CN115335536A - 用于即时核酸检测的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
提供了用于简单、无仪器且灵敏的方法的组合物和方法，该方法能够对目的核酸分子进行快速、即时检测。这基于一个令人惊讶的发现，即扩增及基于CRISPR的切割和检测的相对效率可以调整为利于扩增，直到生成足够的扩增产物实现检测。示例方法包括设计向导RNA和引物以靶向非最优PAM序列，或序列工程化Cas核酸酶以降低其在与该向导RNA形成核糖核蛋白或者结合或切割底物核酸方面的活性。
Description
背景技术
在过去的几十年里，曾发生过多起由病毒(如严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、寨卡病毒、埃博拉病毒)引发的大规模流行性疾病暴发，而当前有由SARS-CoV-2引发的大流行病暴发。到目前为止，世界正面临着控制SARS-CoV-2传播的巨大挑战，该SARS-CoV-2已导致数百万人死亡和城市间封锁。SARS-CoV-2在全球的传播速度很快，部分原因是症状前传播和无症状传播的高流行率。
核酸诊断检测的能力有限，难以减缓传播速度，因为基于定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)的检测是SARS-CoV-2诊断的金标准，需要熟练的人员、设备基础设施和较长的样品到结果(sample-to-answer)时间。一种对检测无症状携带者灵敏且周转时间足够快以在聚集前获得结果的即时(point-of-care)核酸检测对于学校和企业安全重新开放至关重要。与qPCR相比，等温扩增测定(如重组酶聚合酶扩增(RPA)和环介导的等温扩增(LAMP))提供了一种快速、不依赖仪器(instrument independent)且成本低廉的替代选择。然而，这些测定的非特异性扩增会导致高假阳性率。
CRISPR/Cas***(成簇规则间隔短回文重复序列和CRISPR相关蛋白)是一种RNA指导的内切核酸酶，已被用于强大的基因组编辑工具。由于Cas12a、Cas12b和Cas13a对ssDNA或ssRNA的附带降解，它们已被重新用作有前途的诊断工具。通过扩增靶序列并通过Cas12或Cas13进行顺序切割，可以在与qPCR相似的检测限检测寨卡病毒和HPV等病原体。
这些方法包括原始的两步高特异性的高灵敏度酶解报告因子法(SHERLOCK)和DNA内切核酸酶靶向的CRISPR反式报告因子(DETECTR)。最近，两步SHERLOCK和DETECTR均已通过临床验证能够以高灵敏度和可靠性检测SARS-CoV-2。然而，两步法操作复杂且耗时，并且频繁开盖会增加污染风险。STOP(SHERLOCK一锅检测)和SHINE(SHERLOCK和HUDSON整合以应对流行病)只需将简单提取的核酸滴入含有等温扩增和切割体积的反应混合物中，然后通过荧光读取器或条带读出。然而，这些测定通常需要大约一个小时的总反应时间。相比之下，雅培公司(Abbott)的ID NOW COVID-19检测(其对未提取的样品应用等温扩增)能够在不到15分钟的时间内报告结果，但它具有相当大的假阳性率和假阴性率。
发明内容
本发明的诸位发明人已开发了一种一步、快速、灵敏、可靠且灵活的核酸检测测定。该测定显示出与定量PCR(qPCR)相当的检测限，但时间显著缩短，例如时间从15到20分钟。因此，本申请提供了金标准qPCR的简单、无仪器(instrument-free)且灵敏的替代选择，并能够快速、即时筛选目的核酸分子。
本公开的一个实施方案提供了用于检测靶多核苷酸的方法，该方法包括在如下混合物中孵育该靶多核苷酸，该混合物包含(a)聚合酶、(b)脱氧核苷三磷酸(dNTP)、(c)用于扩增该靶多核苷酸的引物、(c)CRISPR相关(Cas)核酸酶、和(d)包含与该靶多核苷酸上的靶片段互补的间隔片段的向导RNA，该孵育在使得该聚合酶有效扩增该靶多核苷酸，同时该Cas核酸酶能够切割该经扩增的靶多核苷酸的条件下进行。
还提供了用于检测靶多核苷酸的试剂盒或包装，所述试剂盒或包装包含(a)聚合酶、(b)脱氧核苷三磷酸(dNTP)、(c)用于扩增该靶多核苷酸的引物、(c)CRISPR相关(Cas)核酸酶、和(d)包含与该靶多核苷酸上的靶片段互补的间隔片段的向导RNA，其中该聚合酶可有效扩增该靶多核苷酸，同时该Cas核酸酶能够切割该经扩增的靶多核苷酸。
还提供了用于检测靶多核苷酸的试剂盒或包装，所述试剂盒或包装包含(a)聚合酶、(b)脱氧核苷三磷酸(dNTP)、和(c)用于扩增所述靶多核苷酸的引物，其中至少一种引物包括Cas核酸酶的次优PAM序列，或者其中由所述聚合酶扩增出的DNA片段含有一个或多个被Cas核酸酶靶向的次优PAM，或者其中至少dNTP或引物经修饰以减少Cas核酸酶的切割或结合。
在另一个实施方案中，还进一步提供了用于切割靶多核苷酸的试剂盒或包装，所述试剂盒或包装包含(a)CRISPR相关(Cas)核酸酶、和(b)包含与所述靶多核苷酸上的靶片段互补的间隔片段的向导RNA，其中与标准向导RNA相比，所述向导RNA与所述靶多核苷酸的结合减少或对所述靶多核苷酸的切割减少。
在另一个实施方案中，还提供了突变的Cas核酸酶，其具有(a)在形成核糖核蛋白(RNP)方面的降低的活性、(b)改变的构象、(c)在与靶PAM序列相互作用方面的降低的活性、或(d)与待切割的靶多核苷酸的减少的结合。
附图说明
图1次优PAM比经典PAM介导更快的一锅反应。(a-d)Orf1ab基因间隔子4和间隔子5在37℃下在附带活性测试(a-b)和一锅反应(c-d)中的荧光信号。Orf1ab间隔子4(GTTG)和间隔子5(CTTA)的次优PAM分别突变为间隔子4(TTTG)和间隔子5(TTTA)的经典PAM。(e-h)间隔子4(g)和间隔子5(h)的附带活性测试(e和f)和相应一锅反应中的位置1-3点突变的次优PAM和三个经典PAM的荧光动力学的概要图。确定达到半最大荧光的时间。分别为于40分钟和20分钟确定附带活性和一锅反应的荧光值。(n＝3)。dsDNA底物的浓度在附带活性测试中为3.5nM，在一锅反应中为2340fM。
图2次优PAM介导的一锅反应的灵敏度和可靠性。比较了使用次优PAM和经典PAM的一锅反应的灵敏度和可靠性。使用了靶向SARS-CoV-2的Orf1ab基因(间隔子4和5)和包膜(E)基因(间隔子8)的crRNA。(a-c)使用次优PAM和经典PAM的间隔子4的灵敏度(a-b)和可靠性(c)。(d-f)使用次优PAM和经典PAM的间隔子5的灵敏度(d-e)和可靠性(f)。(g-i)使用次优PAM和经典PAM的间隔子8的灵敏度(g-h)和可靠性(i)。c、f和i的底物浓度分别为2340fM、2340fM和325.5fM。c、f和i中的荧光值在孵育后50分钟确定，并且数据来自十个实验，每个实验重复两次。对于a、b、d、e、g和h，每个实验重复三次，并且图中示出了一个具有代表性的结果。对于a-i，反应温度为37℃。
图3一锅反应中RPA和crRNA/Cas12a RNP切割的竞争。(a-b)一锅反应中RPA扩增子的积累。将RPA组分、浓度为33nM的crRNA/Cas12a RNP和2340fM dsDNA底物的组分在37℃下孵育0、2、4、6、8、10、12、14、16、18或20分钟，并在琼脂糖凝胶中分析所得的RPA扩增子。箭头表示扩增子产物。(c-d)一锅反应中扩增子的扩增和消耗。将每种浓度的1170fM次优和经典PAM底物以1:1的比率在37℃的一锅反应中混合，并通过深度测序确定0、1、3、5、7、10、15和20分钟时每种浓度的百分比。对于每个时间点，n＝5。(e-f)靶向具有次优(GTTG)或经典(TTTG)PAM的底物的crRNA 4和靶向具有次优(CTTA)或经典(TTTA)PAM的底物的crRNA 5的体外切割活性。将浓度为50nM crRNA/LbCas12a复合物与dsDNA底物(间隔子4为6nM，间隔子5为10nM)在37℃下一起孵育0、0.5、1、2、5、10、15或20分钟以确定顺式切割活性。S，底物；P，产物。(g-h)确定了RNP对次优和经典PAM dsDNA的结合亲和力。将0、12.5、25、50、100、200和400nM crRNA/失活的LbCas12a(dCas12a)复合物与5nM dsDNA在37℃下一起孵育20分钟，并进行EMSA以确定结合的和未结合的部分。每个实验重复三次，并且图中示出了一个代表。
图4四个靶标的120个PAM的顺式切割活性。(a)120个PAM的一锅反应与顺式切割的相关性。黑点代表经典PAM，红点代表性能更好的次优PAM，蓝点代表性能更差的次优PAM。一锅反应的单位(X轴)定义为达到半最大荧光的时间(min)*基于每个PAM的平台信号的经调节的比率。该比率是120个PAM中的最高平台荧光值除以每个PAM的平台荧光值。X轴30min范围外的三个次优PAM仍表现优于其相应的经典PAM。(b)一锅反应中扩增和切割的竞争性示意图工作流程。对于含有经典PAM的底物，在反应的初始阶段，切割占主导地位，从而导致dsDNA激活剂的过度消耗。相比之下，由于对次优PAM底物的扩增胜过切割，因此扩增子积累以刺激更快和更强的荧光信号产生。
图5通过次优PAM介导的一锅反应检测HCMV。(a-d)对靶向HCMV的UL55基因的次优PAM介导的一锅反应和qPCR测定的灵敏度进行比较。(a-b)PUC57-UL55质粒用作底物。(c-d)HCMV病毒为底物。a、c中qPCR的反应体积为20μL，而b、d中一锅反应的反应体积为30μL，两个反应中输入的拷贝数相同。(e)在便携式UV光下且使用横向流动条带的检测示意图。(f)对UV光刺激的直接荧光进行可视化以检测HCMV病毒。在37℃孵育后的8、10、15和20分钟，在UV光下检查反应。(g)孵育后二十分钟，将横向流动条带浸入反应管中持续5分钟，以可视化对照带和测试带。
图6使用次优PAM介导的一锅反应检测SARS-CoV-2。(a)SARS-CoV-2中经典PAM(TTTV)和次优PAM(VTTV、TTVV、TCTV)间隔子的基因组图。(b-e)FASTER(b，d)在42℃和STOPCovid.v1(c，e)在60℃对DNA和RNA的检测限。FASTER和STOPCovid.v1中输入的分子数相同。(f)从患者获得的204个SARS-CoV-2鼻咽拭子样品的FASTER结果(左：104个阳性样品，48个用实心圆标记的未提取的样品和56个用空心圆标记的预提取的样品；右：100个阴性样品)。在42℃下在20分钟时测量荧光读数。阈值确定为所有样品初始荧光值的平均值的三倍，S/N(信噪比)＝3。(g)在UV光下直接可视化检测未提取的SARS-CoV-2阳性样品。在42℃孵育后的10、15和20分钟，在UV光下检查反应。(h)204个样品的FASTER和RT-qPCR之间的便览表。
图7次优和经典PAM介导的一锅检测。一锅检测使用在SARS-CoV-2的Orf1ab(a)和E(b)基因中具有次优或经典PAM的间隔子。靶向Orf1ab基因的crRNA 1-3和靶向E基因的crRNA 2-7使用经典PAM，而靶向Orf1ab基因的crRNA 4-5和靶向E基因的crRNA 1使用次优PAM。(c)一锅反应中使用的PAM和间隔子。
图8各种次优和经典PAM的附带活性和一锅反应比较。(a-d)HPV18 L1基因间隔子1(c)和SARS-CoV-2S基因间隔子2(d)的附带活性测试(a和b)和相应一锅反应中的位置1-3点突变的次优PAM和三个经典PAM的荧光动力学的概要图。确定达到半最大荧光的时间。分别于40分钟和20分钟确定的附带活性和一锅反应的荧光值。将2.7nM和2.8nM dsDNA底物添加到HPV18 L1基因间隔子1和S基因间隔子2的附带活性测定中；将18.3fM和189fM dsDNA底物添加到HPV18 L1基因间隔子1和S基因间隔子2的一锅反应测定中，这些测定在37℃，n＝3下进行。Orf1ab间隔子5在附带活性中的荧光检测。CTTA PAM突变为TTTA、TTTG和TTTC，并且TTTV PAM中的T1-T3分别突变为A、G和C。确定基于TTTA(a-c)、TTTG(d-f)和TTTC PAM(g-i)的T1-T3突变的PAM以对附带活性进行比较。
图9使用各种PAM的Orf1ab间隔子4的附带活性和一锅反应。GTTG PAM突变为TTTA、TTTG和TTTC作为经典PAM，并且TTTV PAM中的T1-T3分别突变为A、G或C。(a-i)对T1-T3突变的次优PAM和相关的经典PAM的附带活性进行比较。(j-r)对T1-T3突变的次优PAM和相关的经典PAM的一锅反应进行比较。将3.5nM dsDNA添加到附带活性测定中，并且将2.3pM dsDNA添加到一锅反应测定中，这些测定在37℃，n＝3下进行。
图10使用各种PAM的Orf1ab间隔子5的附带活性和一锅反应。CTTAPAM突变为TTTA、TTTG和TTTC作为经典PAM，并且TTTV PAM中的T1-T3分别突变为A、G或C。(a-i)对T1-T3突变的次优PAM和相关的经典PAM的附带活性进行比较。(j-r)对T1-T3突变的次优PAM和相关的经典PAM的一锅反应进行比较。将3.5nM dsDNA添加到附带活性测定中，并且将2.3pM dsDNA添加到一锅反应测定中，这些测定在37℃，n＝3下进行。
图11使用各种PAM的HPV18 L1基因间隔子1的附带活性和一锅反应。TTAC PAM突变为TTTA、TTTG和TTTC作为经典PAM，并且TTTV PAM中的T1-T3分别突变为A、G或C。(a-i)对T1-T3突变的次优PAM和相关的经典PAM的附带活性进行比较。(j-r)对T1-T3突变的次优PAM和相关的经典PAM的一锅反应进行比较。将2.7nM dsDNA添加到附带活性测定中，并且将18.3fM dsDNA添加到一锅反应测定中，这些测定在37℃，n＝3下进行。Orf1ab间隔子5在一锅反应中的荧光检测。
图12使用各种PAM的S基因间隔子2的附带活性和一锅反应。TTCT PAM突变为TTTA、TTTG和TTTC作为经典PAM，并且TTTV PAM中的T1-T3分别突变为A、G或C。(a-i)对T1-T3突变的次优PAM和相关的经典PAM的附带活性进行比较。(j-r)对T1-T3突变的次优PAM和相关的经典PAM的一锅反应进行比较。将2.8nM dsDNA添加到附带活性测定中，并且将189fM dsDNA添加到一锅反应测定中，这些测定在37℃，n＝3下进行。
图13识别并与PAM双链体相互作用的Cas12a的示意图。与T2配对的A与Cas12a的保守Lys538和Lys595直接形成氢键(修改自Yamano T,Mol Cell[分子细胞],2017)。
图14两点和三点突变的PAM介导的附带活性和一锅反应。(a-d)靶向具有TTNT PAM的Orf1ab间隔子4和5的附带活性(a，c)和一锅反应(b，d)。(e-f)靶向具有VVTV、VTVV PAM的Orf1ab间隔子4的附带活性(e)和一锅反应(f)。(g-h)靶向具有VVTV、VTVV和TCCV PAM的Orf1ab间隔子5的附带活性(g)和一锅反应(h)。(i-j)靶向具有CCCV和AGCV PAM的Orf1ab间隔子5的附带活性(i)和一锅反应(j)。将3.5nM dsDNA添加到附带活性测定中，并且将2.3pMdsDNA添加到一锅反应测定中，这些测定在37℃，n＝3下进行。
图15次优和经典PAM介导的一锅反应的比较。对SARS-CoV-2的E基因间隔子8(a)和S基因间隔子3(b)进行检查。对于E基因间隔子8和S基因间隔子3，一锅反应中dsDNA的浓度分别为325.5fM和189fM。一锅反应在37℃下进行。
图16确定一锅检测中RNP的剂量效应。在37℃下，在使用次优PAM(a)和经典PAM(b)的一锅反应中测试了范围为从5.5、11、22、33、66至132nM的RNP剂量。将浓度为2.3pM dsDNA添加到一锅反应中。
图17一锅反应中积累的RPA扩增子的量。将RPA、crRNA/Cas12a RNP和dsDNA底物的组分在37℃下孵育0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20分钟，并在琼脂糖凝胶中分析RPA扩增子。单独的RPA代表在没有crRNA/Cas12a RNP情况下的一锅反应；TTTG、TTTC和TTCG、TTAC分别代表使用经典PAM和次优PAM的一锅反应。箭头表示RPA扩增子。
图18四个靶标的120个PAM的顺式切割活性。含有具有次优PAM(VTTV、TVTV、TTVV)和经典PAM(TTTV)的HPV18 L1基因间隔子1、Orf1ab间隔子4、Orf1ab间隔子5和S基因间隔子2的dsDNA底物的体外切割活性。RNP和dsDNA在37℃下孵育0、1、5、10或20分钟。用于HPV18L1基因间隔子1、Orf1ab间隔子4、Orf1ab间隔子5和S基因间隔子2的dsDNA底物分别为7.5nM、11nM、6nM和9nM。HPV18 L1基因间隔子1，S：591bp，P：382bp、209bp；Orf1ab间隔子4，S：539bp，P：388bp、151bp；Orf1ab间隔子5，S：461bp，P：220bp、241bp；S基因间隔子2，S：570bp，P：257bp、313bp。
图19基于安普未来公司(AMP future)和TwistDx公司的一锅反应的比较。(a)使用安普未来公司和TwistDx公司试剂盒的扩增比较。RPA扩增在42℃下进行20分钟。(b)基于安普未来公司和TwistDx公司的一锅反应的荧光比较。应用8403aM、840.3aM、84.03aM、8.403aM dsDNA。(c)基于TwistDx公司的一锅反应中的RNP剂量优化。应用333、200、100或33.3nM RNP。使用8403aM DNA底物。在b-c中使用次优PAM。(d-g)次优和经典PAM介导的一锅反应的比较。使用TwistDx公司试剂盒和100nM RNP对SARS-CoV-2的Orf1ab间隔子4、Orf1ab间隔子5、E基因间隔子8和HPV18的L1基因间隔子1的次优PAM和经典PAM进行比较。输入的dsDNA底物的浓度分别为Orf1ab间隔子4和间隔子5的2340fM，E基因间隔子8的325.5fM和HPV18 L1基因间隔子1的243.9fM。
图20在HCMV和SARS-CoV-2中计数的具有经典和次优PAM的间隔子的数量。(a)在HCMV中具有经典(TTTA、TTTG、TTTC)和次优PAM(VTTV、TTVV、TCTV)的间隔子。(b-c)在SARS-CoV-2(b)和HCMV(c)中经典和替代性次优PAM(A-次优PAM、TTNT、TRTV、YYYN(TTTV除外))。
图21逆转录反应的优化。(a)一锅反应在42℃、43℃和45℃下进行。(b)高效引物筛选逆转录酶。RT酶在48℃下反应30min后通过qPCR对RT产物进行定量。(c-d)使用提取的病毒样品，在不同浓度的RPA反向引物(RPA-R)和逆转录引物1(RT-1)的情况下FASTER的UV图像和荧光。NC代表在没有底物的情况下的反应。
图22RT-qPCR对SARS-CoV-2病毒样颗粒的检测限(LOD)。(a)使用CDC N2引物对的RT-qPCR的LOD。输入底物为104、103、102、101、100.5、100和10-0.5个拷贝/μL。(b)CDC RT-qPCR测定标准曲线。十倍稀释的输入底物生成标准曲线，每个稀释重复三次。(c)FASTER对SARS-CoV-2病毒样颗粒的检测限。
图23对患者样品进行的FASTER。(a-b)通过UV光成像检测到的阳性NP拭子。(a)未提取的样品和(b)提取的样品。在15-20min时捕获UV图像。(c)通过UV光和简单的蓝光设备成像的具有不同Ct值的未提取的NP拭子。(左：0min，右：20min)
图24对患者样品进行的STOPCovid，版本1(STOPCovid.v1)。(a-b)通过STOPCovid.v1检测到104个阳性患者样品和19个阴性患者样品。分别将48个未提取的样品用实心圆标记，56个提取的样品用空心圆标记。在45min时读取荧光值。(c)STOPCovid.v1和RT-qPCR的结果评估。
图25FASTER的特异性评估。(a)SARS-CoV-2N基因目的区与常见人类冠状病毒N基因(包括MERS、HKU1、229E、NL63和OC43)的比对；(b)RPA测定对扩增子的鉴定，其中1E5个拷贝/每个冠状病毒N基因dsDNA在37℃下持续15分钟的反应；箭头代表扩增子。(c)在37℃下使用不同序列的2.5nM dsDNA输入测试的附带活性的荧光动力学；(d)在42℃下使用1E5个拷贝/每个冠状病毒N基因RNA的反应测试的一锅反应的荧光动力学。
图26基于CRISPR的SARS-CoV-2检测方法的比较。用于评估灵敏度的底物如下：用于FASTER的SARS-CoV-2病毒样颗粒，用于DETECTR和无扩增检测的N基因RNA，用于SHERLOCK和SHINE的提取的基因组RNA，用于STOPCovid.v1的SARS-CoV-2基因组标准品，以及用于STOPCovid.v2的浓缩样品。
图27LbCas12a突变体比野生型蛋白介导更快的一锅反应。(a-g)LbCas12a蛋白的PAM相关残基595K和595K&542Y突变为丙氨酸。LbCas12a WT和突变体对Orf1ab基因(ab)、E基因(c-d)和N基因(e-g)的一锅反应。反应在42℃下进行，其中a-d使用20pg dsDNA底物，e-g使用各种剂量。
图28AapCas12b突变体比野生型蛋白介导更快的一锅反应。(a)AapCas12bWT和3M在100ng N基因dsDNA上的顺式切割。NC意指在没有蛋白质的情况下的反应。S是底物，并且P1和P2是切割的产物。(b)WT和3M的反式切割活性。(c)结合RPA和AapCas12b的一锅反应。反应在42℃下进行。(d-e)WT和3M在60℃下的StopCovid.v1反应。(f)StopCovid.v1反应在25min时的荧光值。3M突变体指的是AapCas12b的G478A/K396A/Q403A。
具体实施方式
核酸的一步检测
在本公开的一个实施方案中，提供了用于检测核酸的一步、快速、灵敏、可靠且灵活的方法。该方法显示出与定量PCR(qPCR)相当的检测限，但时间显著缩短，例如从15到20分钟。
据发现，当将用于等温扩增和CRISPR检测的试剂合并以实现一步检测时，CRISPR蛋白酶可以过早切割用作扩增模板的底物核酸。这会导致扩增不足或缓慢，从而导致漏检或检测效率低下。在本公开的一些实施方案中，提供了协调扩增和CRISPR检测过程的***和方法，使得可以有效进行扩增，从而允许快速有效地检测经扩增的产物。
因此，根据本公开的一个实施方案，提供了用于检测靶多核苷酸的方法，该方法包括在如下混合物中孵育所述靶多核苷酸，该混合物包含(a)聚合酶、(b)脱氧核苷三磷酸(dNTP)、(c)用于扩增该靶多核苷酸的引物、(c)CRISPR相关(Cas)核酸酶、和(d)包含与该靶多核苷酸上的靶片段互补的间隔片段的向导RNA。
在一些实施方案中，聚合酶、引物和dNTP能够等温扩增靶多核苷酸。等温扩增技术在本领域中是众所周知的。等温扩增方法以流线型、指数方式提供核酸靶序列的检测，并且不受热循环的限制。尽管这些方法可以有很大的不同，但它们都共享一些共同的特征。例如，由于DNA链没有热变性，所有等温方法都依赖于一种替代性方法来实现引物结合和扩增反应的启动：具有链置换活性的聚合酶。一旦反应启动，聚合酶还必须分离仍然与目的序列退火的链。
等温方法通常采用独特的DNA聚合酶来分离双链DNA。具有这种能力的DNA聚合酶包括用于中等温度反应(25℃-40℃)的Klenow外切-、Bsu大片段和EquiPhi29、phi29，以及用于更高温度(50℃-65℃)反应的Bst、Bsm DNA大片段聚合酶。为了检测RNA种类，添加与反应温度相容的逆转录酶(NASBA/TMA反应除外)以维持扩增的等温性质。
等温扩增的一个实例是环介导的等温扩增(LAMP)。LAMP使用识别靶DNA的6-8个不同区域的4-6种引物。链置换DNA聚合酶启动合成，并且2种引物形成环结构以促进随后的几轮扩增。LAMP快速、灵敏，并且扩增如此广泛，以至于反应期间产生的焦磷酸镁肉眼可见，从而使得LAMP非常适合现场诊断。
等温扩增的另一个实例是全基因组扩增(WGA)。WGA是一种多重置换扩增(MDA)方法，该方法利用DNA聚合酶(如EquiPhi29、phi29或Bst、Bsm DNA聚合酶)的链置换活性来实现整个基因组的稳健扩增。WGA已成为利用珍贵库存材料的有限样品或实现单细胞基因组DNA测序的非常宝贵的方法。反应产物非常长(>30kb)，并且通过多重置换机制高度分支。
等温扩增的另一个实例是链置换扩增(SDA)。SDA或类似的方法(切口酶扩增反应(NEAR))依赖于链置换DNA聚合酶，通常是Bst DNA聚合酶、大片段或克列诺片段(3’-5’外切-)，在引物中含有的位点处由链限制的限制性内切核酸酶或切口酶产生的切口处启动。每个聚合酶置换步骤都会再生切口位点，从而导致指数扩增。NEAR非常快速且灵敏，可以在几分钟内检测到少量靶标。
等温扩增的另一个实例是解旋酶依赖性扩增(HDA)。HDA利用解旋酶的双链DNA解旋活性来分离链，从而通过链置换DNA聚合酶实现引物退火和延伸。与PCR一样，该***只需要两种引物。
等温扩增的另一个实例是重组酶聚合酶扩增(RPA)。RPA使用重组酶来帮助引物侵入双链DNA。T4 UvsX、UvsY和单链结合蛋白T4 gp32形成D环重组结构，这些结构通过链置换DNA聚合酶启动扩增。RPA通常在约37℃-42℃下进行，并且与其他方法不同，它可以产生高达1kb的离散扩增子。
等温扩增的另一个实例是基于核酸序列的扩增(NASBA)。NASBA和转录介导的扩增(TMA)都是通过RNA进行的等温扩增方法。引物被设计成靶向目的区；其中一种引物必须在5’端包含T7 RNA聚合酶的启动子序列。还有其他等温扩增，包括滚环扩增(RCA)、不对称等温扩增(SMAP 2)、指数扩增反应(EXPAR)、信标辅助的检测扩增、单引物等温扩增(SPIA)、交叉引物扩增(CPA)。
在一些实施方案中，对一种或多种成分或条件进行调整，使得聚合酶可有效扩增靶多核苷酸，同时Cas核酸酶能够切割经扩增的靶多核苷酸。在一个实施方案中，靶多核苷酸在10分钟内实现至少102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014倍的扩增，而Cas核酸酶和向导RNA存在于混合物中。
这可以通过多种方式实现。在一个实例中，Cas核酸酶(或Cas蛋白)与向导RNA之间或Cas-向导RNA核糖核蛋白(RNP)与靶多核苷酸之间的结合减少。在另一个实例中，Cas蛋白的切割效率降低。
A.次优PAM
减少RNP和靶多核苷酸之间的结合的示例方法是设计向导RNA以靶向次优PAM。原型间隔子邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)是紧跟在CRISPR细菌适应性免疫***中Cas核酸酶靶向的序列的2-8碱基对DNA序列。PAM是重要的靶向组分。每个Cas核酸酶具有一个或多个经典PAM序列，以及一些非经典序列。非经典PAM不是最优的，并且可能导致结合和切割的效率更低。
在一个实施方案中，向导RNA被设计成使得其包括或邻近可由Cas核酸酶识别的原型间隔子邻近基序(PAM)序列，并且是次优或非经典的。
对于每个已知的Cas核酸酶，相应的经典和非经典PAM都是已知的。例如，对于LbCas12a，非经典PAM序列包括NTTV、TNTV、TTNV(TTTV除外)、TTNT、VTTT、TVTT、VVTT、VTVT、VNVV、NVNV、NVVV、VNTV、NTVV、TNVV和VVNV、YYYN，其中N表示任何核苷酸。对于AapCas12b，非经典PAM序列VTN、TTN(TTV除外)、TVN、NVN和VVN，其中N表示任何核苷酸。
B.经修饰的切割底物
对CRISPR***的靶多核苷酸的某些修饰可能会降低结合亲和力和/或切割效率，同时不会影响扩增。因此，通过将这些修饰掺入到底物中，可以抑制或延迟Cas切割，从而允许充分扩增。
这样的修饰可以通过经修饰的dNTP和/或经修饰的引物掺入到经扩增的靶多核苷酸中。
在一些实施方案中，dNTP经类似物或变体取代，如脱氧尿苷三磷酸、脱氧肌苷三磷酸、假尿苷三磷酸、甲基假尿苷三磷酸、2-氨基嘌呤、5-溴dU或核糖核苷三磷酸(rNTP)。在一些实施方案中，dNTP、rNTP或任一类似物或变体可以经修饰。修饰的非限制性实例包括用以下基团进行的那些，如磷酰基、生物素、地高辛、氨基、硫醇、硫代磷酸酯和甲基。
在一些实施方案中，一种或多种引物中的一个或多个核苷酸经类似物或变体取代，如脱氧尿苷三磷酸、脱氧肌苷三磷酸、假尿苷三磷酸、甲基假尿苷三磷酸、2-氨基嘌呤、5-溴dU或核糖核苷三磷酸(rNTP)。在一些实施方案中，核苷酸、rNTP或任一类似物或变体可以经修饰。修饰的非限制性实例包括用以下基团进行的那些，如磷酰基、生物素、地高辛、氨基、硫醇、硫代磷酸酯和甲基。
这样的经修饰的核苷酸的百分比可以根据需要进行调节。更高百分比的修饰可以更多地降低CRISPR结合/切割效率，反之亦然。在一些实施方案中，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％的dNTP或引物内的核苷酸经修饰。在一些实施方案中，不超过10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％或60％或70％的dNTP或引物内的核苷酸经修饰。
可以对反应的引物进行化学修饰以提高等温扩增，或者在一些实施方案中，引物具有crRNA间隔子的部分序列或具有部分或全部次优PAM序列，并且可以对引物进行化学修饰或不修饰。
C.经修饰的向导RNA
在另一个实例中，与标准向导RNA结构相比，向导RNA(或crRNA)经修饰以抑制RNP的形成或RNP与靶核苷酸之间的结合。经修饰的向导RNA/crRNA的实例提供如下。
在一些实施方案中，crRNA在与靶核酸互补区的3’端被截短。在一些实施方案中，截短的crRNA含有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19个或甚至更少个与靶多核苷酸互补的核苷酸。
在一些实施方案中，crRNA在发夹区的5’端被截短。在一些实施方案中，向导RNA包括截短的tracrRNA序列。在一些实施方案中，截短是1、2、3、4或5个核苷酸。
在一些实施方案中，crRNA的发夹结构被延伸，例如，在间隔子的3’端(例如，5’-AGACAUGGACCA-3’)。在一些实施方案中，茎区包括延伸的序列。在一些实施方案中，环区包括延伸的序列。延伸是至少1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个核苷酸。发夹序列的长度可以是1至100nt或甚至更长。
在一些实施方案中，crRNA或tracrRNA在5’端和(或)3’端延伸，例如，在间隔子的3’端(例如，5’-AGACAUGGACCA-3’)。延伸是至少1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个核苷酸。序列的长度可以是1至100nt或甚至更长，同时可以掺入任何预期的修饰。
在一些实施方案中，通过核糖的2’羟基基团与Cas蛋白相互作用的向导RNA的核苷酸被DNA替换。在一些实施方案中，可以修饰间隔子的5’端的核苷酸(1-12nt，更长或整个序列)，无论是连续的还是不连续的。
在一些实施方案中，向导RNA的指导区中的一个或多个核苷酸掺入一个或多个锁核酸(LNA)或桥接核酸(BNA)。在一些实施方案中，一个或多个核苷酸位于指导区内1-12nt或12-20nt的位置处。
对向导RNA中的核苷酸的其他示例修饰包括脱氧核苷酸、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、脱氧尿苷、脱氧肌苷、假尿苷、甲基假尿苷、或经修饰的核苷酸，这些修饰是用以下基团进行的，如磷酰基、生物素、地高辛、氨基、硫醇、硫代磷酸酯、甲基、2’-O-甲基-3’-膦酰基乙酸酯(MP)、2’O-甲氧基(MOE)、氟代(F)、S-约束乙基、2’-O-甲基-PS(MS)和2’-O-甲基-硫代PACE(MSP)。
在一些实施方案中，向导RNA在与靶多核苷酸的互补区(间隔子)中包含1、2、3、4或5或6个错配。错配可以是连续的或不连续的。
D.Cas核酸酶
在另一个实施方案中，使用经工程化的Cas核酸酶，其与向导RNA和/或靶多核苷酸的结合减少，或切割活性降低。
术语“Cas核酸酶”、“Cas蛋白”或“成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)蛋白”是指与化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)以及其他细菌中的CRISPR(成簇规则间隔短回文重复序列)适应性免疫***相关的RNA指导的DNA或RNA内切核酸酶。Cas蛋白的非限制性实例包括化脓性链球菌Cas9(SpCas9)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)Cas9(SaCas9)、氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.)Cas12a(AsCpf1)、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)Cas12a(LbCpf1)、弗朗西丝氏菌(Francisellanovicida)Cas12a(FnCpf1)。另外的实例提供于Komor等人,“CRISPR-Based Technologiesfor the Manipulation of Eukaryotic Genomes[用于操纵真核基因组的基于CRISPR的技术],”Cell[细胞].2017年1月12日；168(1-2):20-36中。
Cas核酸酶的非限制性实例包括Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e(CasX)、Cas12f、Cas12k、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Csm6、Csm3和Cas14a、Cas14b和Cas14c。更特定的实例包括AsCas12a、FnCas12a、MbCas12a、Lb3Cas12a、Lb2Cas12a、BpCas12a、PeCas12a、PbCas12a、SsCas12a、CMtCas12a、EeCas12a、LiCas12a、PcCas12a、PdCas12a、PmCas12a、ArCas12a、HkCas12a、ErCas12a、BsCas12a、LpCas12a、PrCas12a和PxCas12a(属于Cas12a类)，AapCas12b、AmCas12b、AacCas12b、BsCas12b、BvCas12b、BthCas12b、BhCas12b、AkCas12b、EbCas12b、LsCas12b(属于Cas12b类)，Mi1Cas12f2、Mi2Cas12f2、Un1Cas12f1、Un2Cas12f1、AuCas12f2、PtCas12f1、AsCas12f1、RuCas12f1、SpCas12f1、和CnCas12f1(属于Cas12f类(Cas14a))，ShCas12k(CAST)和AcCas12k(属于Cas12k类)，LwaCas13a、LbaCas13a、LshCas13a、PprCas13a、EreCas13a、LneCa3a、CamCas13a、RcaCas13a、HheCas13a、LbuCas13a、LseCas13a、LbmCas13a、LbnCas13a、RcsCas13a、RcrCas13a、RcdCas13a、CgCas13a、Cg2Cas13a、LweCas13a、LbfCas13a、Lba4Cas13a、Lba9Cas13a、LneCas13a、HheCas13a和RcaCas13a(属于Cas13a类)，BzCas13b、PbCas13b、PspCas13b、RanCas13b、PguCas13b、PsmCas13b、CcaCas13b、AspCas13b、PauCas13b、Pin2Cas13b和Pin3Cas13b(属于Cas13b类)，RspCas13d、RfxCas13d、EsCas13d和AdmCas13d(属于Cas13d类)，以及TtCsm6、EiCsm6和LsCsm6(属于Csm6类)。
下表中提供了减少与向导RNA和/或靶多核苷酸的结合或降低Cas核酸酶的切割活性的示例突变。
基于结构分析，表A中的残基与核糖核蛋白(RNP)的形成相关。
表A.影响RNP形成的残基
表B中的残基被认为对维持Cas核酸酶的构象很重要。
表B.对Cas构象重要的残基
表C中的残基被认为参与与PAM序列的相互作用。
表C.与PAM相互作用的残基
REC1(24-282)和REC2(283-521)结构域以及螺旋Ⅰ(14-391)和螺旋Ⅱ(660-822)结构域中的保守氨基酸被认为对Cas核酸酶的结构或活性很重要。另一个实例是HNH结构域中的残基。
此外，与靶DNA形成氢键的REC叶、Nuc叶或RuvC结构域上的残基也可以成为突变靶标。另外的合适的突变靶标是带正电荷的残基或带负电荷的残基。实例提供在下表D中。
表D.与靶DNA或RNA相互作用的残基
在一些实施方案中，可以缺失以上鉴定的氨基酸残基以被不同的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代是非保守取代。
取代是否为非保守取代可以用众所周知的知识来确定，例如用下表E中的矩阵。在表E中，负相似性分数表示两个氨基酸之间的非保守取代。
表E.氨基酸相似性矩阵
| C | G | P | S | A | T | D | E | N | Q | H | K | R | V | M | I | L | F | Y | W | |
| W | -8 | -7 | -6 | -2 | -6 | -5 | -7 | -7 | -4 | -5 | -3 | -3 | 2 | -6 | -4 | -5 | -2 | 0 | 0 | 17 |
| Y | 0 | -5 | -5 | -3 | -3 | -3 | -4 | -4 | -2 | -4 | 0 | -4 | -5 | -2 | -2 | -1 | -1 | 7 | 10 | |
| F | -4 | -5 | -5 | -3 | -4 | -3 | -6 | -5 | -4 | -5 | -2 | -5 | -4 | -1 | 0 | 1 | 2 | 9 | ||
| L | -6 | -4 | -3 | -3 | -2 | -2 | -4 | -3 | -3 | -2 | -2 | -3 | -3 | 2 | 4 | 2 | 6 | |||
| I | -2 | -3 | -2 | -1 | -1 | 0 | -2 | -2 | -2 | -2 | -2 | -2 | -2 | 4 | 2 | 5 | ||||
| M | -5 | -3 | -2 | -2 | -1 | -1 | -3 | -2 | 0 | -1 | -2 | 0 | 0 | 2 | 6 | |||||
| V | -2 | -1 | -1 | -1 | 0 | 0 | -2 | -2 | -2 | -2 | -2 | -2 | -2 | 4 | ||||||
| R | -4 | -3 | 0 | 0 | -2 | -1 | -1 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 6 | |||||||
| K | -5 | -2 | -1 | 0 | -1 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 | 5 | ||||||||
| H | -3 | -2 | 0 | -1 | -1 | -1 | 1 | 1 | 2 | 3 | 6 | |||||||||
| Q | -5 | -1 | 0 | -1 | 0 | -1 | 2 | 2 | 1 | 4 | ||||||||||
| N | -4 | 0 | -1 | 1 | 0 | 0 | 2 | 1 | 2 | |||||||||||
| E | -5 | 0 | -1 | 0 | 0 | 0 | 3 | 4 | ||||||||||||
| D | -5 | 1 | -1 | 0 | 0 | 0 | 4 | |||||||||||||
| T | -2 | 0 | 0 | 1 | 1 | 3 | ||||||||||||||
| A | -2 | 1 | 1 | 1 | 2 | |||||||||||||||
| S | 0 | 1 | 1 | 1 | ||||||||||||||||
| P | -3 | -1 | 6 | |||||||||||||||||
| G | -3 | 5 | ||||||||||||||||||
| C | 12 |
在一些实施方案中，用丙氨酸进行取代。
E.经调节的反应条件
在另一个实施方案中，对反应条件进行调节以有利于扩增而不是CRISPR切割。
在一个实例中，对混合物中Cas核酸酶/向导RNA的量进行调节以降低切割效率。在另一个实例中，增加或降低镁离子浓度以降低切割效率或增加扩增效率。
在另一个实例中，将一定量的二甲亚砜(DMSO)、牛血清白蛋白(BSA)、tween20、蛋白酶K抑制剂或核酸酶抑制剂添加到反应***中。在另一个实例中，将反应混合物的pH调节到例如5.0和10.0之间。在另一个实例中，调节反应温度。
在又一个实例中，将一种或多种添加剂(参见表F中的实例)添加到反应混合物中以减少RNP和靶多核苷酸之间的结合。
表F.示例添加剂
使用这些方法中的任何一种或组合，可以充分扩增靶多核苷酸，随后由Cas核酸酶进行向导RNA指导的切割。然后可以用本领域已知的多种不同技术检测切割的靶多核苷酸。
例如，可以使用立足点开关(toehold switch)传感器检测切割事件，该传感器可以在试纸上生成比色输出。立足点开关是模拟信使RNA的合成RNA，信使RNA的职责是将信息从DNA传递到蛋白质合成机器。它们含有特定“输入”RNA形式的特定刺激的识别序列(立足点)，以及蛋白质合成机器(核糖体)需要结合的识别序列，以启动融合的蛋白质编码序列翻译为其编码的蛋白质产物。在没有“输入”RNA的情况下，通过形成使用部分“输入”识别序列和核糖体识别序列(保持无法访问)的发夹结构，立足点开关保持在其关闭(OFF)状态。当刺激的“输入”RNA与立足点结合并诱导发夹结构打开时，立足点开关开启，使核糖体能够访问其识别序列以开始下游编码的蛋白质的合成，从而可以生成可检测的信号。
在另一个实例中，将淬灭的荧光团添加到底物中，一旦底物被切割，荧光团就会释放并因此发射荧光，从而实现靶标检测。
此处的方法可用于检测或定量不同类型的核酸，如单链RNA、双链RNA、单链DNA或双链DNA。核酸可以来自任何类型的样品，如疑似感染的临床样品，或需要突变或SNP(单核苷酸多态性)检测的样品，但不限于此。
用于进行这些方法的组合物和试剂盒
还提供了可用于进行本公开的方法的组合物和试剂盒。
在一个实施方案中，提供了用于检测靶多核苷酸的试剂盒、包装或组合物。在一些实施方案中，试剂盒、包装或组合物包括(a)聚合酶、(b)脱氧核苷三磷酸(dNTP)、(c)用于扩增该靶多核苷酸的引物、(c)CRISPR相关(Cas)核酸酶、和(d)包含与该靶多核苷酸上的靶片段互补的间隔片段的向导RNA。存在这些成分，使得聚合酶可有效扩增靶多核苷酸，同时Cas核酸酶能够切割经扩增的靶多核苷酸。在一些实施方案中，通过聚合酶扩增的靶片段包括由向导RNA和Cas核酸酶靶向的次优或非经典PAM序列。
在另一个实施方案中，试剂盒、包装或组合物包括(a)聚合酶、(b)脱氧核苷三磷酸(dNTP)、和(c)用于扩增该靶多核苷酸的引物，其中这些dNTP和/或引物经修饰/取代，使得这些经扩增的产物与CRISPR***(如本文描述的那些)的结合减少。在一些实施方案中，一种或多种引物包括Cas核酸酶的PAM序列。在一些实施方案中，PAM序列是次优或非经典PAM序列。
另一个实施方案提供了用于切割靶多核苷酸的试剂盒、包装或组合物，该试剂盒、包装或组合物包括(a)CRISPR相关(Cas)核酸酶、和(b)包含与该靶多核苷酸上的靶片段互补的间隔片段的向导RNA，其中与标准向导RNA相比，该向导RNA与该靶多核苷酸的结合减少或对该靶多核苷酸的切割减少。
在另一个实施方案中，还提供了突变的Cas核酸酶，其具有(a)在形成核糖核蛋白(RNP)方面的降低的活性、(b)改变的构象、(c)在与靶PAM序列相互作用方面的降低的活性、或(d)与待切割的靶多核苷酸的减少的结合。
在一些实施方案中，聚合酶是能够与dNTP和引物一起扩增靶多核苷酸的酶。在一些实施例中，扩增是等温扩增。示例聚合酶和相应的等温扩增***如上所述。
在一些实施例中，一个或多个dNTP经修饰。在一些实施方案中，修饰导致Cas核酸酶的结合或切割减少。本文还提供了这样的修饰的实例。这样的修饰的合适百分比也在本文中描述。
在一些实施方案中，一种或多种引物中的一个或多个核苷酸经修饰。在一些实施方案中，修饰导致Cas核酸酶的结合或切割减少。本文还提供了这样的修饰的实例。这样的修饰的合适百分比也在本文中描述。
在一些实施方案中，引物和/或向导RNA被设计成使得次优PAM序列包含在经扩增的序列中以供向导RNA/Cas核酸酶靶向。本文还描述了这样的次优PAM序列及其相应的Cas核酸酶的实例。
在一些实施方案中，向导RNA被设计成使得其与Cas核酸酶或靶多核苷酸的结合减少。这样的设计包括但不限于截短、延伸、修饰。本文还提供了实例。
在一些实施例中，提供了经序列工程化的Cas核酸酶，这些核酸酶与向导RNA或靶多核苷酸的结合减少，或对靶多核苷酸的切割减少。在本公开中还提供了这样的突变和示例突变的示例残基。
本公开的方法和组合物可用于快速有效地检测核酸，例如具有潜在病毒感染的临床样品、具有潜在SNP(单核苷酸多态性)的基因组DNA，但不限于此。正如所证明的那样，本申请提供了金标准PCR的简单、无仪器且灵敏的替代选择，并具有实现对目的核酸分子进行快速、即时筛选的巨大潜力。
具体实施方式
实施例1：使用Cas12a的次优PAM进行的具有灵敏度、可靠性和灵活性的加速一锅检测
该实施例展示了一种灵活、加速、基于次优PAM的检测，该检测是具有增强的灵敏度和重现性的(FASTER)检测方法。该实施例发现，在一步CRISPR检测中，但是Cas12a的等温扩增和切割同时发生在同一管中，靶向具有次优PAM而不是常规使用的经典PAM的底物的crRNA可以将反应速度加快2-3倍。此外，大量测试表明，由于对Cas12a等温扩增的干扰较小，因此FASTER检测具有更高的灵敏度和可靠性。次优PAM的流行率远远更高，使得检测试剂盒的开发更灵活，从而进行优化。FASTER检测允许在短短8分钟内检测到DNA病毒人类巨细胞病毒，并且在15分钟内检测到RNA病毒SARS-CoV-2，在这两种情况下检测限与qPCR相当。由于其周转时间快，灵敏度和可靠性高，FASTER检测在促进即时诊断方面具有巨大潜力。
材料与方法
质粒和dsDNA制备
合成SARS-CoV-2的包膜(E)和刺突(S)基因并将其克隆到pUC57载体(金斯瑞生物技术公司(GenScript Biotech)，南京，中国)中。使用灭活病毒通过RT-PCR获得SARS-CoV-2的N基因dsDNA，并合成其他人类冠状病毒的N基因dsDNA(金斯瑞生物技术公司，南京，中国)。通过PCR获得含有间隔子4和间隔子5靶向区的Orf1ab dsDNA底物。使用灭活HCMV病毒作为模板，通过PCR获得UL55 dsDNA，并将其克隆到pUC57载体中。SARS-CoV-2假病毒是包装有SARS-CoV-2N基因的慢病毒(碧云天生物技术公司(Beyotime Biotechnology)，上海，中国)。
HCMV的制备
从用HCMV感染后培养的细胞的上清液收集病毒样品。HCMV病毒样品在95℃下灭活，并在裂解缓冲液(QuickExtract DNA提取溶液，卢西根公司(Lucigen)，美国)中以1:1稀释。根据使用质粒DNA生成的标准曲线，通过qPCR对拷贝数进行定量。
LbCas12a蛋白质表达与纯化
将编码LbCas12a的DNA片段克隆到基于pET的表达载体中，该表达载体含有C-末端6×His-标签。当培养密度达到0.7的OD600时，将重组质粒转化的大肠杆菌菌株BL21(DE3)与0.5mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)一起孵育，并在21℃下使其再生长16小时。通过Ni-NTA树脂从细胞裂解物中纯化蛋白质，并用缓冲液(20mM Tris-HCl、500mM NaCl和500mM咪唑，pH 7.4)对其进行洗脱。然后，使用凝胶过滤柱(Superdex 200Increase 10/300GL)在含有20mM Tris-HCl(pH 7.5)、200mM NaCl的洗脱缓冲液中进一步过滤浓缩蛋白，并且最终的储存缓冲液由20mM Tris-HCl(pH 7.5)、200mM NaCl、5％甘油组成。
RPA和RT-RPA
根据制造商的说明书(潍坊安普未来生物技术公司(Weifang Amp-FutureBiotech)，山东，中国)，将一个冻干的RPA沉淀物重新悬浮在29.4μL缓冲液A、16.1μL无核酸酶水、1μL的20μM RPA正向引物和1μL的20μM RPA反向引物中以形成RPA混合物。图19中使用了TwistDx公司的RPA试剂盒(产品代码：TABAS03KIT)。将TwistDx公司的RPA混合物重新悬浮在29.5μL再水合缓冲液、15.6μL无核酸酶水、1.2μL的20μM RPA正向引物和1.2μL的20μMRPA反向引物中。引物序列呈现在表1中。对于RT-RPA反应，将0.9μL RNA酶H(50U/μL原液，纽英伦生物技术公司(New England Biolabs)，美国)和0.45μL SuperScript IV逆转录酶(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，美国)或EpiScript RNA酶H-逆转录酶(卢西根公司)添加到RPA混合物中(PMID：32848209；33219228)。反应在37℃或42℃下进行。在RT-RPA反应的最终版本中，添加1μL的5μM RPA反向引物和另外的RT引物(1μL 40μM)，并充分混合。
表1.RPA和RT-RPA引物
crRNA的制备
用于体外转录的DNA模板是通过两个寡核苷酸的重叠PCR合成的。一个寡核苷酸含有T7启动子序列，而另一个含有间隔子序列。将PCR产物与T7 RNA聚合酶在37℃下一起孵育2h以进行体外转录。将IVT反应用DNA酶I(普洛麦格公司(Promega))在37℃下处理15min，然后使用Monarch RNA纯化试剂盒(NEB公司)进行纯化。crRNA的序列呈现在图7c和表2中。
表2.crRNA序列
一锅测定
一锅测定在含有33或100nM LbCas12a RNP、400nM FQ ssDNA报告因子(FAM-TTATT-淬灭剂，宝日医生物技术公司(Takara Biotechnology))、dsDNA底物(表3)和RPA或RT-RPA组分的30μL反应体积中在板孔(科宁公司(Corning)，美国)中进行。将RNP复合物、FQssDNA报告因子(8μL)和RPA混合物(18μL)添加到每个一锅反应孔中，随后，提供2μL的缓冲液B和dsDNA激活剂，然后通过SpectraMax i3x在37℃或42℃下进行读数。还在UV光、蓝光下或通过横向流动检测(Milenia HybriDetect 1试剂盒，TwistDx公司，英国)来监测测定。用于UV检测的报告因子的最终浓度调节为0.4-2μM。横向流动检测的报告因子是FAM-TTATTATT-生物素，最终浓度为800nM。对于图1、图8-12和14，使用的dsDNA底物的浓度为18.3fM-2.3pM。
表3.PAM和靶序列
深度测序
将深度测序样品制备为一锅检测反应，不同之处在于底物由经典PAM和次优PAM底物以1:1的比率混合。通过在不同的时间点添加蛋白酶K(赛默飞世尔科技公司)终止反应，然后在95℃下加热5分钟来灭活蛋白酶。使用依诺米那公司(Illumina)的NovaSeq的适配器和条形码(表4)对产物进行扩增，并通过至少25的平均Phred质量(Q分数)过滤所得的读数。通过Python脚本分析原始读数，并根据0分钟时间点的读数对数据进行标准化。
表4.深度测序引物
Fn和Rn代表一对引物。
Cas12a体外切割和附带活性
对于体外切割，将LbCas12a RNP在室温下在1×NEBuffer 2.1中孵育20分钟，然后在37℃下与dsDNA一起孵育。通过在不同的时间点添加蛋白酶K终止反应，并在2％TAE凝胶上对产物进行可视化。使用的RNP的浓度为50或100nM，并且dsDNA底物的浓度为6-7.5nM或9-11nM。通过Image Lab软件(伯乐公司(Bio-rad))对底物和产物的百分比进行定量。将每个时间点的切割效率绘制为时间的函数，并将这些数据与单相指数衰减曲线拟合，以计算K切割值(Prism 8，图板软件公司(GraphPad Software,Inc.))(PMID：26545076)。附带活性测定在含有33nM LbCas12a RNP和400nM ssDNA报告因子(FAM-TTATT-BHQ1)的30μL体积中在1×NEBuffer 2.1中进行，并通过SpectraMax i3x记录荧光信号。使用的dsDNA底物激活剂的浓度为2.7-3.5nM。
EMSA
如上所述表达和纯化失活的LbCas12a(D832A)(简称dCas12a)。使用1×NEBuffer2.1，用dLbCas12a RNP和5’-FAM标记的50-nt dsDNA底物进行电泳迁移率变动测定。结合在37℃下进行15分钟，然后向反应中补充5％甘油。然后将样品在120V电压下在4％Tris-硼酸酯/EDTA聚丙烯酰胺凝胶上解析15-20分钟，并通过荧光图像分析仪对结果进行可视化。
qPCR和RT-qPCR测定
HCMV样品的qPCR测定在含有10μL的2×AceQ qPCR探针主混合物(诺唯赞公司(Vazyme)，南京，中国)、1μL的10μM各引物对(表5)和0.2μL的10μM TaqMan探针(金斯瑞公司(GenScript)，中国)的20μL反应体积中进行。qPCR和FASTER中的病毒拷贝输入和样品处理的数量相同。SARS-CoV-2样品的每个RT-qPCR反应含有10μL的2×One Step SYBR Green混合物、1μL的One Step SYBR Green酶混合物(诺唯赞公司，中国)、0.4μL的10μM引物对。RT-qPCR测定的输入体积为1.34μL样品/20μL反应。
表5.qPCR引物、探针序列及PCR引物和RT引物
SARS-CoV-2临床样品收集
本研究中使用的临床样品经武汉金银潭医院伦理委员会(Wuhan JinyintanHospital Ethics Committee)批准(KY-2021-01.01)。SARS-CoV-2阳性和阴性样品获得自武汉金银潭医院。未提取的样品在95℃下用等体积的裂解缓冲液裂解5-10分钟，该裂解缓冲液含有1U/μL RNasin Plus、250μM TCEP和0.02μg/μL Chelex-100(PMID：32577657；32958655)。根据制造商的方案(之江生物公司(liferiver)，上海)纯化提取的RNA样品。将它们与RT引物混合以进行FASTER检测。所有样品的UV图像均在Image Lab(伯乐公司)中在以下参数下进行处理：曝光时间：0.368-0.636，γ值：0.9-1.14。STOPCovid.v1测定完全按照方案进行(PMID：32937062)。
结果
在这里，我们描述了一种快速简单的基于CRISPR的诊断法，用于检测DNA和RNA病毒，包括SARS-CoV-2。首先，我们设计了许多靶向SARS-CoV-2的ORF1ab和E基因的crRNA，并进行了一锅检测，其中重组酶聚合酶扩增(RPA)和基于Cas12a的检测在一个反应中组合在一起。我们注意到，几个crRNA在一锅反应中表现出比其他更快的荧光信号动力学(图7a-b)。对表现出色的crRNA进行详细分析，我们发现那些crRNA都被设计为使用Cas12a的次优PAM(NTTV和TTNT)而不是经典PAM(TTTV)(图7c)。基于这些观察结果，我们假设使用次优PAM的crRNA加快了一锅检测中的检测速度，其中靶标的等温扩增和Cas12a介导的靶标切割同时发生。为了测试这一点，对靶向ORF1ab基因的间隔子4和5的底物进行了点突变，以将其次优PAM转化为经典PAM。正如预期的那样，使用次优PAM的crRNA产生比经典PAM更弱且更慢的附带活性(图1a-b)。然后我们使用这些底物作为RPA模板，并在一锅检测中同时进行RPA和基于Cas12a的检测。与附带活性测定相比，使用次优PAM的间隔子4和5在一锅反应中表现出比经典PAM更快的动力学(图1c-d)。
为了探索哪些类型的次优PAM在一锅反应中表现出更快的反应，将Orf1ab基因的间隔子4和5、SARS-CoV-2的刺突(S)基因的间隔子2和HPV18 L1基因的间隔子1的底物从TTTV点突变为VTTV、TVTV或TTVV。对四个间隔子的120个次优PAM的附带活性和一锅反应进行的比较表明，超过80％的具有次优PAM的间隔子在一锅反应中表现出比具有经典PAM的那些更快的反应，并且大多数表现出色的次优PAM是VTTV、TCTV和TTVV(图1e-h，图8-12)。Cas12a的蛋白质结构显示PAM相互作用结构域主要接触靶链的第二个核苷酸；因此，将PAM的第二个核苷酸从嘧啶突变为嘌呤可能会显著削弱Cas12a的活性(图13)。事实上，一些TATV和TGTV PAM，但不是TCTV PAM，在一锅反应中显示出更慢的动力学和减少的荧光信号；并且一致地，这些次优PAM都表现出比经典PAM低得多的附带活性(图9-12)。对于间隔子4和5，TTTT PAM在一锅反应中表现出比TTTV PAM更快的动力学，表明PAM的第四个核苷酸也可以经修饰以调整Cas12a的活性(图14a-d)。然后，我们将两个点突变引入PAM中。向间隔子4和间隔子5的一部分引入两个PAM点突变(TTTV到TTVT)，在一锅反应中产生更快的动力学(图14a-d)。然后，我们检查了其他带有两个点突变的次优PAM。间隔子4和5的VVTV和VTVVPAM在一锅反应和附带活性中显示出降低的动力学和信号(图14e-h)。有趣的是，TTTV到TCCV的突变在一锅反应中产生了更优的反应(图14h)。这可能是因为Cas12a的PAM可以耐受T到C的突变；TCCV已被表征为功能性次优PAM(PMID：28781234)。具有三个点突变的CCCV也被认为是次优PAM，并且事实上，CCCA在一锅反应中比经典PAM更快(图14i-j)。作为阴性对照，另一个具有PAM序列的三点突变的序列AGCA在一锅反应中显示出最小的活性。总之，它表明微妙的附带活性水平在一锅反应中至关重要。在这里，我们得出结论，大多数VTTV、TCTV和TTVV，以及一些TRTV、TTNT和YYYN(TTTV除外)PAM，在一锅反应中表现优于经典PAM。
为了进一步证明使用次优PAM序列可以加速一锅反应，我们合成了靶向SARS-CoV-2的E和S基因的crRNA。所有这些crRNA在一锅反应中在具有次优PAM的底物上的反应比在具有经典PAM的那些上的反应更快，表明使用次优PAM可能是加快基于Cas12a的一锅检测速度的普适性策略(图15)。
先前的研究表明，尽管一锅CRISPR诊断法操作简单，但其灵敏度低于两步法，即顺序进行靶标扩增和CRISPR检测。因此，我们研究了次优PAM的应用是否可以提高一锅检测的灵敏度。使用经典PAM的间隔子4的检测限在一锅反应中为234fM浓度的dsDNA；相比之下，使用次优PAM的其检测限为2.34fM浓度的dsDNA(图2a和b)。为了对使用次优和经典PAM的测试的稳定性进行比较，我们在相同条件下重复实验十次，每次进行两次生物学重复。使用底物(2340fM浓度的dsDNA)和足够用于次优和经典PAM两者的孵育时间，来自次优PAM组的荧光信号在所有重复中高度一致；相比之下，来自经典PAM组的信号在所有重复中变化超过10倍(图2c)。然后，我们将使用经典或次优PAM的另外两个crRNA的检测限和稳定性进行了比较。与使用经典PAM的crRNA相比，使用次优PAM的两个crRNA都表现出约10到100倍的灵敏度增加和非常一致的信号产生，证明一锅反应中次优PAM的灵敏度和稳定性有所提高(图2d-i)。
为了研究Cas12a/crRNA核糖核蛋白(RNP)在一锅反应中的剂量效应，我们分别用使用次优或经典PAM的测定测试了范围为从5.5nM至132nM的RNP剂量。使用次优PAM的反应显示出稳定的动力学曲线和一致的结果，其中RNP剂量范围为从22-132nM(图16a)，而使用经典PAM的反应表现出动力学曲线的剧烈波动和高度可变的信号，甚至是RNP剂量的微小变化(图16b)。这些数据进一步阐明，使用次优PAM是Cas12a介导的一锅检测中可重复结果的关键。
接下来，我们试图了解次优PAM介导的一锅检测的稳健性能背后的机制。在一锅反应中，CRISPR检测和等温扩增相互竞争，并且最终的检测信号依赖于靶标扩增以生成足够的用于CRISPR检测的底物。使用次优PAM的crRNA可能具有更慢的CRISPR检测初始动力学，并因此使反应偏向等温扩增。为了验证这种可能性，我们监测了一锅反应中的扩增子生成。对于间隔子4，在使用次优PAM的一锅反应后两分钟首次观察到靶扩增子，而在经典PAM组中，需要八到十分钟来鉴定扩增子(图3a)。此外，在每个时间点，通过使用次优PAM和单独PRA的一锅反应生成的扩增子的量远远大于通过使用经典PAM的一锅反应生成的扩增子的量(图3a)。一致地，与使用经典PAM的测试相比，在使用次优PAM的测试中，由间隔子5和两个另外的间隔子生成扩增子也表现出更快的动力学和更高的扩增子量，表明使用经典PAM时对RPA扩增的干扰更强(图3b，图17a-b)。为了进一步对在Cas12a监测下的等温扩增能力进行比较，使用由50％次优和50％经典PAM组成的混合底物进行一锅反应。扩增子测序分析揭示，在反应的第一分钟内，来自次优PAM底物的扩增子占扩增产物的约90％或更多，这支持了在竞争性Cas12a切割的压力下，使用次优PAM对于促进RPA扩增至关重要的观点(图3c-d)。
Cas12a介导的底物结合和随后的顺式切割可能会干扰RPA扩增。对于恒定量的DNA底物的顺式切割活性的时间过程表明，经典PAM底物的切割在30秒内完成，而完成次优PAM底物的切割需要10-20分钟(图3e-f)。Cas12a能够以降低的亲和力结合次优PAM底物35。我们推断，延迟切割是由于Cas12a与具有次优PAM的DNA底物的弱结合。一致地，Cas12结合亲和力的电泳迁移率变动测定(EMSA)分析显示与间隔子4和5的经典PAM相比，与次优PAM底物的结合减少(图3g-h)。
为了进一步阐明机制，我们评估了四个不同间隔子(HPV18 L1基因间隔子1、Orf1ab间隔子4、Orf1ab间隔子5和S基因间隔子2)的120个PAM(包括次优PAM和经典PAM)的顺式切割活性、附带活性和一锅反应(图9-12和18)。我们鉴定出，K切割和一锅反应的性能具有明显的相关性(图4a-b，表6)。我们将X轴上一锅反应因子的30min定义为判断PAM在一锅反应中是否表现良好的标准。这四个间隔子的所有十二个经典PAM和Orf1ab间隔子4的一个次优PAM具有1.2-3.5min-1的高K切割，它们在附带活性中表现良好，但在一锅反应中均表现不佳(图4a-b，表6)。具有最小顺式切割(K切割为0-0.1min-1)的次优PAM在附带活性和一锅反应两者中的性能最差。相比之下，具有0.1-1.2min-1的中间K切割的次优PAM在一锅反应中表现优于经典PAM(图4a-b，表6)。这些结果表明，顺式切割效率是决定一锅反应性能的关键因素。由于经典PAM介导的顺式切割引起的过度底物消耗，扩增子积累缓慢且不稳定，从而导致附带活性延迟或缺乏。尽管具有最小顺式切割的次优PAM允许扩增子(底物)的积累，但它们不能执行足够的附带活性。相比之下，具有中间K切割的次优PAM允许底物在等温反应的早期积累，同时维持相当大的附带活性。我们基于在一锅反应中达到半最大荧光的时间对表现最佳的次优PAM进行排序(表6)。在每个间隔子的前5个表现最佳的次优PAM(总共20个PAM)中，有12个VTTV和5个TCTV。因此，我们建议可以选择VTTV作为次优PAM的首选，而TCTV作为一锅反应中的良好候选者。
下面显示的表6是按一锅反应性能和顺式切割活性排序的PAM的总结。通过比较一锅反应中的性能对120个PAM进行排序，“一锅反应”代表达到半最大荧光的时间(min)*基于每个PAM的平台信号的经调节的比率，K切割代表顺式切割活性。
表6.一锅反应性能
总之，这些数据提出了一个模型，该模型说明次优PAM如何发挥作用以促进等温扩增，并因此在一锅反应中实现可靠且灵敏的检测(图4b)。鉴于CRISPR检测和等温扩增在一锅反应中相互竞争，Cas12a对次优PAM底物的结合亲和力下降，促进了平衡从切割向扩增的转变，并因此生成足够的用于检测的扩增子；相比之下，经典PAM的结合亲和力更强，允许切割胜过扩增并导致扩增子产生延迟或缺乏，这是所观察到的检测延迟和不稳定的原因。
我们已经证明，使用次优PAM对于一锅反应更优。这些结果是使用RPA试剂盒(安普未来公司)获得的。为了检验使用不同的RPA试剂盒该结论是否有效，我们使用来自TwistDx公司的RPA试剂盒进行了实验。这两种RPA试剂盒在扩增灵敏度方面没有显示出差异(图19a)。然而，当我们在一个反应中组合RPA和Cas12a时，TwistDx公司试剂盒显示出低得多的灵敏度和减少的荧光信号(图19b)。将少量Cas12a RNP(2μL)添加到RPA(18μL)中进行一锅反应。这表明Cas12a不与能良好兼容于TwistDx RPA的缓冲环境完全相容。最近的一项研究表明，LwaCas13a也不与TwistDx RPA缓冲环境完全相容。Arizti-Sanz等人优化了缓冲液，使其适用于RPA扩增和Cas13a活性两者，这是一种名为SHINE的方法。受这项研究的启发，我们将反应中的RNP剂量从33.3nM增加到100nM、200nM和333nM。我们发现RNP的3-6倍提高可以大幅改善一锅反应的荧光曲线(图19c)。使用这种改善的条件和TwistDx公司试剂盒，我们对四个间隔子的经典PAM和次优PAM的性能进行了比较。与安普未来公司试剂盒类似，使用TwistDx公司试剂盒的次优PAM比经典PAM表现好得多(图19d-g)。
因此，我们开发了灵活、加速、基于次优PAM的检测，该检测具有增强的灵敏度和重现性(FASTER)。为了确定FASTER是否能够检测DNA病毒，我们用双链DNA病毒人类巨细胞病毒(HCMV)测试了该方法。我们首先使用含有HCMV的UL55基因序列的质粒作为底物来比较FASTER与qPCR的灵敏度。两种测定均显示相同的检测限，即5.953×10-4amol质粒/反应(等于qPCR中的29.765aM浓度和FASTER中的19.843aM)(图5a-b)。引人注目的是，对于所有测试浓度，FASTER的荧光信号在大约6-10分钟时开始出现，并在大约9-15分钟时达到半最大值(图5b)。值得注意的是，这一速度比所有已公开的CRISPR介导的使用靶标扩增的一锅检测快至少2到3倍。然后我们使用FASTER来测量HCMV病毒样品。结果显示检测限为24个拷贝/反应，与qPCR的检测限相当(图5c-d)。为了更广泛地应用FASTER，我们使用简单的UV光代替荧光光谱法来测量信号。在10分钟的时间点，除最低病毒浓度外，所有的UV检测均显示出阳性信号，而在15分钟，病毒拷贝数最低(等于36的qPCR Ct值)的样品明显呈阳性(图5e-f)。我们还将FASTER与横向流动测定条带组合，并且这种组合能够检测Ct值为33-34的病毒样品(图5g)。这些结果与先前的研究一致，表明横向流动条带测定不如其相应的基于荧光信号的测定灵敏。横向流动读数需要打开管来添加缓冲液和条带，这是一个增加了手动操作和等待时间以及交叉污染风险的另外的步骤。由于由简单的UV光刺激的荧光读数更简单、更快且更灵敏，我们决定将其用于FASTER以检测SARS-CoV-2样品。
FASTER的一个优势是它极大地扩展了crRNA的可用选择，因为次优PAM比经典PAM更多。使用VTTV、TCTV和TTVV PAM的间隔子可能在一锅反应中表现良好，使得可用的次优PAM的数量在理论上比经典PAM的数量高7倍(21种组合对3种组合)(图6a，图20a)。此外，一些另外的次优PAM，如TRTV、TTNT和YYYN(TTTV除外)也可能比经典PAM发挥更好的作用，从而使间隔子的选择甚至更灵活(图20b-c)。PAM选择的宽松标准对于开发用于病毒检测的检测试剂盒特别重要。尽管SARS-CoV-2中有多于1000个Cas12a的经典PAM，但鉴于以下选择标准，只有有限数量的经典PAM可用于病毒检测测定：1)在保守区中；2)在高拷贝基因中；3)活性crRNA；4)与用于等温扩增的稳健引物相容。因此，对次优PAM的扩展选择使得FASTER在测定优化和应用于新病毒株方面更灵活。
最后，我们应用FASTER检测SARS-CoV-2。我们首先使用编码SARS-CoV-2的N基因的DNA片段对基于RPA/Cas12a/次优PAM的FASTER和基于LAMP/Cas12b的STOPCovid的灵敏度进行了比较。FASTER的灵敏度比STOPCovid高约100倍，并且FASTER在检测DNA样品方面的速度比STOPCovid快3倍(13分钟对40分钟，达到半最大荧光的时间)(图6b-e)。然后我们检查了FASTER通过组合RT-RPA和Cas12a来检测RNA样品的能力。我们的初始数据显示，FASTER在检测RNA样品方面不如RT-qPCR灵敏。我们推测RT步骤是限速步骤，尽管RNA酶H已添加到反应中。为了提高RT步骤的效率，我们首先将反应温度从37℃提高到42℃，因为RT酶通常在更高的温度下表现更好，并且RPA和Cas12a均在42℃下被激活。事实上，FASTER在42℃下表现良好(图21a)。与RT-qPCR类似，RT-RPA通常使用其反向引物作为RT引物。我们假设超过30nt的RPA反向引物可能对RT步骤无效。事实上，RPA反向引物的RT效率比qPCR反向引物低6倍(图21b)。因此，我们增加了一个另外的18nt引物作为RT引物，同时降低RPA反向引物的浓度以防止其干扰RT过程。将在42℃的反应、添加另外的短RT引物以及降低RPA反向引物的浓度组合，显著提高了RT效率和整体FASTER性能，以检测RNA样品(图21a-d)。使用SARS-CoV-2N基因的体外转录的RNA片段来对FASTER和STOPCovid检测RNA的能力进行比较。FASTER在RNA检测方面的灵敏度比STOPCovid高约100倍，并且比其快约2.5倍(图6b-e)。
我们直接(head-to-head)比较了FASTER和RT-qPCR的检测限(LOD)，后者被美国疾病控制和预防中心(CDC)称为当前的黄金标准。我们首先使用市售的SARS-CoV-2假病毒作为标准品确定了RT-qPCR的LOD。RT-qPCR的LOD为1cp/μL(图22a-b)，与CDC发布的结果一致。然后我们比较了FASTER和RT-qPCR的LOD，并鉴定出FASTER的LOD为1cp/μL(图22c)，与RT-qPCR的LOD相当。
我们评估了FASTER在SARS-CoV-2阳性和阴性临床样品中的性能，并将其性能与STOPCovid进行了比较。使用了总计104个SARS-CoV-2阳性鼻咽拭子样品(48个未提取的样品和56个提取的样品)和100个SARS-CoV-2阴性样品，这些阳性鼻咽拭子样品的Ct值范围广泛(从18.1到35.8)。FASTER的灵敏度为94.2％，特异性为100.0％，并且它能够检测Ct值为35.8的样品(根据图22b中RT-qPCR的标准曲线为1.2cp/μL)(图6f-h)。阳性信号早在10分钟就出现了，并且所有阳性样品在15分钟就显示出信号(图6h，图23a)。该信号可以通过UV光或简单的蓝光设备检测(图23b)。相比之下，STOPCovid.v1无法稳定检测Ct值高于31.0的样品，导致灵敏度为78.8％(图24a-c)。最后，为了评估FASTER的特异性，我们通过RPA扩增、附带活性测试和一锅反应测试了几种常见的人类冠状病毒，包括MERS、HKU1、229E、NL63和OC43。这些结果表明与其他常见病毒没有交叉反应(图25a-d)。
使用次优PAM进行一锅检测可以应用于Cas12a家族的其他成员和其他II类V型效应子。探索其他Cas蛋白是否可以在一锅反应中使用次优PAM表现出比Cas12a更优的速度将是有趣的。因此，我们还提供了一种使用Cas蛋白突变体的快速且灵敏的检测方法。我们将LbCas12a蛋白上与PAM形成氢键的氨基酸突变为丙氨酸，然后使用突变的蛋白靶向经典PAM以建立快速的一步检测。正如我们所预期的，K595A和K595A&Y542A这两个突变体在一步反应中比野生型蛋白更快地达到平台期，尤其是K595A可以在20分钟内达到峰值(图27a-d)。此外，突变体的灵敏度也比野生型提高了100倍。K595A突变体的检测限为16.457aM N基因dsDNA，而野生型只能鉴定1645.7aM dsDNA(图27e-g)。
Cas12a和RPA的一步法是在37℃-42℃下反应。包括逆转录步骤用于检测RNA病毒样品，并且较高的温度可能有利于该步骤。Cas12b等耐高温方法可以与LAMP等高温等温扩增方法进行组合。我们将残基478G、396K和403Q相关的PAM突变为Cas12b的丙氨酸，在这里将突变体缩写为3M(共3个点突变)。顺式切割和反式切割的结果表明3M的活性确实弱于WT的活性(图28a-b)。在RPA介导的一步法中，3M的反应速度显著快于WT(图28c)。接下来，我们在LAMP介导的一锅反应中对其进行了测试，结果与RPA介导的一锅反应一致。不仅反应速度加快，灵敏度也提高了10倍(图28d-e)。简而言之，使用Cas12b 3M蛋白，可以在25分钟内清楚地检测到164.57aM样品(图28f)。
总之，我们研究中开发的FASTER检测显示出比STOP更短的孵育时间，并且在没有预扩增的情况下比基于Cas13a的检测更灵敏。FASTER检测是第一个结合以下特征的CRISPR介导的检测：速度快、灵敏度高、可靠性高、且灵活性强。
***
本公开的范围不受所述特定实施方案的限制，这些实施方案仅旨在用于说明本公开的各个方面，并且任何在功能上相同的组合物或方法均在本公开的范围内。对于本领域技术人员应当清楚的是，在不脱离本公开的精神或范围的情况下可以在本公开的方法和组合物方面做出各种修改和变化。因此，预期的是本公开覆盖了本公开的修改和变化，其条件是它们在所附权利要求书及其等效物范围之内。
本说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，引用的程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉大学
<120> 用于即时核酸检测的组合物和方法
<130> P22114044CP
<150> PCT/CN2021/070963
<151> 2021-01-08
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<223> 合成的
<400> 18
ttcaaggctc cctcagttgc aacccatatg at 32
<210> 19
<211> 41
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 19
uaauuucuac uaaguguaga uccacauaga ucauccaaau c 41
<210> 20
<211> 41
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 20
uaauuucuac uaaguguaga uacacaauua gugauugguu g 41
<210> 21
<211> 41
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 21
uaauuucuac uaaguguaga ugacagcugg ugcugcagcu u 41
<210> 22
<211> 41
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 22
uaauuucuac uaaguguaga uucagguugg acagcuggug c 41
<210> 23
<211> 41
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 23
uaauuucuac uaaguguaga uuguggguua ucuucaaccu a 41
<210> 24
<211> 41
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 24
uaauuucuac uaaguguaga uauugugugc guacugcugc a 41
<210> 25
<211> 41
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 25
uaauuucuac uaaguguaga ucaacaguua auaaucuaga g 41
<210> 26
<211> 41
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 26
uaauuucuac uaaguguaga uugugaugaa ucucccacau a 41
<210> 27
<211> 41
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 27
uaauuucuac uaaguguaga uucaucugga cugcuauugg u 41
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 28
gttgccacat agatcatcca aatc 24
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 29
caacggtgta tctagtaggt ttag 24
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 30
cttaacacaa ttagtgattg gttg 24
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 31
gaattgtgtt aatcactaac caac 24
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 32
gttggacagc tggtgctgca gctt 24
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 33
caacctgtcg accacgacgt cgaa 24
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 34
ttcttcaggt tggacagctg gtgc 24
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 35
aagaagtcca acctgtcgac cacg 24
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 36
attatgtggg ttatcttcaa ccta 24
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 37
taatacaccc aatagaagtt ggat 24
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 38
ttcgattgtg tgcgtactgc tgca 24
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 39
aagctaacac acgcatgacg acgt 24
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 40
ttaccaacag ttaataatct agag 24
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 41
aatggttgtc aattattaga tctc 24
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 42
ttgatgtgat gaatctccca cata 24
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 43
aactacacta cttagagggt gtat 24
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 44
ttggtcatct ggactgctat tggt 24
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 45
aaccagtaga cctgacgata acca 24
<210> 46
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 46
ggagtgagta cggtgtgcaa tttctaaagc ttacaaagat tat 43
<210> 47
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 47
ggagtgagta cggtgtgcct attctaaagc ttacaaagat tat 43
<210> 48
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 48
ggagtgagta cggtgtgccg attctaaagc ttacaaagat tat 43
<210> 49
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 49
ggagtgagta cggtgtgcag gcgctaaagc ttacaaagat tat 43
<210> 50
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 50
ggagtgagta cggtgtgctc ctcctaaagc ttacaaagat tat 43
<210> 51
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 51
ggagtgagta cggtgtgcac taactaaagc ttacaaagat tat 43
<210> 52
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 52
ggagtgagta cggtgtgcgt ggcctaaagc ttacaaagat tat 43
<210> 53
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 53
ggagtgagta cggtgtgcat aaactaaagc ttacaaagat tat 43
<210> 54
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 54
ggagtgagta cggtgtgcca cgcctaaagc ttacaaagat tat 43
<210> 55
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 55
ggagtgagta cggtgtgcgt agcctaaagc ttacaaagat tat 43
<210> 56
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 56
ggagtgagta cggtgtgcga agtctaaagc ttacaaagat tat 43
<210> 57
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 57
ggagtgagta cggtgtgcct gtgctaaagc ttacaaagat tat 43
<210> 58
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 58
ggagtgagta cggtgtgcac ccactaaagc ttacaaagat tat 43
<210> 59
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 59
ggagtgagta cggtgtgcgg gtgctaaagc ttacaaagat tat 43
<210> 60
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 60
ggagtgagta cggtgtgcga gatctaaagc ttacaaagat tat 43
<210> 61
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 61
ggagtgagta cggtgtgcgc gcgctaaagc ttacaaagat tat 43
<210> 62
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 62
gagttggatg ctggatggac aagtttgtac atacttacct ttt 43
<210> 63
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 63
gagttggatg ctggatggtg gcttttgtac atacttacct ttt 43
<210> 64
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 64
gagttggatg ctggatggtg ccctttgtac atacttacct ttt 43
<210> 65
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 65
gagttggatg ctggatggat ttctttgtac atacttacct ttt 43
<210> 66
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 66
gagttggatg ctggatggcc ctgtttgtac atacttacct ttt 43
<210> 67
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 67
gagttggatg ctggatggtc atttttgtac atacttacct ttt 43
<210> 68
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 68
gagttggatg ctggatgggc gtatttgtac atacttacct ttt 43
<210> 69
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 69
gagttggatg ctggatggcc gcatttgtac atacttacct ttt 43
<210> 70
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 70
gagttggatg ctggatggac acgtttgtac atacttacct ttt 43
<210> 71
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 71
gagttggatg ctggatggct tcgtttgtac atacttacct ttt 43
<210> 72
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 72
gagttggatg ctggatggga gcgtttgtac atacttacct ttt 43
<210> 73
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 73
gagttggatg ctggatgggt acgtttgtac atacttacct ttt 43
<210> 74
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 74
gagttggatg ctggatgggt ttatttgtac atacttacct ttt 43
<210> 75
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 75
gagttggatg ctggatggcg ctctttgtac atacttacct ttt 43
<210> 76
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 76
gagttggatg ctggatggtt gaatttgtac atacttacct ttt 43
<210> 77
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 77
gagttggatg ctggatggga tcgtttgtac atacttacct ttt 43
<210> 78
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 78
ctaccctcaa gtacggagat gtg 23
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 79
gtcttcattg ataggcttca tcg 23
<210> 80
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 80
atcttattcg ctttgaacgt aatatcat 28
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 81
ttacaaacat tggccgcaaa 20
<210> 82
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 82
gcgcgacatt ccgaagaa 18
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 83
tggaaccacc ttgtaggttt g 21
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 84
tatgcaccac cgggtaaagt 20
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 85
tggaaccacc ttgtaggttt g 21
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 86
acccacaggg tcattagcac 20
<210> 87
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 87
tggaaccacc ttgtaggttt g 21
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 88
acccacaggg tcattagcac 20
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 89
acacattatt atttgtggcc att 23
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 90
gtgcctttag cccagtgttc 20
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 91
tggaaccacc ttgtaggttt g 21
<210> 92
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 92
ttcgcggagt tgatcacaac ta 22
<210> 93
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 93
ttggatggaa agtgagttca ga 22
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 94
acttcaccaa aagggcacaa 20
<210> 95
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 95
atgtgatctt ttggtgta 18
<210> 96
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 96
atcttttggt gtattcaa 18
<210> 97
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 97
ttgcagcatt gttagca 17
<210> 98
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 98
ggatttggat gatctatgtg gca 23
<210> 99
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 99
gtggtgcatc gtgttgtct 19
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 100
gatgatctat gtggcaacgg 20
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 101
ccacatagat catccaaatc 20
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 102
acacaattag tgattggttg 20
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 103
taacgtgagt cttgtaaaac 20
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 104
ttgctttcgt ggtattcttg 20
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 105
gtggtattct tgctagttac 20
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 106
caagactcac gttaacaata 20
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 107
cgtttactct cgtgttaaaa 20
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 108
ctctcgtgtt aaaaatctga 20
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 109
acacgagagt aaacgtaaaa 20
Claims (48)
1.一种用于检测靶多核苷酸的方法，所述方法包括在如下混合物中孵育所述靶多核苷酸，所述混合物包含(a)聚合酶、(b)脱氧核苷三磷酸(dNTP)、(c)用于扩增所述靶多核苷酸的引物、(c)CRISPR相关(Cas)核酸酶、和(d)包含与所述靶多核苷酸上的靶片段互补的间隔片段的向导RNA，所述孵育在使得所述聚合酶有效扩增所述靶多核苷酸，同时所述Cas核酸酶能够切割经扩增的靶多核苷酸的条件下进行。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述向导RNA的靶片段包括或邻近可由所述Cas核酸酶识别的原型间隔子邻近基序(PAM)序列，所述PAM序列为次优的。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述PAM序列不是经典的。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述Cas核酸酶为LbCas12a，并且所述PAM序列选自由以下组成的组：NTTV、TNTV、TTNV、TTNT、VTTT、TVTT、VVTT、VTVT、VNVV、NVNV、NVVV、VNTV、NTVV、TNVV、YYYN和VVNV，其中N表示任何核苷酸。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述Cas核酸酶为AapCas12b，并且所述PAM序列选自由以下组成的组：VTN、TTN、TVN、NVN和VVN，其中N表示任何核苷酸。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中至少一个dNTP经修饰。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述修饰为用选自由以下组成的组进行的：磷酰基、生物素、地高辛、氨基、硫醇、硫代磷酸酯和甲基。
8.如权利要求6所述的方法，其中至少一个dNTP被替换为如下或所述引物中的至少一个核苷酸如下：脱氧尿苷三磷酸、脱氧肌苷三磷酸、假尿苷三磷酸、甲基假尿苷三磷酸、2-氨基嘌呤、5-溴dU或核糖核苷三磷酸(rNTP)。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述rNTP经修饰。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中所述修饰为用选自由以下基团组成的组进行的：磷酰基、生物素、地高辛、氨基、硫醇、硫代磷酸酯和甲基。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包含包括所述间隔片段的截短的或5’/3’DNA-/RNA-延伸的CRISPR RNA(crRNA)。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述间隔片段为19个核苷酸或更短，优选18、17、16、15、14、13、12、11、10个核苷酸或更短。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述截短的或延伸的crRNA包括截短的或延伸的发夹结构序列。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括截短的反式激活crispr RNA(tracrRNA)序列。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括与所述间隔片段或所述发夹的至少一部分互补的区域。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述间隔片段中的至少一个核苷酸不是标准核糖核苷酸，其优选位于所述间隔片段中的核苷酸1-25处。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述间隔片段中的至少一个核苷酸选自由以下组成的组：脱氧核苷酸、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、脱氧尿苷、脱氧肌苷、假尿苷、甲基假尿苷和经修饰的核苷酸，其中所述修饰为用选自由以下组成的组的基团进行的：磷酰基、生物素、地高辛、氨基、硫醇、硫代磷酸酯、甲基、2’-O-甲基-3’-膦酰基乙酸酯(MP)、2’O-甲氧基乙基(MOE)、氟代(F)、S-约束乙基、2’-O-甲基-PS(MS)和2’-O-甲基-硫代PACE(MSP)。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述间隔片段包括与所述靶片段的1、2、3、4、5或6个内部错配。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶选自由以下组成的组：Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e(CasX)、Cas12f、Cas12k、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Csm6、Csm3、Cas14a、Cas14b和Cas14c。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述Cas核酸酶选自由以下组成的组：AsCas12a、FnCas12a、MbCas12a、Lb3Cas12a、Lb2Cas12a、BpCas12a、PeCas12a、PbCas12a、SsCas12a、CMtCas12a、EeCas12a、LiCas12a、PcCas12a、PdCas12a、PmCas12a、ArCas12a、HkCas12a、ErCas12a、BsCas12a、LpCas12a、PrCas12a、PxCas12a、AapCas12b、、AmCas12b、AacCas12b、BsCas12b、BvCas12b、BthCas12b、BhCas12b、AkCas12b、EbCas12b、LsCas12b、Mi1Cas12f2、Mi2Cas12f2、Un1Cas12f1、Un2Cas12f1、AuCas12f2、PtCas12f1、AsCas12f1、RuCas12f1、SpCas12f1、Cas12f的CnCas12f1(Cas14a)；
ShCas12k(CAST)、AcCas12k、LwaCas13a、LbaCas13a、LshCas13a、PprCas13a、EreCas13a、LneCa3a、CamCas13a、RcaCas13a、HheCas13a、LbuCas13a、LseCas13a、LbmCas13a、LbnCas13a、RcsCas13a、RcrCas13a、RcdCas13a、CgCas13a、Cg2Cas13a、LweCas13a、LbfCas13a、Lba4Cas13a、Lba9Cas13a、LneCas13a、HheCas13a、Cas13a的RcaCas13a；
BzCas13b、PbCas13b、PspCas13b、RanCas13b、PguCas13b、PsmCas13b、CcaCas13b、AspCas13b、PauCas13b、Pin2Cas13b、Pin3Cas13b、RspCas13d、RfxCas13d、EsCas13d、AdmCas13d、TtCsm6、EiCsm6和LsCsm6。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶经序列工程化。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述序列工程化改变所述Cas核酸酶在形成核糖核蛋白(RNP)或结合底物核酸方面的活性。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述经序列工程化的Cas核酸酶为LbCas12a，其在选自由以下组成的组的残基处具有一个或多个氨基酸缺失或取代：Lys15、Thr16、Arg18、Lys20、Lys51、Asn157、Arg158、Arg174、Lys253、Gln264、Lys278、Leu281、Arg386、Lys390、Lys464、Arg508、Lys520、Lys707、Ser710、Thr713、His714、Gly715、Thr716、Asn718、His720、Arg747、Ala766、Asn767、Lys768、Asn769、Asn772、Lys774、Thr777、Tyr781、Asp786、Arg788、Gln793、Asn808、Tyr872、Glu898、Lys953和Lys960。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述经序列工程化的Cas核酸酶为AsCas12a，其在选自由以下组成的组的残基处具有一个或多个氨基酸缺失或取代：Lys414、Gln286、Lys273、Lys369、Gly270、His479、Asn515、His479、Arg518、Gln956、Trp382、Arg192、Lys307、Leu310、Arg176、Lys51、Asn175、Tyr47、Glu786、His872、Lys530、His761、Thr16、Lys15、Lys1022、His977、Lys1029、Lys757、His856、Leu807、Met806、Asn808、Lys852、Ile858、Lys810、Lys809、Arg863、Lys943、Tyr940、Asp966、Arg790、Lys748、Arg18、Lys752、Ser973、Leu760、Arg313、Arg955和Asn759。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述经序列工程化的Cas核酸酶为AapCas12b，其在选自由以下组成的组的残基处具有一个或多个氨基酸缺失或取代：Lys4、Ser5、Lys7、Lys9、Trp391、Arg415、Ser442、Met443、Gln446、Arg484、Arg485、Tyr501、Asn503、Phe600、His614、Gln618、Arg731、Arg734、Val737、Arg738、Arg742、Pro743、Lys744、Ile745、Arg746、Arg746、Val753、Gly754、Gly755、Leu764、Asn766、Gln767、Arg792、Ala794、Thr796、His800、His803、Asp807、Lys810、Lys811、Asp814、Arg815、Glu819、Tyr825、Trp835、Tyr839、Asn881、Gln882、Gln973、Leu978和Gln982。
26.如权利要求22所述的方法，其中所述经序列工程化的Cas核酸酶为AacCas12b，其在选自由以下组成的组的残基处具有一个或多个氨基酸缺失或取代：Leu978、Gln982、Gln973、His514、Phe600、Tyr839、Arg815、Glu819、Gln618、Arg415、Met443、Ala794、Arg792、Arg738、Arg731、Arg734、Thr796、Arg746、Leu764、Arg738、Gln767、Val737、His800、Pro743、Val753、Gly754、Asn756、Asp807、His803、Arg484、Tyr501、Lys9、Ser442、Arg742、Lys744、Ile745、Gly755、Arg746、Gln446、Lys810、Ser5、Asn503、Asn881、Lys7、Trp391、Arg485、Tyr825、Lys811、Trp835、Gln882、Asp814和Lys4。
27.如权利要求22所述的方法，其中所述经序列工程化的Cas核酸酶为LbuCas13a，其在选自由以下组成的组的残基处具有一个或多个氨基酸缺失或取代：Met1、Lys2、Val3、Thr4、Lys5、Ser10、His11、His11、Asn139、Lys140、Asn142、Ser143、Ser147、Asn151、Arg172、Tyr176、Arg224、His228、Arg233、Lys237、Tyr245、Gln271、Tyr274、Lys275、Tyr276、His294、Glu297、Ser301、Lys305、Tyr307、Arg311、Lys319、Arg322、Lys336、Asn339、Lys340、Ser363、Ala367、Glu371、Phe375、Asn378、Asn547、Arg547、Asn549、Ser555、Lys558、Tyr601、His771、Ser780、Lys783、Ala787、Asn804、Asn804、Arg809、Arg857、His901、Tyr938、Lys942、His962、Arg963、Arg973、Arg1072、Asn1083、Lys1087、Ser1088、Phe1102和Ala1106。
28.如权利要求21所述的方法，其中所述序列工程化改变所述Cas核酸酶的构象。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述经序列工程化的Cas核酸酶为LbCas12a，其在选自由以下组成的组的残基处具有一个或多个氨基酸缺失或取代：Lys457、Val511、Thr512、Gln888和Try890，或者为LbuCas13a，其在选自由以下组成的组的残基处具有一个或多个氨基酸缺失或取代：Lys2、Lys5、Gln371、Phe375、Lys783和His962。
30.如权利要求21所述的方法，其中所述序列工程化改变所述Cas核酸酶在与PAM序列相互作用方面的活性。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述经序列工程化的Cas核酸酶为LbCas12a，其在选自由以下组成的组的残基处具有一个或多个氨基酸缺失或取代：Lys121、Thr148、Thr149、Trp534、Asp535、Lys538、Tyr542、Lys595、Ser599、Lys600、Lys601、Try616、Try646、Trp649和Gly740，或者为AapCas12b，其在选自由以下组成的组的残基处具有一个或多个氨基酸缺失或取代：Lys209、Lys141、Ala142、Lys145、Asn144、Gly143、Asn400、Lys396、Gln118、Gly478、Arg507、Gln403、Arg208、Gln211、Ala212、Val213、Arg218、Val134、Gly135、Leu137、Gly136、Gln119、Arg122、Gly143、Asn144和Arg150、Arg147。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述经序列工程化的Cas核酸酶为AsCas12a，其在选自由以下组成的组的残基处具有一个或多个氨基酸缺失或取代：Lys164、Thr166、Thr167、Ala135、Lys607、Lys613、Asn631、Tyr687、Asn547、Lys689、Asp545、Lys548、Lys780、Asn782和Gly783。
33.如权利要求30所述的方法，其中所述经序列工程化的Cas核酸酶为AacCas12b，其在选自由以下组成的组的残基处具有一个或多个氨基酸缺失或取代：Lys209、Lys141、Ala142、Lys145、Asn144、Gly143、Asn400、Lys396、Gln118、Gly478、Arg507、Gln403、Arg208、Gln211、Ala212、Val213、Arg218、Val134、Gly135、Leu137、Gly136、Gln119、Arg122、Gly143、Asn144和Arg150、Arg147。
34.如权利要求21所述的方法，其中所述序列工程化位于REC1结构域、REC2结构域、螺旋I结构域或螺旋II结构域内的保守残基处。
35.如权利要求21所述的方法，其中所述序列工程化位于所述Cas核酸酶的REC叶或RuvC结构域内的残基处，所述残基带正电荷或带负电荷，或能够与所述靶多核苷酸形成氢键。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述残基为以下中的一个或多个：
LbCas12a的Asn160、Lys167、Ser168、Asn256、Asn260、Ser286、Ser288、Trp355、Lys514、Ile896、Lys897、Gln944、Lys945、Phe983、Gly740或Lys984；
AsCas12a的Ser376、Asn282、Asn278、Arg301、Thr315、Lys524、Arg955、Arg951、Ile964、Lys965、Gln1014、Phe1052、Ala1053、Ser186、Asn178、Lys603、Gln784、Lys780、Gly783、Ser1051、Gln1013、Lys968、Gly263或Trp382；
FnCas12a的Lys1066、Lys895、Lys1281、Lys1287、Lys1069、Arg1016、Phe1010、Arg1014、Asn1288、Leu329、Asp331、Ser330、Gln327、Lys326、Leu324、Leu1008、Gln1006、Asp917、Asn1009、Arg1014、Lys1021、Arg1016、Lys1013、Gln309、Asn305、Leu306、Glu302或Asn301，
AapCas12b的Arg332、Arg900、Phe897、Ser898、Ser899、Asp570、Glu848、Asp977、Arg911、Leu573、Arg574、Arg913、Asn1101、Gln1093、Arg859、Tyr853、Gln866、Arg331、Gly955、Trp930、Ser5、Pro86、Gln109、Ala117、Lys141、Ala142、Lys145、Arg208、Lys209、Gln211、Ala212、Val213、Arg218、Gln222、Ser233、Trp234、Arg237、Leu281、Lys284、Glu285、His289、Thr292、Arg294、Arg297、Ser335、Gln403、Ser505、Arg785、Lys789、Phe793、Arg798、Lys805、Phe855、Ser862、Arg873或Gly874；
AacCas12b的Ser5、Pro86、Gln109、Ala117、Lys141、Ala142、Lys145、Arg208、Lys209、Gln211、Ala212、Val213、Arg218、Gln222、Ser233、Trp234、Arg237、Leu281、Lys284、Glu285、His289、Thr292、Arg294、Arg297、Ser335、Gln403、Ser505、Arg785、Lys789、Phe793、Arg798、Lys805、Phe855、Ser862、Arg873、Gly874、Arg332、Arg900、Phe897、Ser898、Ser899、Asp570、Glu848、Asp977、Arg911、Leu573、Arg574、Arg913、Asn1101、Gln1093、Arg859、Tyr853、Gln866、Arg331、Gly955或Trp930；或者
LbuCas13a的Lys2、Arg41、Lys47、Lys86、His473、His477、Gln519、Ser522、Thr557、Asp590、Lys597、Gln659、Arg809、Val810、Lys855、Arg857、Gln904、Glu996、Phe995、Asn997、Lys998、Gln1007或Arg1135。
37.如权利要求21所述的方法，其中所述序列工程化位于所述Cas核酸酶的HNH基序、REC叶或Nuc叶中的保守残基处。
38.如权利要求21-37中任一项所述的方法，其中所述序列工程化为非保守取代或用丙氨酸取代。
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述混合物进一步包含提高所述聚合酶的扩增动力学的聚合酶激活剂。
40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述混合物进一步包含二甲亚砜(DMSO)、牛血清白蛋白(BSA)、tween20、蛋白酶K抑制剂或核酸酶抑制剂。
41.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述混合物进一步包含选自表F的试剂。
42.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸为单链RNA、双链RNA、单链DNA或双链DNA。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述靶多核苷酸为病毒DNA或RNA，或含有SNP(单核苷酸多态性)的基因组DNA。
44.如权利要求42所述的方法，所述方法进一步包括由所述Cas核酸酶切割所述靶多核苷酸时激活的可检测的标签。
45.一种用于检测靶多核苷酸的试剂盒或包装，所述试剂盒或包装包含(a)聚合酶、(b)脱氧核苷三磷酸(dNTP)、(c)用于扩增所述靶多核苷酸的引物、(c)CRISPR相关(Cas)核酸酶、和(d)包含与所述靶多核苷酸上的靶片段互补的间隔片段(spacer)的向导RNA，其中所述聚合酶可有效扩增所述靶多核苷酸，同时所述Cas核酸酶能够切割所述经扩增的靶多核苷酸。
46.一种用于检测靶多核苷酸的试剂盒或包装，所述试剂盒或包装包含(a)聚合酶、(b)脱氧核苷三磷酸(dNTP)、和(c)用于扩增所述靶多核苷酸的引物，其中至少一种引物包括Cas核酸酶的次优PAM序列，或者其中至少dNTP或引物经修饰以减少Cas核酸酶的切割或结合。
47.一种用于切割靶多核苷酸的试剂盒或包装，所述试剂盒或包装包含(a)CRISPR相关(Cas)核酸酶、和(b)包含与所述靶多核苷酸上的靶片段互补的间隔片段的向导RNA，其中与标准向导RNA相比，所述向导RNA与所述靶多核苷酸的结合减少或对所述靶多核苷酸的切割减少。
48.一种突变的Cas核酸酶，其具有(a)在形成核糖核蛋白(RNP)方面的降低的活性、(b)改变的构象、(c)在与靶PAM序列相互作用方面的降低的活性、或(d)与待切割的靶多核苷酸的减少的结合。
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