CN115838834A

CN115838834A - 一种基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系

Info

Publication number: CN115838834A
Application number: CN202211211966.0A
Authority: CN
Inventors: 李永东; 张丹丹; 徐荣; 焦素黎; 倪红霞
Original assignee: Ningbo Municipal Center For Disease Control & Prevention
Current assignee: Ningbo Municipal Center For Disease Control & Prevention
Priority date: 2022-09-30
Filing date: 2022-09-30
Publication date: 2023-03-24

Abstract

本发明公开了一种基于RT‑RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系，包括反转录重组聚合酶扩增体系和CRISPR/Cas12a切割体系，所述RT‑RAA等温扩增体系包括人鼻病毒A型和C型的RT‑RAA引物对、RNase抑制剂、模板RNA、无核酸酶水、缓冲液和醋酸镁；所述CRISPR/Cas12a切割体系包括：针对人鼻病毒A型和C型的特异性crRNA、Cas12a蛋白、ssDNA报告分子、NEB2.1缓冲体系、RNase抑制剂和无核酸酶水；所述特异性crRNA为针对人鼻病毒A型和C型保守序列片段设计合成；所述ssDNA报告分子包括用于酶标仪荧光检测的ssDNAFAMreporter，实时荧光检测器或用于免疫胶体金试纸条检测的ssDNALFAreporter。本发明具有灵敏度高、特异性强、耗时短，适用于对人鼻病毒A型和C型的现场快速高灵敏检测。

Description

一种基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系

技术领域

本发明涉及一种检测体系、方法以及用途，特别涉及一种基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系、方法以及用途。

背景技术

人鼻病毒(human rhinovirus，HRV)血清型已经超过120多种。人鼻病毒是一种无包膜、单股正链RNA病毒，基因组大约7200bp，属于小核糖核酸病毒科肠病毒属。人鼻病毒A型和C型被认为是儿童呼吸道病毒感染的主要致病病毒，可导致三分之二的普通感冒以及与哮喘恶化和呼吸困难等慢性肺病的病因。该病毒主要感染对象是婴幼儿和学前儿童，以及免疫力低下的人群。该病毒主要流行季节是春季和秋季，主要临床症状为鼻塞、打喷嚏、头痛、轻度喉咙痛、发烧以及下呼吸道疾病。该病毒变异快、环境抵抗力强、感染剂量低，感染后潜伏期短、排毒时间长、免疫保护时间短，且传播途径多样。因此，人鼻病毒具有高度传染性和快速传播能力。其中，鼻病毒A型和C型为最常见的致人感冒及其他下呼吸道相关疾病的鼻病毒亚型。目前，针对人鼻病毒A型或C型尚无特效的抗病毒药物和疫苗，其预防控制主要利用非药物性预防措施。因此，及时有效地检测患者是否感染鼻病毒A型或C型，对临床早期诊断和精准防控具有重要意义，且病原体的检测是疾病确诊的前提条件。

目前人鼻病毒A型和C型检测的方法主要有病毒分离培养法、免疫学方法和核酸检测法。病毒分离培养法虽有“金标准”之称，但其操作复杂，耗时长，且成本较高，不适合早期诊断；免疫学方法是目前最为广泛的技术，但由于人鼻病毒A、C血清型较多及缺乏常见的群抗原，所以抗原检测和血清学检测无法大规模使用；核酸检测最常用的分子诊断方法为实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术，但该方法需要昂贵的特殊设备及专业人员。

CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫***，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来靶标核酸。其中，CRISPR/Cas9蛋白家族已被广泛应用到基因编辑、抗病毒制剂和生物影像等众多领域。CRISPR/Cas12a属于Cas酶第二家族，用来引导RNA指导双链DNA裂解单个RuvC催化结构域。CRISPR/Cas12a酶识别富含胸腺嘧啶核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)，催化它们自身的指导CRISPR RNA(crRNA)成熟，并产生具有交错5'的PAM远端dsDNA断裂和3'端不通顺。当CRISPR/Cas12a蛋白以序列特异性方式切割双链DNA时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性。基于CRISPR/Cas12a上述特性，我们开发了一种快速准确的鼻病毒A和C型检测方法。从待检临床样品中提取基因组DNA，并在等温条件下进行基础型逆转录等温扩增(RT-RAA)。CRISPR/Cas12a-crRNA复合物结合靶标DNA，其介导CRISPR/Cas12a对ssDNA的切割活性。此外，与ssDNA偶联的荧光报告分子在切割时产生荧光信号，或荧光素与生物素分离呈游离态，可通过胶体金试纸条检测结果。

胶体金免疫测定是临床快速检测的一种高效技术方案。当胶体金颗粒标记的抗体与相应的抗原结合时，可目视检测有色免疫反应物。胶体金检测作用时间短、可以长期稳定保存以及相对低成本，这些特性使其广泛适用室外或基层针对人鼻病毒A型和C型核酸的高特异性，高灵敏度，方便快捷的即时检测。目前，尚未见基于CRISPR/Cas12a检测技术的人鼻病毒A型和C型检测的相关研究。

发明内容

本发明主要是解决现有技术所存在的技术问题，从而提供一种基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系、方法以及用途，具有检测快速，高灵敏度和高特异性的优势。

本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：

一种基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系，包括RT-RAA体系和CRISPR/Cas12a检测体系；所述RT-RAA体系为RT-RAA等温扩增体系。

所述RT-RAA体系包括基于人鼻病毒A型和C型共同保守序列设计的RT-RAA引物对，所述RT-RAA引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述CRISPR/Cas12a检测体系包括的基于人鼻病毒A型和C型核酸设计的crRNA，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

可选的，所述RT-RAA体系还包括无核酸酶水、缓冲液、镁离子。

可选的，所述RT-RAA体系还包括：

正向引物，浓度10μM，体积2μL；

反向引物，浓度10μM，体积2μL；

2×缓冲液，体积25μL；

镁离子，浓度280-300mM，体积2-3μL；

无核酸酶水，体积13.5-14.5μL。

可选的，该人鼻病毒A型和C型检测体系还包括crRNA制备所需的DNA单链序列组，crRNA制备所需的DNA单链序列组包括crRNA1制备所需的DNA单链序列组或crRNA2制备所需的DNA单链序列组；所述crRNA1制备所需的DNA单链序列组包括crRNA1-F和crRNA1-R，crRNA1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，crRNA1-R核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述crRNA2制备所需的DNA单链序列组包括crRNA2-F和crRNA2-R，所述crRNA2-F核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述crRNA2-R核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

可选的，所述CRISPR/Cas12a检测体系还包括Cas12a蛋白、ssDNA报告分子、缓冲液、无核酸酶水；

可选的，ssDNA报告分子为5’-F-TTATTATT-Q-3’，所述F为荧光素，Q为荧光淬灭剂；ssDNALFAreporter为5’-F-TTATTATT-B-3’，F为FAM，B为生物素。

更可选的，F为6-羧基荧光素，Q为荧光淬灭剂BHQ1；F为6-羧基荧光素，B为生物素。

可选的，所述缓冲液为NEB2.1缓冲液。

可选的，所述CRISPR/Cas12a检测体系包括：

NEB2.1缓冲液，5μL；

crRNA，50-200nM，1-10μL；

ssDNA报告分子，1-2μM，2μL；

Cas12a蛋白，1-2.5μM，1-2μL；

无核酸酶水，26-32μL；

可选的，所述CRISPR/Cas12a检测体系包括：

NEB2.1缓冲液，5μL；

crRNA，100nM，5μL；

ssDNA报告分子，1μM，2μL；

Cas12a蛋白，2.5μM，2μL；

无核酸酶水，36μL。

一种基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系制备检测人鼻病毒A型和C型核酸产品的用途。

一种基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系用于非疾病诊断检测人鼻病毒A型和C型核酸的方法，包括如下步骤：

步骤1、将待测样品DNA加入RT-RAA体系中进行RT-RAA等温扩增，得到RT-RAA扩增产物；

步骤2、将RT-RAA扩增产物加入CRISPR/Cas12a检测体系中进行反应；

步骤3、实时检测步骤2中CRISPR/Cas12a检测体系荧光变化，绘制荧光曲线；所绘制荧光曲线中，将随时间延长荧光值呈曲线上升的检测结果判定为阳性；将随时间延长荧光值呈水平线的结果判定为阴性；或将免疫胶体金试纸条***到步骤2中反应后的CRISPR/Cas12a检测体系中，在10min内即出现控制线和检测线两条条带的检测结果判定为阳性；10min内仅在控制线处出现条带的结果判定为阴性。

可选的，所述步骤1步骤中，RT-RAA等温扩增条件为：37-40℃反应20-30min；

更加优选的，RT-RAA等温扩增条件为：39℃反应20min。

可选的，所述步骤2步骤中，所述反应条件为：37-40℃反应20-30min；

更加优选的，所述反应条件为：37℃反应30min。

本发明技术方案，具有如下优点：

1、本发明通过利用RT-RAA技术结合CRISPR/Cas12a检测体系联合，基于RT-RAA的靶向DNA特异性放大体系，以及CRISPR/Cas12a-crRNA复合物结合RT-RAA制备的靶标DNA，激活Cas12a蛋白的无差别的反式DNA切割活性，对报告分子ssDNA FAM reporter或ssDNA LFAreporter的反式切割，报告分子被切割后会产生荧光信号，进而实现对人鼻病毒A型和C型核酸的高灵敏度、高特异性的快速检测，具有耗时短、操作简单且不依赖大型实验设备等优势。人鼻病毒A型和C型常用的检测方法为RT-qPCR，其检测限达10³copies/μL，本发明实验表明本发明试剂盒建立的检测方法灵敏度高于RT-qPCR，检测限可达0.1copies/μL。

2.本发明提供一种利用基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测方法，在恒温条件下，全程1h内就能完成样品核酸提取以及检测。对设备要求不高，只需简单的恒温设备即可使反应进行，有利于在硬件资源有限的环境下开展核酸检测。

3、本发明提供一种利用基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测方法，可通过荧光观测结果。当使用荧光检测时，CRISPR/Cas12a检测体系中报告分子为ssDNAFAM reporter或ssDNA LFA reporter，当反应结束，即可通过荧光值观测结果。本发明建立的检测方法适用于基层医疗人员开展快速及时的病毒检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系的灵敏度分析结果；

图2是本发明实施例1中基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系的特异性分析结果；图中：HBoV：人博卡病毒，HmPV：人偏肺病毒，HRV-B：人鼻病毒B型，ADV：腺病毒，RSV：人合胞病毒，HRV-A/C型：人鼻病毒A型和C型共同保守序列，NC：阴性对照样品。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

如图1至图2所示，一种基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系、方法以及用途。

本发明中RT-RAA体系中的无核酸酶水(RNase free water)、缓冲液(RehydrationBuffer)和醋酸镁(MgAc)来自乐尚生物公司试剂盒(Lesun，产品编号：LS-RNA01)；体外转录试剂盒In vitro Transcription T7 Kit，购自TaKaRa公司；RT-RAA引物对和报告分子ssDNA FAM reporter和ssDNA LFA reporter合成分别由上海生工和通用生物***(安徽)有限公司完成；硕世生物科技公司的核酸快速提取试剂盒(磁珠法)提取制备临床人鼻病毒A型和C型的样本核酸；等温扩增仪为Axxin ISO-T8。

pBluescript II SK+载体，由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；载体菌TOP10，由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

实施例1：人鼻病毒A型和C型标准RNA的制备及RT-RAA引物对和crRNA。

本发明实施例通过大量的实验，发现选自人鼻病毒A/C型保守基因VP-4中的一段基因片段(其cDNA序列如SEQ ID NO.8所示，所述基因片段命名为人鼻病毒A型和C型共同保守序列片段)，依据该人鼻病毒A型和C型共同保守序列片段特别设计的RT-RAA引物对以及crRNA可以高灵敏度和高特异性的检测人鼻病毒A型和C型。

人鼻病毒A型和C型共同保守序列片段的核苷酸序列：

5’-ATCGTTATCCGCAAAGTGCCTACGAGAAGCCTAGATCGTTATCCGCAAGATGCCTACACAAAGCCTAGTACTTTTGATGTAACTAGGTTGGTCGCTCCCTGCAAACCCAGCAGTAGACCTGGCAGATGAGGCTGAGTAGACCTGGCAGATGAGGCTAGAAAATCCCCACTGGTAACAGTGTTCTAGCCTGCGTGGCTGCCTGCTCACCCTATTGGGTGAGAAGCCAAATAATGGACAAGGTGTGAAGAGCCCCGTGTGCTCGCTTTAGGAGTCCTCCGGCCCCTGAATGTGGCTAACCTTAACCCTGCAGCTATTGCACACAATCCAGTGTGTTGATAGTCGTAATGGGCAACTGTGGGATGGAACCAACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC-3’(SEQ ID NO.8)。

设计的用于扩增人鼻病毒A型和C型共同保守序列片段的RT-RAA引物对，包括正向引物(RT-RAA-F)和反向引物(RT-RAA-R)，如下：

RT-RAA-F：5’-TAGACCTGGCAGATGAGGCT-3’(SEQ ID NO.1)；

RT-RAA-R：5’-CACATTCAGGGGCCGGAGGA-3’(SEQ ID NO.2)。

寻找包含CRISPR/Cas12a识别序列TTTN(N表示碱基A、T、C或G)的靶向序列，基于靶向人鼻病毒A型和C型共同保守序列片段设计的crRNA，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，如下：

5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUAGACCUGGCAGAUGAGGCU-3’(SEQ ID NO.3)。

5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGCCUGCGUGGCUGCCUGC-3’(SEQ ID NO.3)。

实施例2：crRNA的制备。

crRNA序列采用体外转录的方式制备，用于制备crRNA所需的DNA单链序列组，DNA单链序列组包括crRNA1制备所需的DNA单链序列组或crRNA2制备所需的DNA单链序列组；所述crRNA1制备所需的DNA单链序列组包括crRNA1-F和crRNA1-R，所述crRNA2制备所需的DNA单链序列组包括crRNA2-F和crRNA2-R。上述crRNA制备所需的DNA单链序列组包括：T7启动子序列(1-26nt)，该序列在crRNA的体外转录过程用于T7RNA聚合酶的识别与结合；Cas蛋白结合的锚定支架序列(27-46nt)，该序列会产生稳定的发卡结构，有助于形成Cas12a/crRNA/靶序列复合物；以及和靶向序列互补的向导序列(28-66nt)，该片段通过与靶向序列的特异性识别和互补配对，从而促进Cas12a/crRNA/靶序列三体复合物的形成，进一步激活Cas12a的反式剪切活性，实现针对人博卡病毒的精准检测。

人工合成的DNA单链序列组，如crRNA1-F和crRNA1-R所示：

crRNA1-F:

5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATTAGACCTGGCAGATGAGGCT-3’(SEQ ID NO.4)；

crRNA1-R:

5’-AGCCTCATCTGCCAGGTCTAATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC-3’(SEQ ID NO.5)。

人工合成的DNA单链序列组，如crRNA2-F和crRNA2-R所示

crRNA2-F:

5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATAGCCTGCGTGGCTGCCTGC-3’(SEQ ID NO.6)；

crRNA2-R:

5’-GCAGGCAGCCACGCAGGCTATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC-3’(SEQ ID NO.7)。

以上设计的DNA单链序列组，由金唯智公司直接化学合成，再经退火后再通过IVT试剂盒(厂家NEB，Ipswich，UK、货号E2060S)得到crRNA(SEQ ID NO.3所示)。

实施例3：一种基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系。

本实施例提供了一种基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系，包括独立包装的RT-RAA体系和CRISPR/Cas12a检测体系；

RT-RAA体系包括：

正向引物(如SEQ ID NO.1所示)，浓度10μM，体积2μL；

反向引物(如SEQ ID NO.2所示)，浓度10μM，体积2μL；

2×缓冲液，体积25μL；

镁离子(醋酸镁)，浓度280mM，体积3μL；

无核酸酶水，体积13μL。

CRISPR/Cas12a检测体系：

NEB 2.1缓冲液，5μL；

crRNA(如SEQ ID NO.3所示)，100nM，5μL；

ssDNA报告分子，1μM，2μL；

Cas12a蛋白，2.5μM，2μL；

无核酸酶水，36μL。

ssDNA LFA reporter为5’-F-TTATTATT-B-3’，F为FAM，B为生物素。

实施例4：一种基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系。

RT-RAA体系包括：

正向引物(如SEQ ID NO.1所示)，浓度10μM，体积2μL；

反向引物(如SEQ ID NO.2所示)，浓度10μM，体积2μL；

2×缓冲液，体积25μL；

镁离子(醋酸镁)，浓度280mM，体积3μL；

无核酸酶水，体积13μL。

CRISPR/Cas12a检测体系：

NEB2.1缓冲液，5μL；

crRNA(如SEQ ID NO.3所示)，50nM，10μL；

ssDNA报告分子，2μM，2μL；

Cas12a蛋白，2.5μM，2μL；

无核酸酶水，31μL。

ssDNA FAM reporter报告分子为5’-F-TTATTATT-Q-3’，所述F为荧光素，Q为荧光淬灭剂，F为6-羧基荧光素，Q为荧光淬灭剂BHQ1；ssDNA LFA reporter为5’-F-TTATTATT-B-3’，F为FAM，B为生物素。

实施例5：一种基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系。

RT-RAA体系包括：

正向引物(如SEQ ID NO.1所示)，浓度10μM，体积2μL；

反向引物(如SEQ ID NO.2所示)，浓度10μM，体积2μL；

2×缓冲液，体积25μL；

镁离子(醋酸镁)，浓度300mM，体积3μL；

无核酸酶水，体积13μL。

CRISPR/Cas12a检测体系：

NEB 2.1缓冲液，5μL；

crRNA(如SEQ ID NO.3所示)，100μM，5μL；

ssDNA报告分子，1μM，2μL；

Cas12a蛋白，2.5μM，2μL；

无核酸酶水，31μL。

实施例6：一种检测人鼻病毒A型和C型核酸的方法。

本实施例提供了利用实施例3中的试剂盒检测人鼻病毒A型和C型核酸的方法，包括如下步骤：

(1)人鼻病毒A型和C型基因组RNA的提取

取200μL临床组织液，根据江苏硕世生物公司提供的核酸快速提取试剂盒(磁珠法)(SDKF60101)以及全自动核酸提取仪(SSNP-3000A)提取待测样品RNA，具体的操作参见该试剂盒产品说明书。

(2)靶向核酸RT-RAA扩增

将步骤(1)中的待测样品RNA(3-5微升)加入RT-RAA体系中，置于39℃反应30min。

(3)CRISPR/Cas12a体系检测

将步骤(2)中获得的RT-RAA扩增产物(5μL)加入到CRISPR/Cas12a检测体系中，混合均匀后置于37℃反应30min，使用等温扩增仪ISO-T8测量检测反应的荧光，监测荧光动力学，其中激发波长为495nm，发射波长为520nm，每10s检测一次，持续检测30min，将检测15min的荧光数值为反应值。

实施例7：一种检测人鼻病毒A型和C型核酸的方法。

本实施例与实施例6的区别在于，利用实施例4中的试剂盒检测人鼻病毒A型和C型核酸的方法；步骤(2)中，RT-RAA等温扩增条件为：39℃反应30min；步骤(3)中，混合均匀后置于37℃反应30min。

实施例8：一种检测人鼻病毒A型和C型核酸的方法。

本实施例与实施例6的区别在于，利用实施例5中的试剂盒检测人鼻病毒A型和C型核酸的方法；步骤(2)中，RT-RAA等温扩增条件为：39℃反应20min；步骤(3)中，混合均匀后置于37℃反应20min，反应结束后，将免疫胶体金试纸条(Tiosbio cas12/13专用核酸检测试纸条，南京沃博生物科技有限公司)***到反应后的CRISPR/Cas12a检测体系中，在10min内即出现控制线和检测线两条条带的检测结果判定为阳性；10min内仅在控制线处出现条带的结果判定为阴性。

对比例1：一种检测人鼻病毒A型和C型核酸的方法。

本对比例与实施例6的区别在于，RT-RAA引物对的正向引物为5’-TAGACCTGGCAGATGAGGCT-3’(SEQ ID NO.1)和反向引物5’-CACATTCAGGGGCCGGAGGA-3’(SEQID NO.2)，crRNA的核苷酸序列为5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGACAAGGUGUGAAGAGCC-3’(SEQID NO.39)，针对的人鼻病毒A/C型的靶点序列为GACAAGGTGTGAAGAGCC。

对比例2：一种检测人鼻病毒A型和C型核酸的方法。

本对比例与实施例6的区别在于，RT-RAA引物对的正向引物为5’-TAGACCTGGCAGATGAGGCT-3’(SEQ ID NO.1)和反向引物5’-CACATTCAGGGGCCGGAGGA-3’(SEQID NO.2)，crRNA的核苷酸序列为5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCCUCCGGCCCCUGAAUGUG-3’(SEQ ID NO.310)，针对的人鼻病毒A型和C型的靶向序列为TCCTCCGGCCCCTGAATGTG。

实施例1灵敏度和特异性检测

标准模板RNA的制备

由上海生工公司合成人鼻病毒A型和C型共同保守序列片段(SEQ ID NO.8)并构建到pBluescript II SK+载体的EcoRⅠ位点，命名为pBlu-HRV-V，继而转化入载体菌TOP10内；

在添加了200μg/mL(终浓度)氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养8-12h后，按照质粒小提试剂盒(TIANprep Mini Plasmid Kit，购自TIANGEN公司，目录号DP103)说明书进行质粒提取，进而利用IVT试剂盒进行体外转录制备标准RNA。最后，通过超微量分光光度计(B-500Biophotometer，上海元析仪器有限公司)测得提取的RNA浓度，并计算拷贝数。

1、灵敏度检测

将人鼻病毒A型和C型的标准模板质粒RNA，进行梯度稀释，制备浓度从1.05×10³copies/μl到5.0×10^-2copies/μl的系列浓度的标准模板质粒RNA，将其作为模板RNA(待测样品)。阴性对照：模板RNA用灭菌双蒸水替代。然后按照实施例6(或对比例1、或对比例2)实施，结果如图1所示，当模板浓度为0.1copies/μl时，荧光曲线仍有上升，则该方法检测人鼻病毒A型和C型的灵敏度可达0.1copies/μl。

而对比例1的结果显示表明，该条crRNA不能够有效地激活Cas12a蛋白剪切活性。

对比例2的结果显示表明，该条crRNA序列不能够与Cas12a蛋白以及靶标特异性结合结，从而不能够激活Cas12a蛋白剪切活性。

2、特异性检测

将人鼻病毒A型和C型的RNA、人偏肺病毒核酸、人合胞病毒合胞、腺病毒核酸、人鼻病毒B型核酸、人博卡病毒核酸作为模板(浓度为1.0×10²copies/μl)。然后按照实施例6(或对比例1、或对比例2)实施，结果如图2所示，人鼻病毒A型和C型的检测体系与其他病原体并无交叉反应，特异性较好。

而对比例1的结果显示表明，所用的crRNA与靶向分子及Cas12a蛋白特异性结合效率差，导致不能激活Cas12a蛋白的切割活性。

对比例2的结果显示表明，所用的crRNA与靶向核酸及Cas12a蛋白特异性结合效率低，不能有效地激活Cas12a蛋白无差别切割活性。

实施例2对人鼻病毒A型或C型临床样品的核酸检测

为了进一步评价本发明建立的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A/C型检测体系及检测方法的效果，对35份疑似HRV临床样品，利用江苏硕世生物公司提供的核酸快速提取试剂盒(磁珠法)(SDKF60101)以及全自动核酸提取仪(SSNP-3000A)提取待测样品RNA，分别按照实施例6和人鼻病毒试剂盒进行核酸检测。

选取35份临床样品进行分析，其中31份为人鼻病毒A型或C型阳性样品，有4份为人鼻病毒A型和C型阴性样品；结果临床样品的检测结果如表1所示，只有28份阳性检测结果与RT-qPCR检测试剂盒检测一致，即本发明建立的检测方法的检测结果与RT-qPCR检测结果一致率为90.3％(表1)。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系，其特征在于：其包括RT-RAA体系和CRISPR/Cas12a检测体系；

所述CRISPR/Cas12a检测体系包括基于人鼻病毒A型和C型共同保守序列设计的crRNA，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系，其特征在于：所述RT-RAA体系还包括无核酸酶水、缓冲液和镁离子。

3.根据权利要求2所述的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系，其特征在于：所述RT-RAA体系还包括：

正向引物，浓度10μM，体积2μL；

反向引物，浓度10μM，体积2μL；

2×缓冲液，体积25μL；

镁离子，浓度280-300mM，体积2-3μL；

无核酸酶水，体积13.5-14.5μL。

4.根据权利要求1～3任一项所述的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系，其特征在于：该人鼻病毒A型和C型检测体系还包括crRNA制备所需的DNA单链序列组，所述crRNA制备所需的DNA单链序列组包括crRNA1制备所需的DNA单链序列组或crRNA2制备所需的DNA单链序列组；所述crRNA1制备所需的DNA单链序列组包括crRNA1-F和crRNA1-R，crRNA1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，crRNA1-R核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述crRNA2制备所需的DNA单链序列组包括crRNA2-F和crRNA2-R，所述crRNA2-F核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述crRNA2-R核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述CRISPR/Cas12a检测体系还包括Cas12a蛋白、ssDNA报告分子、缓冲液和无核酸酶水；

ssDNA报告分子分别为ssDNAFAM reporter为5’-F-TTATTATT-Q-3’，F为荧光素，Q为荧光淬灭剂和ssDNA LFA reporter为5’-F-TTATTATT-B-3’，F为FAM，B为生物素。

缓冲液为NEB 2.1缓冲液。

5.根据权利要求4所述的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系，其特征在于：所述CRISPR/Cas12a检测体系包括：

NEB 2.1缓冲液，5μL；

crRNA，10-200nM，1-10μL；

ssDNA报告分子，1-2μM，2-4μL；

Cas12a蛋白，1-2.5μM，1-4μL；

无核酸酶水，26-32μL；

所述CRISPR/Cas12a检测体系中包括：

NEB 2.1缓冲液，5μL；

crRNA，1μM，1μL；

ssDNA报告分子，1μM，2μL；

Cas12a蛋白，2.5μM，2μL；

无核酸酶水，30.5μL。

6.一种基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系在制备检测人鼻病毒A型和C型核酸产品中的用途。

7.一种基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系用于非疾病诊断的检测人鼻病毒A型和C型核酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤1、将待测样品RNA加入RT-RAA体系中进行RT-RAA等温扩增，得到RT-RAA扩增产物；

步骤3、实时检测步骤2中CRISPR/Cas12a检测体系荧光变化，绘制荧光曲线；所绘制荧光曲线中，将随时间延长荧光值呈曲线上升的检测结果判定为阳性；将随时间延长荧光值呈水平线的结果判定为阴性；或将免疫胶体金试纸条***到步骤2中反应后的CRISPR/Cas12a检测体系中，在5min内即出现控制线和检测线两条条带的检测结果判定为阳性；5min内仅在控制线处出现条带的结果判定为阴性。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤1中，RT-RAA等温扩增条件为：37-40℃反应20-30min；

RT-RAA等温扩增条件优选为：39℃反应20min。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述步骤2中进行反应条件为：37-40℃反应20-30min；优选的反应条件为：39℃反应30min。

10.根据权利要求4所述的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A/C型检测体系，其特征在于：F为6-羧基荧光素，Q为荧光淬灭剂BHQ1，B为生物素。