CN111560482B - 基于CRISPR/Cas和核酸试纸的检测方法和人***瘤病毒检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种基于CRISPR/Cas和核酸试纸的核酸检测方法和人***瘤病毒快速检测试剂盒。所示人***瘤病毒检测试剂盒包括crRNA、Cas12、RPA上下游引物、缓冲体系和单链DNA报告分子；所述报告分子序列为5’‑NNN…‑3’，长度为3‑30碱基，进行FAM，DIG，Biotin标记，同时对核酸分子进行防止DNA酶或是激活后cas12降解的修饰。本发明的基于CRISPR/Cas和核酸试纸的核酸检测方法和人***瘤病毒快速检测试剂盒具有以下优点：采用创新的报告分子设计和修饰，并结合相应试纸条，完全杜绝非特异性显色，对临床实际应用具有显著意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种基于CRISPR/Cas和核酸试纸的核酸检测方法和人***瘤病毒快速检测试剂盒。
背景技术
诊断行业是生物制药行业的重要组成部分，中国的诊断行业现在正处于产品研发与生产的投入初期，成长期还未到来。中国目前的诊断市场规模不到全球市场的1/10。总的来说，目前在临床应用较广泛、市场前景广阔的项目上(如免疫试剂中的肝炎、性病和孕检系列，临床生化中的酶类、脂类、肝功、血糖、尿检等系列)，国内主要生产厂家的技术水平已基本达到国际先进水平；基因检测中的PCR技术系列已经达到国际先进水平，基因芯片、癌症系列正在迅速追赶国际水平。但是由于市场因素、技术因素的限制，目前国内的分子快检水平，即POCT产品和国际先进水平仍有较大差距。
2018年全球POCT市场规模约为280亿美元，预计2021年将超350亿美元。其中在IVD细分领域中，POCT市场规模约占28％，位居榜首。近年来，我国POCT市场发展非常迅速，行业增速保持在10％～20％，远远高于全球6％～7％的增速。随着我国老龄化加剧和慢性病高发，以及分级诊断政策的逐步落地，未来POCT市场仍将保持高速发展。2018年我国POCT市场规模超70亿元，约占IVD行业的10.9％，预计2022年行业规模将达200亿元。所以我国的POCT有着巨大的市场空间尚未开发。
由于分子诊断试剂产品具有较高的特异性与灵敏度，其在诊断领域仍然占有主导地位。目前大多数实验室采用PCR方法对病原体进行检测，其灵敏度特异性均较好，但是耗时较长，并且仪器设备价格昂贵，难以在基层检验机构普及。恒温扩增技术相对PCR等变温核酸检测技术，不需要升降温循环，所以对扩增设备要求不高，有利于进行核酸POCT检测。
新兴的重组酶依赖的聚合酶扩增技术(Recombinase polymeraseamplification,RPA)能够将检测时间缩短到15min-30min，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。但该技术相较于目前市场上的实时定量PCR(Q-PCR)方法，并未实质性地提升检测灵敏度。因此亟需建立一种可应用于现场、简易、快速、且高灵敏度的检测技术，近年来发展起来的CRISPR/Cas检测技术成为理想的候选方案。
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是大多数细菌及古细菌中抵御病毒入侵的一种获得性免疫方式。当病毒入侵时，细菌生成对应的能识别病毒基因组的crRNA，该crRNA引导具有核酸内切酶活性的Cas蛋白(CRISPR-associated proteins)对病毒靶标序列进行识别和切割。CRISPR***是由自身的RNA和靶标DNA进行序列配对，并且引导cas蛋白对靶标进行特异性切割。对于双链DNA，CRISPR***需要识别目标DNA上的一个protospacer adjacent motif(PAM)序列。这种特性使我们可以很方便地使用CRISPR***去鉴别不同的核酸序列。比如，使用不同序列的指导RNA(guideRNA,是指代sgRNA或者crRNA)可特异性识别和指导RNA序列匹配的，并带有PAM序列的双链DNA。S.pyogenes Cas9(SpCas9，简称Cas9)，因其具有简单的PAM序列和细胞内较高的基因编辑效率，因而应用最最为广泛。
2016年6月，张锋课题组发现了一种CRISPR效应蛋白Cas13a。该蛋白是一种在crRNA引导下与靶标RNA结合并降解靶标的核酸内切酶(Makarova et al.,2011)。同年10月Doudna等(East-Seletsky et al.,2016)发现一种叫Leptotrichia buccalis Cas13a(LbuCas13a)的核酸内切酶不仅具有对靶标RNA切割活性，而且还具有切割非靶标RNA的活性，这种非特异性切割称为附属切割。2017年，张锋与Collins合作将Cas13a与重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)结合，开发出了一个高特异性和灵敏性的核酸检测***(Specific High-Sensitivity Enzymatic ReporterUnLOCKing，SHERLOCK)(Gootenberg et al.,2017)。RPA的引入显著地提高了该***的灵敏度，SHERLOCK对靶标的检出限低至2X103copies/mL(3.2amol/L)，实现了单分子的检测。这项突破性的研究成果再次证实了CRISPR/Cas***在核酸诊断领域的价值，有望在公共卫生领域产生重大影响。
2015年，张锋等发现一种Ⅱ类Ⅴ型CRISPR效应蛋白Cas12(Zetsche et al.,2015)。Cas12可在crRNA引导下与靶标双链DNA结合并切割基因组DNA。2018年，Doudna等发现当Cas12特异性结合和切割目标dsDNA后，具有非特异性切割单链DNA(ssDNA)的活性，Cas12对单链DNA切割速度极快，达到每秒1000个分子以上，且可以持续数小时以上。研究人员利用Cas12的这种活性开发了一个被命名为DETECTR(DNA Endonuclease TargetedCRISPR Trans Reporter)的核酸检测***(Chen et al.,2018)。该***在体系中引入用荧光基团和淬灭基团标记的单链报告DNA分子，当被激活的cas12切割单链DNA时，淬灭基团和荧光基团分离，从而让荧光光分子发光，进而检测到光信号。DETECTR将RPA等温扩增技术与Cas12相结合，扩增产物激活Cas12的附属切割活性，切割底物产生荧光信号，并且实现了单分子级别的灵敏度。该***在单核苷酸多态性分析、癌症筛查、细菌和病毒感染检测以及耐药性筛查等方面有广泛的应用潜力。
尽管这些基于CRISPR/Cas的技术可以实现对核酸分子的快速灵敏检测，但是仍然需要借助荧光检测仪，并且结果不能进行可视化的判读，这对该技术在基层检验机构的普及带来困难。
目前有利用核酸试纸条对结果进行判读的实施例，但其采用的试纸条会产生严重的非特异性显色，这对结果判读带来极大困难。
发明内容
本发明目的在于：提供一种可用于CRISPR/Cas***的并且可以完全杜绝非特异性显色的核酸试纸条和报告分子构造方式的核酸检测方法和相应的人***瘤病毒快速检测试剂盒。
本发明提供的一种技术方案为：提供一种基于CRISPR/Cas12和核酸试纸的检测方法，包括步骤：
步骤1)设计合成单链DNA报告分子；所述单链DNA报告分子序列为5’-NNN…-3’，长度为3-30碱基，所述单链DNA报告分子进行FAM，DIG，Biotin标记，同时对单链DNA报告分子的核酸分子进行防止DNA酶或是激活后cas12酶降解的修饰；
步骤2)设计合成用于扩增靶基因的RPA上下游引物；
步骤3)针对靶基因设计特异性的crRNA，长度为17-25个核苷酸，在crRNA近5’端存在PAM序列：TTTN，所述PAM序列用于crRNA和cas12组成的复合物识别；
步骤4)将冻干RPA反应颗粒，RPA水化缓冲液，RPA上下游引物，待测靶标核酸与醋酸镁混合，所得置于37-42℃恒温条件下反应10-30min得RPA反应液；
步骤5)将包括RPA反应液、crRNA分子，Cas12和单链DNA报告分子、RNA酶抑制剂，镁离子，缓冲液的组分进行混合得反应混合物，将反应混合物置于37℃孵育5-30min；
步骤6)取步骤5)所得反应混合物加入反应稀释液稀释，将试纸条***稀释后的液体中，层析2-5min，肉眼进行检测结果判读。
优选的，上述的基于CRISPR/Cas12和核酸试纸的检测方法中，所述修饰为：phosphorothioate，2′-O-methyl或2′-O-methoxyethyl(MOE)nucleosides修饰。
优选的，上述的基于CRISPR/Cas12和核酸试纸的检测方法中，所述Cas12为FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a和Lb4Cas12a中一种。
本发明提供的另一技术方案为：提供一种基于CRISPR/Cas13和核酸试纸的检测方法，包括步骤：
步骤1)设计合成单链RNA报告分子；所述单链RNA报告分子的序列为5’-rNrNrN…-3’，长度为3-30碱基，所述单链RNA报告分子进行FAM，DIG，Biotin标记，同时对单链RNA报告分子进行防止RNA酶或是激活后cas13酶降解的修饰；
步骤2)设计合成用于扩增靶基因的并且带有T7转录启动子序列的RPA上下游引物；
步骤3)针对靶基因设计特异性的crRNA；
步骤4)将冻干RPA反应颗粒，RPA水化缓冲液，RPA上下游引物，待测靶标核酸与醋酸镁混合，所得置于37-42℃恒温条件下反应10-30min得RPA反应液；
步骤5)将包括RPA反应液、crRNA分子，Cas13和单链RNA报告分子RNA酶抑制剂，T7转录酶，镁离子，缓冲液的组分进行混合得反应混合物，将反应混合物置于37℃孵育5-30min；
步骤6)取步骤5)所得反应混合物加入反应稀释液稀释，将试纸条***稀释后的液体中，层析2-5min，肉眼进行检测结果判读。
优选的，上述的基于CRISPR/Cas13和核酸试纸的检测方法中，所述修饰为：phosphorothioate，2′-O-methyl或2′-O-methoxyethyl(MOE)nucleosides修饰。
优选的，上述的基于CRISPR/Cas13和核酸试纸的检测方法中，所述Cas13为PsmCas13b、LwaCas13a和Cca13b中一种
本发明的又一技术方案为提供一种人***瘤病毒检测试剂盒，包括crRNA、Cas12、RPA上下游引物、缓冲体系和单链DNA报告分子；
所述报告分子的序列为5’-NNN…-3’，长度为3-30碱基，报告分子进行FAM，DIG，Biotin标记，同时对核酸分子进行防止DNA酶或是激活后cas12降解的修饰；
所述crRNA为针对靶标基因设计特异性的crRNA，长度为17-25个核苷酸，在crRNA近5’端应存在序列：TTTN，所述PAM序列用于crRNA和cas12组成的复合物识别。
优选的，上述的新型冠状病毒检测试剂盒中，所述修饰为：phosphorothioate，2′-O-methyl或2′-O-methoxyethyl(MOE)nucleosides修饰。
优选的，上述的新型冠状病毒检测试剂盒中，所述RPA上下游引物序列为：
HPV16-F：SEQ ID NO：4
HPV16-R：SEQ ID NO：5
所述crRNA序列为：
crRNA-HPV16：SEQ ID NO：6。
优选的，上述的新型冠状病毒检测试剂盒中，所述Cas12为FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a和Lb4Cas12a中一种。
本发明有益效果在于：本发明的基于CRISPR/Cas12和核酸试纸的核酸检测方法和人***瘤病毒快速检测试剂盒具有以下优点：
1、相比于市面上现有的基于PCR核酸检测技术，具有以下优点：
1)快速：从样本到检测结果依据待测模板量，扩增效率和crRNA切割效率只需15-40min，其中样本处理5-10min，扩增检测反应10-30min。
2)准确：本发明具有极高的灵敏度，可以检测到单个核酸分子；同时，由于crRNA对单个碱基错配敏感，因而本发明特异性极好，能够检测样本中的单个核苷酸的突变。
3)便捷：由于本发明在恒温37℃进行，因此对设备要求极低，只需简单的恒温设备甚至利用体温也能使反应进行，有利于在基层检验机构普及。
2、相比于现有的基于CRISPR/Cas12的核酸检测技术，具有以下优点：
1)操作更简便：由于现有技术多采用荧光检测，因而需要借助荧光检测设备，本发明采用核酸试纸条进行检测，操作更为便捷，对缺乏仪器设备的地区意义重大。
2)特异性好：现有技术核酸试纸条检测方法会产生严重非特异性显色，对结果判读带来困难，本发明采用创新的报告分子设计和修饰，并结合相应试纸条，完全杜绝非特异性显色，对临床实际应用具有显著意义。
附图说明
图1为本发明具体实施方式中的实施例1的新型的报告分子和试纸条结构的组合示意图；
图2为本发明具体实施方式中的实施例1的传统的报告分子和试纸条结构的组合示意图；
图3为本发明具体实施方式中的实施例1的采用传统的试纸条和报告分子检测阳性样本和阴性样本的对照图；
图4为本发明具体实施方式中的实施例1的采用本发明的试纸条和报告分子检测阳性样本和阴性样本的对照图；
图5为本发明具体实施方式中的实施例2的新型的报告分子和试纸条结构的组合示意图；
图6为本发明具体实施方式中的实施例2的传统的报告分子和试纸条结构的组合示意图；
图7为本发明具体实施方式中的实施例2的采用传统的试纸条和单链DNA报告分子检测阳性样本和阴性样本的对照图；
图8为本发明具体实施方式中的实施例2的采用本发明的试纸条和单链DNA报告分子检测阳性样本和阴性样本的对照图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。
CRISPR/Cas12***具有准确，快速，便捷的特点，其和RPA相结合发展而来的核酸诊断技术摆脱了对精密的PCR仪的依赖，因此是核酸诊断发展的重要方向。当前主流方法是采用荧光信号对该***的结果进行判读。也有部分研究者使用试纸条对结果进行判读，但目前采用的试纸条都会产生严重的非特异性条带，本发明的目的是提供一种可以应用于CRISPR/Ca12和CRISPR/Cas13***的并且可以完全杜绝非特异性显色的探针和试纸条组合方式及其构造方法。
本发明通过下述技术路线实现：
1、CRISPR/Cas12***技术路线：
1)设计序列为5’-NNN…-3’的报告分子，长度可3-30碱基，对报告分子进行FAM，DIG，Biotin标记，同时对核酸分子进行防止DNA酶或是激活后cas12降解的修饰(包括但不限于phosphorothioate，2′-O-methyl或2′-O-methoxyethyl(MOE)nucleosides修饰)。
2)设计合成用于扩增靶基因的RPA上下游引物，引物长度为30-35个核苷酸。
3)针对靶标基因，设计特异性的crRNA，长度为17-25个核苷酸，在crRNA近5’端应存在TTTN序列(PAM序列，用于crRNA和cas12组成的复合物识别)。根据设计的crRNA序列，直接化学合成或者构建crRNA体外转录载体并用T7转录试剂盒进行体外转录和纯化；
4)将冻干RPA反应颗粒，RPA水化缓冲液，RPA上下游引物，待测靶标核酸与醋酸镁按适当比例混合。将反应混合物置于37-42℃恒温条件下反应10-30min(视待测模板量，扩增效率而定)。
5)取上述RPA反应液与crRNA分子，Cas12，单链DNA报告分子，RNA酶抑制剂，镁离子，缓冲液按适当比例混合，并将反应混合物置于37℃孵育5-30min。
6)取上述反应混合物加入适量反应稀释液(Tris-HCL,PH＝7-8)，将试纸条***稀释后的液体中，室温下层析2-5min，肉眼进行结果判读并用拍照。
2、CRISPR/Cas13***技术路线：
1)设计序列为5’-rUrUrU…-3’的报告分子，长度可3-30碱基，对报告分子进行FAM，DIG，Biotin标记，同时对核酸分子进行防止RNA酶或是激活后cas13酶降解的修饰(包括但不限于phosphorothioate，2′-O-methyl或2′-O-methoxyethyl(MOE)nucleosides修饰)。
2)设计合成用于扩增靶基因的并且带有T7转录启动子序列的RPA上下游引物。
3)针对靶标基因，设计特异性的crRNA，根据设计的crRNA序列，直接化学合成或者构建crRNA体外转录载体并用T7转录试剂盒进行体外转录和纯化；
4)将冻干RPA反应颗粒，RPA水化缓冲液，RPA上下游引物，待测靶标核酸与醋酸镁按适当比例混合。将反应混合物置于37-42℃恒温条件下反应10-30min(视待测模板量，扩增效率而定)。
5)取上述RPA反应液与crRNA分子，Cas13，单链RNA报告分子，RNA酶抑制剂，T7转录酶，镁离子，缓冲液按适当比例混合，并将反应混合物置于37℃孵育5-30min。
6)取上述反应混合物加入适量反应稀释液(Tris-HCL,PH＝7-8)，将试纸条***稀释后的液体中，室温下层析2-5min，肉眼进行结果判读并拍照。
实施例1
一种基于CRISPR/Cas12和核酸试纸的检测方法，以下以检测人源β肌动蛋白(ACTB)为例描述该方法的操作步骤：
1)在人源β肌动蛋白区域寻找5’-TTTN-3’序列设计并合成crRNA；在crRNA的上下游设计引物序列，本发明中所使用crRNA和引物均由上海生工合成。合成并采用硫代修饰报告分子，并且制作核酸试纸条，本发明中所采用的报告分子和试纸条结构和组合方式如图1和图2所示。
本示例中选用的引物，crRNA，报告分子序列如下表1所示：
表1
2)用咽拭子取健康志愿者样本，加入到如下表2配方的快速裂解液中，于80℃裂解5分钟。
表2
| 试剂 | 浓度 |
| 胍盐酸 | 800mM |
| 吐温20 | 0.5％ |
| 聚乙二醇辛基苯基醚 | 1％ |
| DEPC水 | - |
3)取2μL步骤1)中的裂解液加入到RPA反应颗粒，并加入适当比例RPA水化缓冲液，RPA上下游引物，纯水和醋酸镁。将反应混合物置于42℃恒温条件下反应30min。本发明采用安普未来等温扩增试剂盒(DNA基础型)。
本发明中RPA反应液配比如下表3所示。
表3
4)取RPA产物10μL加入到40μL crRNA，cas12a和单链DNA报告分子反应检测液中，37℃反应20分钟。
本发明中cas12a检测液配比如下表4所示。
表4
5)取10μL切割产物，用稀释液稀释到100μL，将稀释物滴加到试纸条上，肉眼观察结果并拍照。采用传统的试纸条和报告分子组合的阳性样本在检测线处(T)出现明显条带，同时阴性样本在检测线处也出现微弱信号(图3)；用本发明的报告分子和试纸条组合检测的阳性样本在检测线处出现明显条带，阴性样本在检测线处无条带，显示出很好的特异性(图4)。
实施例2
一种人***瘤病毒检测试剂盒，包括crRNA、Cas12、RPA上下游引物、缓冲体系和单链DNA报告分子；具体设计使用如下：
1)在人***瘤病毒的保守L1基因区域寻找5’-TTTN-3’序列，设计并合成crRNA；在crRNA的上下游设计引物序列，本发明中所使用crRNA和引物均由上海生工合成。合成并修饰报告分子，并且制作核酸试纸条，本发明中所采用的报告分子和试纸条结构和组合方式如图5和图6所示。
本示例中选用引物，crRNA，报告分子序列如下表5所示。
表5
2)取RPA反应颗粒，并加入适当比例RPA水化缓冲液，RPA上下游引物，待测核酸，纯水和醋酸镁。将反应混合物置于37℃恒温条件下反应30min。本发明采用安普未来等温扩增试剂盒(DNA基础型)。本发明中RPA反应液配比如上表3。
3)取RPA产物10μL加入到40μL crRNA，cas12a和报告分子反应检测液中，37℃反应20分钟。本发明中cas12a检测液配比如上表4。
5)取10μL切割产物，用稀释液稀释到100μL，将稀释物滴加到试纸条上，肉眼观察结果并拍照。采用传统的试纸条和报告分子组合的阳性样本在检测线处(T)出现明显条带，同时阴性样本在检测线处也出现微弱信号(图7)；用本发明的报告分子和试纸条组合检测的阳性样本在检测线处出现明显条带，阴性样本在检测线处无条带，显示出很好的特异性(图8)。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 亚能生物技术(深圳)有限公司
<120> 基于CRISPR/Cas和核酸试纸的检测方法和人***瘤病毒检测试剂盒
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtggatcag caagcaggag tatgacgagt cc 32
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caggcagcag taggggaact tctcctgcta gaat 34
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cggtggacga tggaggggcc gg 22
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggttacaacg agcacagggc cacaataatg gca 33
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cccatgtcgt aggtactcct taaagttagt atttt 35
<210> 6
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
uaauuucuac uaaguguaga uugaaguaga uauggcagca c 41
Claims (4)
1.一种基于CRISPR/Cas和核酸试纸的检测方法，其特征在于，包括步骤：
步骤1）设计合成单链DNA报告分子；所述单链DNA报告分子序列为5’- T*TTATT-3’，所述单链DNA报告分子进行FAM，DIG，Biotin标记，同时对单链DNA报告分子进行防止DNA酶或是激活后cas12酶降解的修饰；在所述单链DNA报告分子5’端进行Biotin和DIG标记，3’进行FAM标记；在单链DNA报告分子的Biotin和DIG中间进行防止DNA酶或是激活后cas12酶降解的修饰；所述修饰为在所述单链DNA报告分子的T*TTATT序列中*位置两个T之间的磷酸二酯键进行硫代修饰；
步骤2）设计合成用于扩增靶基因的RPA上下游引物；所述靶基因为人源肌动蛋白基因序列；
步骤3）针对靶基因设计特异性的crRNA，在crRNA近5’端存在PAM序列：TTTN，所述PAM序列用于crRNA和cas12组成的复合物识别；
所述RPA上下游引物序列为：
ACTB-F1：SEQ ID NO：1；
ACTB-R1：SEQ ID NO：2；
所述crRNA序列为：
crRNA-ACTB：SEQ ID NO：3；
步骤4）将冻干RPA反应颗粒，RPA水化缓冲液，RPA上下游引物，待测靶标核酸与醋酸镁混合，所得置于37-42℃恒温条件下反应10-30min得RPA反应液；
步骤5）将包括RPA反应液、crRNA分子，Cas12和单链DNA报告分子、RNA酶抑制剂，镁离子，缓冲液的组分进行混合得反应混合物，将反应混合物置于37℃孵育5-30min；
步骤6）取步骤5）所得反应混合物加入反应稀释液稀释，将试纸条***稀释后的液体中，层析2-5min，肉眼进行检测结果判读。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas和核酸试纸的检测方法，其特征在于，所述Cas12为FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、 BoCas12a和Lb4Cas12a中一种。
3.一种人***瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，包括crRNA、Cas12、RPA上下游引物、缓冲体系和单链DNA报告分子；
所述单链DNA报告分子为5’-T*TTATT-3’，所述单链DNA报告分子进行FAM，DIG，Biotin标记，同时对核酸分子进行防止DNA酶或是激活后cas12降解的修饰；在所述单链DNA报告分子5’端进行Biotin和DIG标记，3’进行FAM标记；在单链DNA报告分子的Biotin和DIG中间进行防止DNA酶或是激活后cas12酶降解的修饰；所述修饰为在所述单链DNA报告分子的T*TTATT序列中*位置两个T之间的磷酸二酯键进行硫代修饰；
所述crRNA为针对靶标基因设计特异性的crRNA，在crRNA近5’端存在PAM序列：TTTN，所述PAM序列用于crRNA和cas12组成的复合物识别；
所述RPA上下游引物序列为：
HPV16-F：SEQ ID NO：4
HPV16-R：SEQ ID NO：5
所述crRNA序列为：
crRNA-HPV16 ：SEQ ID NO：6。
4.根据权利要求3所述的人***瘤病毒检测试剂盒，其特征在于，所述Cas12为FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a和Lb4Cas12a中一种。
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