CN114410752A - 一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114410752A
CN114410752A CN202210078298.2A CN202210078298A CN114410752A CN 114410752 A CN114410752 A CN 114410752A CN 202210078298 A CN202210078298 A CN 202210078298A CN 114410752 A CN114410752 A CN 114410752A
Authority
CN
China
Prior art keywords
guide rna
artificial sequence
nucleic acid
silent
cas
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210078298.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114410752B (zh
Inventor
周小明
胡梦露
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Normal University
Original Assignee
South China Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Normal University filed Critical South China Normal University
Priority to CN202210078298.2A priority Critical patent/CN114410752B/zh
Publication of CN114410752A publication Critical patent/CN114410752A/zh
Priority to PCT/CN2022/091068 priority patent/WO2023137926A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114410752B publication Critical patent/CN114410752B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于光控的CRISPR‑Cas核酸检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括沉默引导RNA和Cas蛋白；沉默引导RNA是由沉默核苷酸和引导RNA通过退火杂交形成；引导RNA是根据靶标核酸序列设计的，包含重复区和间隔区两个区域；沉默核苷酸与引导RNA的间隔区序列完全互补配对，或者与引导RNA的重复区序列完全配对；沉默核苷酸的碱基之间采用PC linker连接；Cas蛋白为Cas12蛋白或Cas13蛋白。本申请将核酸扩增和CRISPR‑Cas检测在时间上分开，但是可以实现在一个试管里面封闭完成，避免了开盖试剂转移过程，在确保高的检测灵敏度的同时，又保证了检测不受气溶胶污染影响。

Description

一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒及检测方法。
背景技术
目前，CRISPR-Cas***，如CRISPR-Cas12和CRISPR-Cas13***，已广泛地应用于核酸诊断领域，但是单独的CRISPR-Cas检测体系灵敏度仍然难以达到PCR的水平，所以当前基于CRISPR-Cas发展起来的核酸检测方法绝大多数要结合核酸扩增。
在将核酸扩增和CRISPR-Cas识别体系结合到单个试管的检测方法中，因为CRISPR-Cas检测体系将识别并切割靶核酸，所以会导致扩增模板的断裂，从而降低扩增效率。另一方面，在扩增过程当中，初期扩增产物也会被CRISPR-Cas检测体系识别并切割，从而导致可被循环使用的模板的断裂，导致扩增效率下降。
这些因素导致现有的基于CRISPR-Cas的单管核酸检测技术仍然效率较低，满足不了高灵敏度的核酸检测要求。
由于这些原因，很多报道的基于CRISPR-Cas的核酸检测技术将核酸扩增过程和CRISPR-Cas检测过程分步进行。但是分步过程会涉及到反应试管的开盖和液体转移，这些过程将容易引起气溶胶污染，从而导致假阳性。因此，发展能提高CRISPR-Cas***灵敏度的单管检测方法是本领域重要的科学课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒及检测方法，将核酸扩增和CRISPR-Cas检测在时间上分开，又可以在一个试管中封闭完成，避免了开盖试剂转移过程，在确保高检测灵敏度的同时，保证了检测不受气溶胶污染影响。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒，包括沉默引导RNA和Cas蛋白；
所述的试剂盒还包括荧光报告探针、扩增引物、酶或缓冲液中的一种以上；
所述的沉默引导RNA，是由沉默核苷酸和引导RNA通过退火杂交形成；
所述引导RNA是根据靶标核酸序列设计的，包含重复区(repetitive sequence)和间隔区(spacer sequence)两个区域，引导RNA与Cas蛋白结合形成蛋白核酸复合物，引导蛋白核酸复合物识别并切割靶标核酸；
所述沉默核苷酸的碱基之间采用可被光激活降解的PC linker连接；
所述沉默核苷酸与引导RNA的间隔区序列完全互补配对，或者与引导RNA的重复区序列完全配对；
优选地，所述沉默核苷酸除了与引导RNA间隔区序列完全互配之外，还往重复区多配对若干个(1-21个)碱基，优选多配对5个碱基；
所述沉默核苷酸中可以含有1-6个PC linker，优选含有3个PC linker；
所述沉默核苷酸中，每隔5-10个碱基嵌入一个PC linker；优选每隔6个碱基嵌入一个PC linker；
所述沉默核苷酸与引导RNA的摩尔浓度比为(1～2):1，优选2:1；
所述引导RNA的碱基长度为30-60个，优选41或51个；
所述沉默核苷酸的碱基长度为20-40个，优选25个或30个；
所述的Cas蛋白为Cas12蛋白或Cas13蛋白，这些蛋白不仅具有顺式切割活性，还具有反式切割活性，这是其不同于Cas9蛋白的地方(Cas9蛋白仅具有顺式切割活性)；同时，Cas12蛋白是一种以DNA(dsDNA或ssDNA)为靶标的核酸内切酶，其激活的反式切割活性可切割ssDNA；Cas13蛋白是一种以RNA为靶标的核酸内切酶，其激活的反式切割活性可切割ssRNA。
所述的等温扩增引物是根据靶标核酸序列设计的；
所述的等温扩增具体指重组酶聚合酶等温扩增(RPA)、环介导等温扩增(LAMP)、依赖解旋酶恒温扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、指数等温扩增(EXPAR)、依赖核酸序列扩增(NASBA)、单引物等温扩增技术(SPIA)、嵌合引物引发的核酸等温扩增(ICAN)、链交换扩增技术(SEA)等，优选重组酶聚合酶等温扩增(RPA)。
一种基于上述试剂盒的光控CRISPR-Cas核酸检测方法，包括以下步骤：
(1)将沉默引导RNA、Cas蛋白、荧光报告探针、扩增引物、酶与缓冲液混合配制成预混反应液，加入包含靶标核酸的待测物形成单管内的混合体系；
(2)将上述混合体系进行等温扩增，待等温扩增完成，启动UV光照，连接子断裂，沉默核苷酸从引导RNA上脱离，CRISPR-Cas核酸切割反应启动，最后检测所述混合体系中的荧光信号；
进一步地，步骤(1)所述混合体系中，Cas蛋白终浓度可为10-500nM，所述沉默核苷酸-引导RNA复合物终浓度为10-500nM，确保Cas蛋白与靶标核酸的切割反应能够高效率发生，所述沉默核苷酸-引导RNA复合物与Cas蛋白结合形成蛋白核酸复合物，沉默核苷酸-引导RNA复合物的浓度与Cas蛋白的浓度成对应关系。
进一步地，步骤(1)所述混合体系中，所述荧光报告探针终浓度为200nM-1μM，以保证靶标核酸附近存在充足的荧光报告探针可被切割。
进一步地，步骤(2)所述等温扩增的反应温度为25-65℃，以保证核酸扩增反应正常进行和Cas蛋白不失活。
进一步地，步骤(2)所述等温扩增的反应时间至少5min以上，所述UV光照时间至少5s以上，所述CRISPR-Cas核酸检测的时间至少5min以上。
本发明的原理如下：
Cas蛋白与引导RNA结合形成蛋白核酸复合物，当存在靶标核酸时，在引导RNA介导下，蛋白核酸复合物识别并切割靶标核酸，同时Cas蛋白的反式切割活性被激发，以非特异性的方式切割周围的荧光报告探针。荧光报告探针一端连接荧光素，一端连接淬灭基团，其被切断后则可被激发产生荧光信号。
本发明设计沉默核苷酸与引导RNA互补，从而阻断引导RNA对靶标核酸的识别。同时，设计沉默核苷酸由光激活的连接子连接，可以很便捷地用UV光激发导致沉默核苷酸断裂，从而对CRISPR-Cas检测体系进行复活。
当将这种失活的CRISPR-Cas检测体系与核酸扩增技术结合到一管反应时，核酸扩增的模板不会被CRISPR-Cas所切割，所以扩增效率不受影响。当核酸扩增完成以后，用光激活CRISPR-Cas检测体系。
这种检测方式虽然将核酸扩增和CRISPR-Cas检测在时间上分开，但是可以实现在一个试管里面封闭完成，避免了开盖试剂转移过程，在确保高的检测灵敏度的同时，又保证了检测不受气溶胶污染影响。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、相对于分步反应体系，本发明的试剂盒和方法避免了气溶胶污染的产生，简化了实验步骤。
2、相对基于相分离的一管反应体系，本发明的试剂盒和方法简化了反应体系和实验步骤。
3、相对于在管内不同位置发生Cas反应和扩增反应的一管反应体系，本发明的试剂盒和方法解决了其不稳定的问题，并且不需要依赖离心设备。
4、相对于优化Cas反应体系(例如：需要两条及以上的引导RNA)，本发明的试剂盒和方法仅用一条引导RNA即可实现高灵敏度的核酸检测，简化了反应体系和实验步骤。
附图说明
图1是不同沉默引导DNA所致的荧光信号强度。
图2是沉默引导RNA所致的荧光信号强度。
图3是不同沉默引导RNA所致的荧光信号强度。
图4是采用本发明试剂盒和方法检测靶标时的荧光强度曲线。
图5是采用本发明试剂盒和方法检测靶标时的荧光强度曲线。
图6是采用本发明试剂盒和方法检测不同靶标时的荧光强度。
图7是采用本发明试剂盒和方法对不同靶标量检测时的荧光强度曲线。
图8是采用传统的CRISPR-Cas12方法检测靶标时的荧光强度曲线。
图9是采用琼脂糖凝胶电泳检测靶标时的电泳图。
图10是不同沉默引导DNA所致的荧光信号强度。
图11是沉默引导DNA所致的荧光信号强度。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
沉默DNA(未修饰PC-linker)的筛选
(1)制备沉默引导RNA
采用退火杂交的方式将引导RNA失活。退火预混反应液包括引导RNA、沉默DNA、Cas蛋白反应缓冲液(NEBuffer 2.1，购买于纽英伦生物技术(北京)有限公司，下同)。所述退火预混反应液中各组分的终浓度分别为：引导RNA终浓度为10μM、沉默DNA终浓度为20μM、Cas蛋白反应缓冲液的终浓度为1×。将上述预混反应液置于核酸扩增仪上。在70℃条件下温育5min，并逐步降温直至温度降至室温，得到沉默引导RNA；
引导RNA：uaauuucuacuaaguguagaugggguuugagguccauuaca(SEQ.ID.NO.1)，斜体的碱基为重复区，其余为间隔区；
沉默DNA的代号、序列、序号如表1所示：
表1
Figure BDA0003484916980000041
Figure BDA0003484916980000051
关于沉默DNA代号的含义，引导RNA的序列分为两个部分，重复区(repetitivesequence)和间隔区(spacer sequence)。因此，沉默DNA与引导RNA之间的互补配对，对应重复区的简称为R，对应间隔区的简称为S。不同的数字代表互补配对的碱基长度。
(2)制备靶标DNA
所用靶标为通过退火形成的双链DNA，靶标序列为：
靶标F：ctgatagtatttaggggtttgaggtccattacagctgtaatgaacattacgtcttatgt(SEQ.ID.NO.31)
靶标R：acataagacgtaatgttcattacagctgtaatggacctcaaacccctaaatactatcag(SEQ.ID.NO.32)
退火预混反应液包括靶标F、靶标R、Cas蛋白反应缓冲液。所述退火预混反应液中各组分的终浓度分别为：靶标F终浓度为10μM、靶标R终浓度为10μM、Cas蛋白反应缓冲液的终浓度为1×。将上述预混反应液置于核酸扩增仪上。在70℃条件下温育5min，并逐步降温直至温度降至室温，得到靶标DNA。
(3)配制Cas蛋白预混反应液
Cas蛋白预混反应液包括Cas蛋白反应缓冲液，Cas12蛋白(购自广州博徕斯生物科技股份有限公司，下同)，沉默引导RNA，FQ探针，靶标DNA。反应液中各组分的终浓度分别为：Cas蛋白反应缓冲液终浓度为1×，Cas12蛋白的终浓度为100nM，沉默引导RNA的终浓度为10nM，FQ探针的终浓度为400nM，靶标的终浓度为1nM。本实施例中所使用FQ探针为FQC6(购自湖州河马生物科技有限公司)，序列为FAM-CCCCCC-BHQ1。
所述Cas蛋白预混反应液在37℃下孵育30分钟。测定所述Cas蛋白预混反应液每分钟的荧光信号强度。
图1中，阳性组(P)中加入了靶标DNA，阴性组(N)用无RNase水代替靶标DNA，CG组不含有沉默DNA。
实验结果如图1所示，与引导RNA互补配对不同位置的沉默DNA对其活性进行封闭时，并不能起到很好的活性封闭效果。
然而，图1中，当使用S15、S16、S17三条沉默DNA进行引导RNA的活性封闭时，即使是不加入靶标DNA的阴性对照组也有荧光信号产生，可能是这三条沉默DNA已足以作为靶标，进而激活Cas蛋白的切割活性。
实施例2
沉默RNA(未修饰PC-linker，与引导RNA的间隔区序列完全互补配对)的封闭效果验证
(1)制备沉默引导RNA
采用退火杂交的方式将引导RNA失活。退火预混反应液包括引导RNA、沉默RNA、Cas蛋白反应缓冲液(NEBuffer 2.1，购买于纽英伦生物技术(北京)有限公司，下同)。所述退火预混反应液中各组分的终浓度分别为：引导RNA终浓度为10μM、沉默RNA终浓度为20μM、Cas蛋白反应缓冲液的终浓度为1×。将上述预混反应液置于核酸扩增仪上。在70℃条件下温育5min，并逐步降温直至温度降至室温，得到沉默引导RNA；
沉默RNA的序列为：uguaauggaccucaaacccc(SEQ.ID.NO.33)，引导RNA(即表2中的“配对crRNA”)为SEQ.ID.NO.1。
(2)制备靶标DNA，同实施例1。
(3)配制Cas蛋白预混反应液，同实施例1。
(4)所述Cas蛋白预混反应液在37℃下孵育60分钟。测定所述Cas蛋白预混反应液每分钟的荧光信号强度。
图2中各实验组的主要加样配方如表2所示。表2中的“错配crRNA”是与沉默RNA(SEQ.ID.NO.33)不完全互补配对的引导RNA，序列为uaauuucuacuaaguguagauaaaaauuacagaagagguug(SEQ.ID.NO.34)。不含靶标的实验组则以无RNase水代替靶标。
表2
配对crRNA 错配crRNA 沉默RNA Cas12a蛋白 靶标
一 + + +
二 + +
三 + + + +
四 + + +
五 + + +
六 + +
七 + + + +
八 + + +
结果如图2所示，与引导RNA的间隔区序列完全互补配对的沉默RNA取得了极好的沉默效果，几乎不产生荧光信号(实验三)；而与沉默RNA不完全互补配对的引导RNA在封闭后，仍旧具有很强的荧光信号(实验七)。
说明使用与引导RNA的间隔序列完全互补配对的沉默RNA，能够实现引导RNA活性的完全封闭，且沉默RNA加入到引导RNA不配对的Cas12a切割体系中，不会对该体系产生影响。
实施例3
探究沉默RNA(不同数量的PC-linker，不同的封闭位置，不同用量比)对于引导RNA的活性封闭效果，及其光照之后的活性恢复效果
(1)采用杂交的方式将引导RNA失活，按照沉默RNA(SEQ.ID.NO.33)与引导RNA(SEQ.ID.NO.1)按摩尔浓度比分别为1：1，1.5：1，2：1的比例加入。将10uM引导RNA、沉默RNA、1×Cas蛋白反应缓冲液混合配制预混反应液。将上述预混反应液置于核酸扩增仪上。在70℃条件下反应5min，并逐步降温直至温度降至室温，得到沉默引导RNA；
本发明所使用的修饰PC-linker的序列购自湖州河马生物科技有限公司。
(2)制备靶标DNA，同实施例1。
(3)配制Cas蛋白预混反应液，同实施例1。
(4)在37℃下所述Cas蛋白预混反应液孵育60min。测定所述Cas蛋白预混反应液每分钟的荧光信号强度。
本实施例所使用的沉默RNA 6PC、3PC、2PC的序列同SEQ.ID.NO.33，在其碱基中连接不同数量的PC-linker。R5-3PC除了与引导RNA间隔区序列完全互配之外，还往重复区多配对了5个碱基。
具体地，各沉默RNA的代号和序列如表3所示：
表3
Figure BDA0003484916980000081
在图3中，+代表在步骤3之前，使用UV光对该预混反应液照射30s，-代表在步骤3之前，未进行光照处理。
结果如图3所示，使用R5-3PC沉默引导RNA时，能够达到最佳的效果。
从图中可以看出，不论所使用的沉默RNA与引导RNA的比例是1：1；1.5：1；2：1，在光照后，其活性都能与阳性对照组持平，但是从不光照组就能看出封闭效果，即信号值越低，代表封闭效果越好，从图中可以看出，当沉默RNA与引导RNA的加入比例为2：1，并且所使用的封闭RNA为R5-3PC时，封闭效果最佳。
实施例4
验证光控的CRISPR-Cas12检测体系的可行性(靶标DNA为含有非洲猪瘟病毒(ASFV)的B646L基因部分序列的质粒DNA(SEQ.ID.NO.35))
(1)针对非洲猪瘟病毒(ASFV)的B646L基因，设计引导RNA(SEQ.ID.NO.1)。使用的沉默RNA序列为R5-3PC。
(2)制备沉默引导RNA，同实施例2。
(3)配制Cas蛋白预混反应液，所述反应液包括Cas蛋白反应缓冲液，Cas12蛋白，沉默引导RNA，FQ探针。所述反应液的终浓度为：Cas蛋白反应缓冲液终浓度为1×，Cas蛋白的终浓度为100nM，沉默引导RNA的终浓度为100nM，FQ探针的终浓度为400nM。本实例中所使用FQ探针为FQC6，序列为FAM-CCCCCC-BHQ1。
(4)配制扩增反应液。本实施例采用重组酶聚合酶等温扩增方式进行DNA靶标的扩增，使用TwistAmp Basic Kit(货号111781)。所述重组酶聚合酶等温扩增反应液包括引物，扩增缓冲液，扩增酶，含有非洲猪瘟病毒(ASFV)B646L基因部分序列的质粒DNA(由南京擎科生物科技有限公司合成)、醋酸镁。所述反应液的终浓度为：引物的终浓度为480nM，扩增缓冲液终浓度为1×，靶标终浓度为100ag/μL，醋酸镁终浓度为14mM。
前引物序列：gccgaagggaatggatactgagggaatagcaa(SEQ.ID.NO.36)；
后引物序列：tcccgagaactctcacaatatccaaacagcag(SEQ.ID.NO.37)；
(5)将上述Cas蛋白反应液和扩增反应液混合配制预混反应液，在37℃条件下孵育所述预混反应液。30min后，将其取出，使用UV光对该预混反应液照射30s。采用实时定量PCR仪测定预混反应液的荧光信号强度。
本实施例中，阳性组(P)加入靶标，阴性组(N)加入的是无RNase水。
实验结果如图4所示，阳性组和阴性组的信号差距很大，说明阳性组具有良好的信噪比和反应速率。
实施例5
验证光控的CRISPR-Cas12检测体系的可行性(靶标RNA为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的O基因(基因组坐标：13201-15600，GenBank No.NC_045512)
(1)针对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的O基因，设计引导RNA的序列为uaauuucuacuaaguguagauggugauuucauacaaaccac(SEQ.ID.NO.38)，斜体的碱基为重复区，其余为间隔区。所使用的沉默RNA序列为gugguu(PC-linker)uguaug(PC-linker)aaauca(PC-linker)ccaucua。
(2)制备沉默引导RNA，同实施例4；
(3)配制Cas蛋白预混反应液，同实施例4；
(4)配制反转录扩增反应液，采用反转录重组酶聚合酶等温扩增方式(RT-RPA)进行RNA靶标的扩增，使用TwistAmp Basic Kit(货号111781)。所述反转录重组酶聚合酶等温扩增反应液包括引物，扩增缓冲液，扩增酶，反转录酶，靶标，醋酸镁。所述反应液的终浓度为：引物的终浓度为480nM，扩增缓冲液终浓度为1×，反转录酶终浓度为5U/μL，靶标终浓度为100aM，醋酸镁终浓度为14mM。
(5)同实施例4；
前引物序列为：tgatgccatgcgaaatgctggtattgttgg(SEQ.ID.NO.39)；
后引物序列为：ctgcagttaaagccctggtcaaggttaata(SEQ.ID.NO.40)；
本实施例所使用的靶标为购自中国计量科学研究院的、含有部分新型冠状病毒(SARS-CoV-2)O基因序列(基因组坐标：13201-15600，GenBank No.NC_045512)的RNA标准品(下同)。
本实施例中，阳性组加入的是靶标，阴性组加入的是无RNase水。
如图5所示，在运用于SARS-CoV-2的检测时，阳性组和阴性组的信号差距很大，说明阳性组具有良好的信噪比和反应速率。
实施例6
基于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N基因的特异性检测
(1)针对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的N基因(基因组坐标：28274-29533，GenBank:MN908947.3)，设计引导RNA的序列为uaauuucuacuaaguguagaucccccagcgcuucagcguuc(SEQ.ID.NO.41)，斜体的碱基为重复区，其余为间隔区。所使用的沉默RNA序列为gaacgc(PC-linker)ugaagc(PC-linker)gcuggg(PC-linker)ggaucua。
余下步骤同实施例5。
前引物序列为：agacgtggtccagaacaaacccaaggaaatt(SEQ.ID.NO.42)；
后引物序列为：tgtgtaggtcaaccacgttcccgaaggtgt(SEQ.ID.NO.43)；
加入的靶标分别为：新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RNA标准品(购自中国计量科学研究院)，冠状病毒(SARS-CoV)RNA(SEQ.ID.NO.66)，蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)RNA(SEQ.ID.NO.67)。
冠状病毒(SARS-CoV)RNA和蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)RNA是由生物公司合成N-gene序列的质粒，并通过转录得到了相应的RNA。
NTC组加入无RNase水。
如图6所示，在运用于SARS-CoV-2的特异性检测时，本方法具有良好的检测特异性。另外，值得指出的是本方法将有望运用于单碱基突变的检测。
实施例7
基于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)O基因的灵敏度检测
实验材料和步骤同实施例5。
加入的靶标量分别为：104copies、103copies、102copies、101copies、100copies、0copies(NTC)。
如图7所示，在运用于SARS-CoV-2的灵敏度检测时，本方法具有良好的检测灵敏度，其最低检测限可达10copies。
对比例1
本对比例为常规的单管的基于CRISPR-Cas12的DNA检测方法，选用实施例1的靶标DNA、Cas12a蛋白、引导RNA、荧光报告探针和缓冲液。
(1)针对非洲猪瘟病毒(ASFV)的B646L基因，设计引导RNA的序列(SEQ.ID.NO.1)。
(2)配制Cas蛋白预混反应液，所述反应液包括Cas蛋白反应缓冲液，Cas蛋白，引导RNA，FQ探针。所述反应液的终浓度为：Cas蛋白反应缓冲液终浓度为1×，Cas蛋白的终浓度为100nM，引导RNA的终浓度为100nM，FQ探针的终浓度为400nM。本实施例中所使用FQ探针为FQC6，序列为FAM-CCCCCC-BHQ1。
图8中“本发明方法”则在Cas蛋白预混反应液中加入了沉默引导RNA，其制法同实施例1，沉默RNA序列为R5-3PC。
除不进行光照处理外，余下步骤同实施例4。
本实施例中，阳性组加入的是靶标，阴性组加入的是无RNase水。
如图8所示，在使用常规的单管的基于CRISPR-Cas12的DNA检测方法进行与本方法相同浓度(100ag/μL)的靶标的检测时，本发明方法具有很强的荧光信号强度(图8)，而常规的CRISPR-Cas12检测方法几乎没有荧光信号产生(图8)。该结果进一步阐明本发明所提出方法能够显著的提高单管检测法的灵敏度。
对比例2
本对比例为使用琼脂糖凝胶电泳验证RT-RPA扩增新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RNA标准品，冠状病毒(SARS-CoV)RNA，蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)RNA的特异性。使用实施例6的靶标RNA，和RT-RPA扩增体系。
RT-RPA扩增反应液同实施例6，将上述RT-RPA扩增反应液在37℃条件下孵育30min。随后使用琼脂糖凝胶电泳，验证扩增产物。
如图9所示，当使用琼脂糖凝胶电泳进行新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RNA标准品，冠状病毒(SARS-CoV)RNA，蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)RNA三种病毒RNA的RT-RPA扩增产物的验证时，可观察到除NTC(以无RNase代替靶标)外，均有扩增条带出现，说明仅仅依赖于RT-RPA扩增的特异性，是不足以区分这三种病毒的。
而在实施例6中，使用本专利所提出方法进行这三种病毒的特异性分析时，除扩增靶标为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RNA标准品外，其它均没有荧光信号产生(图6)，说明本专利所提出方法具有更好的特异性。
实施例8
针对Cas13***的沉默DNA(不带PC-linker)的筛选
(1)制备沉默引导RNA。采用退火杂交的方式将引导RNA失活。退火预混反应液包括引导RNA、沉默DNA、Cas蛋白反应缓冲液(PCR缓冲液，购买于宝日医生物技术(北京)有限公司，下同)。所述退火预混反应液中各组分的终浓度分别为：引导RNA终浓度为10μM、沉默DNA终浓度为20μM、Cas蛋白反应缓冲液的终浓度为1×。将上述预混反应液置于核酸扩增仪上。在70℃条件下温育5min，并逐步降温直至温度降至室温，得到沉默引导RNA；
引导RNA：gaccaccccaaaaaugaaggggacuaaaaccaacaucagucugauaagcua(SEQ.ID.NO.44)，斜体的碱基为重复区，其余为间隔区；
沉默DNA的代号、序列、序号如表4所示：
表4
代号 序列 序号
S11 tagcttatcag SEQ.ID.NO.45
S16 tagcttatcagactga SEQ.ID.NO.46
S21 tagcttatcagactgatgttg SEQ.ID.NO.47
R12 gttttagtcccc SEQ.ID.NO.48
R17 ccccttcatttttgggg SEQ.ID.NO.49
R18 ttcatttttggggtggtc SEQ.ID.NO.50
R21 gttttagtccccttcattttt SEQ.ID.NO.51
R30 gttttagtccccttcatttttggggtggtc SEQ.ID.NO.52
S21R1 tagcttatcagactgatgttgg SEQ.ID.NO.53
S21R2 tagcttatcagactgatgttggt SEQ.ID.NO.54
S21R3 tagcttatcagactgatgttggtt SEQ.ID.NO.55
S21R4 tagcttatcagactgatgttggttt SEQ.ID.NO.56
S21R5 tagcttatcagactgatgttggtttt SEQ.ID.NO.57
S20R5 agcttatcagactgatgttggtttt SEQ.ID.NO.58
S19R5 gcttatcagactgatgttggtttt SEQ.ID.NO.59
S18R5 cttatcagactgatgttggtttt SEQ.ID.NO.60
S17R5 ttatcagactgatgttggtttt SEQ.ID.NO.61
S15R5 atcagactgatgttggtttt SEQ.ID.NO.62
S15R10 atcagactgatgttggttttagtcc SEQ.ID.NO.63
S8R12 tgatgttggttttagtcccc SEQ.ID.NO.64
关于沉默DNA代号的含义，引导RNA的序列分为两个部分，重复区(repetitivesequence)和间隔区(spacer sequence)。因此，沉默DNA与引导RNA之间的互补配对，对应重复区的简称为R，对应间隔区的简称为S。不同的数字代表互补配对的碱基长度。
(2)配制Cas蛋白预混反应液，所述反应液包括Cas蛋白反应缓冲液，Cas13蛋白(购自广州博徕斯生物科技股份有限公司，下同)，沉默引导RNA，FQ探针，靶标RNA(同实施例1)。所述反应液中各组分的终浓度分别为：Cas蛋白反应缓冲液终浓度为1×，Cas13蛋白的终浓度为100nM，沉默引导RNA的终浓度为10nM，FQ探针的终浓度为400nM，靶标的终浓度为1nM。本实施例中所使用FQ探针为FQU5(购自湖州河马生物科技有限公司)，序列为FAM-UUUUU-BHQ1。
所用靶标为单链RNA，靶标序列为：uagcuuaucagacugauguuga(SEQ.ID.NO.65)。
(3)在37℃下所述Cas蛋白预混反应液孵育30分钟。测定所述Cas蛋白预混反应液每分钟的荧光信号强度。
图10中，阳性组(P)中加入了靶标RNA，阴性组(N)用无RNase水代替靶标DNA，CG组不含有沉默DNA。
结果如图10所示，使用R30序列(与引导RNA的重复区序列完全配对)进行引导RNA的活性沉默时，荧光信号强度最低，说明该序列的沉默效果最佳。
实施例9
针对Cas13***探究沉默DNA(带有PC-linker，不同用量比)对于引导RNA的活性封闭效果，及其光照之后的活性恢复效果。
(1)制备沉默引导RNA。采用杂交的方式将引导RNA失活，按照沉默RNA与引导RNA摩尔浓度比分别为1：1，1.5：1，2：1的比例加入。将10uM引导RNA(SEQ.ID.NO.43)、沉默RNA(gttttagt(PC-linker)ccccttc(PC-linker)atttttg(PC-linker)gggtggtc)、1×Cas蛋白反应缓冲液混合配制预混反应液。将上述预混反应液置于核酸扩增仪上。在70℃条件下反应5min，并逐步降温直至温度降至室温；
步骤(2)-(3)同实施例7。
图11中，阳性组(P)中加入了靶标RNA，阴性组(N)用无RNase水代替靶标DNA，CG组不含有沉默DNA。图中所示荧光强度为Cas蛋白预混反应液反应60min时的荧光信号强度。在图11中，+代表在步骤3之前，使用UV光对该预混反应液照射30s，-代表在步骤3之前，未进行光照处理。
从图中可以看出，不论所使用的沉默RNA与引导RNA的比例是1：1；1.5：1；2：1，在光照后，其活性都能与阳性对照组持平，但是从不光照组就能看出封闭效果，即信号值越低，代表封闭效果越好，从图中可以看出，当沉默RNA与引导RNA的加入比例为2：1时，封闭效果最佳。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南师范大学
<120> 一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒及检测方法
<160> 67
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uaauuucuac uaaguguaga ugggguuuga gguccauuac a 41
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accccatcta cacttagtag aaatt 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
accccatcta cacttagtag aaat 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
accccatcta cacttagtag aaa 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
accccatcta cacttagtag aa 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
accccatcta cacttagtag a 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
accccatcta cacttagta 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
accccatcta cacttagt 18
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
accccatcta cacttag 17
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
accccatcta cactta 16
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
accccatcta cactt 15
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctcaaacccc atctacactt agtag 25
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcaaacccca tctacactta gtag 24
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caaaccccat ctacacttag tag 23
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaaccccatc tacacttagt ag 22
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aaccccatct acacttagta g 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
accccatcta cacttagtag 20
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccccatctac acttagtag 19
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cccatctaca cttagtag 18
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccatctacac ttagtag 17
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
catctacact tagtag 16
<210> 22
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atctacactt agtag 15
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atctacactt agtagaaatt a 21
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgtaatggac ctcaaac 17
<210> 25
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tgtaatggac ctcaaa 16
<210> 26
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tgtaatggac ctcaa 15
<210> 27
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgtaatggac ctca 14
<210> 28
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgtaatggac ctc 13
<210> 29
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tgtaatggac ct 12
<210> 30
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tgtaatggac c 11
<210> 31
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctgatagtat ttaggggttt gaggtccatt acagctgtaa tgaacattac gtcttatgt 59
<210> 32
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
acataagacg taatgttcat tacagctgta atggacctca aacccctaaa tactatcag 59
<210> 33
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
uguaauggac cucaaacccc 20
<210> 34
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
uaauuucuac uaaguguaga uaaaaauuac agaagagguu g 41
<210> 35
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aagtccagga aattcattca ccaaatcctt ttgcgatgca agctttatgg tgataaagcg 60
ctcgccgaag ggaatggata ctgagggaat agcaaggttc acgttctcgt taaaccaaaa 120
gcgcagctta atccagagcg caagaggggg ctgatagtat ttaggggttt gaggtccatt 180
acagctgtaa tgaacattac gtcttatgtc cagatacgtt gcgtccgtga taggagtgat 240
atcttgttta cctgctgttt ggatattgtg agagttctcg ggaaaatgtt gtgaaagaaa 300
tttcgggttg gtatggctgc acgttcgctg cgtatcattt tcatcggtaa gaataggttt 360
gctttggtgc ggcttgtgca aatcatgaat gttgcatagg agagggccac tggttccctc 420
caccgatacc tcctggccga ccaagtgctt atatcc 456
<210> 36
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gccgaaggga atggatactg agggaatagc aa 32
<210> 37
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tcccgagaac tctcacaata tccaaacagc ag 32
<210> 38
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
uaauuucuac uaaguguaga uggugauuuc auacaaacca c 41
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tgatgccatg cgaaatgctg gtattgttgg 30
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ctgcagttaa agccctggtc aaggttaata 30
<210> 41
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
uaauuucuac uaaguguaga ucccccagcg cuucagcguu c 41
<210> 42
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
agacgtggtc cagaacaaac ccaaggaaat t 31
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tgtgtaggtc aaccacgttc ccgaaggtgt 30
<210> 44
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gaccacccca aaaaugaagg ggacuaaaac caacaucagu cugauaagcu a 51
<210> 45
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tagcttatca g 11
<210> 46
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tagcttatca gactga 16
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tagcttatca gactgatgtt g 21
<210> 48
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gttttagtcc cc 12
<210> 49
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ccccttcatt tttgggg 17
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ttcatttttg gggtggtc 18
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gttttagtcc ccttcatttt t 21
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gttttagtcc ccttcatttt tggggtggtc 30
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
tagcttatca gactgatgtt gg 22
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tagcttatca gactgatgtt ggt 23
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tagcttatca gactgatgtt ggtt 24
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
tagcttatca gactgatgtt ggttt 25
<210> 57
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
tagcttatca gactgatgtt ggtttt 26
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
agcttatcag actgatgttg gtttt 25
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gcttatcaga ctgatgttgg tttt 24
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
cttatcagac tgatgttggt ttt 23
<210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ttatcagact gatgttggtt tt 22
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
atcagactga tgttggtttt 20
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
atcagactga tgttggtttt agtcc 25
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
tgatgttggt tttagtcccc 20
<210> 65
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 66
<211> 931
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
ccaaattggc tactaccgaa gagctacccg acgagttcgt ggtggtgacg gcaaaatgaa 60
agagctcagc cccagatggt acttctatta cctaggaact ggcccagaag cttcacttcc 120
ctacggcgct aacaaagaag gcatcgtatg ggttgcaact gagggagcct tgaatacacc 180
caaagaccac attggcaccc gcaatcctaa taacaatgct gccaccgtgc tacaacttcc 240
tcaaggaaca acattgccaa aaggcttcta cgcagaggga agcagaggcg gcagtcaagc 300
ctcttctcgc tcctcatcac gtagtcgcgg taattcaaga aattcaactc ctggcagcag 360
taggggaaat tctcctgctc gaatggctag cggaggtggt gaaactgccc tcgcgctatt 420
gctgctagac agattgaacc agcttgagag caaagtttct ggtaaaggcc aacaacaaca 480
aggccaaact gtcactaaga aatctgctgc tgaggcatct aaaaagcctc gccaaaaacg 540
tactgccaca aaacagtaca acgtcactca agcatttggg agacgtggtc cagaacaaac 600
ccaaggaaat ttcggggacc aagacctaat cagacaagga actgattaca aacattggcc 660
gcaaattgca caatttgctc caagtgcctc tgcattcttt ggaatgtcac gcattggcat 720
ggaagtcaca ccttcgggaa catggctgac ttatcatgga gccattaaat tggatgacaa 780
agatccacaa ttcaaagaca acgtcatact gctgaacaag cacattgacg catacaaaac 840
attcccacca acagagccta aaaaggacaa aaagaaaaag actgatgaag ctcagccttt 900
gccgcagaga caaaagaagc agcccactgt g 931
<210> 67
<211> 931
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
ccaaattggc tactaccgta gagctaccag acgaattcgt ggtggtgacg gtaaaatgaa 60
agagctcagc cccagatggt atttttacta tctaggaact ggaccagaag ctggacttcc 120
ctatggtgct aacaaagaag gcatcatatg ggttgcaact gagggagcct taaacacacc 180
gaaagaccac attggcaccc gcaatcctgc taacaatgct gcaatcgtgc tacaacttcc 240
tcaaggaaca acattgccaa aaggcttcta cgcagaaggg agcagaggcg gcagtcaagc 300
ttcttcacgc tcctcatcac gtagtcgcaa cagttcaaga aactcaactc caggcagcag 360
taggggaact tctcctgcta gaatggctgg caatggcggt gacactgctc ttgctttgct 420
gctgctagat aggttgaacc agcttgagaa caaagtatct ggcaaaggcc aacaacaaca 480
gggccaaact gtcactaaga aatctgctgc tgaggcatct aaaaagcctc gccaaaaacg 540
tactgctaca aaacagtaca acgtcactca agcatttggg agacgtggtc cagaacaaac 600
ccaaggaaat tttggggacc aagaattaat cagacaagga actgattaca aacattggcc 660
gcaaattgca caatttgctc caagtgcctc tgcattcttt ggaatgtcac gcattggcat 720
ggaagtcaca ccttcgggaa catggctgac ttatcatgga gccattaaat tggatgacaa 780
agatccacaa ttcaaagata acgtcatact gctgaataag cacattgacg catacaaaac 840
attcccacca acagagccta aaaaggacaa aaagaaaaag gctgatgaac ttcaggcttt 900
accgcagaga cagaagaaac aacaaactgt g 931

Claims (10)

1.一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒，其特征在于包括沉默引导RNA和Cas蛋白；
所述的沉默引导RNA，是由沉默核苷酸和引导RNA通过退火杂交形成；
所述引导RNA是根据靶标核酸序列设计的，包含重复区和间隔区两个区域；
所述沉默核苷酸与引导RNA的间隔区序列完全互补配对，或者与引导RNA的重复区序列完全配对；
所述沉默核苷酸的碱基之间采用PC linker连接；
所述的Cas蛋白为Cas12蛋白或Cas13蛋白。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述沉默核苷酸除了与引导RNA间隔区序列完全互配之外，还往重复区多配对若干个碱基。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述沉默核苷酸中含有1-6个PClinker，每隔5-10个碱基嵌入一个PC linker。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述沉默核苷酸与引导RNA的摩尔浓度比为(1～2):1。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述沉默核苷酸中含有3个PC linker。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述沉默核苷酸中，每隔6个碱基嵌入一个PC linker。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述沉默核苷酸与引导RNA的质量比为2:1。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括荧光报告探针、扩增引物、酶或缓冲液中的一种以上。
9.一种基于上述试剂盒的光控CRISPR-Cas核酸检测方法，其特征在于使用权利要求1-8任一项所述的试剂盒。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将沉默引导RNA、Cas蛋白、荧光报告探针、扩增引物、酶与缓冲液混合配制成预混反应液，加入包含靶标核酸的待测物形成单管内的混合体系；
(2)将上述混合体系进行等温扩增，待等温扩增完成，启动UV光照，连接子断裂，沉默核苷酸从引导RNA上脱离，CRISPR-Cas核酸切割反应启动，最后检测所述混合体系中的荧光信号。
CN202210078298.2A 2022-01-24 2022-01-24 一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒及检测方法 Active CN114410752B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210078298.2A CN114410752B (zh) 2022-01-24 2022-01-24 一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒及检测方法
PCT/CN2022/091068 WO2023137926A1 (zh) 2022-01-24 2022-05-06 一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210078298.2A CN114410752B (zh) 2022-01-24 2022-01-24 一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒及检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114410752A true CN114410752A (zh) 2022-04-29
CN114410752B CN114410752B (zh) 2024-06-25

Family

ID=81277991

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210078298.2A Active CN114410752B (zh) 2022-01-24 2022-01-24 一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒及检测方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN114410752B (zh)
WO (1) WO2023137926A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114703258A (zh) * 2022-06-06 2022-07-05 深圳大学 一种基于光激活的一锅式rpa-crispr核酸检测方法及***
CN115896332A (zh) * 2022-11-21 2023-04-04 吉林大学 一种基于CRISPR/Cas12和LAMP的温和镰孢菌可视化检测方法
WO2023137926A1 (zh) * 2022-01-24 2023-07-27 华南师范大学 一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒及检测方法

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107557455A (zh) * 2017-09-15 2018-01-09 国家纳米科学中心 一种基于CRISPR‑Cas13a的特异性核酸片段的检测方法
CN109563514A (zh) * 2016-06-08 2019-04-02 安捷伦科技有限公司 使用化学修饰的引导rna的高特异性基因组编辑
CN110117621A (zh) * 2019-05-24 2019-08-13 青岛农业大学 一种碱基编辑器及其制备方法和应用
CN110129485A (zh) * 2019-06-10 2019-08-16 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种快速鉴别非洲猪瘟病毒的检测试剂盒及其检测方法
CN111117984A (zh) * 2018-11-01 2020-05-08 浙江大学 可视化特异检测核酸目标的crispr体系及方法和装置
CN111593145A (zh) * 2020-06-11 2020-08-28 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种CRISPR/Cas12一步核酸检测方法及新型冠状病毒检测试剂盒
CN111855990A (zh) * 2019-04-29 2020-10-30 华南师范大学 一种基于CRISPR/Cas***的通用比色核酸检测方法及试剂盒与应用
CN112301102A (zh) * 2019-07-31 2021-02-02 华南师范大学 一种高特异性的环介导等温扩增方法及其应用
US20210269866A1 (en) * 2018-06-26 2021-09-02 The Broad Institute, Inc. Crispr effector system based amplification methods, systems, and diagnostics
CN113677793A (zh) * 2019-07-19 2021-11-19 辛瑟高公司 稳定的crispr复合物
CN113874503A (zh) * 2019-01-25 2021-12-31 辛瑟高公司 用于调节crispr活性的***和方法
WO2022006536A1 (en) * 2020-07-03 2022-01-06 The Regents Of The University Of California Crispr-cas-based detection of sars-cov-2 using recombinase polymerase amplification

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109055499B (zh) * 2018-08-30 2021-01-19 杭州杰毅生物技术有限公司 基于CRISPR-Cas的等温核酸检测方法及试剂盒
CN111394490B (zh) * 2020-05-15 2020-12-29 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 用于土拉杆菌的CRISPR-Cas12a检测引物组及其应用
CN113234856B (zh) * 2021-04-27 2024-02-20 华南理工大学 一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法
CN113005230B (zh) * 2021-04-28 2024-02-20 南通海关综合技术中心(江苏国际旅行卫生保健中心南通分中心、南通海关口岸门诊部) 亚洲型寨卡病毒RT-RPA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒及其检测方法
CN114410752B (zh) * 2022-01-24 2024-06-25 华南师范大学 一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒及检测方法

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109563514A (zh) * 2016-06-08 2019-04-02 安捷伦科技有限公司 使用化学修饰的引导rna的高特异性基因组编辑
CN107557455A (zh) * 2017-09-15 2018-01-09 国家纳米科学中心 一种基于CRISPR‑Cas13a的特异性核酸片段的检测方法
US20210269866A1 (en) * 2018-06-26 2021-09-02 The Broad Institute, Inc. Crispr effector system based amplification methods, systems, and diagnostics
CN111117984A (zh) * 2018-11-01 2020-05-08 浙江大学 可视化特异检测核酸目标的crispr体系及方法和装置
CN113874503A (zh) * 2019-01-25 2021-12-31 辛瑟高公司 用于调节crispr活性的***和方法
CN111855990A (zh) * 2019-04-29 2020-10-30 华南师范大学 一种基于CRISPR/Cas***的通用比色核酸检测方法及试剂盒与应用
CN110117621A (zh) * 2019-05-24 2019-08-13 青岛农业大学 一种碱基编辑器及其制备方法和应用
CN110129485A (zh) * 2019-06-10 2019-08-16 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种快速鉴别非洲猪瘟病毒的检测试剂盒及其检测方法
CN113677793A (zh) * 2019-07-19 2021-11-19 辛瑟高公司 稳定的crispr复合物
CN112301102A (zh) * 2019-07-31 2021-02-02 华南师范大学 一种高特异性的环介导等温扩增方法及其应用
CN111593145A (zh) * 2020-06-11 2020-08-28 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种CRISPR/Cas12一步核酸检测方法及新型冠状病毒检测试剂盒
WO2022006536A1 (en) * 2020-07-03 2022-01-06 The Regents Of The University Of California Crispr-cas-based detection of sars-cov-2 using recombinase polymerase amplification

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAROON BUTT等: "Efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing using a chimeric single guide RNA molecule", 《FRONTIERS IN PLANT SCIENCE》, vol. 8, no. 1441, pages 1 - 8 *
刘红等: "光控CRISPR技术的研究进展", 《高等学校化学学报》, vol. 42, no. 11, pages 3321 - 3333 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023137926A1 (zh) * 2022-01-24 2023-07-27 华南师范大学 一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒及检测方法
CN114703258A (zh) * 2022-06-06 2022-07-05 深圳大学 一种基于光激活的一锅式rpa-crispr核酸检测方法及***
CN114703258B (zh) * 2022-06-06 2022-10-11 深圳大学 一种基于光激活的一锅式rpa-crispr核酸检测方法及***
CN115896332A (zh) * 2022-11-21 2023-04-04 吉林大学 一种基于CRISPR/Cas12和LAMP的温和镰孢菌可视化检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114410752B (zh) 2024-06-25
WO2023137926A1 (zh) 2023-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114410752B (zh) 一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒及检测方法
CN109055499B (zh) 基于CRISPR-Cas的等温核酸检测方法及试剂盒
CN108192956B (zh) 一种基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法及其应用
CN107299155B (zh) 一种鹅星状病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针
JP2021528090A (ja) Ｃｒｉｓｐｒエフェクター系に基づく増幅法、システム、及び診断法
WO2022148450A1 (en) Compositions and methods for instant nucleic acid detection
JP2012080871A (ja) Ｒｎａの直接検出法
CN113512548A (zh) 一种基于CRISPR-Cas12a***的新型冠状病毒检测试剂盒及其应用
Wang et al. A ligation/recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of SARS-CoV− 2
CN112301102B (zh) 一种高特异性的环介导等温扩增方法及其应用
CN115232888A (zh) 快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物、试剂盒及方法
CN110923314A (zh) 一组检测SNP位点rs9263726的引物、crRNA序列及其应用
CN110452958B (zh) 一种微量碎片化核酸甲基化检测的接头、引物、试剂盒及其应用
CN114703258B (zh) 一种基于光激活的一锅式rpa-crispr核酸检测方法及***
CN115928225A (zh) 游离dna甲基化文库构建方法及其文库、应用和试剂盒
CN112534062A (zh) 可切割合作引物和使用所述可切割合作引物扩增核酸序列的方法
CN115029345A (zh) 基于crispr的核酸检测试剂盒及其应用
CN115094060A (zh) 基于LAMP-CRISPR/Cas12a可视化检测PCV2核酸的试剂盒及方法
CN112501166A (zh) 一种化学修饰的高稳定性rna及试剂盒和方法
EP3643787A1 (en) Pcr primer pair and application thereof
CN113151599A (zh) 用于检测新型冠状病毒的引物组、试剂、试剂盒及检测方法
Wang et al. Visual and label-free ASFV and PCV2 detection by CRISPR-Cas12a combined with G-quadruplex
CN114317689A (zh) 非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用
CN113862333A (zh) 一种组合物及其氧化5-甲基胞嘧啶的方法
CN113337638A (zh) 一种新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的检测方法和试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant