CN116024316A - 一种可替代crispr***的核酸试纸条检测方法及新冠病毒检测试剂盒 - Google Patents
一种可替代crispr***的核酸试纸条检测方法及新冠病毒检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种可替代CRISPR***的核酸试纸条检测方法及新冠病毒检测试剂盒，涉及检测技术领域。本申请包括以下步骤：1)基于不同的活性，设计合成不同类型用于扩增靶基因的引物，并在相关区域设计对应的探针；2)将基于不同活性以及不同类型引物酶系及其buffer、引物和DNA探针进行混合，得到反应混合物，并加入至相应模板即可；3)反应混合物进行反应后，以稀释液稀释10倍后***CAS核酸试纸条，进行检测结果可视化判读。本申请相比于市面上现有的核酸试纸条检测技术，本发明具有以下优点：更快速：从取样到结果判断仅需22min，其中样本处理5min以内，扩增15min，试纸条检测2min。
Description
技术领域
本申请涉及检测技术领域，具体涉及一种可替代CRISPR***的核酸试纸条检测方法及新冠病毒检测试剂盒。
背景技术
核酸诊断技术具有快速、灵敏的优势，能够检测处于潜伏期的病原体。目前，大多数实验室采用聚合酶链式反应(PCR)作为分子检测的金标准，被广泛应用于医学诊断、食品安全检测等领域。采用PCR扩增后，微量的待测物可被放大为初始浓度的约108倍，大大提高了检测灵敏度。但是PCR扩增需要集成精密温控热块，价格昂贵，非便携，不适用于现场检测。此外，PCR扩增通常需要1～2小时，非常耗时。
近年来出现了如RPA(RecombinasePolymeraseAmplification，重组酶聚合酶等温扩增)，LAMP等多种恒等温扩增技术，可用于现场检测，但如何准确特异地检测扩增产物一直是制约其发展的因素。目前RPA扩增可结合探针检测扩增产物，探针的引入可阻碍扩增反应的进行，因此该方法对引物探针组合筛选要求极高，难以达到快速应对突发疫情的目的。并且探针法本身并未改变其单级扩增反应的本质，相较于目前市场上的实时定量PCR(Q-PCR)方法，并未实质性地提升检测灵敏度。LAMP扩增反应体系较复杂，已有的终端检测方式(如显色法、荧光法及核酸试纸条等)均不同程度地显示出假阳性。因此亟待建立一种特异地，可应用于现场、简易、快速、且高灵敏度的检测技术，近年来发展起来的CRISPR/Cas检测技术成为理想的候选方案。
CRISPR是大多数细菌及古细菌中抵御病毒入侵的一种获得性免疫方式。当病毒入侵时，细菌生成对应的能识别病毒基因组的crRNA，该crRNA引导具有核酸内切酶活性的Cas蛋白对病毒靶标序列进行识别和切割。
2016年6月，张锋课题组发现了一种CRISPR效应蛋白Cas13a。该蛋白是一种在crRNA引导下与靶标RNA结合并降解靶标的核酸内切酶(Makarovaetal.,2011)。同年10月Doudna等(East-Seletskyetal.,2016)发现一种叫LeptotrichiabuccalisCas13a(LbuCas13a)的核酸内切酶不仅具有对靶标RNA切割活性，而且还具有切割非靶标RNA的活性，这种非特异性切割称为反式切割。利用这种特性，该研究组将Cas13a用于检测RNA靶标但其检出限仅为10pmol/L。这对核酸检测来说不具有应用价值，因为大多数核酸检测方法检出限都在amol/L数量级(Songetal.,2013)。2017年，张锋与Collins合作将Cas13a与重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)结合，开发出了一个高特异性和灵敏性的核酸检测***(Specific High-Sensitivity Enzymatic ReporterUnLOCKing，SHERLOCK)(Gootenberg et al.,2017)。该检测***中，靶标经RPA和T7RNA聚合酶转录扩增后，在对应的crRNA的引导下，能特异性地识别并切割靶标RPA分子，同时激活LwCas13a的非特异性单链RNA酶活性，切割底物产生荧光信号。RPA的引入显著地提高了该***的灵敏度，SHERLOCK对靶标的检出限低至2x103copies/mL，实现了单分子的检测。这项突破性的研究成果再次证实了CRISPR/Cas***在核酸诊断领域的价值，有望在公共卫生领域产生重大影响。但是环境中的核糖核酸酶(RNase)广泛存在且十分稳定，而SHERLOCK***的关键组分均为RNA链，因此该***对操作环境要求较为苛刻。2015年，张锋等发现一种Ⅱ类V型CRISPR效应蛋白Cas12(Zetsche et al.，2015)。Cas12可在crRNA引导下与靶标双链DNA结合并切割基因组DNA。2018年，Doudna等发现当Cas12特异性结合和切割目标dsDNA后，具有非特异性切割单链DNA(ssDNA)的活性，并利用Cas12的这种活性开发了一个被命名为DETECTR的核酸检测***。DETECTR将RPA等温扩增技术与Cas12相结合，扩增产物激活Cas12的附属切割活性，切割底物产生荧光信号，并且实现了单分子级别的灵敏度。该***在单核苷酸多态性分析、肿瘤筛查、细菌和病毒感染检测以及耐药性筛查等方面有广泛的应用潜力。由于cas12的靶标及底物均为DNA，稳定性较强，因此该***对实验操作环境要求低，可应用于现场的快速检测。同时由于Cas12被靶标特异性激活后，能够非特异性地切割单链报告分子，该步骤具有信号放大作用，因而该技术相较于单一的探针法等传统核酸检测技术具有更高的灵敏度。
以上技术及技术的组合尽管可以实现核酸分子的快速灵敏检测。但基于荧光的方法需要复杂、大型且价格昂贵、做工精密的光学仪器，不利于设备的小型化和降低成本，并且结果不能可视化的判读，这对该类技术在基层检验机构的普及带来困难。现有的核酸试纸条层析法大多基于PCR、RPA及LAMP等扩增产物的显色而进行可视化判读，其体系中存在的引物二聚体和非特异扩增等会促成假阳性结果；而CRISPR***需先扩增再进行CAS切割，分步进行一方面增加了操作的复杂度，亦增加了整个检测过程的时长，同时开盖操作极易形成气溶胶，造成核酸实验室的污染，不利于临床应用。即使可实现“扩增+CAS”***的一步法，但整个体系所需物料过多，增加了产品化的可行性及成本,鉴于此，本申请提出一种可替代CRISPR***的核酸试纸条检测方法及新冠病毒检测试剂盒新冠病毒检测试剂盒。
发明内容
本申请的目的在于：为解决上述背景技术中提出的问题，本申请提供了一种可替代CRISPR***的核酸试纸条检测方法及新冠病毒检测试剂盒。
本申请为了实现上述目的具体采用以下技术方案：
一种可替代CRISPR***的核酸试纸条检测方法，包括以下步骤：
1)基于不同的活性，设计合成不同类型用于扩增靶基因的引物，并在相关区域设计对应的探针；
2)将基于不同活性以及不同类型引物酶系及其buffer、引物和DNA探针进行混合，得到反应混合物，并加入至相应模板即可；
3)反应混合物进行反应后，以稀释液稀释10倍后***CAS核酸试纸条，进行检测结果可视化判读。
进一步地，所述步骤1)中不同的活性包括5’→3’核酸外切酶活性、ExonucleaseIII活性或Endonuclease IV活性。
进一步地，所述步骤1)中不同的活性还包括RNase HII活性。
进一步地，当活性为5’→3’核酸外切酶活性时，此时引物类型为PCR引物和LAMP引物、RCA引物中的一种或几种；当活性为Exonuclease III活性或Endonuclease IV活性时，此时引物类型为RPA引物；当活性为RNase HII活性时，此时引物类型为PCR引物、RPA引物、LAMP引物和RCA引物中的一种或几种。
进一步地，所述步骤2)中，DNA探针两端的标记基团FAM、TAMRA、DIG及Biotin可两两自由组合，当活性为Exonuclease III活性或Endonuclease IV活性时，DNA探针中间某碱基以四氢呋喃THF替代。
本申请还提出一种新冠病毒检测试剂盒，包括上述一种可替代CRISPR***的核酸试纸条检测方法，至少还包括引物、DNA探针和CAS核酸试纸条。
进一步地，当活性为5’→3’核酸外切酶活性时，试剂盒还包括完整的Bst聚合酶及其buffer；当活性为Exonuclease III活性或Endonuclease IV活性时，试剂盒还包括RPA酶系及其buffer、醋酸镁；当活性为RNase HII活性时，还包括Bst聚合酶大片段及其buffer，LAMP引物。
进一步地，当活性为5’→3’核酸外切酶活性时，引物序列为:
N1-F3：GACCCTGTGGGTTTTAC；
N1-B3：GTCAAAAGCCCTGTATAC；
N1-FIP：CGGAGTTGATCACAACTACACACAGTCTGTACCGTCTG；
N1-BIP：TCGTTTTTAAACGGGTTTGCCTAGTGCCTGTGCCG；
N1-LB：GCAGCCCGTCTTACAC；
DNA探针序列为：
N1-P：AGTGCAGCCCGTCTTACACC。
进一步地，当活性为Exonuclease III活性或Endonuclease IV活性时，引物序列为:
ORF1ab-F：TACTGCCGTTGCCACATAGATCATCCAAATCC；
ORF1ab-R：CTACAGCCATAACCTTTCCACATACCGCAGAC；
DNA探针序列为：
ORF1ab-P：ACTTGTGCTAATGACCCTGTGGGTTTTA(THF)ACTTAAAAACACA。
进一步地，当活性为RNase HII活性时，引物序列为:
N2-F3：AAACACAGTCTGTACCG；
N2-B3：GTCAAAAGCCCTGTATAC；
N2-FIP：GCATCAGCTGACTGAAGCAAAAGGTTATGGCTGTAGT；
N2-BIP：TCGTTTTTAAACGGGTTTGCCTAGTGCCTGTGCCG；
N2-LB：GCAGCCCGTCTTACAC；
DNA探针序列为：
N2-P：AA/rT/TGCACAATTTGCCCCA。
本申请的有益效果如下：
1、本申请相比于市面上现有的核酸试纸条检测技术，本发明具有以下优点：
1)更快速：从取样到结果判断仅需22min，其中样本处理5min以内，扩增15min，试纸条检测2min；
2)准确：本发明具有极高的灵敏度，检测限在1000copies/ml以内。现有的核酸试纸条层析法大多基于扩增产物的双夹心原理显色，但体系中存在的引物二聚体和非特异扩增产物等会造成假阳性结果，本发明设有特异性靶探针，其大大提升了特异性，保证了检测结果的准确性。
2、本申请相比于现有的基于CRISPR/Cas的核酸检测技术，本发明具有以下优点：
1)反应更快：现有CRISPR/Cas技术从样本处理到结果检出耗时1-3h不等，本发明整个过程只需20min；
2)操作更简便：Crispr-cas***需先扩增再进行CAS切割，步骤繁琐，体系复杂，并且所需物料过多，增加了产品化的可行性及成本。本发明仅在核酸扩增的体系中加入特异的探针，即可实现产物扩增和探针切割的同时进行，提高了特异性，精简了检测体系的复杂程度。
3)低成本：本发明仅运用扩增体系的组分进行检测，省去了CRISPR体系中CAS酶、crRNA以及报告分子等组分，所用材料和酶现已成熟，并且用量少，亦可实现微量化的测试分析，因此成本较低。
3、本申请相比于市面上现有的基于核酸检测技术的新型冠状病毒检测试剂盒，本发明具有以下优点：
1)反应更快：现有的核酸检测技术新型冠状病毒检测试剂盒从样本处理到结果耗时从0.5-3h不等，使用本发明的系列新型冠状病毒检测试剂盒的整个检测过程只需20min，且提供可视化结果判读，具体通过CAS核酸检测试纸条可视化结果判读；
2)快捷方便：市面上现有的核酸检测的新型冠状病毒检测试剂盒大多基于荧光定量PCR技术，因此难以摆脱大型仪器的桎梏。本发明系列技术，在恒温42或65℃进行，因此对设备要求极低，只需简单的恒温设备甚至利用体温也能使反应进行，有利于在基层检验机构和各种检测场景中普及。
附图说明
图1是本申请实施例一检测结果判读图；
图2是本申请实施例二检测结果判读图；
图3是本申请实施例三检测结果判读图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
一种可替代CRISPR***的核酸试纸条检测方法，包括以下步骤：
1)基于不同的活性，设计合成不同类型用于扩增靶基因的引物，并在相关区域设计对应的探针；
2)将基于不同活性以及不同类型引物酶系及其buffer、引物和DNA探针进行混合，得到反应混合物，并加入至相应模板即可；
3)反应混合物进行反应后，以稀释液稀释10倍后***CAS核酸试纸条，进行检测结果可视化判读。
进一步地，所述步骤1)中不同的活性包括5’→3’核酸外切酶活性、ExonucleaseIII活性或Endonuclease IV活性。
进一步地，所述步骤1)中不同的活性还包括RNase HII活性。
进一步地，当活性为5’→3’核酸外切酶活性时，此时引物类型为PCR引物和LAMP引物、RCA引物中的一种或几种；当活性为Exonuclease III活性或Endonuclease IV活性时，此时引物类型为RPA引物；当活性为RNase HII活性时，此时引物类型为PCR引物、RPA引物、LAMP引物和RCA引物中的一种或几种。
进一步地，所述步骤2)中，DNA探针两端的标记基团FAM、TAMRA、DIG及Biotin可两两自由组合，当活性为Exonuclease III活性或Endonuclease IV活性时，DNA探针中间某碱基以四氢呋喃THF替代。
本申请还提出一种新冠病毒检测试剂盒，包括上述一种可替代CRISPR***的核酸试纸条检测方法，至少还包括引物、DNA探针和CAS核酸试纸条。
进一步地，当活性为5’→3’核酸外切酶活性时，试剂盒还包括完整的Bst聚合酶及其buffer；当活性为Exonuclease III活性或Endonuclease IV活性时，试剂盒还包括RPA酶系及其buffer、醋酸镁；当活性为RNase HII活性时，还包括Bst聚合酶大片段及其buffer，LAMP引物。
进一步地，当活性为5’→3’核酸外切酶活性时，引物序列为:
N1-F3：GACCCTGTGGGTTTTAC；
N1-B3：GTCAAAAGCCCTGTATAC；
N1-FIP：CGGAGTTGATCACAACTACACACAGTCTGTACCGTCTG；
N1-BIP：TCGTTTTTAAACGGGTTTGCCTAGTGCCTGTGCCG；
N1-LB：GCAGCCCGTCTTACAC；
DNA探针序列为：
N1-P：AGTGCAGCCCGTCTTACACC。
进一步地，当活性为Exonuclease III活性或Endonuclease IV活性时，引物序列为:
ORF1ab-F：TACTGCCGTTGCCACATAGATCATCCAAATCC；
ORF1ab-R：CTACAGCCATAACCTTTCCACATACCGCAGAC；
DNA探针序列为：
ORF1ab-P：ACTTGTGCTAATGACCCTGTGGGTTTTA(THF)ACTTAAAAACACA。
进一步地，当活性为RNase HII活性时，引物序列为:
N2-F3：AAACACAGTCTGTACCG；
N2-B3：GTCAAAAGCCCTGTATAC；
N2-FIP：GCATCAGCTGACTGAAGCAAAAGGTTATGGCTGTAGT；
N2-BIP：TCGTTTTTAAACGGGTTTGCCTAGTGCCTGTGCCG；
N2-LB：GCAGCCCGTCTTACAC；
DNA探针序列为：
N2-P：AA/rT/TGCACAATTTGCCCCA。
实施例一
本实施例以5’→3’核酸外切酶活性，PCR引物和LAMP引物、RCA引物进行实施例的公开。基于5’→3’核酸外切酶活性的PCR和LAMP、RCA探针切割试纸条法，包括如下步骤：
1)设计合成用于扩增靶基因的PCR和LAMP、RCA引物，并在相关区域设计对应的探针；
2)将包括PCRbuffer、Taq酶，引物和DNA探针(探针两端的标记基团FAM、TAMRA、DIG及Biotin可两两自由组合)混合得反应混合物，加入相应模板即可反应；
3)将包括LAMP和RCAbuffer、完整的Bst聚合酶，配套引物和DNA探针(探针两端的标记基团FAM、TAMRA、DIG及Biotin可两两自由组合)混合得反应混合物，加入相应模板即可反应扩增；
4)所述反应混合物进行反应后，以稀释液稀释10倍后***CAS核酸试纸条，进行检测结果判读。
优选地，所述步骤3)、4)具体为：将反应混合物65℃孵育20-30min，以稀释液稀释10x，再通过CAS核酸试纸条显色，肉眼观察即可进行检测结果判读。
本实施例还提出一种新型冠状病毒试纸条检测试剂盒，包括完整的Bst聚合酶及其buffer，LAMP引物、DNA探针(探针两端的标记基团FAM、TAMRA、DIG及Biotin可两两自由组合)，CAS核酸试纸条，进行检测结果可视化判读。
优选地，上述的新型冠状病毒检测试剂盒中，引物序列为:
N1-F3：GACCCTGTGGGTTTTAC；
N1-B3：GTCAAAAGCCCTGTATAC；
N1-FIP：CGGAGTTGATCACAACTACACACAGTCTGTACCGTCTG；
N1-BIP：TCGTTTTTAAACGGGTTTGCCTAGTGCCTGTGCCG；
N1-LB：GCAGCCCGTCTTACAC；
所述探针序列为：
N1-P：AGTGCAGCCCGTCTTACACC。
该实施例的具体实施方式为：
1、引物探针设计与筛选：
以NEB官网在线软件设计LAMP引物，探针长度18-30bp；
2、实验步骤：
1)以咽拭子取健康志愿者样本，加入到核酸释放剂中，用上述溶液稀释新冠假病毒，制备人工模拟的样本，于室温裂解5分钟；
2)于包含完整的Bst聚合酶的冻干球中加入LAMP各引物/探针组合3.5ul，和1)中制备的咽拭子模拟样本21.5ul，组成LAMP反应体系25ul：
| 组分 | 体积 |
| 冻干球 | 1粒 |
| N1-FIP(100μM) | 0.4μl |
| N1-BIP(100μM) | 0.4μl |
| N1-F3(100μM) | 0.05μl |
| N1-B3(100μM) | 0.05μl |
| N1-LB(100μM) | 0.1μl |
| N1-P(100μM) | 2.5μl |
| Template(1000copies/ml) | 21.5μl |
| Total | 25ul |
3、将反应混合物65℃孵育30min，以稀释液稀释10x，再通过CAS核酸试纸条显色2min，肉眼观察即可进行检测结果判读，如图1。
实施例一中，PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的DNA探针(探针两端的标记基团FAM、TAMRA、DIG及Biotin可两两自由组合)，探针完整时，两端的报告基团在一起；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使探针两端的基团分离，从而被核酸试纸条可视化监测到。对于LAMP，RCA等扩增技术，完整的Bst聚合酶亦具有5’→3’DNA聚合酶活性和5’→3’核酸外切酶活性。加入一条特异性的DNA探针(探针两端的标记基团FAM、TAMRA、DIG及Biotin可两两自由组合)，LAMP，RCA扩增时，Bst聚合酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使探针两端的基团分离，从而被核酸试纸条可视化监测到。
实施例二
本实施例是Exonuclease III活性或Endonuclease IV活性、RPA引物进行实施例的公开。
基于Exonuclease III活性或Endonuclease IV活性的探针切割试纸条法，包括如下步骤：
1)设计合成用于扩增靶基因的RPA引物，并在相关区域设计对应的探针；
2)将包括RPA酶系及其buffer，引物和DNA探针(探针两端的标记基团FAM、TAMRA、DIG及Biotin可两两自由组合，探针中间某碱基以四氢呋喃替代)，醋酸镁混合得反应混合物，加入待测靶标核酸即可反应扩增；
3)所述反应混合物进行反应后，以稀释液稀释10倍后***CAS核酸试纸条，进行检测结果判读。
优选地，步骤3)具体为：将反应混合物42℃孵育15min，以稀释液稀释10x，再通过CAS核酸试纸条显色，肉眼观察即可进行检测结果判读。
本实施例所对应的新冠病毒检测试剂盒实施方案为：
提供一种新型冠状病毒试纸条检测试剂盒，包括RPA酶系及其buffer，引物和DNA探针(探针两端的标记基团FAM、TAMRA、DIG及Biotin可两两自由组合，探针中间某碱基以四氢呋喃THF替代)，醋酸镁，CAS核酸试纸条，进行检测结果可视化判读。
优选地，上述的新型冠状病毒检测试剂盒中，引物序列为:
ORF1ab-F：TACTGCCGTTGCCACATAGATCATCCAAATCC；
ORF1ab-R：CTACAGCCATAACCTTTCCACATACCGCAGAC；
DNA探针序列为：
ORF1ab-P：ACTTGTGCTAATGACCCTGTGGGTTTTA(THF)ACTTAAAAACACA。
该实施例的具体实施方式为：
1、引物探针设计与筛选：
以Primer Premier软件设计RPA引物，长度30-40bp，于上下游引物间设计探针，探针长度40-58bp，四氢呋喃THF距探针上游5，端30-40bp，下游3，端10-18bp；
2、实验步骤：
1)以咽拭子取健康志愿者样本，加入到核酸释放剂中，用上述溶液稀释新冠假病毒，制备人工模拟的样本，于室温裂解5分钟；
2)于包含RPA酶系的冻干球中加入RPA各引物/探针组合4.1ul，buffer 29.4ul，以及1)中制备的咽拭子模拟样本14ul；
| 组分 | 体积 |
| 冻干球 | 1粒 |
| ORF1ab-F(10μM) | 2μl |
| ORF1ab-R(10μM) | 2μl |
| ORF1ab-P(10μM) | 0.1μl |
| buffer | 29.4μl |
| Template(1000copies/ml) | 14μl |
3)加入2.5ul的醋酸镁于2)中体系，迅速将反应混合物42℃孵育15min，以稀释液稀释10x，再通过CAS核酸试纸条显色2min，肉眼观察即可进行检测结果判读，如图2所示。
该实施例中，RPA扩增体系中，加入Exonuclease III(Exo III)或EndonucleaseIV(Nfo)，并加入靶标特异性的DNA探针(探针两端的标记基团FAM、TAMRA、DIG及Biotin可两两自由组合)，探针中间以四氢呋喃(THF)替代对应的单个脱氧核糖核苷酸。当探针与扩增产物杂交时，Exonuclease III或Endonuclease IV酶切水解探针，使探针两端的基团分离，从而被核酸试纸条可视化监测到。
实施例三
本实施例是以RNase HII活性、PCR引物、RPA引物、LAMP引物和RCA引物进行实施例的公开。
PCR、RPA、LAMP、RCA等扩增体系中，加入RNase HII，并加入靶标的特异性DNA探针
(探针两端的标记基团FAM、TAMRA、DIG及Biotin可两两自由组合)，探针中间以单个的核糖核苷酸替代对应的脱氧核糖核苷酸。当探针与扩增产物杂交时，RNase HII酶切水解探针，使探针两端的基团分离，从而被核酸试纸条可视化监测到。
1、基于RNase HII活性的PCR探针切割试纸条法，包括如下步骤：
1)设计合成用于扩增靶基因的PCR引物，并在相关区域设计对应的探针，探针中的一个脱氧核糖核苷酸以相应的核糖核苷酸替代；
2)将包括PCRbuffer、Taq酶，引物和DNA探针(探针两端的标记基团FAM、TAMRA、DIG及Biotin可两两自由组合)混合得反应混合物，加入相应模板即可反应；
3)所述反应混合物进行反应后，以稀释液稀释10倍后***CAS核酸试纸条，进行检测结果可视化判读。
2、基于RNase HII活性的RPA探针切割试纸条法，包括如下步骤：
1)设计合成用于扩增靶基因的RPA引物，并在相关区域设计对应的探针，探针中的一个脱氧核糖核苷酸以相应的核糖核苷酸替代；
2)将包括RPA酶系及其buffer，引物和DNA探针(探针两端的标记基团FAM、TAMRA、DIG及Biotin可两两自由组合)，醋酸镁混合得反应混合物，加入待测靶标核酸即可反应扩增；
3)所述反应混合物进行反应后，以稀释液稀释10倍后***CAS核酸试纸条，进行检测结果判读。
优选地，所述步骤3)具体为：将反应混合物42℃孵育15min，以稀释液稀释10x，再通过CAS核酸试纸条显色，肉眼观察即可进行检测结果判读。
3、基于RNase HII活性的LAMP探针切割试纸条法，包括如下步骤：
1)设计合成用于扩增靶基因的LAMP引物，并在相关区域设计对应的探针，探针中的一个脱氧核糖核苷酸以相应的核糖核苷酸替代；
2)将包括LAMP buffer、Bst聚合酶大片段，LAMP引物和DNA探针(探针两端的标记基团FAM、TAMRA、DIG及Biotin可两两自由组合)混合得反应混合物，加入相应模板即可反应扩增；
3)所述反应混合物进行反应后，以稀释液稀释10倍后***CAS核酸试纸条，进行检测结果判读。
优选地，所述步骤3)具体为：将反应混合物65℃孵育20-30min，以稀释液稀释10x，再通过CAS核酸试纸条显色，肉眼观察即可进行检测结果判读。
本实施例所对应的新冠病毒检测试剂盒实施方案为：
提供一种新型冠状病毒试纸条检测试剂盒，包括Bst聚合酶大片段及其buffer，LAMP引物、DNA探针(探针两端的标记基团FAM、TAMRA、DIG及Biotin可两两自由组合)，CAS核酸试纸条，进行检测结果可视化判读。
优选地，上述的新型冠状病毒检测试剂盒中，所述引物序列为:
N2-F3：AAACACAGTCTGTACCG；
N2-B3：GTCAAAAGCCCTGTATAC；
N2-FIP：GCATCAGCTGACTGAAGCAAAAGGTTATGGCTGTAGT；
N2-BIP：TCGTTTTTAAACGGGTTTGCCTAGTGCCTGTGCCG；
N2-LB：GCAGCCCGTCTTACAC
DNA探针序列为：
N2-P：AA/rT/TGCACAATTTGCCCCA。(r为核糖核苷酸)
优选地，上述的新型冠状病毒检测试剂盒中，所述单链DNA探针的两端分别带有FAM和Biotin基团。
优选地，所用试纸条为CAS核酸检测试纸条。
本实施例的具体实施方式为：
1、引物探针设计与筛选：
以NEB官网在线软件设计LAMP引物，探针长度18-30bp；
2、实验步骤：
1)以咽拭子取健康志愿者样本，加入到核酸释放剂中，用上述溶液稀释新冠假病毒，制备人工模拟的样本，于室温裂解5分钟；
2)于包含完整的Bst聚合酶的冻干球中加入LAMP各引物/探针组合3.5ul，RNaseHII 0.1ul，和1)中制备的咽拭子模拟样本21.4ul，组成LAMP反应体系25ul：
| 组分 | 体积 |
| 冻干球 | 1粒 |
| N2-FIP(100μM) | 0.4μl |
| N2-BIP(100μM) | 0.4μl |
| N2-F3(100μM) | 0.05μl |
| N2-B3(100μM) | 0.05μl |
| N2-LB(100μM) | 0.1μl |
| N2-P(100μM) | 2.5μl |
| RNaseHII(10mU/ul) | 0.1μl |
| Template(1000copies/ml) | 21.4μl |
| Total | 25ul |
3)将反应混合物65℃孵育30min，以稀释液稀释10x，再通过CAS核酸试纸条显色，肉眼观察即可进行检测结果判读，如图3所示。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种可替代CRISPR***的核酸试纸条检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)基于不同的活性，设计合成不同类型用于扩增靶基因的引物，并在相关区域设计对应的探针；
2)将基于不同活性以及不同类型引物酶系及其buffer、引物和DNA探针进行混合，得到反应混合物，并加入至相应模板即可；
3)反应混合物进行反应后，以稀释液稀释10倍后***CAS核酸试纸条，进行检测结果可视化判读。
2.根据权利要求1所述的一种可替代CRISPR***的核酸试纸条检测方法，其特征在于，所述步骤1)中不同的活性包括5’→3’核酸外切酶活性、ExonucleaseIII活性或EndonucleaseIV活性。
3.根据权利要求2所述的一种可替代CRISPR***的核酸试纸条检测方法，其特征在于，所述步骤1)中不同的活性还包括RNaseHII活性。
4.根据权利要求3所述的一种可替代CRISPR***的核酸试纸条检测方法，其特征在于，当活性为5’→3’核酸外切酶活性时，此时引物类型为PCR引物和LAMP引物、RCA引物中的一种或几种；当活性为ExonucleaseIII活性或EndonucleaseIV活性时，此时引物类型为RPA引物；当活性为RNaseHII活性时，此时引物类型为PCR引物、RPA引物、LAMP引物和RCA引物中的一种或几种。
5.根据权利要求2所述的一种可替代CRISPR***的核酸试纸条检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，DNA探针两端的标记基团FAM、TAMRA、DIG及Biotin可两两自由组合，当活性为ExonucleaseIII活性或EndonucleaseIV活性时，DNA探针中间某碱基以四氢呋喃THF替代。
6.一种新冠病毒检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-5任意一项所述的一种可替代CRISPR***的核酸试纸条检测方法，至少还包括引物、DNA探针和CAS核酸试纸条。
7.根据权利要求6所述的一种新冠病毒检测试剂盒，其特征在于，当活性为5’→3’核酸外切酶活性时，试剂盒还包括完整的Bst聚合酶及其buffer；当活性为ExonucleaseIII活性或EndonucleaseIV活性时，试剂盒还包括RPA酶系及其buffer、醋酸镁；当活性为RNaseHII活性时，还包括Bst聚合酶大片段及其buffer，LAMP引物。
8.根据权利要求7所述的一种新冠病毒检测试剂盒，其特征在于，当活性为5’→3’核酸外切酶活性时，引物序列为:
N1-F3：GACCCTGTGGGTTTTAC；
N1-B3：GTCAAAAGCCCTGTATAC；
N1-FIP：CGGAGTTGATCACAACTACACACAGTCTGTACCGTCTG；
N1-BIP：TCGTTTTTAAACGGGTTTGCCTAGTGCCTGTGCCG；
N1-LB：GCAGCCCGTCTTACAC；
DNA探针序列为：
N1-P：AGTGCAGCCCGTCTTACACC。
9.根据权利要求7所述的一种新冠病毒检测试剂盒，其特征在于，当活性为ExonucleaseIII活性或EndonucleaseIV活性时，引物序列为:
ORF1ab-F：TACTGCCGTTGCCACATAGATCATCCAAATCC；
ORF1ab-R：CTACAGCCATAACCTTTCCACATACCGCAGAC；
DNA探针序列为：
ORF1ab-P：ACTTGTGCTAATGACCCTGTGGGTTTTA(THF)ACTTAAAAACACA。
10.根据权利要求7所述的一种试剂盒，其特征在于，当活性为RNaseHII活性时，引物序列为:
N2-F3：AAACACAGTCTGTACCG；
N2-B3：GTCAAAAGCCCTGTATAC；
N2-FIP：GCATCAGCTGACTGAAGCAAAAGGTTATGGCTGTAGT；
N2-BIP：TCGTTTTTAAACGGGTTTGCCTAGTGCCTGTGCCG；
N2-LB：GCAGCCCGTCTTACAC；
DNA探针序列为：
N2-P：AA/rT/TGCACAATTTGCCCCA。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310031771.6A CN116024316A (zh) | 2023-01-10 | 2023-01-10 | 一种可替代crispr***的核酸试纸条检测方法及新冠病毒检测试剂盒 |
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