CN111521781B

CN111521781B - 一种用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸的检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN111521781B
Application number: CN202010113049.3A
Authority: CN
Inventors: 刘明; 王鑫杰; 钟名天
Original assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date: 2020-02-24
Filing date: 2020-02-24
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2040-02-24
Also published as: CN111521781A

Abstract

本发明属于病毒检测的生物技术领域，具体涉及一种用于新冠肺炎病毒SARS‑CoV‑2核酸检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括基于Cpf1的胶体金试纸条检测体系；所述检测方法包括如下步骤：a)制备新冠病毒核酸样品；b)取步骤a)得到的核酸样品，利用病毒核酸orf1a、orf1a、N和E基因片段的特异性引物，加入RT‑RPA等温扩增体系，扩增获得特异性产物；c)将步骤b)得到的特异性产物加入Cpf1检测体系，反应得到Cpf1检测产物；d)将Cpf1检测产物进行胶体金试纸条检测。本发明通过利用Cpf1特异识别核酸和胶体金试纸条检测技术，实现对新冠病毒核酸的高灵敏度、高特异性及快速可视化检测。

Description

一种用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸的检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于病毒检测的生物技术领域，具体涉及一种用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

国际病毒分类委员会(ICTV)将新型冠状病毒(2019-nCoV)的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)。世界卫生组织(WHO)宣布，由这一病毒导致的疾病的正式名称为COVID-19，该病毒与严重的急性呼吸***综合症冠状病毒(SARS-CoV)相似。SARS-CoV-2(ssRNA+)是具包膜RNA冠状病毒(sarbecovirus亚属，Orthocoronavirinae亚科)的第七个成员。

目前，对于新冠肺炎的诊断主要有病毒核酸分子检测和胸部影像学检测两种。胸部影像学检测，主要依赖于胸肺部CT成像结果进行判断：早期呈现多发的小斑片影及间质改变，以肺外带明显，进而发展为双肺多发磨玻璃影、浸润影。严重者出现肺实变，甚至‘白肺’，胸腔积液少见。但是，胸肺部CT检测，需要依赖于专业。在分子生物学的手段上，目前常用的办法有两种：病毒的基因测序和核酸检测。二代测序因为可以检测微量物质，但是大多数医院没有测序的设备和生物信息团队来协助，并且成本高检测周期也比较长，不适合做筛查。

现在的诊断方法以来病毒核酸检测：通过实时反转录聚合酶链式反应(realtimereverse transcrition PCR，rRT-PCR)鉴定。每个病例采集上、下呼吸道标本，如支气管和肺泡灌洗液、深咳痰液，同时采集发病初期和发病14天后的血清。目前在符合疑似病例标准的基础上，对痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等标本进行rRT-PCR检测，显示SARS-CoV-2核酸阳性，即可确诊SARS-CoV-2感染。rRT-PCR检测病毒核酸主要受制于：试剂盒质量和能够承担临床检测的P3实验室数量、P3实验室设备的准确性和稳定性、能进行熟练稳定操作的工作人员人数、需要一些昂贵的实验设备、并且检测时间较长。

目前，尚没有针对SARS-CoV-2感染有效治疗手段或疫苗，疾病控制主要依赖于严格的物理隔离切断传播途径，从而直接造成严重的经济损失，鉴于SARS-CoV-2传播途径广泛和传播速度快，迫切需要病毒的快速诊断，这对于预防和确诊该病非常重要。实现SARS-CoV-2准确快速的检测，使得防疫检疫决策可以当机立断、立即处置，达到阻断扩散风险的目的。

CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫***，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸。其中，CRISPR-Cas12a(Cpf1)属于Cas酶第二家族，用来引导RNA指导双链DNA裂解单个RuvC 催化结构域。Cpf1酶识别富含胸腺嘧啶(Thymine，T)核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)，催化它们自身的指导CRISPR RNA(crRNA)成熟，并特异性识别和切割互补配对的双链DNA(dsDNA)，当CRISPR/Cpf1蛋白以序列特异性方式识别切割靶双链DNA时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性。

胶体金免疫测定是临床快速检测的一种高效技术方案。当胶体金颗粒标记的抗体与相应的抗原结合时，可目视检测有色免疫反应物。胶体金检测作用时间短、在广泛的气候条件下长期稳定以及相对低成本，这些特性使其广泛适用于未经训练的人员进行临床一线使用。

发明内容

针对以上问题，本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、快速可视化的用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸的检测试剂盒及其检测方法，利用Cpf1特异性和高灵敏识别切割靶核酸，结合胶体金试纸条进行目视判读检测结果，实现对SARS-CoV-2核酸快速检测。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸的检测试剂盒，所述试剂盒包括基于Cpf1的胶体金试纸条检测体系；

所述基于Cpf1的胶体金试纸条检测体系包括针对新冠病毒SARS-CoV-2核酸的特异性crRNA、Cpf1蛋白和ssDNA报告***；

所述特异性crRNA包括针对orf1a基因的orf1a-cr1到orf1a-cr2，针对orf1b基因的orf1b-cr1到orf1b-cr2，针对N基因的N-cr1到N-cr2和针对E基因的E-cr1到E-cr2，其基因序列分别为SEQ NO.1到SEQ NO.8；根据基因生物信息学分析，将SARS-CoV-2病毒序列与NVBI数据库中SARS和bat-related SARS 病毒序列，设计针对orf1a、orf1b、N和E基因片段的特异性crRNA，为保证检测特异性，对设计的crRNA序列检索NCBI核酸数据库中包括人、动物、植物和微生物等基因，确定没有高同源性匹配；根据Cpf1识别特定PAM序列特点，在orf1a、orf1b、N和E基因靶序列上设计8条特异性crRNA，通过检测发现8个crRNA分别能特异性识别SARS-CoV-2病毒orf1a、orf1b、N和E的4个基因，并且，针对同一待检样品，同时对SARS-CoV-2病毒4基因orf1a、orf1b、N和E的检测，能有效提高检测准确性和可信性；

所述ssDNA报告***为采用包括地高辛和生物素标记的ssDNA，标记产物为/5Dig/TTTATTA/3Bio/，命名为ssDNA DB reporter /5Dig/TTTATTA/3Bio/，用于胶体金试纸条检测；

所述胶体金试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬；所述PVC背衬上依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述结合垫上包被有被胶体金标记鼠抗地高辛抗体的缀合物；所述硝酸纤维素膜上分别包被有链霉亲和素构成的质控线和由兔抗鼠IgG抗体构成的检测线；

所述特异性crRNA的制备方法包括如下步骤：针对SARS-CoV-2病毒基因片段orf1a、orf1b、N和E，找到包含Cpf1识别序列TTTN的靶向序列，设计23bp长度的crRNA，通过体外转录或者合成获得特异性crRNA；

所述Cpf1蛋白的制备方法包括如下步骤：针对Cpf1蛋白进行原核密码子优化获得序列SEQ NO.13，构建到pET28a表达载体，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得目的蛋白；

本发明的用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸检测试剂盒的检测原理为：若Cpf1检测体系中存在SARS-CoV-2病毒核酸，会由在SARS-CoV-2特异性crRNA介导下特异性激活Cpf1蛋白的核酸内切酶活性，从而切割ssDNA DB reporter，得到的切割反应产物加入到胶体金试纸条后，被胶体金标的鼠抗地高辛抗体会与地高辛标记的ssDNA报告***结合，复合物随液流方向从质控线走向检测线；质控线链霉亲和素饱和抓获标记有生物素标的ssDNA报告***，从而显示条带；只有当Cpf1检测到新冠肺炎病毒SARS-CoV-2基因特性性序列，会将标记有地高辛和生物素ssDNA报告***切割断开，从而会有地高辛标记的ssDNA片段被检测线抓获显色。

本发明还提供了一种用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

a)制备新冠病毒SARS-CoV-2核酸样品：采用核酸快速释放剂对样品病毒灭活并释放待测样品中的核酸；

b)等温扩增核酸：取步骤a)得到的核酸样品，利用SARS-CoV-2 病毒核酸orf1a、orf1a、N和E基因片段的特异性引物，所述特异性引物的基因序列如SEQ NO.14～SEQNO.21所示，加入RT-RPA等温扩增体系，于37℃下反应25min扩增获得特异性产物；

c)Cpf1检测反应：将步骤b)得到的特异性产物加入Cpf1检测体系，于37℃下反应25min反应得到Cpf1检测产物；

d)将Cpf1检测产物进行如上所述试剂盒的胶体金试纸条检测。

本发明的有益效果如下：

本发明通过利用Cpf1特异识别核酸和胶体金试纸条检测技术，实现对SARS-CoV-2病毒核酸的高灵敏度、高特异性及快速可视化检测；

基于Cpf1的SARS-CoV-2病毒核酸的快速检测工具，该工具包含胶体金试纸条，能实现方便快捷的肉眼直接结果判读，为基层实验和临床一线提供一个准确、快速、简便的检测方法，本发明采用的Cpf1反应体系和crRNA组合，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量、不依赖大型试验设备等优势。

附图说明

图1为基于Cpf1胶体金试纸条法快速检测SARS-CoV-2核酸示意图；

图2为不同SARS-CoV-2核酸特异性crRNA检测效果图；

图3为基于Cpf1胶体金试纸条法检测SARS-CoV-2核酸灵敏度的结果图；

图4为基于Cpf1胶体金试纸条法检测SARS-CoV-2核酸特异性的结果图；

图5为实施例2的Cpf1胶体金试纸条法模拟检测临床 SARS-CoV-2核酸样品结果图。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。

RPA扩增试剂盒Basic kit购自TwistAmp公司；crRNA体外转录盒子MEGAshortscript T7 Transcription Kit和纯化盒子MEGAclear Kit购自Ambion公司；常规试剂如Tris-Base、NaCl、Tris-HCl、MgCl₂、BSA和甘油等购自Thermo Fisher；检测用核酸片段、ssDNA探针和RNA合成由南京金斯瑞公司完成；本发明使用购自诺唯赞公司的快速核酸释放剂获得预处理的核酸。

实施例1

一种用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2检测试剂盒的制备以及检测方法：

1)制备新冠病毒SARS-CoV-2核酸样品：

新冠病毒SARS-CoV-2的orf1a、orf1b、N和E基因片段，为参考NCBI基因库中的相关毒株序列设计，由南京金斯瑞公司合成，并命名为pc-orf1a、pc-orf1b、pc-N和pc-E，所对应的基因序列分为SEQ NO.9至SEQ NO.12；

新冠病毒SARS-CoV-2的orf1a、orf1b、N和E基因对应的RNA核酸样品通过体外转录制备得到：使用MEGAshortscript T7转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific)，分别以pc-orf1a、pc-orf1b、pc-N和pc-E 作为模板转录对应的基因RNA样品pcRNA-orf1a、pcRNA-orf1b、pcRNA-N和pcRNA-E。转录后的RNA用MEGAclear试剂盒(Thermo FisherScientific)纯化，并通过乙醇沉淀法回收，检测转录后RNA质量和浓度，并保存在-80℃直至使用；

2)针对SARS-CoV-2特异性crRNA的设计以及制备：

针对SARS-CoV-2的orf1a、orf1b、N和E基因，寻找包含cpf1识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计23bp长度的crRNA，并分别命名为针对orf1a基因的orf1a-cr1到orf1a-cr2，针对orf1b基因的orf1b-cr1到orf1b-cr2，针对N基因的N-cr1到N-cr2和针对E基因的E-cr1到E-cr2；

设计完成后，交于南京金斯瑞公司合成oligo，构建到载体pUC57-T7-crRNA，通过体外转录获得目的crRNA，或由南京金斯瑞公司直接合成crRNA序列对应的RNA；

得到的SARS-CoV-2的orf1a、orf11b、N和E基因的crRNA的基因序列为SEQ NO.1～SEQ NO.8所示，具体信息如表1所示：

表1 针对SARS-CoV-2病毒的核酸特异性crRNA

3)反转录等温扩增核酸：

利用反转录等温扩增(RT-RPA)对单链RNA(ssRNA)病毒核酸进行预扩增，以便进行Cpf1检测反应；

按照等温扩增反应要求，设计并合成RT-RPA扩增引物RT-RPA-F (正向引物)和RT-RPA-R(反向引物)，得到的序列信息如表2所示：

表2针对新冠病毒nCoV核酸特异性RT-RPA引物序列

参考RT-RPA等温扩增操作步骤，扩增获得待检测样品：等温扩增在50μL反应体系中进行，取xμL RNA样品、(18.5-x)μL ddH₂O、2μL RT-RPA-F、2μL RT-RPA-R和252μL反应缓冲液均匀，加入反应管溶解混匀，最后，加入2.5μL乙酸镁，混匀后在39℃下反应25分钟，得到的RT-RPA产物进行下一步检测。

4)Cpf1检测反应：

新冠病毒Cpf1检测采用20μL的反应体系如表3所示，但反应体系不限于此，包含对相应成分的比例调整。

表3针对SARS-CoV-2病毒核酸的Cpf1检测体系

在Cpf1对目的基因检测体系依次加入2μL Buffer、1μL Rnase Inhibitors、1μLCpf1、1μL ssDNA DB reporter、5μL RPA sample、1μL crRNA和9μL H₂O，各组分混合均匀后于37℃反应25min，各组成分如表3所示。

首先，依次检测针对SARS-CoV-2病毒核酸的crRNA的检测效率：在Cpf1检测体系中，各加入1μL crRNA，其它各组分维持一致，混合均匀，37℃反应25min，对上述反应产物进行后续结果检测判定；

5)将Cpf1检测产物进行胶体金试纸条检测：

胶体金试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬；所述PVC背衬上依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述结合垫上包被有被胶体金标记鼠抗地高辛抗体的缀合物；所述硝酸纤维素膜上分别包被有链霉亲和素构成的质控线和由兔抗鼠IgG抗体构成的检测线；

将20μL上述Cpf1检测产物与40μL胶体金试纸条缓冲液(4X SSC，2％BSA和0.05％TWEEN-20，pH7.0)混合，将测试条浸入混合物中，反应3min后，可由肉眼进行结果判定，并拍照记录；

得到反应检测的结果如图2所示，结果表明，本实施例的检测体系中，针对不同基因片段的crRNA均能高效特异地检测对应的orf1a、orf1b、N和E基因片段；

鉴于本实施例中，针对orf1a、orf1b、N和E基因的crRNA有一致的检测效果，将针对orf1a基因的orf1a-cr1到orf1a-cr2等比例混合获得orf1a-crmix；将针对orf1b基因的orf1b-cr1到orf1b-cr2等比例混合获得orf1b-crmix；针对N基因的N-cr1到N-cr2等比例混合获得N-crmix；将针对E基因的E-cr1到E-cr2等比例混合获得E-crmix。后续检测中，orf1a-crmix检测orf1a基因，orf1b-crmix检测orf1b基因，N-crmix检测N基因和E-crmix检测E基因；

上述流程步骤如图1所述。

1.测定Cpf1胶体金试纸条法对SARS-CoV-2检测灵敏度：

将获得的SARS-CoV-2的orf1a、orf1b、N和E基因片段对应RNA 样品pcRNA-orf1a、pcRNA-orf1b、pcRNA-N和pcRNA-E，计算检测片段的分子量，并进行10倍梯度稀释，获得每微升含有2×e⁵、2×e⁴、2×e³、2×e²、2×e¹和2×e⁰拷贝数(copy/μL)的测试样品；

将上述稀释样品进行Cpf1特异性反应，参照实施例1中的检测步骤进行检测和试纸条判读：2μL梯度稀释上述样品，加入到50μL RT-RPA等温扩增反应体系进行扩增，之后再去10μL等温扩增产物，加入到20μL Cpf1核酸检测体系，混合均匀，37℃反应25min后，将胶体金试纸条***反应液，进行结果判读，得到的结果如图3所示，利用orfla-crRNAmix检测SARS-CoV-2核酸orfla基因灵敏度测试，可得应用Cpf1胶体金试纸条检测SRAS-CoV-2病毒核酸，可实现对4copy/μL病毒核酸的高灵敏度检出。

2.测定Cpf1胶体金试纸条法对SARS-CoV-2检测高特异性免疫，检测能否有效区分SRAS病毒和SARS-CoV-2病毒核酸，进行以下检测：取SARS-CoV-2病毒核酸检测区段pcRNA-orf1a、pcRNA-orf1b、pcRNA-N和pcRNA-E，参照实施例1的方法，制备SARS病毒对应基因序列RNA样品：ncRNA-orf1a、ncRNA-orf1b、ncRNA-N和 ncRNA-E；

通过RT-RPA反应，分别扩增制备SARS-CoV-2和SARS检测样品；

制备Cpf1检测体系：依次加入2μL Buffer、1μL Rnase Inhibitors、1μL Cpf1、1μLssDNA DB reporter、1μL crRNA和10μL检测样品。各组分混合均匀，在37℃反应25min。本检测体系中，Rnase Inhibitors 浓度为40U/μL，Cpf1浓度为200ng/μL，ssDNA DB reporter浓度为 25pM/μL，crRNA浓度为1nM/μL；

胶体金试纸条检测：使用全波长酶标仪用于测量Cpf1检测反应的荧光，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，取检测25min 时荧光数值为反应值；

同样在Cpf1检测体系反应25min后，同样可以在485nm激光灯下，用肉眼对检测产物荧光反应进行判读，检测结果如图4，其表明了本发明中Cpf1胶体金试纸条法可高特异性检测SARS-CoV-2病毒核酸，而对SARS病毒没有反应。

实施例2

模拟Cpf1检测体系下胶体金试纸条快速检测临床SARS-CoV-2病毒核酸

将上述检测特异性的SARS-CoV-2病毒核酸对应RNA样品(pcRNA-orf1a、pcRNA-orf1b和pcRNA-N)和SARS病毒核酸对应RNA样品(pcRNA-E ncRNA-orf1a、ncRNA-orf1b、ncRNA-N和ncRNA-E)，点涂到咽拭子，模拟临床样品进行检测；

1)病毒灭活和病毒核酸释放：将上述咽拭子加入50 μLPBS，模拟溶解病毒为液体，即为待检测样品，去3 μL待检测样品加入20 μL核酸裂解液，加入RNA酶抑制剂，常温静置3分钟，之后加入20 μL中和液，混匀后进行下一步检测；

2)Cpf1检测：取5μL待检测样品，依次加入2μL Buffer、1μL Rnase Inhibitors、1μL Cpf1、1μL ssDNA DB reporter、10μL RPA sample、1μL crRNA，混合均匀，在37℃反应25min；

3)胶体金试纸条检测：将胶体金试纸条***步骤2)得到的Cpf1检测产物，反应3min，肉眼判读结果，结果如图5所示，从左至右的样品分别，其表明本实施例的Cpf1胶体金试纸条法可有效对模拟临床阴阳性的样品进行判定。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心）

<120> 一种用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸的检测试剂盒及其检测方法

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aagctgtact tccagaaccc gcaattcatg ggtggctggg acaaggataa agagaccgac 1620

tatcgtgcga ccatcctgcg ttacggtagc aagtactatc tggcgattat ggataaaaag 1680

tacgcgaaat gcctgcagaa gatcgacaaa gacgatgtta acggtaacta cgaaaagatc 1740

aactacaagc tgctgccggg cccgaacaag atgctgccga aagtgttctt tagcaaaaag 1800

tggatggcgt actataaccc gagcgaggac atccaaaaga tctacaagaa cggtaccttc 1860

aaaaagggcg atatgtttaa cctgaacgac tgccacaagc tgatcgactt ctttaaagat 1920

agcattagcc gttatccgaa gtggagcaac gcgtacgatt tcaactttag cgagaccgaa 1980

aagtataaag acatcgcggg tttttaccgt gaggttgagg aacagggcta taaagtgagc 2040

ttcgaaagcg cgagcaagaa agaggtggat aaactggtgg aggaaggtaa actgtacatg 2100

ttccaaatct acaacaagga cttcagcgat aagagccacg gcaccccgaa cctgcacacc 2160

atgtacttca agctgctgtt tgacgaaaac aaccatggtc agatccgtct gagcggtggc 2220

gcggagctgt tcatgcgtcg tgcgagcctg aagaaagagg agctggttgt gcacccggcg 2280

aacagcccga ttgcgaacaa aaacccggat aacccgaaaa agaccaccac cctgagctac 2340

gacgtgtata aggataaacg ttttagcgaa gaccaatacg agctgcacat tccgatcgcg 2400

attaacaagt gcccgaaaaa catcttcaag attaacaccg aagttcgtgt gctgctgaaa 2460

cacgacgata acccgtatgt tatcggtatt gaccgtggcg agcgtaacct gctgtacatc 2520

gtggttgtgg acggtaaagg caacattgtg gaacagtata gcctgaacga gattatcaac 2580

aactttaacg gtatccgtat taagaccgat taccacagcc tgctggacaa aaaggagaag 2640

gaacgtttcg aggcgcgtca gaactggacc agcatcgaaa acattaagga gctgaaagcg 2700

ggctatatca gccaagttgt gcacaagatt tgcgaactgg ttgagaaata cgatgcggtg 2760

atcgcgctgg aggacctgaa cagcggtttt aagaacagcc gtgttaaggt ggaaaagcag 2820

gtttaccaaa agttcgagaa gatgctgatc gataagctga actacatggt ggacaaaaag 2880

agcaacccgt gcgcgaccgg tggcgcgctg aaaggttatc agattaccaa caagttcgaa 2940

agctttaaaa gcatgagcac ccaaaacggc ttcatctttt acattccggc gtggctgacc 3000

agcaaaatcg atccgagcac cggttttgtt aacctgctga agaccaaata taccagcatt 3060

gcggatagca aaaagttcat cagcagcttt gaccgtatta tgtacgtgcc ggaggaagac 3120

ctgttcgagt ttgcgctgga ctataagaac ttcagccgta ccgacgcgga ctacatcaaa 3180

aagtggaaac tgtacagcta tggtaaccgt atccgtattt tccgtaaccc gaaaaagaac 3240

aacgtttttg actgggagga agtgtgcctg accagcgcgt ataaggaact gttcaacaaa 3300

tacggtatca actatcagca aggcgatatt cgtgcgctgc tgtgcgagca gagcgacaag 3360

gcgttctaca gcagctttat ggcgctgatg agcctgatgc tgcaaatgcg taacagcatc 3420

accggtcgta ccgatgttga ttttctgatc agcccggtga aaaacagcga cggcattttc 3480

tacgatagcc gtaactatga agcgcaggag aacgcgattc tgccgaagaa cgcggacgcg 3540

aacggtgcgt ataacatcgc gcgtaaagtt ctgtgggcga ttggccagtt caaaaaggcg 3600

gaggacgaaa agctggataa ggtgaaaatc gcgattagca acaaagaatg gctggagtac 3660

gcgcaaacca gcgttaagca cgagaacctg tacttccaat cccaccacca ccaccaccac 3720

caccaccacc accaccacca ctga 3744

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

actggtactg gtcaggcaat aacagttaca ccg 33

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

ttgtgcatca gctgactgaa gcatgggttc gc 32

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

cacaccgttt ctatagatta gctaatgagt gtgc 34

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

tgcgtaaaac tcattcacaa agtctgtgtc aac 33

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

tgtactcatt cgtttcggaa gagacaggta cg 32

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

tagaccagaa gatcaggaac tctagaagaa ttcag 35

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

ctaacaatgc tgcaatcgtg ctacaacttc ctc 33

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

ttcttagtga cagtttggcc ttgttgttgt tgg 33

<210> 22

<211> 7

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

tttatta 7

Claims

1.一种用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括基于Cpf1的胶体金试纸条检测体系；

所述特异性crRNA包括针对orf1a基因的orf1a-cr1到orf1a-cr2，针对orf1b基因的orf1b-cr1到orf1b-cr2，针对N基因的N-cr1到N-cr2和针对E基因的E-cr1到E-cr2；

所述特异性crRNA的基因序列分别为SEQ NO.1到SEQ NO.8；

所述orf1a基因、orf1b基因、N基因和E基因的序列分别为SEQ NO.9到SEQ NO.12；

所述ssDNA报告***采用包括地高辛和生物素标记的ssDNA，标记产物为/5Dig/TTTATTA/3Bio/，命名为ssDNA DB reporter /5Dig/TTTATTA/3Bio/，用于胶体金试纸条检测。

2.由权利要求1所述的用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述特异性crRNA的制备方法包括如下步骤：针对SARS-CoV-2病毒基因片段orf1a、orf1b、N和E，找到包含Cpf1识别序列TTTN的靶向序列，设计23bp长度的crRNA，通过体外转录或者合成获得特异性crRNA。

3.由权利要求1所述的用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述Cpf1蛋白的制备方法包括如下步骤：针对Cpf1蛋白进行原核密码子优化获得序列SEQNO.13，构建到pET28a表达载体，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得目的蛋白。

4.一种用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸检测的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

a）制备新冠病毒SARS-CoV-2核酸样品；

b）等温扩增核酸：取步骤a）得到的核酸样品，利用SARS-CoV-2病毒核酸orf1a、orf1a、N和E基因片段的特异性引物，所述特异性引物的基因序列如SEQ NO.14~ SEQ NO.21所示，加入RT-RPA等温扩增体系，扩增获得特异性产物；

c）Cpf1检测反应：将步骤b）得到的特异性产物加入Cpf1检测体系，反应得到Cpf1检测产物；

d）将Cpf1检测产物进行权利要求1至3任一项所述试剂盒的胶体金试纸条检测。