CN115786582A - 结合CRISPR/Cas12a与RPA检测猴痘病毒方法、试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种结合CRISPR/Cas12a与RPA检测猴痘病毒方法、检测猴痘病毒核酸的试剂盒以及制备方法包括以下步骤：获取猴痘病毒的基因组序列，通过生物信息学分析对比，寻找其特异性鉴定区域；设计得到检测猴痘病毒核酸的crRNA‑1、crRNA‑2；RPA扩增MPXV F3L和B6R基因；取上述体系加入Cas12a***，crRNA与dsDNA进行识别并结合，并激活Cas12a酶活性；Cas12a酶随机切割ssDNA FQ探针；荧光恒温放大器捕捉荧光信号，输出结果。该检测***可在40min内检测MPXV基因组DNA，检测限为1copy/μL，形成了一种高灵敏度、高特异性、低成本的MPXV检测工具。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种结合CRISPR/Cas12a与RPA检测猴痘病毒方法、试剂盒及其制备方法。
背景技术
随着病毒检测技术日益发展，现有的猴痘病毒的检测手段主要有形态学观察、血清学检测和分子生物学方法等。由于血清学诊断和临床诊断敏感性较低，病毒感染的快速特异性诊断主要采用分子诊断(PCR或real-time PCR)，然而real-time PCR技术对环境要求严格，仪器昂贵，不适合现场检测。近年来，利用重组酶聚合酶扩增(RPA)结合CRISPR-Cas***进行病原体检测在提高检测灵敏度的同时，可以大大缩短检测时间和对现场的仪器要求，但还没有应用到猴痘病毒(MPXV)的检测中。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足和填补空白，提供可以检测猴痘病毒核酸(MPXV)的crRNA以及试剂盒。
为达成上述目的，本发明第一个技术方案如下：一种结合CRISPR/Cas12a与RPA检测猴痘病毒方法，包括如下步骤：
步骤1)：样品的特定片段经过特异性引物的RPA扩增；
步骤2)：上一步扩增得到的含有病毒模板片段的混合物与含有Cas12a酶、crRNA的***混合，并加入检测探针；
步骤3)：不同的探针发出的信号分别被便携式荧光恒温放大器捕捉与放大，通过荧光值对结果进行判读。
本发明的第二个技术方案：一种检测猴痘病毒核酸的试剂盒，包括检测猴痘病毒核酸的crRNA-1或者crRNA-2、LbCas12a核酸酶、核酸检测探针、引物对以及
Basic试剂盒、DEPC水和10X NEBufferTM r2.1。
本发明的第三个技术方案：一种检测猴痘病毒核酸的试剂盒制备方法，包括如下步骤：
1)获取猴痘病毒MPXV的基因组序列，通过生物信息学分析对比，寻找其特异性鉴定区域；
2)设计得到检测猴痘病毒核酸的crRNA-1、crRNA-2：
crRNA-1序列为taatttctactaagtgtagatttggaaaggtgttaaccctgtcac；
crRNA-2序列为taatttctactaagtgtagatgtatataagttgtacggctaattc；
3)试剂盒的具体操作步骤如下：
在39℃条件下，RPA扩增MPXV F3L和B6R基因；
取上述体系加入Cas12a***，crRNA与dsDNA进行识别并结合，并激活Cas12a酶活性；Cas12a酶随机切割ssDNA FQ探针；
荧光恒温放大器捕捉荧光信号，输出结果。
进一步，所述步骤1)具体步骤包括：在NCBI核酸序列库查找猴痘病毒MPXV的全基因组序列，锁定相对保守的F3L和B6R基因作为鉴定基因，寻找“TTTN”序列，将这些序列作为crRNA靶向序列的备选数据库，与其它正痘病毒属病毒相比,寻找备选数据库的中序列的特异性。
进一步，所述步骤2)具体步骤包括：根据筛选原则包含的序列的GC含量、碱基均一性、序列保守性参数,最终得到一段大小为20-24nt的靶位点识别序列,然后将一段大小为20-21nt的直接重复序列加上前述得到的大小为20-24nt的靶位点识别序列得到检测MPXV核酸的crRNA,共得到2条,分别为crRNA-1和crRNA-2。
进一步，所述步骤3)具体步骤包括：
(1)用重组酶聚合酶RPA扩增试剂盒扩增目的片段，取2.2-2.5μL上游引物(F3L:TAGGAGAGTTACTAGGCCCCAC；B6R:CTAATGCGGAATGTCAACCTCTTCAA)，2.2-2.5μL下游引物(F3L:ACGACAATGGATGCTGATACAC；B6R:AGAAAATGTAGATCCGGAAATTAATC)(10μmol/L)，反应缓冲液，活化剂，加入DNA模板和水的混合物，37-42℃孵育；
(2)取crRNA和缓冲液与Cas12a孵育，在20-28℃下放置，充分混合；
(3)将RPA反应体系和ssDNA FQ探针加入到CRISPR/Cas12a混合体系中，反应在GS8等温循环仪中进行放置，荧光测量；
(4)CRISPR/Cas12a结合RPA***检测F3L和B6R基因的灵敏度，读取相对荧光值。
本发明的有益效果表现如下
1、为了便于早期疑似感染病例的准确诊断和快速稳定地检测样本，我们设计了一种RPA与CRISPR-Cas12a相结合的猴痘病毒核酸检测试剂盒，可以快速、灵敏地检测MPXV。该检测***可在30-40min内检测MPXV基因组DNA，检测限为1copy/μL。
2、本发明将CRISPR/Cas12a方法与荧光恒温放大器相结合，减少了现场检测对大型设备的依赖，形成了一种高灵敏度、低成本的MPXV检测工具。
附图说明
图1为本发明的一种检测猴痘病毒核酸的流程图；
图2为本发明选定的MPXV目的基因与其他病毒同源片段比对图；
图3为本发明所设计的crRNA和引物的序列示意图；
图4为本发明使用便携式荧光恒温放大器(GS8等温循环仪)检测MPXV目的基因数据的示意图；
图5为本发明的检测MPXV片段的灵敏度示意图。
具体实施方式
以下结合附图以及具体实施方式，对本发明作进一步详细说明。
本发明一种结合CRISPR/Cas12a与RPA检测猴痘病毒方法，包括如下步骤：
步骤1)：样品的特定片段经过特异性引物的RPA扩增；
步骤2)：上一步扩增得到的含有病毒模板片段的混合物与含有Cas12a酶、crRNA的***混合，并加入检测探针；
步骤3)：不同的探针发出的信号分别被便携式荧光恒温放大器捕捉与放大，通过荧光值对结果进行判读
本发明提供了一种检测猴痘病毒(MPXV)核酸的试剂盒，包括检测猴痘病毒核酸的crRNA-1或者crRNA-2、LbCas12a核酸酶、核酸检测探针、引物对以及
Basic试剂盒、DEPC水和10X NEBufferTM r2.1。
本发明一种检测猴痘病毒核酸的试剂盒制备方法包括以下步骤：
1、获取猴痘病毒(MPXV)的基因组序列，通过生物信息学分析对比，寻找其特异性鉴定区域；
2、设计得到检测猴痘病毒核酸的crRNA-1、crRNA-2；
3、试剂盒的具体操作步骤如下：如图1所示，在39℃条件下，RPA扩增MPXV F3L和B6R基因20min；取上述体系加入Cas12a***，crRNA与dsDNA进行识别并结合，并激活Cas12a酶活性；Cas12a酶随机切割ssDNA FQ探针(用FAM和BHQ1标记)；荧光恒温放大器(GS8等温循环仪)捕捉荧光信号，输出结果。
进一步地，所述步骤1中通过生物信息学分析对比，寻找MPXV特异性鉴定区域，具体步骤包括：
在NCBI核酸序列库查找猴痘病毒MPXV的全基因组序列，锁定相对保守的F3L和B6R基因作为鉴定基因，寻找“TTTN”序列，将这些序列作为crRNA靶向序列的备选数据库，与其它正痘病毒属病毒(VARV、VACV、CPXV)相比,寻找备选数据库的中序列的特异性，如图2。
进一步地，所述步骤2中设计得到检测猴痘病毒核酸的crRNA-1、crRNA-2,具体步骤包括：
根据筛选原则,如序列的GC含量、碱基均一性、序列保守性等参数,最终得到一段大小为20-24nt的靶位点识别序列,然后将一段大小为20-21nt的直接重复序列加上前述得到的大小为20-24nt的靶位点识别序列得到检测MPXV核酸的crRNA,共得到2条,分别为crRNA-1和crRNA-2,如图3所示。
进一步地，所述步骤3中检测MPXV F3L和B6R基因,具体步骤包括：
3.1用商业化的重组酶聚合酶(RPA)扩增试剂盒(TwistAmp,cat.no.TABAS03KIT)扩增目的片段，取2.2-2.5μL上游引物(F3L:TAGGAGAGTTACTAGGCCCCAC；B6R:CTAATGCGGAATGTCAACCTCTTCAA)，2.2-2.5μL下游引物(F3L:ACGACAATGGATGCTGATACAC；B6R:AGAAAATGTAGATCCGGAAATTAATC)(10μmol/L)，29.5μL反应缓冲液，2μL活化剂，加入DNA模板和水的混合物使终浓度为50μL，37-42℃孵育20min。
3.2取2-4μL crRNA(1μmol/L)(终浓度80nM左右)和3μL 10x缓冲液与1μL Cas12a(1μmol/L)(终浓度30nM左右)(New England Biolabs,cat.no.M0653S)孵育，在20-28℃下放置20分钟，充分混合。
3.3将20μL RPA反应体系和2-4μL ssDNA FQ探针(10μM,FAM和BHQ1标记)加入到CRISPR/Cas12a混合体系中。反应在GS8等温循环仪中进行(GenDX,cat.no.GS8)在37℃下放置10-20min，每30s进行一次荧光测量，如图4。
3.4 CRISPR/Cas12a结合RPA***在20min时检测F3L和B6R基因的灵敏度，便携式荧光恒温放大器(GS8等温循环仪)读取的相对荧光值如图5所示。
综上所述，本发明设计了一种检测猴痘病毒核酸的试剂盒，可以快速、灵敏地检测MPXV。该检测***可在40min内检测MPXV基因组DNA，检测限为1copy/μL，形成了一种高灵敏度、高特异性、低成本的MPXV检测工具。
Claims (8)
1.一种结合CRISPR/Cas12a与RPA检测猴痘病毒方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1)：样品的特定片段经过特异性引物的RPA扩增；
步骤2)：上一步扩增得到的含有病毒模板片段的混合物与含有Cas12a酶、crRNA的***混合，并加入检测探针；
步骤3)：不同的探针发出的信号分别被便携式荧光恒温放大器捕捉与放大，通过荧光值对结果进行判读。
2.一种检测猴痘病毒核酸的试剂盒，其特征在于，包括检测猴痘病毒核酸的crRNA-1或者crRNA-2、LbCas12a核酸酶、核酸检测探针、引物对以及
Basic试剂盒、DEPC水和10X NEBufferTMr2.1。
3.一种检测猴痘病毒核酸的试剂盒制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)获取猴痘病毒MPXV的基因组序列，通过生物信息学分析对比，寻找其特异性鉴定区域；
2)设计得到检测猴痘病毒核酸的crRNA-1、crRNA-2；
3)试剂盒的具体操作步骤如下：
RPA扩增MPXV F3L和B6R基因；
取上述体系加入Cas12a***，crRNA与dsDNA进行识别并结合，并激活Cas12a酶活性；
Cas12a酶随机切割ssDNA FQ探针；
荧光恒温放大器捕捉荧光信号，输出结果。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1)具体步骤包括：在NCBI核酸序列库查找猴痘病毒MPXV的全基因组序列，锁定相对保守的F3L和B6R基因作为鉴定基因，寻找“TTTN”序列，将这些序列作为crRNA靶向序列的备选数据库，与其它正痘病毒属病毒相比,寻找备选数据库的中序列的特异性。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)具体步骤包括：根据筛选原则包含的序列的GC含量、碱基均一性、序列保守性参数,最终得到一段大小为20-24nt的靶位点识别序列,然后将一段大小为20-21nt的直接重复序列加上前述得到的大小为20-24nt的靶位点识别序列得到检测MPXV核酸的crRNA,共得到2条,分别为crRNA-1和crRNA-2。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，crRNA-1序列为taatttctactaagtgtagatttggaaaggtgttaaccctgtcac；
crRNA-2序列为taatttctactaagtgtagatgtatataagttgtacggctaattc。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤3)具体步骤包括：
(1)用重组酶聚合酶RPA扩增试剂盒扩增目的片段，取2.2-2.5μL上游引物，2.2-2.5μL下游引物，反应缓冲液，活化剂，加入DNA模板和水的混合物，37-42℃孵育；
(2)取crRNA和缓冲液与Cas12a孵育，在20-28℃下放置，充分混合；
(3)将RPA反应体系和ssDNA FQ探针加入到CRISPR/Cas12a混合体系中，反应在GS8等温循环仪中进行放置，荧光测量；
(4)CRISPR/Cas12a结合RPA***检测F3L和B6R基因的灵敏度，读取相对荧光值。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
上游引物F3L:taggagagttactaggccccac；
B6R:ctaatgcggaatgtcaacctcttcaa；
下游引物F3L:acgacaatggatgctgatacac；
B6R:agaaaatgtagatccggaaattaatc。
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