CN114807435A - 一种用于呼吸道合胞病毒检测的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于呼吸道合胞病毒检测的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于呼吸道合胞病毒检测的试剂盒及其应用，该试剂盒包括RPA扩增反应体系和CRISPR‑Cas13a蛋白酶检测体系；其中，RPA扩增反应体系包括RPA扩增引物对，CRISPR‑Cas13a蛋白酶检测体系包括sgRNA、Cas13a蛋白和探针。本发明还提供了对应的检测方法，通过该试剂盒在恒温条件下即可实现对呼吸道合胞病毒的检测，具有检测时间短、操作简便、检测条件温和、无需昂贵的专业仪器辅助等优点。该试剂盒和对应的检测方法具有良好的应用前景，有潜力应用于临床检测。

Description

一种用于呼吸道合胞病毒检测的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于呼吸道合胞病毒检测的试剂盒及其应用。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)属于副黏病毒科的肺病毒属(Pneumovirus)。呼吸道合胞病毒是一种单链RNA病毒，有A、B两个压型，在酸碱环境中容易失活，在日常环境中可存活数小时。常通过飞沫或者密切接触传播，北方多发在寒冷的冬春季，南方流行高峰期则主要在炎热的夏秋季。主要症状表现为发热、咳嗽、喘息、X线检查为小点片状阴影。病情较轻的患儿一般病程在6-10天，6个月以下婴幼儿感染呼吸道合胞病毒后多为重症病例，症状类似肺炎。
呼吸道合胞病毒是引起一岁以下婴幼儿健康问题的主要原因，可引发危及婴幼儿生命的下呼吸道感染，导致婴幼儿患毛细支气管炎和肺炎，除此之外，呼吸道合胞病毒亦能感染老年人及免疫力低下的人群。因此、建立有效、快速的呼吸道合胞病毒鉴定方法对保障婴幼儿的健康至关重要。
目前临床对呼吸道合胞病毒进行辅助的检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、实时荧光定量PCR(RT-PCR)等。酶联免疫吸附法检测操作复杂、检测时间长、交互反应发生的机率较高、检测费用高。实时荧光定量PCR在检测方面与酶联免疫吸附检测法相比，具有操作简便、检测特异性高、灵敏度高等多方面的优点，但是实时荧光定量PCR法也存在以下缺陷：检测时间相对较长，需要昂贵的仪器辅助配合检测，只能在专业设备仪器中操作进行，需要高温进行PCR扩增反应来达到检测目的。
相对于PCR等需要高温条件实现核酸扩增的检测技术，恒温扩增技术只需要一个温度，不需要温度循环改变，精准的升温控温模块，对仪器设备要求低。目前常用的恒温扩增手段主要包括了环介导恒温扩增(LAMP)、依赖核酸序列扩增(NASBA)、滚环核酸扩增(RCA)、链代替扩增(SDA)和重组酶聚合酶扩增(RPA)等。在众多恒温扩增方法中，RPA技术能够将检测时间缩短至15-30min完成，检测可在室温下直接进行，对实现核酸POCT检测提供了有利的实验条件基础。
然而，直接利用RPA技术进行检测仍存在诸多问题，特别是假阳性问题亟待解决，另外，RPA技术的检测灵敏度相对于PCR技术并未得到有效提升。
为了克服现有技术中的上述缺陷，本领域技术人员希望开发一种新的对呼吸道合胞病毒进行检测的方法，使其同时具有检测时间短、操作简便、特异性高、灵敏性高、检测条件温和、无需昂贵的专业仪器辅助等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于呼吸道合胞病毒检测的试剂盒及其应用，通过该试剂盒在恒温条件下即可实现对呼吸道合胞病毒的检测，具有检测时间短、操作简便、检测条件温和、无需昂贵的专业仪器辅助等优点。该试剂盒和对应的检测方法具有良好的应用前景，有潜力应用于临床检测。
为此，第一方面，本发明提供一种用于呼吸道合胞病毒检测的试剂组合，包括RPA扩增引物对、sgRNA、Cas13a蛋白和探针；
所述RPA扩增引物对选自下组中的至少一种：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物对；所述sgRNA的序列如SEQ ID NO：7所示所示。
sgRNA与Cas13a蛋白结合形成复合体，在加入由RPA扩增引物对扩增得到的扩增产物后，所述复合体识别并结合靶RNA序列后Cas13a蛋白被激活，活化的Cas13a蛋白对探针进行切割，从而发出可检测的信号。
根据本发明的技术方案，本领域技术人员可以设计得到可组装为本发明所述的单引导RNA(sgRNA)的crRNA和tracrRNA；如果将本发明的技术方案中的sgRNA替换为相应的crRNA和tracrRNA，该技术方案仍在本发明的保护范围之内。
在本发明的一些实施方式中，所述探针为荧光探针，例如两端分别连接有荧光基团和猝灭基团的单链RNA。
进一步，所述荧光探针的5’端修饰有荧光基团，选自下组FAM、HEX、ROX、CY5、Cy3、TET、JOE、VIC；所述荧光探针的3’端修饰有淬灭基团，选自下组BHQ、Dabcy1、TAMRA、MGB。
在一些实施方式中，所述荧光探针为5’-FAM-AUAGCUAC-BHQ1-3’。
本发明的第二方面，提供一种用于呼吸道合胞病毒检测的试剂盒，包括RPA扩增反应体系和CRISPR-Cas13a蛋白酶检测体系；
所述RPA扩增反应体系包括RPA扩增引物对，所述RPA扩增引物对选自下组中的至少一种：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物对；
所述CRISPR-Cas13a蛋白酶检测体系包括sgRNA、Cas13a蛋白和探针；所述sgRNA的序列如SEQ ID NO：7所示。
进一步，所述RPA扩增反应体系还包括RPA扩增反应缓冲液和聚合酶。
在一些实施方式中，所述RPA扩增反应缓冲液包括RPA Buffer，Mg(CH3COO)2。例如，可采用购自英国Twist DX公司的RPA试剂盒中提供的相应试剂。
进一步，所述PRA扩增反应体系中，所述RPA扩增引物对的浓度为每种引物10-20μM。
进一步，所述CRISPR-Cas13a蛋白酶检测体系还包括CRISPR-Cas13a蛋白酶缓冲液，RNA酶抑制剂。
进一步，所述CRISPR-Cas13a蛋白酶缓冲液包括Fncas13a Buffer。例如，可采用购自New England Biolabs(NEB)公司的10×Fncas13a Bufffer进行配制。
进一步，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品，所述阳性对照品为含有呼吸道合胞病毒检测目标序列的T载体；所述阴性对照为超纯水。
本发明的第三方面，提供一种应用本发明提供的试剂盒进行呼吸道合胞病毒的检测方法，包括：
(1)提取待测样本的核酸作为待测模板；
(2)将所述待测模板加入所述RPA扩增反应体系中进行扩增，得到扩增产物；
(3)将所述扩增产物加入所述CRISPR-Cas13a蛋白酶检测体系，在等温条件下收集检测信号。
根据本发明所述的呼吸道合胞病毒的检测方法用于非诊断目的。
进一步，当所述探针为荧光探针时，所述检测信号为荧光信号。
进一步，所述扩增的反应温度为35-45℃，例如35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃等；所述扩增反演的时间为15-30min，例如15min、20min、25min、30min等。
进一步，所述等温条件为35-45℃，例如35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃等。
根据荧光信号的检测结果，如果出现扩增曲线则判定为阳性；如果无扩增曲线，则判定为阴性。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供的试剂盒和检测方法将RPA技术与CRISPR/Cas13a***联用，该试剂盒通过恒温扩增结合Cas13a的方法可以实现高灵敏度检测；其中，sgRNA与Cas13a蛋白结合形成复合体，在加入由RPA扩增引物对扩增得到的扩增产物后，所述复合体识别并结合靶RNA序列，使Cas13a蛋白被激活，活化的Cas13a蛋白对探针进行切割，从而发出可检测的信号。该检测方法具有变异性低和灵敏度高的特点。
(2)本发明提供的试剂盒和检测方法在恒温条件下即可实现检测，具有检测时间短、操作简便、检测条件温和、无需昂贵的专业仪器辅助等优点。
(3)本发明提供的试剂盒和检测方法具有良好的应用前景，有潜力应用于临床检测。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明提供的呼吸道合胞病毒检测方法的流程图；
图2为不同RPA扩增引物对的扩增效率的比较结果；
图3为RPA扩增引物对的特异性分析结果；
图4为本发明提供的呼吸道合胞病毒检测方法的灵敏度分析结果；
图5为本发明提供的呼吸道合胞病毒检测方法的特异性分析结果。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
试剂材料来源：RPA试剂盒(RPA Buffer、Mg(CH3COO)2)购自于英国Twist DX公司；Fncas13a酶、10×Fncas13a Bufffer购自于New England Biolabs(NEB)公司；RNase抑制剂购自于上海生工生物工程有限公司。
实施例1
本实施例对呼吸道合胞病毒的RPA扩增引物对的扩增效率进行了研究。在反应体系各组分成分含量不发生变化的情况下，对三对呼吸道合胞病毒RPA引物对进行扩增效率的研究。
扩增反应体系为：1μL RSV-F(10μM)，1μL RSV-R(10μM)，0.3μL 1×syto-9，20.5μLRPA Buffer，1.2μL Mg(CH3COO)2(280mM)，模板(含有呼吸道合胞病毒检测目标序列的T载体)50ng，超纯水补齐到25μL。扩增程序设置为42℃、预变性30s；42℃变性15s，37℃退火、延伸15s，循环40次。
呼吸道合胞病毒的RPA扩增引物对序列见表1所示。
表1呼吸道合胞病毒RPA扩增引物对序列
Figure BDA0003548381640000061
扩增结果如图2所示，根据图2可知，表1提供的三对RPA扩增引物对均可对靶序列进行特异性扩增，其中RSV-F3、RSV-R3引物对扩增速率最优，将其用于后续实施例。
实施例2
本实施例以50份呼吸道合胞病毒临床阴性的样本作为特异性评价指标，对实施例1中提供的呼吸道合胞病毒RPA扩增引物对的特异性进行分析。按照实施例1所述的RPA扩增反应体系和扩增程序对50份呼吸道合胞病毒临床阴性的样本进行扩增，同时设置阳性对照和阴性对照。其中，阳性对照的模板为含有呼吸道合胞病毒检测目标序列的T载体；阴性对照不加入模板。
检测结果如图3所示，根据图3，仅阳性对照出现“S”型扩增曲线，阴性对照及50份临床阴性的样本均未出现扩增现象。表明本发明提供的RPA扩增引物对具有良好的特异性。
实施例3
本实施例提供一种检测呼吸道合胞病毒的试剂盒，包括RPA反应体系、CRISPR-Cas13a蛋白酶检测体系。
RPA反应体系见表2所示。
表2 RPA反应体系
Figure BDA0003548381640000062
Figure BDA0003548381640000071
CRISPR-Cas13a蛋白酶检测体系见表4所示。
表3 CRISPR-Cas13a蛋白酶检测所需碱基序列
Figure BDA0003548381640000072
表4 CRISPR-Cas13a蛋白酶检测体系
试剂成分 使用量(μL)
NTP Buffer Mix 10
T7转录酶 3
sgRNA 1
报告序列 5
Mg(CH<sub>3</sub>COO)<sub>2</sub> 3
RPA反应产物 1
RNase-free 至25
实施例4
本实施例提供一种呼吸道合胞病毒的检测方法，包括以下步骤：
一、核酸样本提取
(1)取200μL待测样本，加入400μL裂解液，80℃水浴加热10min；
(2)加入20μL核酸吸附磁珠，涡旋30s，静置5min，将反应管转移至磁力架上吸附1-5min，倒弃或吸弃溶液；
(3)加入1000μL 80％乙醇溶液涡旋震荡后，将反应管转移至磁力架上吸附5min，弃去溶液；
(4)重复上一步骤；
(5)使用磁力棒收集管内磁珠，移入新的离心管中，加入150μL核酸洗脱液。将制备得到核酸样本作为后续步骤的待测模板。
二、重组酶聚合酶等温扩增反应
配制如实施例3中表2所示的RPA反应体系，进行等温扩增反应，反应条件为：于37℃条件下放置15min。制备得到扩增产物。
三、CRISPR-Cas13a蛋白酶等温检测反应与荧光检测
取步骤二制备得到的扩增产物，配制实施例3中表4所示的CRISPR-Cas13a蛋白酶检测体系。将配制得到的CRISPR-Cas13a蛋白酶等温检测反应体系放置于ABI 7500荧光定量PCR仪中，程序设置如下：37℃预变性30s，37℃变性45s，37℃退火、延伸15s，循环40次。
四、结果判读
根据实验结果，出现扩增曲线的为阳性，无扩增曲线的则为阴性。
实施例5
本实施例对本发明提供的呼吸道合胞病毒的检测方法的灵敏度进行分析。
具体步骤如下：
以含有呼吸道合胞病毒检测目标序列的T载体作为阳性质粒，提取阳性质粒后通过NanoDrop One进行定量，将阳性质粒分别稀释到1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL、10ag/μL作为待测模板。使用实施例4中的检测方法对不同浓度的待测模板进行检测。检测结果如图4所示。
图4中，从左到右的曲线依次为浓度为1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL、10ag/μL的阳性质粒的扩增结果，可以看出本发明的呼吸道合胞病毒的检测方法的灵敏度可达100ag/μL，本发明的呼吸道合胞病毒的检测试剂盒和检测方法对呼吸道合胞病毒的诊断具有高度的灵敏性。
实施例6
本实施例对本发明提供的呼吸道合胞病毒的检测方法的特异性进行分析。
具体步骤如下：
以50份呼吸道合胞病毒临床阴性的样本作为特异性评价指标，按照实施例4中检测方法对样本进行检测。检测结果如图5所示。仅阳性质粒出现“S”型扩增曲线，阴性对照及50份呼吸道合胞病毒临床阴性样品均未出现扩增曲线。表明本发明的呼吸道合胞病毒的检测方法具有高度特异性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 申请人名称
<120> 一种用于呼吸道合胞病毒检测的试剂盒及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaactcagtg taggtagaat gtttgcaatg c 31
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctagatcac catatcttgt aagactttca gg 32
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacaggcaaa gaaagagaac tcagtgtagg tag 33
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tagatcacca tatcttgtaa gactttcagg ga 32
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agagaactca gtgtaggtag aatgtttgc 29
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gatcaccata tcttgtaaga ctttcaggga 30
<210> 7
<211> 43
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
uaauuucuaa guguagauca agaauguuug caaugcaacc agg 43
<210> 8
<211> 8
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
auagcuac 8

Claims (10)

1.一种用于呼吸道合胞病毒检测的试剂组合，其特征在于，包括RPA扩增引物对、sgRNA、Cas13a蛋白和探针；
所述RPA扩增引物对选自下组中的至少一种：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物对；所述sgRNA的序列如SEQ ID NO：7所示。
2.一种用于呼吸道合胞病毒检测的试剂盒，其特征在于，包括RPA扩增反应体系和CRISPR-Cas13a蛋白酶检测体系；
所述RPA扩增反应体系包括RPA扩增引物对，所述RPA扩增引物对选自下组中的至少一种：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物对；
所述CRISPR-Cas13a蛋白酶检测体系包括sgRNA、Cas13a蛋白和探针；所述sgRNA的序列如SEQ ID NO：7所示。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA扩增反应体系还包括RPA扩增反应缓冲液和聚合酶。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA扩增反应缓冲液包括RPA Buffer和Mg(CH3COO)2。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PRA扩增反应体系中，所述RPA扩增引物对的浓度为每种引物10-20μM。
6.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述CRISPR-Cas13a蛋白酶检测体系还包括CRISPR-Cas13a蛋白酶缓冲液，RNA酶抑制剂。
7.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有呼吸道合胞病毒检测目标序列的T载体；所述阴性对照为超纯水。
9.一种呼吸道合胞病毒的检测方法，其特征在于，所述检测方法应用权利要求2-8任一项所述的试剂盒进行呼吸道合胞病毒的检测，所述检测方法包括以下步骤：
(1)提取待测样本的核酸作为待测模板；
(2)将所述待测模板加入所述RPA扩增反应体系中进行扩增，得到扩增产物；
(3)将所述扩增产物加入所述CRISPR-Cas13a蛋白酶检测体系，在等温条件下收集检测信号。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述扩增的反应温度为35-45℃；所述扩增反演的时间为15-30min；
优选地，所述等温条件为35-45℃。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117551818A (zh) * 2024-01-11 2024-02-13 天津欧德莱生物医药科技有限公司 一种检测呼吸道合胞病毒的靶基因、引物探针组合以及试剂盒和应用

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