CN113005230A

CN113005230A - 亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN113005230A
Application number: CN202110466902.4A
Authority: CN
Inventors: 陈�峰; 吴海磊; 唐晓宇; 杨国平
Original assignee: Nantong Customs Comprehensive Technical Center Nantong Branch Of Jiangsu International Travel Health Care Center And Nantong Customs Port Outpatient Department
Current assignee: Nantong Customs Comprehensive Technical Center Nantong Branch Of Jiangsu International Travel Health Care Center And Nantong Customs Port Outpatient Department
Priority date: 2021-04-28
Filing date: 2021-04-28
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2041-04-28
Also published as: CN113005230B

Abstract

本发明涉及一种亚洲型寨卡病毒RT‑RIA/CRISPR‑Cas12a检测试剂盒及其检测方法。所述的试剂盒包括用于亚洲型寨卡病毒RT‑RIA/CRISPR‑Cas12a检测的引物和探针序列，所述的引物和探针序列包括寨卡病毒ZIKV和内参基因β‑actin基因的RIA引物序列、Cas12a反应crRNA序列和荧光报告探针序列，crRNA序列5’端含有T7启动子识别位点，ZIKV和β‑actin基因荧光报告探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、ROX、VIC、CY5中一种，ZIKV和β‑actin基因荧光报告探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ1和BHQ2中的一种；且探针ZIKV和β‑actin的5’端标记的荧光基团均不相同；所述的试剂盒还包括：RIA反应试剂组分；Cas12a反应试剂组分；样本释放剂；所述的RIA反应试剂组分包括RIA Buffer、RIA酶和RIA激活剂；所述的Cas12a反应试剂组分包括Cas Buffer和Cas12a酶。

Description

亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及检测技术领域,具体涉及一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

寨卡病毒(Zika Virus，ZIKV)是一种重要的蚊媒病毒，属黄病毒科，黄病毒属，基因组为单股正链RNA，病毒颗粒直径40-50nm，传播媒介为伊蚊。截止2018年3月，全球范围内共有84个国家报道发现ZIKV感染病例。2016年2月我国确诊了中国大陆首例境外输入性ZIKV感染病例^[1]，随后在广东、浙江、北京等地相继出现输入性病例^[2]。该病毒在东南亚等地区有逐步蔓延的趋势。我国南方地区温暖潮湿极适合蚊子的生长繁殖，导致蚊媒传染病长期处于高发状态。世界卫生组织(WHO)认为，新生儿小头畸形、格林-巴利综合征(吉兰-巴雷综合征)可能与寨卡病毒感染有关^[3]。由于寨卡病毒与登革病毒、西尼罗河病毒和黄热病毒等其他黄病毒会发生交叉反应，因此通过血清学方法诊断较为困难。建立快速、简便、灵敏的实验室核酸检测方法对及时进行临床诊断救治、开展流行病学调查具有重要意义。

核酸恒温扩增技术由于不需反复热变性，无需特殊仪器，反应速度更快，适合现场快速检测，在生命科学研究及相关诸多领域已经得到了广泛应用^[4]。目前已有10余种核酸恒温扩增技术，其中重组聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)是2006年由英国公司TwistDx Inc研发的一种核酸恒温扩增技术^[5]，具有灵敏度高、特异性强、操作快速便捷等优点，而且可以实现定量分析，因此在疾病诊断和病原鉴定等许多领域具有广阔的应用前景，已在动物疫病检测如***病毒^[6]、小反刍兽疫病毒^[7]、猪细小病毒^[8]、牛病毒性腹泻^[9]的检测和病毒性出血热检测^[10]如马尔堡病毒、埃博拉病毒、登革病毒、黄热病毒和天花病毒的检测上得到应用。虽然RPA扩增可结合探针进行实时荧光定量PCR检测，但该方法对引物探针组合筛选要求极高，相较于目前市场上的实时荧光定量PCR方法，并未实质性地提升检测灵敏度。

CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列(clustered regularly interspacedshort palindromic repeats，CRISPR)的简称，Cas是CRISPR相关蛋白(CRISPR associatedprotein，Cas)的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御***CRISPR-Cas检测***。Gootenberg等^[11-13]先后建立了基于cas13a的特异性高灵敏度酶报告***(specific high-sensitivity enzymaticreporter unlocking，SHERLOCK)和不经核酸提取热处理样品灭活核酸酶技术(heatingunextracted diagnostic samples to obliterate nucleases，HUDSON)检测平台。Chen等^[14]基于Cas12a建立了DNA内切酶靶向的CRISPR反式报告检测***(DNA endonucleasetargeted crispr trans reporter，DETECTR)，并且实现了单分子级别的灵敏度。说明CRISPR技术已经在分子诊断技术中得到了一定的应用。

本发明基于国境口岸对寨卡病毒防控的需求，以简单、即时、高灵敏检测为目标，开发出一套基于RT-RIA/CRISPR-Cas12a荧光检测技术的寨卡病毒检测试剂及其方法，为蚊媒传染病疫情的检测与监测提供一种可选的方法。

发明内容

针对背景技术中提出的问题，本发明提出一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒及其检测方法，包括一种基于RT-RIA/CRISPR-Cas12a荧光检测引物探针组、试剂盒及其检测方法。

下述ZIKV即为寨卡病毒的简称；

RIA反应、RT-RIA反应表示均为同一体系；

Cas、Cas12a、CRISPR-Cas12a反应表示均为同一体系；

下述crRNA与CrRNA为同一物质；

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒，包括用于亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测的引物和探针序列，所述的引物和探针序列包括寨卡病毒ZIKV和内参基因β-actin基因的RIA引物序列、Cas12a反应crRNA序列和荧光报告探针序列，

ZIKV RIA引物的核苷酸序列如下所示：

引物ZIKV-F：

5’-TTGAGGGAGAGTTCAAGCTTAGGACGGAGCAA-3’，(SEQ ID NO：1)；

引物ZIKV-R：

5’-GAGATGCGACCTGATAGGCCAGCCAAACAGGA-3’，(SEQ ID NO：2)；

引物β-actin-F：

5’-TGGATCAGCAAGCAGGAGTATGACGAGTCCGG-3’，(SEQ ID NO：3)；

引物β-actin-R：

5’-CATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGGTTTTGTC-3’，(SEQ ID NO：4)；

crRNA序列5’端含有T7启动子识别位点，核苷酸序列如下所示：

ZIKV-crRNA：

5’-TAATTTCTACTAAGTGTAGATgacctttgtggaactcatgaaaagaggagatctt-3’，(SEQ IDNO：5)；

β-actin-crRNA：

5’-TAATTTCTACTAAGTGTAGATcggtggacgatggaggggccgg-3’，(SEQ ID NO：6)；

荧光报告探针核苷酸序列如下所示：

ZIKV-P：

5’-TTATT-3’，(SEQ ID NO：7)；

β-actin-P：

5’-TTAATT-3’，(SEQ ID NO：8)；

ZIKV和β-actin基因荧光报告探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、ROX、VIC、CY5中一种，ZIKV和β-actin基因荧光报告探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ1和BHQ2中的一种；且探针ZIKV和β-actin的5’端标记的荧光基团均不相同；

所述的试剂盒还包括：

(1)RIA反应试剂组分；

(2)Cas12a反应试剂组分；

(3)样本释放剂；

所述的RIA反应试剂组分包括RIA Buffer、RIA酶和RIA激活剂；

所述的Cas12a反应试剂组分包括Cas Buffer和Cas12a酶。

进一步的，ZIKV和β-actin基因荧光报告探针序列的5’端分别标记FAM和VIC荧光素，ZIKV和β-actin基因荧光报告探针序列3’端均标记BHQ1淬灭基团。

进一步的，RIA反应体系中，ZIKV和β-actin基因引物终浓度为400nmol/L；Cas12a反应体系中crRNA浓度为70nmol/L，荧光报告探针浓度为500nmol/L。

进一步的，RIA反应和Cas12a反应条件相同，均为42℃下进行反应，其中，RIA反应时间15min，Cas12a反应时间10min。

进一步的，所述的RIA激活剂为MgOAc；所述的RIA酶包括反转录酶、RNA酶抑制剂、结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶；所述的Cas12a酶为LbCas12a。

再进一步的，RIA反应体系中RIA激活剂MgOAc的终浓度为14mmol/L；Cas12a反应体系中LbCas12a酶浓度为1μM。

进一步的，所述的RIA Buffer中包括核酸释放剂、金属螯合剂、缓冲剂、表面活性剂、核酸稳定剂、细胞膜通透剂和核酸酶抑制剂；所述的核酸释放剂为月桂酰肌胺酸钠、缓冲液为Tris-HCl、金属螯合剂为EDTA、表面活性剂为Triton X-100、细胞膜通透剂为DMSO，核酸稳定剂为DTT，核酸酶抑制剂为DEPC水。

再进一步的，所述的RIA Buffer中包括月桂酰肌胺酸钠浓度为70mM～170mM，Tris-HCl浓度为50mM，EDTA浓度为20mM～50mM，Triton X-100浓度为30mM～75mM，DMSO浓度为1.2M～3.6M，DTT浓度为5mM～10mM。

一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测方法，包括以下步骤：

(1)配制RIA反应体系和Cas12a反应体系；

(2)RIA反应；

(3)Cas12a反应；

(4)结果判定。

进一步的，一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测方法，包括以下步骤：

(1)试剂的配置

配置RIA反应体系：配置50μL RIA反应体系，RIA反应体系中RIA Buffer 30.0μL，RIA酶10.0μL，10μmol/L的上、下游RIA各2.0μL，加入DEPC水补至45.5μL，混匀后移入置于冰上，加入血清模板2.0μL，再加入浓度为280mmol/L的MgOAc RIA激活剂2.5μL；

配置Cas12a反应体系：Cas12a Buffer 3μL，300nM crRNA 3μL，1μM LbCas12a 1μL，10μM FQ荧光报告探针1.5μL，补水至27μL，以3μL RIA反应产物为模板；

(2)荧光检测

RIA反应在恒温设备或者变温的PCR设备上进行反应，反应条件：37℃，15min；Cas12a荧光检测在含有FAM或者VIC通道的恒温或者变温实时荧光检测设备上进行，反应条件为：37℃，10min，每0.5min收集一次荧光。

(3)结果分析

质控标准：VIC通道为阳性，且荧光曲线呈明显“S”型曲线，说明核酸提取、扩增反应正常；

结果判读：在质控合格的前提下进行结果分析，如果FAM通道有明显“S”型曲线或者扩增曲线有指数增长趋势，则结果为寨卡病毒阳性；反之为阴性。

上述方案，本发明的有益效果：

(1)样本直扩：由于RT-RIA反应Buffer中含有能够直接进行核酸提取试剂组分，血清样本无需进行病毒RNA的提取，可直接将分离的血清加入RT-RIA反应体系中进行RT-RIA扩增；

(2)对仪器需求简单：RT-RIA检测和CRISPR-Cas12a检测仅需恒温荧光检测设备，无需变温PCR设备，适用于各种型号的小型化恒温荧光检测仪。

(3)灵敏度高：最低检测灵敏度为5.0×102copies/mL，即每个PCR反应可检测浓度低至1.5个拷贝的寨卡病毒RNA，实现寨卡病毒的单拷贝检测；

(4)特异性好：特异性检测寨卡病毒核酸，对西尼罗病毒、登革病毒(I～IV型)、黄热病毒、丙型肝炎病毒等其他病毒核酸无检测信号。

(5)重复性好：对浓度为1.0×107copies/mL和1.0×104copies/mL的假病毒标准品10次重复检测结果均为阳性，log(荧光强度响应值)变异系数<5％。

附图说明

图1-1是不同ZIKV RIA引物组合筛选结果图，图1-2是β-actin RIA引物组合筛选结果；

图2-1是不同RIA引物浓度对ZIKV基因检测灵敏度的影响图，图2-2是β-actin基因检测灵敏度的影响图；

图3是不同gRNA浓度对ZIKV检测灵敏度的影响图；

图4是不同LbCas12a酶浓度对ZIKV检测灵敏度的影响图；

图5是不同FQ荧光探针浓度对ZIKV检测灵敏度的影响图；

图6是不同反应时间检测结果的影响图；

图7是试剂盒ZIKV灵敏度检测结果图；

图8是试剂盒特异性检测结果图；

图9是血清模拟试验结果图。

具体实施方式

下面通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

本发明公开了一种(亚洲型)寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a荧光检测引物探针组、试剂盒及检测方法。

其中，引物探针序列如下段中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8所示。

本发明公开的(亚洲型)寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a荧光检测试剂盒，主要包括：(寨卡病毒)RT-RIA反应试剂和(寨卡病毒)RT-RIA引物，CRISPR-Cas12a反应试剂和Cas引物探针。

采用该试剂盒可以实现寨卡病毒的快速恒温检测，该检测***对寨卡病毒的最低检测限为5.0×102copies/mL，高于RT-qPCR检测灵敏度；特异性检测寨卡病毒核酸，对西尼罗病毒、登革病毒(I～IV型)、黄热病毒、丙型肝炎病毒等其他病毒核酸无检测信号；对浓度为1.0×107copies/mL和1.0×104copies/mL的假病毒标准品10次重复检测结果均为阳性，log(荧光强度响应值)变异系数<5％；模拟试验结果表明ZIKV假病毒浓度超过5.0×102copies/mL时检测结果均为阳性；比对试验结果表明ZIKV RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测方法对临床样本的检测符合率为100％。

即本发明提供的引物(和)探针序列(组)包括ZIKV RT-RIA/CRSPR-Cas12a检测的RT-RIA引物序(列)组和CRISPR-CAS12a检测的引物探针(序列)组，ZIKV RT-RIA引物的核苷酸序列如下所示：

引物ZIKV-F：

5’-TTGAGGGAGAGTTCAAGCTTAGGACGGAGCAA-3’，(SEQ ID NO：1)；

引物ZIKV-R：

5’-GAGATGCGACCTGATAGGCCAGCCAAACAGGA-3’，(SEQ ID NO：2)；

引物β-actin-F：

5’-TGGATCAGCAAGCAGGAGTATGACGAGTCCGG-3’，(SEQ ID NO：3)；

引物β-actin-R：

5’-CATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGGTTTTGTC-3’，(SEQ ID NO：4)；

CRISPR-CAS12a反应体系中crRNA序列5’端含有T7启动子识别位点，核苷酸序列如下所示：

ZIKV-crRNA：

β-actin-crRNA：

5’-TAATTTCTACTAAGTGTAGATcggtggacgatggaggggccgg-3’，(SEQ ID NO：6)；

该CrRNA引物为RT-RIA扩增目的片段的一部分，且5’端含有T7启动子序列，该启动子序列可在CRISPR-CAS12a反应时作为T7 RNA聚合酶识别位点。

荧光报告探针核苷酸序列如下所示：

ZIKV-P：

5’-TTATT-3’，(SEQ ID NO：7)；

β-actin-P：

5’-TTAATT-3’，(SEQ ID NO：8)；

探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、ROX、VIC、CY5中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ1和BHQ2中的一种；作为优选的，ZIKV和β-actin的5’端标记的荧光基团分别为FAM和VIC荧光素，探针的3’端均标记BHQ1淬灭基团。

基于上述引物探针组，本发明提供一种灵敏度高、特异性强、重复性好的亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a试剂盒，该试剂盒含有上述引物探针组，RIA引物探针在RT-RIA体系的终浓度均为400nmol/Lol/L；CrRNA和(荧光)报告探针在CRISPR-Cas12a反应体系中浓度分别为70nmol/L，和500nmol/L。

进一步的，所述的试剂盒还应含有RT-RIA反应试剂组分和CRISPR-Cas12a反应试剂组分。RT-RIA反应试剂(组分)包含RIA Buffer、RIA酶和RIA激活剂；CRISPR-Cas12a反应试剂(组分)包括Cas Buffer和Cas12a酶。

所述的RIA Buffer中包括核酸释放剂、金属螯合剂、缓冲剂、表面活性剂、核酸稳定剂、细胞膜通透剂和核酸酶抑制剂。

进一步的，所述的核酸释放剂、金属螯合剂、缓冲剂、表面活性剂、核酸稳定剂、细胞膜通透剂和核酸酶抑制剂分别为月桂酰肌胺酸钠、EDTA、Tris-HCl、Triton X-100、DTT、DMSO和DEPC水，其终浓度月桂酰肌胺酸钠为2％～5％，Tris-HCl为50mM，EDTA为20mM～50mM，Triton X-100为2％～5％，DMSO为10％～30％，DTT为5mM～10mM。换算统一即月桂酰肌胺酸钠浓度为70mM～170mM，Tris-HCl浓度为50mM，EDTA浓度为20mM～50mM，Triton X-100浓度为30mM～75mM，DMSO浓度为1.2M～3.6M，DTT浓度为5mM～10mM。

RIA反应体系中RIA激活剂MgOAc的终浓度为14mmol/L。

CRISPR-CAS12a反应体系中LbCas12a酶浓度为1μM。

基于上述试剂盒，本发明还提供了上述试剂盒的检测方法：

(1)配制RT-RIA反应体系和CRISPR-Cas12a反应体系；

(2)RT-RIA反应；

(3)CRISPR-Cas12a反应；

(4)结果判定。

作为优选的，RT-RIA反应体系为：50μL(RIA)反应体系中RIA Buffer 30.0μL，RIA酶10.0μL，10μmol/L的上、下游RIA各2.0μL，加入DEPC水补至45.5μL，混匀后移入置于冰上，加入血清模板2.0μL，再加入浓度为280mmol/L的MgOAc RIA激活剂2.5μL。

Cas12a反应体系为：Cas12a Buffer 3μL，300nM crRNA 3μL，1μM LbCas12a 1μL，10μM FQ荧光报告探针1.5μL，补水至27μL，以3μL RPA反应产物为模板。

作为优选的，RT-RIA反应条件为：37℃，15min；Cas12a荧光检测在含有FAM或者VIC通道的恒温或者变温实时荧光检测设备上均可进行，反应条件为：37℃，10min，每0.5min收集一次荧光。

实施例1：RT-RIA引物的设计与筛选

根据生物信息学分析结果结合文献报道，从NCBI数据库中下载亚洲型和非洲型寨卡病毒基因组序列以及登革病毒I～IV型、黄热病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒和丙型肝炎病毒基因组序列，用MEGA6.06生物学软件进行比对，选择亚洲型寨卡病毒非编码结构蛋白基因NS5的保守区域作为靶基因设计引物，利用primer premier5.0软件按照Twist引物设计原则：引物的5’端3～5个核苷酸应当避免聚鸟嘌呤；3’末端的3个碱基为鸟嘌呤和胞嘧啶有助于聚合酶的稳定结合，可以提升引物的扩增性能；引物中最好不要出现特殊序列，比如长串的聚嘌呤或聚嘧啶；GC含量过高(>70％)或过低(<30％)都不利于RPA扩增；此外，引物设计时应当尽量避免容易形成二级结构、引物-引物互作、发夹结构的序列，减少引物二聚体的形成。分别设计4组RPA扩增引物，对设计的4组引物在NCBI中进行Blast，比对结果均为亚洲型寨卡病毒。

根据https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design在线设计CRISPR gRNA序列，引物序列及标记见下表1。

表1引物及探针详细信息

Table 1 Primer details

采用RT-RIA扩增试剂对设计的4对ZIKV和4对β-actin基因RPA引物进行筛选，反应体系和反应程序参考本实验室前期课题研究结果，50μL反应体系中50μL反应体系中RIABuffer 30.0μL，RIA酶10.0μL，10μmol/L的上、下游RIA各2.0μL，加入DEPC水补至45.5μL，混匀后移入置于冰上，加入血清模板2.0μL，再加入浓度为280mmol/L的MgOAc RIA激活剂2.5μL。以10倍梯度稀释的ZIKV假病毒标准品(1.0×10⁷copies/mL、1.0×10⁶copies/mL、1.0×10⁵copies/mL和1.0×10⁴copies/mL)和10倍梯度稀释(10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL和10pg/μL)的人血清RNA为模板，反应温度设定为37℃，反应时间15min，扩增产物采用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，分别筛选ZIKV和β-actin基因最优RPA引物组合。

实施例2：反应条件的优化

(1)RT-RIA引物浓度优化

设置3个不同引物浓度水平(浓度分别为：200nmol/L、400nmol/L、600nmol/L)，用10倍梯度稀释的ZIKV假病毒标准品(1.0×10⁷copies/mL、1.0×10⁶copies/mL、1.0×10⁵copies/mL和1.0×10⁴copies/mL)和10倍梯度稀释(10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL和10pg/μL)的人血清RNA及阴性对照作为待测标本进行RT-RIA反应，扩增产物采用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，测试不同引物浓度对扩增结果的影响。

结果：不同RPA引物浓度对ZIKV和β-actin的扩增灵敏度有影响。当RPA引物终浓度均为200nol/L时，ZIKV和β-actin基因检测灵敏度偏低，其中ZIKV假病毒的检测灵敏度为10⁵copies/mL，β-actin基因的检测灵敏度为100pg/μL；当RPA引物终浓度增加至400nol/L时，ZIKV和β-actin基因的检测灵敏度分别增加至10⁴copies/mL和10pg/μL；继续增加RPA引物浓度至600nol/L时，检测灵敏度不再增加(见附图2-1、2-2)，最终确定RT-RIA体系中ZIKV和β-actin基因的RPA引物终浓度为400nol/L。

(2)gRNA浓度优化

设置4个不同gRNA浓度水平(浓度分别为：30nmol/L、50nmol/L、70nmol/L和100nmol/L)，以添加ZIKV假病毒终浓度1.0×10³copies/mL的血清样本及阴性对照作为待测标本进行RT-RIA反应，以3μL RPA反应产物为模板添加至27μLCas12a反应体系中，处理组3个平行，测试不同gRNA浓度对检测结果的影响。

结果：低浓度的gRNA影响ZIKV的检测灵敏度，在gRNA浓度为30nol/L时，血清终浓度为1.0×10³copies/mL的ZIKV假病毒检测结果为阴性；在gRNA浓度为50nol/L以上时，ZIKV检测结果为阳性(见附图3)。考虑长期保存稳定性，最终确定反应体系中gRNA的终浓度为70nol/L。

(3)LbCas12a浓度优化

设置4个不同LbCas12a浓度水平(浓度分别为：30nmol/L、50nmol/L、70nmol/L和100nmol/L)，以添加ZIKV假病毒终浓度1.0×10³copies/mL的血清样本及阴性对照作为待测标本进行RT-RIA反应，以3μL RPA反应产物为模板添加至27μLCas12a反应体系中，处理组3个平行，测试不同LbCas12a浓度对检测结果的影响。

结果：LbCas12a酶在4种不同浓度下对1.0×10³copies/mL的ZIKV假病毒检测结果均为阳性。低浓度(30nmol/L)或者高浓度(100nmol/L)的LbCas12a酶会降低检测荧光强度，LbCas12a酶的浓度为50nmol/L或70nmol/L时ZIKV和β-actin基因均有较强的荧光强度且有一定的差异，易于区分(见附图4)。考虑长期保存稳定性，最终确定反应体系中LbCas12a酶的浓度为70nol/L。

(4)FQ荧光报告探针浓度优化

设置4个不同FQ荧光报告探针浓度水平(浓度分别为：100nmol/L、300nmol/L、500nmol/L和700nmol/L)，以添加ZIKV假病毒终浓度1.0×10³copies/mL的血清样本及阴性对照作为待测标本进行RT-RIA反应，以3μL RPA反应产物为模板添加至27μLCas12a反应体系中，处理组3个平行，测试不同LbCas12a浓度对检测结果的影响。

结果：不同浓度的FQ荧光报告探针对1.0×10³copies/mL的ZIKV假病毒检测结果均为阳性，但ZIKV的检测荧光强度随着FQ荧光报告探针的浓度增加而增加。在FQ荧光报告探针浓度为500nmol/L时，ZIKV和β-actin基因荧光强度高且有一定差异，易于区分(见附图5)。确定反应体系中FQ荧光报告探针的终浓度为500nol/L。

(5)Cas12a反应时间测试

CRISPR-Cas12a反应区别于PCR反应的是不依赖引物的Tm值，反应温度主要取决于酶促动力学反应，仅需在推荐的最适温度37℃下进行反应时间摸索即可。根据上述优化的反应体系，固定gRNA浓度70nmol/L，LbCas12a 70nmol/L，FQ荧光报告探针500nmol/L，反应温度37℃。以添加ZIKV假病毒终浓度5.0×10²copies/mL的血清样本及阴性对照作为待测标本进行RT-RIA反应，以3μL RPA反应产物为模板添加至27μLCas12a反应体系中，设置3个平行，分别在5min、10min和15min收集荧光，测试最低检测限参考品在最优反应体系下能够检出所需的最短时间。

结果：CRISPR-Cas12a体系反应时间5min以内时，血清中浓度为5.0×10²copies/mL的最低检测限参考品检测结果为阴性；当反应时间10min时，最低检测限参考品检测结果为阳性；荧光强度与15min时的荧光强度基本一致(见附图6)，最终确定CRISPR-Cas12a的最适反应时间为10min。

实施例3：性能评价

(1)灵敏度试验

以ZIKV假病毒标准品2.0×10³copies/mL、1.0×10³copies/mL、5.0×10²copies/mL)和250×10²copies/mL及阴性对照为待测标本，每个浓度样本及阴性对照均10次重复，采用构建的RPA/CRISPR-Cas12a方法进行检测，确定检测敏感性。

实验结果表明，当ZIKV假病毒浓度为250copies/mL时，10次重复检测仅3次结果为阳性，阳性率30％(3/10)；当ZIKV假病毒浓度不低于500copies/mL时，检测结果均为阳性，检出率100％(10/10)(见附图7)。因此，本研究构建的RT-RIA/CRISPR-Cas12a荧光检测体系对ZIKV的检测灵敏度为500copies/mL，即1.5copies/反应(3μLRT-RIA产物作为模板)。

(2)特异性试验

对寨卡病毒核酸、登革病毒(I～IV型)和黄热病毒减毒灭活疫苗、丙型肝炎病毒血清以及乙型脑炎病毒、副流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒A组、腺病毒7型、麻疹病毒、风疹病毒、流行性腮腺炎病毒、甲型流感病毒H1N1、乙型流感病毒Yamagata、肺炎支原体、肺炎衣原体阳性咽拭子标本进行核酸提取，使用本研究构建的RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测体系进行特异性试验。

ZIKV核酸扩增结果为阳性；登革病毒(I～IV型)和黄热病毒灭活减毒疫苗内标扩增结果均为阴性；其他咽拭子样本内标扩增结果均为阳性，ZIKV检测结果均为阴性，无非特异性扩增(见附图8)，表明反应体系特异性好。

(3)重复性试验

分别将ZIKV的高浓度假病毒标准品(1.0×10⁶copies/mL)和低浓度假病毒标准品(1.0×10³copies/mL)及阴性对照为标本进行重复性检测，每个浓度10次平行。统计log荧光强度响应值的变异系数。

ZIKV病毒对高浓度(1.0×10⁶copies/mL)和低浓度(1.0×10³copies/mL)的假病毒标准品检测结果均为阳性，原始荧光强度变异系数分别为4.77％和2.48％，原始荧光强度Log₁₀(RF)值的变异系数分别为0.51％和0.27％，变异系数均在5％以内(见下表2)，说明本研究构建的RT-RIA/CRISPR-Cas12a荧光检测体系重复性好。

表2重复性检测结果

Table 2 Results of reproducibility

(4)血清模拟比对试验

在健康人血清中添加ZIKV假病毒，使其终浓度分别为1.0×10⁵copies/mL、1.0×10⁴copies/mL、1.0×10³copies/mL、5.0×10²copies/mL、250×10²copies/mL和1份不添加的对照血清，每个处理3次重复，采用构建的ZIKV RPA/CRISPR-Cas12a检测方法和ZIKV RT-qPCR检测方法分别对上述提取的核酸进行检测，比较二者检测灵敏度差异。

血清学模拟试验结果表明RT-RIA/CRISPR-Cas12a对血清中ZIKV的检测灵敏度高，当血清中添加假病毒浓度低至250copies/mL时，RT-qPCR检测结果均为阴性，RT-RIA/CRISPR-Cas12a可以检测出阳性信号；在血清中添加ZIKV假病毒终浓度至500copies/mL以上时，RT-RIA/CRISPR-Cas12a与RT-qPCR方法均能稳定检出阳性结果(见附图9)。说明本研究构建的ZIKV RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测体系对血清中ZIKV的检测灵敏度为500copies/mL。

(5)临床样本测试

用本研究构建的ZIKV RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测体系对过往检测的100例咽拭子样本进行检测，并将检测结果与过往实时荧光PCR检测试剂盒检测结果进行统计分析，比较二者的阳性、阴性和总体符合率。

对过往检测留存的100例咽拭子标本提取核酸后用本项目构建的ZIKV RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测体系进行检测，仅检测出1例寨卡病毒阳性样本，其阳性符合率，阴性符合率和总符合率均为100％，表明本检测体系对临床样本检测结果可靠。

序列表

<110> 南通海关综合技术中心（江苏国际旅行卫生保健中心南通分中心、南通海关口岸门诊部）

<120> 亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒及其检测方法

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgagggaga gttcaagctt aggacggagc aa 32

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tggatcagca agcaggagta tgacgagtcc gg 32

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggatcagca agcaggagta tgacgagtcc gg 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catcttgttt tctgcgcaag ttaggttttg tc 32

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taatttctac taagtgtaga tgacctttgt ggaactcatg aaaagaggag atctt 55

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taatttctac taagtgtaga tcggtggacg atggaggggc cgg 43

<210> 7

<211> 5

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

<210> 7

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttaatt 6

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cattgaggga gagttcaagc ttaggac 27

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gatgcgacct gataggccag ccaaacag 28

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttgagggaga gttcaagctt aggacggagc aa 32

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gagatgcgac ctgataggcc agccaaacag ga 32

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aagtagcagc cattgaggga gagttcaagc ttaggacg 38

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gatgcgacct gataggccag ccaaacagga agatct 36

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agcagccatt gagggagagt tcaagcttag gacggagcaa agga 44

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccggcagatg cgacctgata ggccagccaa acaggaagat ctcc 44

<210> 17

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

taatttctac taagtgtaga tgacctttgt ggaactcatg aaaagaggag atctt 55

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgtggatcag caagcaggag tatgacga 28

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

caggcagcag taggggaact tctcctg 27

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tggatcagca agcaggagta tgacgagtcc gg 32

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

catcttgttt tctgcgcaag ttaggttttg tc 32

<210> 22

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atcagcaagc aggagtatga cgagtccggc ccctcca 37

<210> 23

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tgccaatctc atcttgtttt ctgcgcaagt taggttt 37

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gatgtggatc agcaagcagg agtatgacga gtccggcccc 40

<210> 25

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aagccatgcc aatctcatct tgttttctgc gcaagttagg t 41

<210> 26

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

taatttctac taagtgtaga tcggtggacg atggaggggc cgg 43

Claims

1.一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒，包括用于亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测的引物和探针序列，所述的引物和探针序列包括寨卡病毒ZIKV和内参基因β-actin基因的RIA引物序列、Cas12a反应crRNA序列和荧光报告探针序列，其特征在于：

ZIKV RIA引物的核苷酸序列如下所示：

引物ZIKV-F：

5’-TTGAGGGAGAGTTCAAGCTTAGGACGGAGCAA-3’，(SEQ ID NO：1)；

引物ZIKV-R：

5’-GAGATGCGACCTGATAGGCCAGCCAAACAGGA-3’，(SEQ ID NO：2)；

引物β-actin-F：

5’-TGGATCAGCAAGCAGGAGTATGACGAGTCCGG-3’，(SEQ ID NO：3)；

引物β-actin-R：

5’-CATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGGTTTTGTC-3’，(SEQ ID NO：4)；

ZIKV-crRNA：

5’-TAATTTCTACTAAGTGTAGATgacctttgtggaactcatgaaaagaggagatctt-3’，(SEQ ID NO：5)；

β-actin-crRNA：

5’-TAATTTCTACTAAGTGTAGATcggtggacgatggaggggccgg-3’，(SEQ ID NO：6)；

荧光报告探针核苷酸序列如下所示：

ZIKV-P：

5’-TTATT-3’，(SEQ ID NO：7)；

β-actin-P：

5’-TTAATT-3’，(SEQ ID NO：8)；

所述的试剂盒还包括：

(1)RIA反应试剂组分；

(2)Cas12a反应试剂组分；

(3)样本释放剂；

所述的RIA反应试剂组分包括RIA Buffer、RIA酶和RIA激活剂；

所述的Cas12a反应试剂组分包括Cas Buffer和Cas12a酶。

2.根据权利要求1所述的一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒，其特征在于：ZIKV和β-actin基因荧光报告探针序列的5’端分别标记FAM和VIC荧光素，ZIKV和β-actin基因荧光报告探针序列3’端均标记BHQ1淬灭基团。

3.根据权利要求1所述的一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒，其特征在于，RIA反应体系中，ZIKV和β-actin基因引物终浓度为400nmol/L；Cas12a反应体系中crRNA浓度为70nmol/L，荧光报告探针浓度为500nmol/L。

4.根据权利要求1所述的一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒，其特征在于：RIA反应和Cas12a反应条件相同，均为42℃下进行反应，其中，RIA反应时间15min，Cas12a反应时间10min。

5.根据权利要求1所述的一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒，其特征在于：所述的RIA激活剂为MgOAc；所述的RIA酶包括反转录酶、RNA酶抑制剂、结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶；所述的Cas12a酶为LbCas12a。

6.根据权利要求5所述的一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒，其特征在于：RIA反应体系中RIA激活剂MgOAc的终浓度为14mmol/L；Cas12a反应体系中LbCas12a酶浓度为1μM。

7.根据权利要求1所述的一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒，其特征在于：所述的RIA Buffer中包括核酸释放剂、金属螯合剂、缓冲剂、表面活性剂、核酸稳定剂、细胞膜通透剂和核酸酶抑制剂；所述的核酸释放剂为月桂酰肌胺酸钠、缓冲液为Tris-HCl、金属螯合剂为EDTA、表面活性剂为Triton X-100、细胞膜通透剂为DMSO，核酸稳定剂为DTT，核酸酶抑制剂为DEPC水。

8.根据权利要求7所述的一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒，其特征在于：所述的RIA Buffer中包括月桂酰肌胺酸钠浓度为70mM～170mM，Tris-HCl浓度为50mM，EDTA浓度为20mM～50mM，Triton X-100浓度为30mM～75mM，DMSO浓度为1.2M～3.6M，DTT浓度为5mM～10mM。

9.一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测方法，其特征在于，采用权利要求1-8中任意一项所述的试剂盒，包括以下步骤：

(1)配制RIA反应体系和Cas12a反应体系；

(2)RIA反应；

(3)Cas12a反应；

(4)结果判定。

10.根据权利要求9所述的一种亚洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)试剂的配置

(2)荧光检测

(3)结果分析