CN111057798A - 一种检测新型冠状病毒的lamp引物组合和试剂盒 - Google Patents

一种检测新型冠状病毒的lamp引物组合和试剂盒 Download PDF

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CN111057798A CN202010067653.7A CN202010067653A CN111057798A CN 111057798 A CN111057798 A CN 111057798A CN 202010067653 A CN202010067653 A CN 202010067653A CN 111057798 A CN111057798 A CN 111057798A
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邢志芳
关明
曹国君
康志华
许笑
吴之源
马艳春
秦欢欢
许育
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Huashan Hospital of Fudan University
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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Abstract

本发明公开了一种检测新型冠状病毒的LAMP引物组合和试剂盒，该引物组合选自如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:6所示的引物组1、如SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:10所示的引物组2、如SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:14所示的引物组3、如SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:18所示的引物组4、如SEQ ID NO:19～SEQ ID NO:22所示的引物组5、如SEQ ID NO:24～SEQ ID NO:27所示的引物组6、如SEQ ID NO:28～SEQ ID NO:31所示的引物组7、如SEQ ID NO:32～SEQ ID NO:35所示的引物组8中的任一种或几种。本发明将上述引物组合与LAMP技术结合，不但可以通过肉眼观察到检测结果，无需复杂的辅助设备，简单易用，而且可通过荧光染料法实现检测结果半定量，检测灵敏度高，为该新型冠状病毒相关疾病的诊断以及治疗药物的研究提供了便利而快速的手段。

Description

一种检测新型冠状病毒的LAMP引物组合和试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒检测领域，尤其涉及一种检测新型冠状病毒的LAMP引物组合和试剂盒。
背景技术
此新型冠状病毒基因序列信息已经公布(GenBank，MN908947)，如SEQ ID NO:1所示，为其诊断工具的的开发奠定了前期基础。
环介导恒温扩增(LAMP)根据链置换DNA聚合酶的扩增特性以及特异性引物(针对靶序列6个区域设计的4条特异性引物)，利用链置换DNA聚合酶保证引物在等温条件下顺利与模板结合并进行扩增反应，与聚合酶链式反应有等同的特异性和灵敏度，可实现在恒温条件下的连续快速扩增，同时还可添加环引物，提高扩增效率。
因此，将LAMP技术应用于此新型冠状病毒的检测，可准确高效地对相关疾病进行诊断，也便于对该新型冠状病毒的研究。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种检测新型冠状病毒的LAMP引物组合和试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个方面是提供一种检测新型冠状病毒的LAMP引物组合，选自如SEQID NO:3～SEQ ID NO:6所示的引物组1、如SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:10所示的引物组2、如SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:14所示的引物组3、如SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:18所示的引物组4、如SEQ ID NO:19～SEQ ID NO:22所示的引物组5、如SEQ ID NO:24～SEQ ID NO:27所示的引物组6、如SEQ ID NO:28～SEQ ID NO:31所示的引物组7、如SEQ ID NO:32～SEQID NO:35所示的引物组8中的任一种或几种。
本发明的第二方面是一种检测新型冠状病毒的LAMP试剂盒，包括上述LAMP引物组合。
进一步地，引物的浓度为80-110μM。
进一步地，引物的浓度为100μM。
进一步地，上述LAMP试剂盒还包括反应缓冲液、BSst DNA聚合酶、SYBR/中性红染料、DNA模板和双蒸水。
进一步地，反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Tween-20。
本发明的第三方面提供了利用上述试剂盒检测该新型冠状病毒的方法，包括如下步骤：
步骤1，提取纯化待测样品的DNA；
步骤2，配制LAMP反应体系，进行环介导等温扩增反应；
步骤3，结果判断。
进一步地，步骤2中的反应体系的体积为30μL，包括如下体积的试剂：反应缓冲液20μL、引物各0.05μL、BSst DNA聚合酶1μL、SYBR/中性红染料1μL、DNA模板4μL、余量为双蒸水。
进一步地，环介导等温扩增反应的条件为55～70℃，30～60min。
进一步优选地，环介导等温扩增反应的条件为63～68℃，60min。
进一步更优选地，环介导等温扩增反应的条件为65℃，60min。
进一步地，环介导等温扩增反应所采用的设备为普通PCR仪、实时PCR仪或恒温金属浴。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供的一种检测新型冠状病毒的LAMP引物组合是针对该新型冠状病毒2019-nCoV的两段靶片段而设计的，特异性强。本发明还提供的一种检测新型冠状病毒的LAMP试剂盒将上述引物组合与LAMP技术结合，不但可以通过肉眼观察到检测结果，无需复杂的辅助设备，简单易用，而且可通过荧光染料法实现检测结果半定量，检测灵敏度高，为该新型冠状病毒相关疾病的诊断以及治疗药物的研究提供了便利而快速的手段。
附图说明
图1为本发明一实施例中的目视染料法检测新型冠状病毒2019-nCoV的结果；
图2为本发明一实施例中的荧光染料法检测新型冠状病毒2019-nCoV的扩增曲线(从左到右依次为A、B、C、D、E样品的扩增曲线)。
具体实施方式
本发明提供了一种检测新型冠状病毒的LAMP引物组合和试剂盒。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1
一种检测新型冠状病毒的LAMP引物组合，选自如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:6所示的引物组1、如SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:10所示的引物组2、如SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:14所示的引物组3、如SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:18所示的引物组4、如SEQ ID NO:19～SEQID NO:22所示的引物组5、如SEQ ID NO:24～SEQ ID NO:27所示的引物组6、如SEQ ID NO:28～SEQ ID NO:31所示的引物组7、如SEQ ID NO:32～SEQ ID NO:35所示的引物组8中的任一种或几种。
上述引物组1-5是针对该新型冠状病毒2019-nCoV靶序列片段[22713-22361]而设计的，其片段序列信息如SEQ ID NO:2所示。
上述引物组6-8是针对该新型冠状病毒2019-nCoV靶序列片段[30001-30473]而设计的，其片段序列信息如SEQ ID NO:23所示。
实施例2
一种检测新型冠状病毒的LAMP试剂盒，包括如实施例1所述的LAMP引物组合，引物的浓度为100μM。
该检测新型冠状病毒的LAMP试剂盒还包括反应缓冲液、BSst DNA聚合酶、SYBR/中性红染料、DNA模板和双蒸水；其中，反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Tween-20。
实施例3
利用实施例2的LAMP试剂盒诊断该新型冠状病毒的方法，包括如下步骤：
步骤1，提取纯化待测样品的DNA；
步骤2，配制LAMP反应体系(如表1所示)，在65℃的恒温金属浴进行环介导等温扩增反应60min；
步骤3，结果判断：根据颜色或者扩增曲线。
表1 30μL LAMP反应体系的配制
Figure BDA0002376436680000041
验证实施例
本验证实施例验证采用实施例1中的引物组或实施例2中的试剂盒检测该新型冠状病毒的效果，包括如下内容：
1.扩增样本的情况
1)梯度浓度的新型冠状病毒质粒模拟样本，具体浓度为A：107copies/ml的模拟样本，B：106copies/ml的模拟样本，C：105copies/ml的模拟样本，D：104copies/ml的模拟样本，E：103copies/ml的模拟样本。
2)其他类型的样本：F：人的基因组DNA样本，G：SARS质粒模拟样本，H：阴性对照样本。
2.按照实施例3的方法的步骤对该新型冠状病毒进行检测，结果如图1和图2所示；其中，当采用实时荧光曲线法时，反应体系选用SYBR；当采用目视法时，反应体系选用的是中性红染料。
由图1和图2可知，目视然染料法与荧光曲线法的结果一致，A、B、C、D、E为阳性，检测灵敏度可达到103copies/ml。
综上所述，本发明提供一种检测新型冠状病毒的LAMP引物组合和试剂盒检测灵敏，特异性强。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 复旦大学附属华山医院
<120> 一种用于新型冠状病毒快速检测的LAMP试剂盒
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30473
<212> DNA
<213> 2019-nCoV的基因序列
<400> 1
cggtgacgca tacaaaacat tcccaccata ccttcccagg taacaaacca accaactttc 60
gatctcttgt agatctgttc tctaaacgaa ctttaaaatc tgtgtggctg tcactcggct 120
gcatgcttag tgcactcacg cagtataatt aataactaat tactgtcgtt gacaggacac 180
gagtaactcg tctatcttct gcaggctgct tacggtttcg tccgtgttgc agccgatcat 240
cagcacatct aggtttcgtc cgggtgtgac cgaaaggtaa gatggagagc cttgtccctg 300
gtttcaacga gaaaacacac gtccaactca gtttgcctgt tttacaggtt cgcgacgtgc 360
tcgtacgtgg ctttggagac tccgtggagg aggtcttatc agaggcacgt caacatctta 420
aagatggcac ttgtggctta gtagaagttg aaaaaggcgt tttgcctcaa cttgaacagc 480
cctatgtgtt catcaaacgt tcggatgctc gaactgcacc tcatggtcat gttatggttg 540
agctggtagc agaactcgaa ggcattcagt acggtcgtag tggtgagaca cttggtgtcc 600
ttgtccctca tgtgggcgaa ataccagtgg cttaccgcaa ggttcttctt cgtaagaacg 660
gtaataaagg agctggtggc catagttacg gcgccgatct aaagtcattt gacttaggcg 720
acgagcttgg cactgatcct tatgaagatt ttcaagaaaa ctggaacact aaacatagca 780
gtggtgttac ccgtgaactc atgcgtgagc ttaacggagg ggcatacact cgctatgtcg 840
ataacaactt ctgtggccct gatggctacc ctcttgagtg cattaaagac cttctagcac 900
gtgctggtaa agcttcatgc actttgtccg aacaactgga ctttattgac actaagaggg 960
gtgtatactg ctgccgtgaa catgagcatg aaattgcttg gtacacggaa cgttctgaaa 1020
agagctatga attgcagaca ccttttgaaa ttaaattggc aaagaaattt gacaccttca 1080
atggggaatg tccaaatttt gtatttccct taaattccat aatcaagact attcaaccaa 1140
gggttgaaaa gaaaaagctt gatggcttta tgggtagaat tcgatctgtc tatccagttg 1200
cgtcaccaaa tgaatgcaac caaatgtgcc tttcaactct catgaagtgt gatcattgtg 1260
gtgaaacttc atggcagacg ggcgattttg ttaaagccac ttgcgaattt tgtggcactg 1320
agaatttgac taaagaaggt gccactactt gtggttactt accccaaaat gctgttgtta 1380
aaatttattg tccagcatgt cacaattcag aagtaggacc tgagcatagt cttgccgaat 1440
accataatga atctggcttg aaaaccattc ttcgtaaggg tggtcgcact attgcctttg 1500
gaggctgtgt gttctcttat gttggttgcc ataacaagtg tgcctattgg gttccacgtg 1560
ctagcgctaa cataggttgt aaccatacag gtgttgttgg agaaggttcc gaaggtctta 1620
atgacaacct tcttgaaata ctccaaaaag agaaagtcaa catcaatatt gttggtgact 1680
ttaaacttaa tgaagagatc gccattattt tggcatcttt ttctgcttcc acaagtgctt 1740
ttgtggaaac tgtgaaaggt ttggattata aagcattcaa acaaattgtt gaatcctgtg 1800
gtaattttaa agttacaaaa ggaaaagcta aaaaaggtgc ctggaatatt ggtgaacaga 1860
aatcaatact gagtcctctt tatgcatttg catcagaggc tgctcgtgtt gtacgatcaa 1920
ttttctcccg cactcttgaa actgctcaaa attctgtgcg tgttttacag aaggccgcta 1980
taacaatact agatggaatt tcacagtatt cactgagact cattgatgct atgatgttca 2040
catctgattt ggctactaac aatctagttg taatggccta cattacaggt ggtgttgttc 2100
agttgacttc gcagtggcta actaacatct ttggcactgt ttatgaaaaa ctcaaacccg 2160
tccttgattg gcttgaagag aagtttaagg aaggtgtaga gtttcttaga gacggttggg 2220
aaattgttaa atttatctca acctgtgctt gtgaaattgt cggtggacaa attgtcacct 2280
gtgcaaagga aattaaggag agtgttcaga cattctttaa gcttgtaaat aaatttttgg 2340
ctttgtgtgc tgactctatc attattggtg gagctaaact taaagccttg aatttaggtg 2400
aaacatttgt cacgcactca aagggattgt acagaaagtg tgttaaatcc agagaagaaa 2460
ctggcctact catgcctcta aaagccccaa aagaaattat cttcttagag ggagaaacac 2520
ttcccacaga agtgttaaca gaggaagttg tcttgaaaac tggtgattta caaccattag 2580
aacaacctac tagtgaagct gttgaagctc cattggttgg tacaccagtt tgtattaacg 2640
ggcttatgtt gctcgaaatc aaagacacag aaaagtactg tgcccttgca cctaatatga 2700
tggtaacaaa caataccttc acactcaaag gcggtgcacc aacaaaggtt acttttggtg 2760
atgacactgt gatagaagtg caaggttaca agagtgtgaa tatcactttt gaacttgatg 2820
aaaggattga taaagtactt aatgagaagt gctctgccta tacagttgaa ctcggtacag 2880
aagtaaatga gttcgcctgt gttgtggcag atgctgtcat aaaaactttg caaccagtat 2940
ctgaattact tacaccactg ggcattgatt tagatgagtg gagtatggct acatactact 3000
tatttgatga gtctggtgag tttaaattgg cttcacatat gtattgttct ttctaccctc 3060
cagatgagga tgaagaagaa ggtgattgtg aagaagaaga gtttgagcca tcaactcaat 3120
atgagtatgg tactgaagat gattaccaag gtaaaccttt ggaatttggt gccacttctg 3180
ctgctcttca acctgaagaa gagcaagaag aagattggtt agatgatgat agtcaacaaa 3240
ctgttggtca acaagacggc agtgaggaca atcagacaac tactattcaa acaattgttg 3300
aggttcaacc tcaattagag atggaactta caccagttgt tcagactatt gaagtgaata 3360
gttttagtgg ttatttaaaa cttactgaca atgtatacat taaaaatgca gacattgtgg 3420
aagaagctaa aaaggtaaaa ccaacagtgg ttgttaatgc agccaatgtt taccttaaac 3480
atggaggagg tgttgcagga gccttaaata aggctactaa caatgccatg caagttgaat 3540
ctgatgatta catagctact aatggaccac ttaaagtggg tggtagttgt gttttaagcg 3600
gacacaatct tgctaaacac tgtcttcatg ttgtcggccc aaatgttaac aaaggtgaag 3660
acattcaact tcttaagagt gcttatgaaa attttaatca gcacgaagtt ctacttgcac 3720
cattattatc agctggtatt tttggtgctg accctataca ttctttaaga gtttgtgtag 3780
atactgttcg cacaaatgtc tacttagctg tctttgataa aaatctctat gacaaacttg 3840
tttcaagctt tttggaaatg aagagtgaaa agcaagttga acaaaagatc gctgagattc 3900
ctaaagagga agttaagcca tttataactg aaagtaaacc ttcagttgaa cagagaaaac 3960
aagatgataa gaaaatcaaa gcttgtgttg aagaagttac aacaactctg gaagaaacta 4020
agttcctcac agaaaacttg ttactttata ttgacattaa tggcaatctt catccagatt 4080
ctgccactct tgttagtgac attgacatca ctttcttaaa gaaagatgct ccatatatag 4140
tgggtgatgt tgttcaagag ggtgttttaa ctgctgtggt tatacctact aaaaaggctg 4200
gtggcactac tgaaatgcta gcgaaagctt tgagaaaagt gccaacagac aattatataa 4260
ccacttaccc gggtcagggt ttaaatggtt acactgtaga ggaggcaaag acagtgctta 4320
aaaagtgtaa aagtgccttt tacattctac catctattat ctctaatgag aagcaagaaa 4380
ttcttggaac tgtttcttgg aatttgcgag aaatgcttgc acatgcagaa gaaacacgca 4440
aattaatgcc tgtctgtgtg gaaactaaag ccatagtttc aactatacag cgtaaatata 4500
agggtattaa aatacaagag ggtgtggttg attatggtgc tagattttac ttttacacca 4560
gtaaaacaac tgtagcgtca cttatcaaca cacttaacga tctaaatgaa actcttgtta 4620
caatgccact tggctatgta acacatggct taaatttgga agaagctgct cggtatatga 4680
gatctctcaa agtgccagct acagtttctg tttcttcacc tgatgctgtt acagcgtata 4740
atggttatct tacttcttct tctaaaacac ctgaagaaca ttttattgaa accatctcac 4800
ttgctggttc ctataaagat tggtcctatt ctggacaatc tacacaacta ggtatagaat 4860
ttcttaagag aggtgataaa agtgtatatt acactagtaa tcctaccaca ttccacctag 4920
atggtgaagt tatcaccttt gacaatctta agacacttct ttctttgaga gaagtgagga 4980
ctattaaggt gtttacaaca gtagacaaca ttaacctcca cacgcaagtt gtggacatgt 5040
caatgacata tggacaacag tttggtccaa cttatttgga tggagctgat gttactaaaa 5100
taaaacctca taattcacat gaaggtaaaa cattttatgt tttacctaat gatgacactc 5160
tacgtgttga ggcttttgag tactaccaca caactgatcc tagttttctg ggtaggtaca 5220
tgtcagcatt aaatcacact aaaaagtgga aatacccaca agttaatggt ttaacttcta 5280
ttaaatgggc agataacaac tgttatcttg ccactgcatt gttaacactc caacaaatag 5340
agttgaagtt taatccacct gctctacaag atgcttatta cagagcaagg gctggtgaag 5400
ctgctaactt ttgtgcactt atcttagcct actgtaataa gacagtaggt gagttaggtg 5460
atgttagaga aacaatgagt tacttgtttc aacatgccaa tttagattct tgcaaaagag 5520
tcttgaacgt ggtgtgtaaa acttgtggac aacagcagac aacccttaag ggtgtagaag 5580
ctgttatgta catgggcaca ctttcttatg aacaatttaa gaaaggtgtt cagatacctt 5640
gtacgtgtgg taaacaagct acaaaatatc tagtacaaca ggagtcacct tttgttatga 5700
tgtcagcacc acctgctcag tatgaactta agcatggtac atttacttgt gctagtgagt 5760
acactggtaa ttaccagtgt ggtcactata aacatataac ttctaaagaa actttgtatt 5820
gcatagacgg tgctttactt acaaagtcct cagaatacaa aggtcctatt acggatgttt 5880
tctacaaaga aaacagttac acaacaacca taaaaccagt tacttataaa ttggatggtg 5940
ttgtttgtac agaaattgac cctaagttgg acaattatta taagaaagac aattcttatt 6000
tcacagagca accaattgat cttgtaccaa accaaccata tccaaacgca agcttcgata 6060
attttaagtt tgtatgtgat aatatcaaat ttgctgatga tttaaaccag ttaactggtt 6120
ataagaaacc tgcttcaaga gagcttaaag ttacattttt ccctgactta aatggtgatg 6180
tggtggctat tgattataaa cactacacac cctcttttaa gaaaggagct aaattgttac 6240
ataaacctat tgtttggcat gttaacaatg caactaataa agccacgtat aaaccaaata 6300
cctggtgtat acgttgtctt tggagcacaa aaccagttga aacatcaaat tcgtttgatg 6360
tactgaagtc agaggacgcg cagggaatgg ataatcttgc ctgcgaagat ctaaaaccag 6420
tctctgaaga agtagtggaa aatcctacca tacagaaaga cgttcttgag tgtaatgtga 6480
aaactaccga agttgtagga gacattatac ttaaaccagc aaataatagt ttaaaaatta 6540
cagaagaggt tggccacaca gatctaatgg ctgcttatgt agacaattct agtcttacta 6600
ttaagaaacc taatgaatta tctagagtat taggtttgaa aacccttgct actcatggtt 6660
tagctgctgt taatagtgtc ccttgggata ctatagctaa ttatgctaag ccttttctta 6720
acaaagttgt tagtacaact actaacatag ttacacggtg tttaaaccgt gtttgtacta 6780
attatatgcc ttatttcttt actttattgc tacaattgtg tacttttact agaagtacaa 6840
attctagaat taaagcatct atgccgacta ctatagcaaa gaatactgtt aagagtgtcg 6900
gtaaattttg tctagaggct tcatttaatt atttgaagtc acctaatttt tctaaactga 6960
taaatattat aatttggttt ttactattaa gtgtttgcct aggttcttta atctactcaa 7020
ccgctgcttt aggtgtttta atgtctaatt taggcatgcc ttcttactgt actggttaca 7080
gagaaggcta tttgaactct actaatgtca ctattgcaac ctactgtact ggttctatac 7140
cttgtagtgt ttgtcttagt ggtttagatt ctttagacac ctatccttct ttagaaacta 7200
tacaaattac catttcatct tttaaatggg atttaactgc ttttggctta gttgcagagt 7260
ggtttttggc atatattctt ttcactaggt ttttctatgt acttggattg gctgcaatca 7320
tgcaattgtt tttcagctat tttgcagtac attttattag taattcttgg cttatgtggt 7380
taataattaa tcttgtacaa atggccccga tttcagctat ggttagaatg tacatcttct 7440
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ttaatggtgt tagaaggtcc ttttatgtct atgctaatgg aggtaaaggc ttttgcaaac 7620
tacacaattg gaattgtgtt aattgtgata cattctgtgc tggtagtaca tttattagtg 7680
atgaagttgc gagagacttg tcactacagt ttaaaagacc aataaatcct actgaccagt 7740
cttcttacat cgttgatagt gttacagtga agaatggttc catccatctt tactttgata 7800
aagctggtca aaagacttat gaaagacatt ctctctctca ttttgttaac ttagacaacc 7860
tgagagctaa taacactaaa ggttcattgc ctattaatgt tatagttttt gatggtaaat 7920
caaaatgtga agaatcatct gcaaaatcag cgtctgttta ctacagtcag cttatgtgtc 7980
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tacattcaac tcaggacttg ttcttacctt tcttttccaa tgttacttgg ttccatgcta 21780
tacatgtctc tgggaccaat ggtactaaga ggtttgataa ccctgtccta ccatttaatg 21840
atggtgttta ttttgcttcc actgagaagt ctaacataat aagaggctgg atttttggta 21900
ctactttaga ttcgaagacc cagtccctac ttattgttaa taacgctact aatgttgtta 21960
ttaaagtctg tgaatttcaa ttttgtaatg atccattttt gggtgtttat taccacaaaa 22020
acaacaaaag ttggatggaa agtgagttca gagtttattc tagtgcgaat aattgcactt 22080
ttgaatatgt ctctcagcct tttcttatgg accttgaagg aaaacagggt aatttcaaaa 22140
atcttaggga atttgtgttt aagaatattg atggttattt taaaatatat tctaagcaca 22200
cgcctattaa tttagtgcgt gatctccctc agggtttttc ggctttagaa ccattggtag 22260
atttgccaat aggtattaac atcactaggt ttcaaacttt acttgcttta catagaagtt 22320
atttgactcc tggtgattct tcttcaggtt ggacagctgg tgctgcagct tattatgtgg 22380
gttatcttca acctaggact tttctattaa aatataatga aaatggaacc attacagatg 22440
ctgtagactg tgcacttgac cctctctcag aaacaaagtg tacgttgaaa tccttcactg 22500
tagaaaaagg aatctatcaa acttctaact ttagagtcca accaacagaa tctattgtta 22560
gatttcctaa tattacaaac ttgtgccctt ttggtgaagt ttttaacgcc accagatttg 22620
catctgttta tgcttggaac aggaagagaa tcagcaactg tgttgctgat tattctgtcc 22680
tatataattc cgcatcattt tccactttta agtgttatgg agtgtctcct actaaattaa 22740
atgatctctg ctttactaat gtctatgcag attcatttgt aattagaggt gatgaagtca 22800
gacaaatcgc tccagggcaa actggaaaga ttgctgatta taattataaa ttaccagatg 22860
attttacagg ctgcgttata gcttggaatt ctaacaatct tgattctaag gttggtggta 22920
attataatta cctgtataga ttgtttagga agtctaatct caaacctttt gagagagata 22980
tttcaactga aatctatcag gccggtagca caccttgtaa tggtgttgaa ggttttaatt 23040
gttactttcc tttacaatca tatggtttcc aacccactaa tggtgttggt taccaaccat 23100
acagagtagt agtactttct tttgaacttc tacatgcacc agcaactgtt tgtggaccta 23160
aaaagtctac taatttggtt aaaaacaaat gtgtcaattt caacttcaat ggtttaacag 23220
gcacaggtgt tcttactgag tctaacaaaa agtttctgcc tttccaacaa tttggcagag 23280
acattgctga cactactgat gctgtccgtg atccacagac acttgagatt cttgacatta 23340
caccatgttc ttttggtggt gtcagtgtta taacaccagg aacaaatact tctaaccagg 23400
ttgctgttct ttatcaggat gttaactgca cagaagtccc tgttgctatt catgcagatc 23460
aacttactcc tacttggcgt gtttattcta caggttctaa tgtttttcaa acacgtgcag 23520
gctgtttaat aggggctgaa catgtcaaca actcatatga gtgtgacata cccattggtg 23580
caggtatatg cgctagttat cagactcaga ctaattctcc tcggcgggca cgtagtgtag 23640
ctagtcaatc catcattgcc tacactatgt cacttggtgc agaaaattca gttgcttact 23700
ctaataactc tattgccata cccacaaatt ttactattag tgttaccaca gaaattctac 23760
cagtgtctat gaccaagaca tcagtagatt gtacaatgta catttgtggt gattcaactg 23820
aatgcagcaa tcttttgttg caatatggca gtttttgtac acaattaaac cgtgctttaa 23880
ctggaatagc tgttgaacaa gacaaaaaca cccaagaagt ttttgcacaa gtcaaacaaa 23940
tttacaaaac accaccaatt aaagattttg gtggttttaa tttttcacaa atattaccag 24000
atccatcaaa accaagcaag aggtcattta ttgaagatct acttttcaac aaagtgacac 24060
ttgcagatgc tggcttcatc aaacaatatg gtgattgcct tggtgatatt gctgctagag 24120
acctcatttg tgcacaaaag tttaacggcc ttactgtttt gccacctttg ctcacagatg 24180
aaatgattgc tcaatacact tctgcactgt tagcgggtac aatcacttct ggttggacct 24240
ttggtgcagg tgctgcatta caaataccat ttgctatgca aatggcttat aggtttaatg 24300
gtattggagt tacacagaat gttctctatg agaaccaaaa attgattgcc aaccaattta 24360
atagtgctat tggcaaaatt caagactcac tttcttccac agcaagtgca cttggaaaac 24420
ttcaagatgt ggtcaaccaa aatgcacaag ctttaaacac gcttgttaaa caacttagct 24480
ccaattttgg tgcaatttca agtgttttaa atgatatcct ttcacgtctt gacaaagttg 24540
aggctgaagt gcaaattgat aggttgatca caggcagact tcaaagtttg cagacatatg 24600
tgactcaaca attaattaga gctgcagaaa tcagagcttc tgctaatctt gctgctacta 24660
aaatgtcaga gtgtgtactt ggacaatcaa aaagagttga tttttgtgga aagggctatc 24720
atcttatgtc cttccctcag tcagcacctc atggtgtagt cttcttgcat gtgacttatg 24780
tccctgcaca agaaaagaac ttcacaactg ctcctgccat ttgtcatgat ggaaaagcac 24840
actttcctcg tgaaggtgtc tttgtttcaa atggcacaca ctggtttgta acacaaagga 24900
atttttatga accacaaatc attactacag acaacacatt tgtgtctggt aactgtgatg 24960
ttgtaatagg aattgtcaac aacacagttt atgatccttt gcaacctgaa ttagactcat 25020
tcaaggagga gttagataaa tattttaaga atcatacatc accagatgtt gatttaggtg 25080
acatctctgg cattaatgct tcagttgtaa acattcaaaa agaaattgac cgcctcaatg 25140
aggttgccaa gaatttaaat gaatctctca tcgatctcca agaacttgga aagtatgagc 25200
agtatataaa atggccatgg tacatttggc taggttttat agctggcttg attgccatag 25260
taatggtgac aattatgctt tgctgtatga ccagttgctg tagttgtctc aagggctgtt 25320
gttcttgtgg atcctgctgc aaatttgatg aagacgactc tgagccagtg ctcaaaggag 25380
tcaaattaca ttacacataa acgaacttat ggatttgttt atgagaatct tcacaattgg 25440
aactgtaact ttgaagcaag gtgaaatcaa ggatgctact ccttcagatt ttgttcgcgc 25500
tactgcaacg ataccgatac aagcctcact ccctttcgga tggcttattg ttggcgttgc 25560
acttcttgct gtttttcaga gcgcttccaa aatcataacc ctcaaaaaga gatggcaact 25620
agcactctcc aagggtgttc actttgtttg caacttgctg ttgttgtttg taacagttta 25680
ctcacacctt ttgctcgttg ctgctggcct tgaagcccct tttctctatc tttatgcttt 25740
agtctacttc ttgcagagta taaactttgt aagaataata atgaggcttt ggctttgctg 25800
gaaatgccgt tccaaaaacc cattacttta tgatgccaac tattttcttt gctggcatac 25860
taattgttac gactattgta taccttacaa tagtgtaact tcttcaattg tcattacttc 25920
aggtgatggc acaacaagtc ctatttctga acatgactac cagattggtg gttatactga 25980
aaaatgggaa tctggagtaa aagactgtgt tgtattacac agttacttca cttcagacta 26040
ttaccagctg tactcaactc aattgagtac agacactggt gttgaacatg ttaccttctt 26100
catctacaat aaaattgttg atgagcctga agaacatgtc caaattcaca caatcgacgg 26160
ttcatccgga gttgttaatc cagtaatgga accaatttat gatgaaccga cgacgactac 26220
tagcgtgcct ttgtaagcac aagctgatga gtacgaactt atgtactcat tcgtttcgga 26280
agagacaggt acgttaatag ttaatagcgt acttcttttt cttgctttcg tggtattctt 26340
gctagttaca ctagccatcc ttactgcgct tcgattgtgt gcgtactgct gcaatattgt 26400
taacgtgagt cttgtaaaac cttcttttta cgtttactct cgtgttaaaa atctgaattc 26460
ttctagagtt cctgatcttc tggtctaaac gaactaaata ttatattagt ttttctgttt 26520
ggaactttaa ttttagccat ggcagattcc aacggtacta ttaccgttga agagcttaaa 26580
aagctccttg aacaatggaa cctagtaata ggtttcctat tccttacatg gatttgtctt 26640
ctacaatttg cctatgccaa caggaatagg tttttgtata taattaagtt aattttcctc 26700
tggctgttat ggccagtaac tttagcttgt tttgtgcttg ctgctgttta cagaataaat 26760
tggatcaccg gtggaattgc tatcgcaatg gcttgtcttg taggcttgat gtggctcagc 26820
tacttcattg cttctttcag actgtttgcg cgtacgcgtt ccatgtggtc attcaatcca 26880
gaaactaaca ttcttctcaa cgtgccactc catggcacta ttctgaccag accgcttcta 26940
gaaagtgaac tcgtaatcgg agctgtgatc cttcgtggac atcttcgtat tgctggacac 27000
catctaggac gctgtgacat caaggacctg cctaaagaaa tcactgttgc tacatcacga 27060
acgctttctt attacaaatt gggagcttcg cagcgtgtag caggtgactc aggttttgct 27120
gcatacagtc gctacaggat tggcaactat aaattaaaca cagaccattc cagtagcagt 27180
gacaatattg ctttgcttgt acagtaagtg acaacagatg tttcatctcg ttgactttca 27240
ggttactata gcagagatat tactaattat tatgaggact tttaaagttt ccatttggaa 27300
tcttgattac atcataaacc tcataattaa aaatttatct aagtcactaa ctgagaataa 27360
atattctcaa ttagatgaag agcaaccaat ggagattgat taaacgaaca tgaaaattat 27420
tcttttcttg gcactgataa cactcgctac ttgtgagctt tatcactacc aagagtgtgt 27480
tagaggtaca acagtacttt taaaagaacc ttgctcttct ggaacatacg agggcaattc 27540
accatttcat cctctagctg ataacaaatt tgcactgact tgctttagca ctcaatttgc 27600
ttttgcttgt cctgacggcg taaaacacgt ctatcagtta cgtgccagat cagtttcacc 27660
taaactgttc atcagacaag aggaagttca agaactttac tctccaattt ttcttattgt 27720
tgcggcaata gtgtttataa cactttgctt cacactcaaa agaaagacag aatgattgaa 27780
ctttcattaa ttgacttcta tttgtgcttt ttagcctttc tgctattcct tgttttaatt 27840
atgcttatta tcttttggtt ctcacttgaa ctgcaagatc ataatgaaac ttgtcacgcc 27900
taaacgaaca tgaaatttct tgttttctta ggaatcatca caactgtagc tgcatttcac 27960
caagaatgta gtttacagtc atgtactcaa catcaaccat atgtagttga tgacccgtgt 28020
cctattcact tctattctaa atggtatatt agagtaggag ctagaaaatc agcaccttta 28080
attgaattgt gcgtggatga ggctggttct aaatcaccca ttcagtacat cgatatcggt 28140
aattatacag tttcctgttt accttttaca attaattgcc aggaacctaa attgggtagt 28200
cttgtagtgc gttgttcgtt ctatgaagac tttttagagt atcatgacgt tcgtgttgtt 28260
ttagatttca tctaaacgaa caaactaaaa tgtctgataa tggaccccaa aatcagcgaa 28320
atgcaccccg cattacgttt ggtggaccct cagattcaac tggcagtaac cagaatggag 28380
aacgcagtgg ggcgcgatca aaacaacgtc ggccccaagg tttacccaat aatactgcgt 28440
cttggttcac cgctctcact caacatggca aggaagacct taaattccct cgaggacaag 28500
gcgttccaat taacaccaat agcagtccag atgaccaaat tggctactac cgaagagcta 28560
ccagacgaat tcgtggtggt gacggtaaaa tgaaagatct cagtccaaga tggtatttct 28620
actacctagg aactgggcca gaagctggac ttccctatgg tgctaacaaa gacggcatca 28680
tatgggttgc aactgaggga gccttgaata caccaaaaga tcacattggc acccgcaatc 28740
ctgctaacaa tgctgcaatc gtgctacaac ttcctcaagg aacaacattg ccaaaaggct 28800
tctacgcaga agggagcaga ggcggcagtc aagcctcttc tcgttcctca tcacgtagtc 28860
gcaacagttc aagaaattca actccaggca gcagtagggg aacttctcct gctagaatgg 28920
ctggcaatgg cggtgatgct gctcttgctt tgctgctgct tgacagattg aaccagcttg 28980
agagcaaaat gtctggtaaa ggccaacaac aacaaggcca aactgtcact aagaaatctg 29040
ctgctgaggc ttctaagaag cctcggcaaa aacgtactgc cactaaagca tacaatgtaa 29100
cacaagcttt cggcagacgt ggtccagaac aaacccaagg aaattttggg gaccaggaac 29160
taatcagaca aggaactgat tacaaacatt ggccgcaaat tgcacaattt gcccccagcg 29220
cttcagcgtt cttcggaatg tcgcgcattg gcatggaagt cacaccttcg ggaacgtggt 29280
tgacctacac agctgccatc aaattggatg acaaagatcc aaatttcaaa gatcaagtca 29340
ttttgctgaa taagcatatt gacgcataca aaacattccc accaacagag cctaaaaagg 29400
acaaaaagaa gaaggctgat gaaactcaag ccttaccgca gagacagaag aaacagcaaa 29460
ctgtgactct tcttcctgct gcagatttgg atgatttctc caaacaattg caacaatcca 29520
tgagcagtgc tgactcaact caggcctaaa ctcatgcaga ccacacaagg cagatgggct 29580
atataaacgt tttcgctttt ccgtttacga tatatagtct actcttgtgc agaatgaatt 29640
ctcgtaacta catagcacaa gtagatgtag ttaactttaa tctcacatag caatctttaa 29700
tcagtgtgta acattaggga ggacttgaaa gagccaccac attttcaccg aggccacgcg 29760
gagtacgatc gagtgtacag tgaacaatgc tagggagagc tgcctatatg gaagagccct 29820
aatgtgtaaa attaatttta gtagtgctat ccccatgtga ttttaatagc ttcttcctgg 29880
gatcttgatt tcaacagcct cttcctcata ctattctcaa cactactgtc agtgaacttc 29940
taaaaatgga ttctgtgttt gaccgtagga aacatttcag tattccttat ctttagaaac 30000
ctctgcaact caagtgtctc tgccaaagag tcttcaaggt aatgtcaaat accataacat 30060
attttttaag tttttgtata cttcctagga atatatgtca tagtatgtaa agaagatctg 30120
attcatgtga tctgtactgt taagaaacac ttcaaaggaa aacaacctct catagatctt 30180
caaatcctgt tgttcttgag ttggaatgta caatattcag gtagagatgc tggtacaaaa 30240
aaagactgaa tcatcaggct attagaaaga taaactaggc ctctaacata gtaactttaa 30300
cagtttgtac ttatacatat tttcacattg aaatatagtt ttattcatga ctttttttgt 30360
tttagcttct ctgtcttcca ttatttcaag ctgctaaaaa ttaaaaatat cctatagcaa 30420
agggctatgg catctttttg taaaaataag gaaagcaagg ttttttgata atc 30473
<210> 2
<211> 577
<212> DNA
<213> 靶序列片段【22713-22361】
<400> 2
ctcagtttta cattcaactc aggacttgtt cttacctttc ttttccaatg ttacttggtt 60
ccatgctata catgtctctg ggaccaatgg tactaagagg tttgataacc ctgtcctacc 120
atttaatgat ggtgtttatt ttgcttccac tgagaagtct aacataataa gaggctggat 180
ttttggtact actttagatt cgaagaccca gtccctactt attgttaata acgctactaa 240
tgttgttatt aaagtctgtg aatttcaatt ttgtaatgat ccatttttgg gtgtttatta 300
ccacaaaaac aacaaaagtt ggatggaaag tgagttcaga gtttattcta gtgcgaataa 360
ttgcactttt gaatatgtct ctcagccttt tcttatggac cttgaaggaa aacagggtaa 420
tttcaaaaat cttagggaat ttgtgtttaa gaatattgat ggttatttta aaatatattc 480
taagcacacg cctattaatt tagtgcgtga tctccctcag ggtttttcgg ctttagaacc 540
attggtagat ttgccaatag gtattaacat cactagg 577
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 组合1 F3序列
<400> 3
tcaactcagg acttgttctt 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 组合1 B3序列
<400> 4
ggactgggtc ttcgaatc 18
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 组合1 FIP序列
<400> 5
acctcttagt accattggtc ccactttctt ttccaatgtt acttgg 46
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 组合1 BIP序列
<400> 6
cctgtcctac catttaatga tggtaccaaa aatccagcct ct 42
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 组合2 F3序列
<400> 7
caggacttgt tcttaccttt c 21
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 组合2 B3序列
<400> 8
ttattaacaa taagtaggga ctgg 24
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 组合2 FIP序列
<400> 9
aggacagggt tatcaaacct cttagcaatg ttacttggtt ccatgc 46
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 组合2 BIP序列
<400> 10
atgatggtgt ttattttgct tccacaagta gtaccaaaaa tccagc 46
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 组合3 F3序列
<400> 11
ctttcttttc caatgttact tgg 23
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 组合3 B3序列
<400> 12
gactttaata acaacattag tagcg 25
<210> 13
<211> 47
<212> DNA
<213> 组合3 FIP序列
<400> 13
catcattaaa tggtaggaca gggttttcca tgctatacat gtctctg 47
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> 组合3 BIP序列
<400> 14
tgcttccact gagaagtcta acaggactgg gtcttcgaat c 41
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 组合4 F3序列
<400> 15
ccatgctata catgtctctg g 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 组合4 B3序列
<400> 16
aaacacccaa aaatggatca 20
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> 组合4 FIP序列
<400> 17
tggaagcaaa ataaacacca tcattgacca atggtactaa gaggt 45
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> 组合4 BIP序列
<400> 18
actactttag attcgaagac ccagtgactt taataacaac attagtagcg 50
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 组合5 F3序列
<400> 19
gtctctggga ccaatggt 18
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 组合5 B3序列
<400> 20
aaacacccaa aaatggatca 20
<210> 21
<211> 48
<212> DNA
<213> 组合5 FIP序列
<400> 21
ttagacttct cagtggaagc aaaatctaag aggtttgata accctgtc 48
<210> 22
<211> 50
<212> DNA
<213> 组合5 BIP序列
<400> 22
actactttag attcgaagac ccagtgactt taataacaac attagtagcg 50
<210> 23
<211> 473
<212> DNA
<213> 靶片段【30001-30473】
<400> 23
ctctgcaact caagtgtctc tgccaaagag tcttcaaggt aatgtcaaat accataacat 60
attttttaag tttttgtata cttcctagga atatatgtca tagtatgtaa agaagatctg 120
attcatgtga tctgtactgt taagaaacac ttcaaaggaa aacaacctct catagatctt 180
caaatcctgt tgttcttgag ttggaatgta caatattcag gtagagatgc tggtacaaaa 240
aaagactgaa tcatcaggct attagaaaga taaactaggc ctctaacata gtaactttaa 300
cagtttgtac ttatacatat tttcacattg aaatatagtt ttattcatga ctttttttgt 360
tttagcttct ctgtcttcca ttatttcaag ctgctaaaaa ttaaaaatat cctatagcaa 420
agggctatgg catctttttg taaaaataag gaaagcaagg ttttttgata atc 473
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 组合6 F3序列
<400> 24
gtcatagtat gtaaagaaga tctga 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 组合6 B3序列
<400> 25
actgttaaag ttactatgtt agagg 25
<210> 26
<211> 49
<212> DNA
<213> 组合6 FIP序列
<400> 26
ccaactcaag aacaacagga tttgatgtga tctgtactgt taagaaaca 49
<210> 27
<211> 50
<212> DNA
<213> 组合6 BIP序列
<400> 27
acaatattca ggtagagatg ctggtagttt atctttctaa tagcctgatg 50
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 组合7 F3序列
<400> 28
agatctgatt catgtgatct gt 22
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 组合7 B3序列
<400> 29
actgttaaag ttactatgtt agagg 25
<210> 30
<211> 48
<212> DNA
<213> 组合7 FIP序列
<400> 30
ccaactcaag aacaacagga tttgactgtt aagaaacact tcaaagga 48
<210> 31
<211> 50
<212> DNA
<213> 组合7 BIP序列
<400> 31
acaatattca ggtagagatg ctggtgttta tctttctaat agcctgatga 50
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 组合8 F3序列
<400> 32
tgattcatgt gatctgtact gt 22
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 组合8 B3序列
<400> 33
actgttaaag ttactatgtt agagg 25
<210> 34
<211> 46
<212> DNA
<213> 组合8 FIP序列
<400> 34
gtacattcca actcaagaac aacagacact tcaaaggaaa acaacc 46
<210> 35
<211> 46
<212> DNA
<213> 组合8 BIP序列
<400> 35
ttcaggtaga gatgctggta cacctagttt atctttctaa tagcct 46

Claims (10)

1.一种检测新型冠状病毒的LAMP引物组合，其特征在于，选自如SEQ ID NO:3～SEQ IDNO:6所示的引物组1、如SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:10所示的引物组2、如SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:14所示的引物组3、如SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:18所示的引物组4、如SEQ IDNO:19～SEQ ID NO:22所示的引物组5、如SEQ ID NO:24～SEQ ID NO:27所示的引物组6、如SEQ ID NO:28～SEQ ID NO:31所示的引物组7、如SEQ ID NO:32～SEQ ID NO:35所示的引物组8中的任一种或几种。
2.一种检测新型冠状病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的LAMP引物组合。
3.根据权利要求2所述的检测新型冠状病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度为80-110μM。
4.根据权利要求3所述的检测新型冠状病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度为100μM。
5.根据权利要求2所述的检测新型冠状病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，所述LAMP试剂盒还包括反应缓冲液、BSst DNA聚合酶、SYBR/中性红染料、DNA模板和双蒸水。
6.根据权利要求5所述的检测新型冠状病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Tween-20。
7.利用如权利要求2-6任一项所述LAMP试剂盒检测该新型冠状病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，提取纯化待测样品的DNA；
步骤2，配制LAMP反应体系，进行环介导等温扩增反应；
步骤3，结果判断。
8.根据权利要求7所述的检测新型冠状病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，步骤2中的所述反应体系的体积为30μL，包括如下体积的试剂：反应缓冲液20μL、引物各0.05μL、BSstDNA聚合酶1μL、SYBR/中性红染料1μL、DNA模板4μL、余量为双蒸水。
9.根据权利要求7所述的检测新型冠状病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，所述环介导等温扩增反应的条件为55～70℃，30～60min。
10.根据权利要求7所述的检测新型冠状病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，所述环介导等温扩增反应所采用的设备为普通PCR仪、实时PCR仪或恒温金属浴。
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