCR，qPCR，ELISA，FAT等传统方法比较，不需要复杂仪器且能快速检测，无需专业人士操作，适合于采样后在野外直接使用，可快速提供准确结果，便于及时采取相应措施阻止ASFV传播，也避免了运输过程中的样品质量控制问题，而传统检测方法需采样后运送达专业检测机构处理，需要较长周期；CRISPR的crRNA对靶标的识别是高度特异性的且不容许突变，使得此种检测方法相比于PCR，qPCR或者RPA等核酸扩增法更为特异；且灵敏度高于和等于PCR和qPCR和RPA。具体来说，本发明的试剂盒检测下限为aM级别，且有半定量作用；本发明的试剂盒特异性高，因为其需要精确的序列配对才会产生信号，其特异性也高于PCR以及qPCR等核酸检测方法。

利用Cas蛋白在crRNA指导下切割非洲猪瘟病毒双链DNA底物后释放PAM远端产物，激活非特异性切割单链DNA活性的特点而设计的一种高灵敏度，高特异性的快速检测非洲猪瘟病毒的方法。本发明的试剂盒还通过优化反应条件，将上述方法实现试纸化检测，适合于采样后在野外直接使用，无需专业人员操作，可快速提供准确结果，便于及时采取相应措施阻止非洲猪瘟病毒传播，也避免了运输过程中的样品质量控制问题。

附图说明

图1为本发明实施例1中针对DNA聚合酶的crRNA序列T1的荧光报告实验结果；

图2为本发明实施例1中针对DNA聚合酶的crRNA序列T2的荧光报告实验结果；

图3为本发明实施例1中针对DNA聚合酶的crRNA序列T3的荧光报告实验结果；

图4为本发明实施例1中针对P220的crRNA序列T1的实验结果；

图5为本发明实施例1中针对P220的crRNA序列T2的实验结果；

图6为本发明实施例1中针对P220的crRNA序列T3的实验结果；

图7为本发明的试纸条的结构示意图；

图8为本发明实施例3中DNA聚合酶PCR扩增后使用Cas12a的荧光检测图；

图9为本发明实施例3中pp220基因PCR扩增后使用Cas12a的荧光检测图；

图10为本发明实施例4中试纸条反应条件优化中，一系列报告浓度测试最佳报告序列加入量的结果图；

图11为本发明实施例4中试纸条反应条件优化中，LbCas12a和crRNA加入量优化结果图；

图12为本发明实施例4中在最优条件下阳性和阴性样品PCR后试纸条检测结果；

图13为本发明实施例5中样品1+和2+RPA扩增后的试纸条结果；

图14为本发明实施例6中CRISPR-Cas12a检测***对几种家猪病原微生物的DNA样品与含ASFV样品信号相比较结果；

图15为本发明实施例6中CRISPR-Cas12a检测***的对检测靶标序列突变后荧光检测示意图。

具体实施方式

为更好的理解本发明，下面的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

(1)Lb Cas12a蛋白表达与纯化

编码Lb Cas12a的DNA片段克隆到包含C端6个组氨酸标签的pET30c载体上构建表达质粒，BL21(DE3)转化后挑单克隆在37℃，2×YT培养基(10g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5gNaCl)中进行菌种过夜活化和扩大培养，待OD₆₀₀达到0.6时加入0.5mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)21℃诱导表达14-16小时后收菌。

表达得到的菌用裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，500mM NaCl,5％(v/v)甘油，1mM TCEP，0.25mg/ml溶菌酶)重悬超声破菌，破碎后得到的上清0.22μM滤膜过滤，HisTrap HP镍柱纯化，500mM咪唑洗脱，50k超滤管浓缩至500μL过分子筛(SuperdexIncrease 200)纯化，目标蛋白保存在储存缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5，200mM NaCl，5％(v/v)甘油，1mM TCEP)冻于-80℃备用。

(2)底物和报告序列的制备

1、底物的制备

DNA聚合酶基因和pp220基因片段克隆到PUC57质粒载体上构建重组质粒PUC57-DNA pol和PUC57-pp220，作为激发LbCas12a非特异性单链DNA切割活性的双链DNA底物。

2、报告序列的制备

LbCas12a非特异性切割单链有TA偏好性，单链DNA报告序列(5’-3’)：TTATT，5’端FAM修饰，3’端quencher修饰，即FAM-TTATT-quencher，称F-Q标记的单链DNA报告序列。

试纸条检测实验中单链DNA报告序列(5’-3’)：TTATT,5’端FAM修饰，3’端生物素(Biotin)修饰，即FAM-TTATT-Biotin，称F-B标记的单链DNA报告序列。

荧光检测实验中单链DNA报告序列由IDT合成，试纸条实验中单链DNA报告序列由TaKaRa合成。

(3)crRNA的筛选和制备

1、候选靶向序列的确定

由于LbCas12a特异性切割双链DNA需要PAM序列的识别(TTTN)，PAM序列下游23nt即为特异性切割靶标双链DNA，且crRNA与双链DNA的非靶向链互补配对。

本发明人首先通过对比30种不同基因型ASFV的DNA聚合酶和pp220基因的序列，确定DNA聚合酶和多聚蛋白pp220的保守区，将保守区序列片段拼接起来，分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7。再利用CCTOP在线设计gRNA软件筛选针对DNA聚合酶和多聚蛋白pp220基因保守区可以靶向的位点，先去除掉横跨两个拼接片段的靶向位点，因保守区片段太短，不能作为靶向位点；再根据网站预测的在猪的基因组序列上可能产生脱靶的位点，去除脱靶位点位于外显子，尽量使其脱靶位点位于基因间隔区或内含子区域，降低脱靶。筛选后选取评分较高的3个位点，综合考虑初步分别选择3个位点如SEQ ID NO:2至4和SEQ ID NO:8至10所示，供后续研究确定最优位点。

DNA聚合酶基因靶向序列如SEQ ID NO:2-6、SEQ ID NO:49-52所示。

T1 TTTGGTGAGTTTTGTTTGACCCTGCTT(SEQ ID NO:2)

T2 TTTAGCCTTTGCTTCAGAGACGTATTC(SEQ ID NO:3)

T3 TTTCCACGATAACGTAGGAGAAGCGTT(SEQ ID NO:4)

T4 TTTAATACAAAAGAATTATTCATCCGC(SEQ ID NO:5)

T5 TTTGTTTGACCCTGCTTAATGATATCT(SEQ ID NO:6)

T6 TTTCATAATACTTCCACATGAGATGGT(SEQ ID NO:49)

T7 TTTCAATCCTTACTTCTGCTTTGTAAC(SEQ ID NO:50)

T8 TTTGATATCTTTAAGAATATCTTCGAT(SEQ ID NO:51)

T9 TTTAAGAATATCTTCGATGGGCTGCTT(SEQ ID NO:52)

P220基因靶向序列如SEQ ID NO:8-12、SEQ ID NO:53-57所示。

T1 TTTCCTCGTAGGATTGAAACTCCTGTT(SEQ ID NO:8)

T2 TTTAAAAGTCGACGATATACTGCTTCA(SEQ ID NO:9)

T3 TTTGGTTACCTCCGTCACCATGCGCTC(SEQ ID NO:10)

T4 TTTCAATCCTACGAGGAAAACTATGCC(SEQ ID NO:11)

T5 TTTAAGAATATCTTCGATGGGCTGCTT(SEQ ID NO:12)

T6 TTTACTCCAATTTAACGCATAACAAAC(SEQ ID NO:53)

T7 TTTGTTATGCGTTAAATTGGAGTAAAT(SEQ ID NO:54)

T8 TTTCAGGCGCTTAAAAATATCATCAAT(SEQ ID NO:55)

T9 TTTGGAAAATGTGAAAAAAATAGGCAT(SEQ ID NO:56)

T10 TTTGTTCATTTAAAAGTCGACGATATA(SEQ ID NO:57)

2、候选crRNA的筛选

(1)针对上述确定的DNA聚合酶和多聚蛋白p220基因保守区分别筛选靶向位点以设计crRNA序列。由于Lb Cas12a特异性切割双链DNA需要PAM序列的识别(TTTN)，保守区含有PAM附近的区域即为Cas12a可以切割的序列。从上面5个候选序列中分别找到3个可以靶向的位点设计crRNA序列。针对前3个可以靶向的位点设计crRNA序列，如SEQ ID NO:13至15和SEQ ID NO:16至18所示。

针对DNA聚合酶的crRNA序列如SEQ ID NO:13-15、SEQ ID NO:58-63所示。

T1 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUGAGUUUUGUUUGACCCUGCUU(SEQ ID NO:13)

T2 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCCUUUGCUUCAGAGACGUAUUC(SEQ ID NO:14)

T3 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCACGAUAACGUAGGAGAAGCGUU(SEQ ID NO:15)

T4 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUACAAAAGAAUUAUUCAUCCGC(SEQ ID NO:58)

T5 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUUUGACCCUGCUUAAUGAUAUCU(SEQ ID NO:59)

T6 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUAAUACUUCCACAUGAGAUGGU(SEQ ID NO:60)

T7 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAUCCUUACUUCUGCUUUGUAAC(SEQ ID NO:61)

T8 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUAUCUUUAAGAAUAUCUUCGAU(SEQ ID NO:62)

T9 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGAAUAUCUUCGAUGGGCUGCUU(SEQ ID NO:63)

针对P220的crRNA序列如SEQ ID NO:16-18、SEQ ID NO:64-71所示。

T1 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCUCGUAGGAUUGAAACUCCUGUU(SEQ ID NO:16)

T2 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAAGUCGACGAUAUACUGCUUCA(SEQ ID NO:17)

T3UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUUACCUCCGUCACCAUGCGCUC(SEQ ID NO:18)

T4 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAUCCUACGAGGAAAACUAUGCC(SEQ ID NO:64)

T5 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGAAUAUCUUCGAUGGGCUGCUU(SEQ ID NO:65)

T6 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCUCCAAUUUAACGCAUAACAAAC(SEQ ID NO:66)

T7 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUUAUGCGUUAAAUUGGAGUAAAU(SEQ ID NO:67)

T8 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGGCGCUUAAAAAUAUCAUCAAU(SEQ ID NO:69)

T9 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAAAAUGUGAAAAAAAUAGGCAU(SEQ ID NO:70)

T10 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUUCAUUUAAAAGUCGACGAUAUA(SEQ ID NO:71)

3、最优crRNA的确定

crRNA的DNA序列前加T7启动子序列，和其互补序列，退火形成DNA双链作为体外转录的模板，加入T7RNA聚合酶37℃孵育4-8h，DNaseⅠ消化DNA模板，切10％Urea-PAGE胶回收得到crRNA。

用荧光报告实验能否激发出荧光初步筛选出一对特异性较强的crRNA及检测位点，即针对DNA聚合酶基因的crRNA如SEQ ID NO:13和针对PP220基因的crRNA的如SEQ IDNO:17所示。

在1×NEBuffer2.1中加入50ng LbCas12a，2ng crRNA，50nM F-Q标记的单链DNA报告，最后加入质粒底物(100fmol)，37℃反应2小时过程中酶标仪读板。如图1-3所示针对DNA聚合酶的crRNA序列T1至T3的荧光报告实验结果，图4-6所示针对P220的crRNA序列T1至T3的实验结果，可以看出DNA聚合酶的T1，T3和pp220的T1，T2均能激发较强荧光，证明SEQ IDNO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17的crRNA特异性较强。

在实验过程中，对于SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16所示crRNA进行PCR时，并没有筛到较好的引物，因此后续仅就特异性较强的SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:17所示的crRNA进行进一步的验证。

实施例2：试纸条的制备

本实验使用的试纸条可以采用购买于英国TwistDx公司HybriDetect 1 lateralflow strips(Milenia)，也可根据本发明自行制备的试纸条，图3为本发明制备的试纸条的结构示意图)。

试纸条制备流程如下：

1、AuNPs纳米金颗粒的制备

按柠檬酸盐还原氯金酸(HAuCl₄)的方法制备。

2、AuNPs与抗FITC抗体耦联

1)将AuNPs溶液用0.1M NaOH调节pH至8.0，不同浓度抗体(0.2,0.4,0.8,1.6,3.2mg/mL)分别加入到上述溶液中孵育10min，然后再分别加入10％的NaCl保持1h，观察溶液颜色，最优抗体加入量即是溶液颜色保持不变时的抗体量的1.2倍。

2)在pH为8.0的AuNPs溶液中加入抗体搅拌反应1h，再加入0.1％的BSA继续搅拌反应钝化没有结合抗体的AuNP表面部位。生成的AuNP-FITC抗体缀合物弃去上清液，沉淀用包含有0.1％BSA的PBS溶液离心洗涤3次，最后将沉淀重新悬浮于包含有1％BSA、1％Suc和0.5％吐温20的PBS溶液中，4℃避光保存。

3、免疫层析试纸条的准备

用15mm×4mm的玻璃纤维膜作为样品垫，8mm×4mm的聚酯纤维膜作结合垫，在NC膜(25mm×4mm)上适当的位置用微量移液枪分别少量多次加入适量的链霉亲和素(对照线)和兔抗羊IgG Fc二抗(检测线)。37℃干燥1h，再将NC膜加入到3％的BSA(PBS溶)溶液中孵育30min以封闭NC膜的剩余位点，然后取出NC膜再次干燥。结合垫则加入适量的AuNP-FITC抗体缀合物，在37℃干燥1h。最后将样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸互相重叠2mm依次粘贴在PVC衬底上组装成一个完整的试纸条。

图7为本发明的试纸条的结构示意图，其中，链霉亲和素为对照条带(controlband),兔抗羊二抗为检测条带(test band)，阳性结果应为两条带，阴性应为只在链霉亲和素区域显色。

实施例3：荧光检测非洲猪瘟病毒

1、阳性和阴性样品的制备

阳性样品为不同滴度的病毒DNA和猪的基因组的混合物，阴性样品为猪的基因组DNA或其他猪类病毒的基因组，其中1-8为阳性，9-15为阴性。具体而言，样1-7为血样，以qPCR检测确定的病毒滴度(copies/mL)分别为1.2E+06，5.0E+05，4.9E+04，1.3E+04，6.2E+05，4.3E+05，2.8E+07，样8为肛拭子，病毒滴度为3.0E+05，样9-11为血样，12-13为肛拭子，14为口拭子，15为前期已确定的阴性样品，qPCR未检测到非洲猪瘟病毒存在。

每10μl PCR反应体系包含0.5μl基因组DNA样品，变性：95℃，15s；退火，60℃,15s；延伸：72℃，30s；循环数：30。

DNA聚合酶PCR引物：

F:TGCGCCGAGGTGAATGAATA(SEQ ID NO:43)

R:TGTCCCCCTTTCTGGAGGAA(SEQ ID NO:44)

pp220 PCR引物

F:TTCTGCGGAGACAAGACCAC(SEQ ID NO:45)

R：GCCGCCAGTATATGTCGACA(SEQ ID NO:46)

2、F-Q标记的单链DNA荧光报告实验

将50ng实施例1制备的LbCas12a、2ng实施例3确定最优crRNA(即针对DNA聚合酶基因的为SEQ ID NO:13，针对PP220基因的为SEQ ID NO:17分别进行实验)和50nM实施例2中的F-Q标记的单链DNA报告序列在1×NEBuffer2.1(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mMMgCl₂，100μg/ml BSA pH 7.9)中室温孵育5-10分钟，加入10μl用本实施例上述制备的阳性或阴性样品的PCR产物使总体积30ul(康宁黑色圆底96孔酶标板)，37℃酶标仪读板2小时，每30秒读一次，FAM激发波长：485nm；吸收波长：535nm。

未被切割的单链DNA报告序列FAM荧光被quencher淬灭，只有被切割后才能释放出荧光。若样品中无双链DNA底物则不会激发LbCas12a非特异性切割单链DNA活性即报告序列不会被切割，检测不到荧光信号。样品中有双链DNA底物则报告序列会被切割，FAM一端处于游离状态会检测到荧光信号，以此来区别阳性和阴性样品。

结果如图8和图9所示，其中样品1-8为阳性样品，9-15疑似为阴性样品，分别用DNA聚合酶和pp220基因的特异性引物对扩增的基因组样品PCR，与LbCas12a反应的2小时内，阳性样品1-8均检测到荧光信号，强阳性1-2和5-8激发的荧光比弱阳性3-4强，阴性样品的荧光信号几乎与阴性对照(PCR反应未加样品)相一致，几乎不激发荧光，DNA聚合酶基因和pp220两个基因的结果相一致。

实施例4：试纸条检测非洲猪瘟病毒

试纸条检测非洲猪瘟病毒的步骤：在1×NEBuffer2.1中加入LbCas12a，crRNA(用针对DNA聚合酶基因的为SEQ ID NO:13，针对PP220基因的为SEQ ID NO:17分别进行实验)，F-B标记的单链DNA报告序列，最后加入PCR产物，放入37℃反应1-2h，反应完成后，向20μl反应体系中加入80μl试剂盒中自带HybriDetect assay buffer，枪头混匀后***试纸条反应5min***试纸条进行检测。

由于样品垫能在短时间内吸收样品溶液，之后在虹吸作用下向结合垫方向移动，样品溶液中未被切割和被切割的报告5’端FAM会与耦联抗FITC抗体的金纳米颗粒特异性结合，在毛细作用下金纳米颗粒随液体移动，未被切开的报告序列和被切掉带生物素的一端因生物素与链霉亲和素的强亲和作用而被富集显色在第一条带即对照条带(controlband)处显色，而被切掉带有FAM的一端的金纳米颗粒会继续向前移动，因二抗与抗FITC的作用而在第二条带截留显色，故包被链霉亲和素的区域为对照条带(control band),包被兔抗羊二抗的区域为检测条带(test band)。理论上，阳性样品应在试纸条出现两条带(control band和test band)，阴性样品只有一条带(control band)。

为使抗体与报告充分结合，避免出现假阳性结果。通过向ddH₂O中加入一系列不同量的报告序列使其终浓度为0、5、10、50、100、125、150、200、400、1000、2000、4000nM，来确定最佳报告加入量。如图10所示结果，不加报告序列，空载抗体不会在第一条带(链霉亲和素)显色，只会在第二条(二抗)显色，随着加入报告序列浓度越高，第二条抗体显色带越来越弱，当抗体与报告结合达到饱和时，不会有空载抗体，也就不会出现第二条显色带了。因此选择1uM报告序列作为最优加入量。

如图11所示结果，报告序列浓度为1uM时，加入50ng LbCas12a和2ng crRNA反应时，阳性样品在test band依旧没有很明显的显色，可能是加入报告序列量增多，50ngLbCas12a切割报告序列较少，不能在试纸条上看到明显差异。通过将LbCas12a和crRNA加入量提高到3倍即150ng LbCas12a和6ng crRNA，能明显看到阳性样品为两条带，阴性样品为一条带。综上所述，最终确定试纸条反应的最佳条件：150ng LbCas12a,，6ng crRNA，1uM F-B报告。

基于上述优选的反应最佳条件进行实验：分别选取阳性(样品7)和阴性(样品15)样品和阴性对照，用上述DNA聚合酶基因的特异性引物PCR法扩增目标双链DNA，阴性样品和阴性对照均未扩增出目标双链DNA，阳性样品能扩增出双链DNA。在1×NEBuffer2.1中加入150ng LbCas12a，6ng crRNA，1μM F-B单链DNA报告序列，最后加入10μl PCR产物总体积20μl，放入37℃反应1-2h。反应完成后，向20μl反应体系中加入80μl试剂盒中自带的分析缓冲液(HybriDetect assay buffer)，枪头混匀后***试纸条反应5min。如图12所示结果，其中，采用的样品是样品7作为阳性和样品15作为阴性样品；显示阳性样品能激发LbCas12a切割报告序列的能力，能释放出带FAM的一端，会出现两条带，而阴性样品均会在链霉素区域被截留只出现一条带。

实施例5：RPA扩增目的片段后试纸条检测

RPA引物设计网站：Primer3,Primer-BLAST，PCR引物一般可以使用，但不是最优的，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-36个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。RPA反应的产物不能超过500bp，最好100-200bp。如此，限定引物长度为30-36，产物为100-200，针对DNA聚合酶靶向位点1(SEQ ID NO:2)附近的区域设计引物设计得到了引物1和引物2，目的产物为134bp。

将引物1和引物2，基因组样品(分别用到两种样品，即之前的样品2和样品8，分别称为样品1+和2+)，重悬缓冲液混合均匀后加入含有RPA必须的重组酶，单链结合蛋白，链置换DNA聚合酶三种酶的冻干粉中(RPA试剂盒自带

Basic reaction)，混匀后加入醋酸镁，激发扩增反应起始。

1、RPA体系(15ul):

引物1(5uM)1.44ul：TATTGCTCATGTAAACACACCCAATTTTAATAC(SEQ ID NO:47)

引物2(5uM)1.44ul：GTAGTTTCATGGATTCTTCCATAATTCGCGTT(SEQ ID NO:48)

重悬缓冲液8.85ul

样品1ul

280mM醋酸镁(MgOAc)1.5ul

39℃孵育20分钟

2、试纸条检测

在1×NEBuffer2.1中加入150ng LbCas12a，6ng crRNA，1uM F-B标记的单链DNA报告序列，最后加入10ul上述RPA产物总体积20ul，放入37℃反应1-2h。向20ul反应体系中加入80ul分析缓冲液(assay buffer)，枪头混匀后***试纸条反应5min。

图13为两个阳性样品RPA扩增后的试纸条结果，采用的样品是样品2和样品8，分别称为样品1+和2+，前期qPCR结果表明1+样品的病毒滴度高于2+样品，琼脂糖凝胶显示样品1+比样品2+扩增出的目的双链DNA多，试纸条上样品1+和2+均有两条带出现即为阳性结果，且在检测条带(test band)区域1+比2+显色强。说明2号样品中含有的非洲猪瘟病毒多于8号样品。

实施例6：检测的特异性

1、比较Cas12a检测***对ASFV与PCV3(猪环形病毒3型)，MH(猪鼻支原体)，HPS(副猪嗜血杆菌)，PRV(猪伪狂犬病毒)，SS(猪链球菌)的检测敏感性。

将上述几种病毒用DNA聚合酶基因的特异性引物PCR扩增后，将PCR产物加入到含有2ng crRNA，50ng LbCas12a，50nM F-Q单链DNA报告的NEBuffer2.1缓冲液中反应2小时，用酶标仪检测荧光。

图14所示结果显示，只有ASFV样品组检测到荧光信号，其余均与对照组不加双链DNA底物的荧光信号相似，表明该检测***对除ASFV以外的其他病毒不敏感，证明此检测方法对ASFV的高度特异性。

2、选取DNA聚合酶基因的一个靶向序列TTTGGTGAGTTTTGTTTGACCCTGCTT(SEQ IDNO:2)，比较该***对检测位点PAM突变及靠近PAM的20个碱基突变的识别。

其中，检测位点未突变和突变PAM或核心区域的非靶向链NTS(1uM)和靶向链TS按50：1摩尔比在退火缓冲液中退火：95℃孵育5分钟后以0.1℃/s的速度缓慢降到25℃，形成双链DNA，以用于作为激发LbCas12a非特异性切割单链活性的底物，比较Cas12a检测***对位点突变的容忍度。

未突变靶向链TS(SEQ ID NO:19)：

cggaatagatatcattaagcagggtcaaacaaaactcaccaaaacgataggaacgcgaa

未突变非靶向链NTS(SEQ ID NO:20)：

ttcgcgttcctatcgttttggtgagttttgtttgaccctgcttaatgatatctattccg

PAM突变TS(SEQ ID NO:21)：

cggaatagatatcattaagcagggtcaaacaaaactcaccgctacgataggaacgcgaa

PAM突变NTS(SEQ ID NO:22)：

ttcgcgttcctatcgtagcggtgagttttgtttgaccctgcttaatgatatctattccg

1,2突变TS(SEQ ID NO:23)：

cggaatagatatcattaagcagggtcaaacaaaactctgcaaaacgataggaacgcgaa

1,2突变NTS(SEQ ID NO:24)：

ttcgcgttcctatcgttttgcagagttttgtttgaccctgcttaatgatatctattccg

3,4突变TS(SEQ ID NO:25)：

cggaatagatatcattaagcagggtcaaacaaaacagaccaaaacgataggaacgcgaa

3,4突变NTS(SEQ ID NO:26)：

ttcgcgttcctatcgttttggtctgttttgtttgaccctgcttaatgatatctattccg

5,6突变TS(SEQ ID NO:27)：

cggaatagatatcattaagcagggtcaaacaaatgtcaccaaaacgataggaacgcgaa

5,6突变NTS(SEQ ID NO:28)：

ttcgcgttcctatcgttttggtgacatttgtttgaccctgcttaatgatatctattccg

7,8突变TS(SEQ ID NO:29)：

cggaatagatatcattaagcagggtcaaacattactcaccaaaacgataggaacgcgaa

7,8突变NTS(SEQ ID NO:30)：

ttcgcgttcctatcgttttggtgagtaatgtttgaccctgcttaatgatatctattccg

9,10突变TS(SEQ ID NO:31)：

cggaatagatatcattaagcagggtcaaagtaaactcaccaaaacgataggaacgcgaa

9,10突变NTS(SEQ ID NO:32)：

ttcgcgttcctatcgttttggtgagtttactttgaccctgcttaatgatatctattccg

11,12突变TS(SEQ ID NO:33)：

cggaatagatatcattaagcagggtcattcaaaactcaccaaaacgataggaacgcgaa

11,12突变NTS(SEQ ID NO:34)

ttcgcgttcctatcgttttggtgagttttgaatgaccctgcttaatgatatctattccg

13,14突变TS(SEQ ID NO:35)：

cggaatagatatcattaagcagggtgtaacaaaactcaccaaaacgataggaacgcgaa

13,14突变NTS(SEQ ID NO:36)：

ttcgcgttcctatcgttttggtgagttttgttacaccctgcttaatgatatctattccg

15,16突变TS(SEQ ID NO:37)：

cggaatagatatcattaagcaggcacaaacaaaactcaccaaaacgataggaacgcgaa

15,16突变NTS(SEQ ID NO:38)

ttcgcgttcctatcgttttggtgagttttgtttgtgcctgcttaatgatatctattccg

17,18突变TS(SEQ ID NO:39)：

cggaatagatatcattaagcaccgtcaaacaaaactcaccaaaacgataggaacgcgaa

17,18突变NTS(SEQ ID NO:40)：

ttcgcgttcctatcgttttggtgagttttgtttgacggtgcttaatgatatctattccg

19,20突变TS(SEQ ID NO:41)：

cggaatagatatcattaaggtgggtcaaacaaaactcaccaaaacgataggaacgcgaa

19,20突变NTS(SEQ ID NO:42)：

ttcgcgttcctatcgttttggtgagttttgtttgacccaccttaatgatatctattccg

分别将该位点的PAM突变(TTTG突变为AAAC)和靠近PAM的20nt依次突变两个碱基(A突变为C，T突变为G)合成其靶向链和非靶向链，退火得到双链底物，将退火产物加入到含有2ng crRNA，50ng LbCas12a，50nM F-Q单链DNA报告序列的NEBuffer2.1缓冲液中与LbCas12a反应1.5小时，用酶标仪检测荧光。

图15显示，只有远离PAM的位点突变掉能激发出少量荧光，证明crRNA高度特异性，其不识别PAM突变的序列和靠近PAM突变的序列。其完全不能产生荧光信号的突变序列长度为4(PAM)+16nt(靠近PAM)＝20nt。20nt长的序列足够特异，对应于10的12次方以上的序列中才有一个相同序列，而病毒的基因组的长度一般在10的5次方上下，远小于10的12次方。以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 基于CRISPR方式检测非洲猪瘟病毒的crRNA及试剂盒

<160> 70

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 205

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggttacaaag cagaagtaag gattgaaaat accatctcat gtggaagtat tatgaaattt 60

taatacaaaa gaattattca tccgcggata gatatcatta agcagggtca aacaaaactc 120

accaaaacga tagggagccg ggagaacgct tctcctacgt tatcgtggaa aaaatggaat 180

acgtctctga agcaaaggct aaaaa 205

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tttggtgagt tttgtttgac cctgctt 27

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttagccttt gcttcagaga cgtattc 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttccacgat aacgtaggag aagcgtt 27

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttaatacaa aagaattatt catccgc 27

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttgtttgac cctgcttaat gatatct 27

<210> 7

<211> 476

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaacctatcg gagggaagta attggcattg atgatatttt taagcgcctg aaagtttggc 60

atagttttcc tcgtaggatt gaaactcctg tttgttatgc gttaaattgg agtaaatctg 120

ggccacataa gcaggagtca taaagatttt taaaattagg gtcgatgcct atttttttca 180

cattttccaa aaagtcttta tcaagttcct tttgggtggg ttttgttcat ttaaaagtcg 240

acgatatact gcttcaatca tggtgactgc tttggttacc tccgtcacca tgcgctcttt 300

tcaagtgtat tttctatact gccagcttat cctgacctaa atcaataaat tcctggttaa 360

tggcgtctgc aatcatttta cagcggctcg aggatcgggc agttgttttt tgatatcttt 420

aagaatatct tcgatgggct gctttgtgtc tttgctttac tcgatacgga gtctat 476

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttcctcgta ggattgaaac tcctgtt 27

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tttaaaagtc gacgatatac tgcttca 27

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tttggttacc tccgtcacca tgcgctc 27

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tttcaatcct acgaggaaaa ctatgcc 27

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tttaagaata tcttcgatgg gctgctt 27

<210> 13

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

uaauuucuac uaaguguaga ugugaguuuu guuugacccu gcuu 44

<210> 14

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

uaauuucuac uaaguguaga ugccuuugcu ucagagacgu auuc 44

<210> 15

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

uaauuucuac uaaguguaga ucacgauaac guaggagaag cguu 44

<210> 16

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

uaauuucuac uaaguguaga ucucguagga uugaaacucc uguu 44

<210> 17

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

uaauuucuac uaaguguaga uaaagucgac gauauacugc uuca 44

<210> 18

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

uaauuucuac uaaguguaga uguuaccucc gucaccaugc gcuc 44

<210> 19

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cggaatagat atcattaagc agggtcaaac aaaactcacc aaaacgatag gaacgcgaa 59

<210> 20

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ttcgcgttcc tatcgttttg gtgagttttg tttgaccctg cttaatgata tctattccg 59

<210> 21

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cggaatagat atcattaagc agggtcaaac aaaactcacc gctacgatag gaacgcgaa 59

<210> 22

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ttcgcgttcc tatcgtagcg gtgagttttg tttgaccctg cttaatgata tctattccg 59

<210> 23

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cggaatagat atcattaagc agggtcaaac aaaactctgc aaaacgatag gaacgcgaa 59

<210> 24

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ttcgcgttcc tatcgttttg cagagttttg tttgaccctg cttaatgata tctattccg 59

<210> 25

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cggaatagat atcattaagc agggtcaaac aaaacagacc aaaacgatag gaacgcgaa 59

<210> 26

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ttcgcgttcc tatcgttttg gtctgttttg tttgaccctg cttaatgata tctattccg 59

<210> 27

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cggaatagat atcattaagc agggtcaaac aaatgtcacc aaaacgatag gaacgcgaa 59

<210> 28

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ttcgcgttcc tatcgttttg gtgacatttg tttgaccctg cttaatgata tctattccg 59

<210> 29

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

cggaatagat atcattaagc agggtcaaac attactcacc aaaacgatag gaacgcgaa 59

<210> 30

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ttcgcgttcc tatcgttttg gtgagtaatg tttgaccctg cttaatgata tctattccg 59

<210> 31

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cggaatagat atcattaagc agggtcaaag taaactcacc aaaacgatag gaacgcgaa 59

<210> 32

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ttcgcgttcc tatcgttttg gtgagtttac tttgaccctg cttaatgata tctattccg 59

<210> 33

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cggaatagat atcattaagc agggtcattc aaaactcacc aaaacgatag gaacgcgaa 59

<210> 34

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

ttcgcgttcc tatcgttttg gtgagttttg aatgaccctg cttaatgata tctattccg 59

<210> 35

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

cggaatagat atcattaagc agggtgtaac aaaactcacc aaaacgatag gaacgcgaa 59

<210> 36

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ttcgcgttcc tatcgttttg gtgagttttg ttacaccctg cttaatgata tctattccg 59

<210> 37

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

cggaatagat atcattaagc aggcacaaac aaaactcacc aaaacgatag gaacgcgaa 59

<210> 38

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

ttcgcgttcc tatcgttttg gtgagttttg tttgtgcctg cttaatgata tctattccg 59

<210> 39

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

cggaatagat atcattaagc accgtcaaac aaaactcacc aaaacgatag gaacgcgaa 59

<210> 40

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ttcgcgttcc tatcgttttg gtgagttttg tttgacggtg cttaatgata tctattccg 59

<210> 41

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

cggaatagat atcattaagg tgggtcaaac aaaactcacc aaaacgatag gaacgcgaa 59

<210> 42

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

ttcgcgttcc tatcgttttg gtgagttttg tttgacccac cttaatgata tctattccg 59

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

tgcgccgagg tgaatgaata 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

tgtccccctt tctggaggaa 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

ttctgcggag acaagaccac 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

gccgccagta tatgtcgaca 20

<210> 47

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

tattgctcat gtaaacacac ccaattttaa tac 33

<210> 48

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

gtagtttcat ggattcttcc ataattcgcg tt 32

<210> 49

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

tttcataata cttccacatg agatggt 27

<210> 50

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

tttcaatcct tacttctgct ttgtaac 27

<210> 51

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

tttgatatct ttaagaatat cttcgat 27

<210> 52

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

tttaagaata tcttcgatgg gctgctt 27

<210> 53

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

tttactccaa tttaacgcat aacaaac 27

<210> 54

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

tttgttatgc gttaaattgg agtaaat 27

<210> 55

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

tttcaggcgc ttaaaaatat catcaat 27

<210> 56

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

tttggaaaat gtgaaaaaaa taggcat 27

<210> 57

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

tttgttcatt taaaagtcga cgatata 27

<210> 58

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

uaauuucuac uaaguguaga uauacaaaag aauuauucau ccgc 44

<210> 59

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

uaauuucuac uaaguguaga uuuugacccu gcuuaaugau aucu 44

<210> 60

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

uaauuucuac uaaguguaga uauaauacuu ccacaugaga uggu 44

<210> 61

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

uaauuucuac uaaguguaga uaauccuuac uucugcuuug uaac 44

<210> 62

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

uaauuucuac uaaguguaga uauaucuuua agaauaucuu cgau 44

<210> 63

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

uaauuucuac uaaguguaga uagaauaucu ucgaugggcu gcuu 44

<210> 64

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

uaauuucuac uaaguguaga uaauccuacg aggaaaacua ugcc 44

<210> 65

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

uaauuucuac uaaguguaga uagaauaucu ucgaugggcu gcuu 44

<210> 66

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

uaauuucuac uaaguguaga ucuccaauuu aacgcauaac aaac 44

<210> 67

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

uaauuucuac uaaguguaga uuuaugcguu aaauuggagu aaau 44

<210> 68

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

uaauuucuac uaaguguaga uaggcgcuua aaaauaucau caau 44

<210> 69

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

uaauuucuac uaaguguaga ugaaaaugug aaaaaaauag gcau 44

<210> 70

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

uaauuucuac uaaguguaga uuucauuuaa aagucgacga uaua 44

Claims

1.一种基于CRISPR方式检测非洲猪瘟病毒的crRNA，其特征在于：所述crRNA根据如SEQID NO:2或SEQ ID NO:6所示的靶向位点设计得到。

2.如权利要求1所述的基于CRISPR方式检测非洲猪瘟病毒的crRNA，其特征在于：所述crRNA的指导序列为GUGAGUUUUGUUUGACCCUGCUU或AAAGUCGACGAUAUACUGCUUCA；所述crRNA的非指导序列为UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU或与其序列相似性大于75％的序列。

3.如权利要求1所述的基于CRISPR方式检测非洲猪瘟病毒的crRNA，其特征在于：所述crRNA的序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:17所示。

4.如权利要求1至3任一项所述的基于CRISPR方式检测非洲猪瘟病毒的crRNA，其特征在于：所述crRNA可通过Cas蛋白剪切成多条crRNA的RNA形式。

5.一种基于CRISPR方式检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：其包括如权利要求1至4中任一项所述的crRNA、单链DNA报告序列、缓冲液、试纸条、分析缓冲液及Cas蛋白。

6.如权利要求5所述的基于CRISPR方式检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：所述单链DNA报告序列为含有T和A的富集序列。

7.如权利要求6所述的基于CRISPR方式检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：所述单链DNA报告序列含有TTATT、TTTTA、AAAAT、ATATAT中的至少一种。

8.如权利要求5所述的基于CRISPR方式检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：所述单链DNA报告序列的5’端用FAM、FITC、RB200、TRITC、TET、PE、PI、AMCA、Atto425、PerCP、APC、Alexa Fluor 488、JOE、VIC、HEX、NED、Cy3、TAMRA、ROX、Texas red、Cy5、Quasar 670、Cy5.5和Cy7中的任意一种进行修饰；且所述单链DNA报告序列的3’端用quencher或生物素修饰。

9.如权利要求5所述的基于CRISPR方式检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：所述Cas蛋白为Cas12、Cas13或Cas14；所述Cas12为Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d或Cas12e；所述试纸条按液流方向依次包括样品垫、耦连抗所述单链DNA报告序列的5’端的修饰标记抗体的金属颗粒的结合垫、链霉亲和素及二抗；所述分析缓冲液为HybriDetect assaybuffer。

10.如权利要求5项所述的基于CRISPR方式检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的检测反应体系用量为：50-500ng Cas蛋白，4-8ng crRNA，0.5-1.5uM单链DNA报告序列，分析缓冲液80-200μl。