CN113337638A

CN113337638A - 一种新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的检测方法和试剂盒

Info

Publication number: CN113337638A
Application number: CN202010140787.7A
Authority: CN
Inventors: 王金; 赵国屏; 黄卫人
Original assignee: Tolo Biotech Co ltd; Shenzhen Second Peoples Hospital
Current assignee: Tolo Biotech Co ltd; Shenzhen Second Peoples Hospital
Priority date: 2020-03-03
Filing date: 2020-03-03
Publication date: 2021-09-03

Abstract

本发明提供了一种新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)的检测方法和试剂盒。本发明的检测方法包括：(a)提供一含核酸扩增产物的待核验样品；(b)将所述待核验样品与增敏试剂或含所述增敏试剂的增敏缓冲液进行混合，从而形成一检测体系，其中，所述的增敏试剂包括：向导RNA、Cas蛋白、和增敏核酸探针；和(c)检测所述检测体系中的所述增敏核酸探针是否被所述Cas蛋白切割。根据该方法的特点，将其命名为SENA(Specific Enhancement for Nucleic Acid Amplification Assays)，用于新冠病毒PCR反应产物的专一增敏。

Description

一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的检测方法和试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新型冠状病毒的检测方法和试剂盒。本发明还涉及一种用于核酸分子扩增产物增敏检测的方法和试剂盒。

背景技术

冠状病毒是一种具有包膜的正链单股RNA冠状病毒，它造成了于2019年爆发的急性呼吸道病毒疾病。2月11日，国际病毒分类委员会指定病毒名称为severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2，缩写为SARS-CoV-2，即“严重急性呼吸***综合征冠状病毒2型”。由其引发的疾病则被世界卫生组织命名为“COVID-19”，即“2019年冠状病毒疾病”。

在COVID-19的临床检查中，咽拭子、鼻拭子、下呼吸道灌洗液、粪便等样本的核酸检测目前是确诊SARS-CoV-2病毒最有效的方式。然而，由于疫情爆发仓促，没有留给IVD公司充足的时间研发和验证试剂性能和有效性，导致目前临床使用的试剂灵敏度和特异性等关键指标良莠不齐。

此外，由于SARS-CoV-2在咽喉、鼻子和上呼吸道等部位的数量较少，则导致检测的准确性显著下降，尤其在潜伏期或感染早期时更难以准确地检测出SARS-CoV-2，这也导致了COVID-19的传染风险进一步增大。

SARS-CoV-2病毒qRT-PCR检测具有高的灵敏度和专一性，因此，是目前被广泛接受的判断病毒感染的标准。但是，当被检样本中的病毒核酸含量很低而导致检测结果的Ct值接近甚至大于40时，则面临很难判断样本为“弱阳性”还是“真阴性”的窘境。

目前，虽然可以采用深度测序的方法作进一步判断，但是，该方法费时费力费钱。此外，虽然也可以结合临床症状或治疗效果作综合判断，但是，该方案不仅费时，而且不安全，也无法统一判断的标准，从而导致结果不精准。

因此，本领域迫切需要开发快速、简便、高效而准确的检测SARS-CoV-2的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、简便、高效而准确的检测SARS-CoV-2的方法和试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种对靶标核酸分子扩增后进一步进行高效增敏的检测方法。

在本发明第一方面，提供了一种靶标核酸分子的检测方法，包括步骤：

(a)提供一含核酸扩增产物的待核验样品，其中所述的核酸扩增产物为对疑似含有靶标核酸分子的检测样本进行基于所述靶核酸分子的特异性扩增而获得的扩增产物；

(b)将所述待核验样品与增敏试剂或含所述增敏试剂的增敏缓冲液进行混合，从而形成一检测体系，其中，所述的增敏试剂包括：向导RNA、Cas蛋白、和增敏核酸探针，其中，所述的向导RNA特异性针对所述的核酸扩增产物；和

(c)检测所述检测体系中的所述增敏核酸探针是否被所述Cas蛋白切割，其中，如果所述增敏核酸探针被切割，则提示所述检测样本中含有靶标核酸分子；如果所述增敏核酸探针未被切割，则提示所述检测样本中不含有靶标核酸分子。

在另一优选例中，所述的靶标核酸包括靶标DNA和靶标RNA。

在另一优选例中，所述的核酸扩增产物为DNA产物。

在另一优选例中，所述的术语“向导RNA特异性针对所述的核酸扩增产物”指所述的向导RNA与Cas蛋白的复合物特异性地结合于所述核酸扩增产物的正链DNA和/或负链DNA，并且与所述检测体系中其他核酸物质不特异结合。

在另一优选例中，所述的检测体系中其他核酸物质包括：引物、Taqman荧光探针、增敏核酸探针、和不含靶标核酸序列的核酸分子。

在另一优选例中，所述的检测体系中还含有缓冲液或缓冲剂。

在另一优选例中，在步骤(c)中，通过检测荧光强度的方法进行检测。

在另一优选例中，所述Cas蛋白为Cas12a或者具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白；

或者，Cas蛋白为Cas12b(即C2c1)或者具有与Cas12b的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白。

或者，Cas蛋白为Cas14或者具有与Cas14的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白。

在另一优选例中，所述的Cas12a选自下组：LbaCas12a、FnCas12a、AsCas12a、LbaCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a中一种；更优选地，所述的Cas12a为LbaCas12a。

在另一优选例中，向导RNA是指引导Cas蛋白特异性结合靶标DNA的RNA。

优选地，所述的向导RNA是指引导Cas蛋白特异性结合SARS-CoV-2病毒靶标序列的向导RNA。

在另一优选例中，所述增敏核酸探针为单链DNA或含有部分DNA序列的单链核酸探针。

在另一优选例中，所述增敏核酸探针为FAM-N₁₂-BHQ1，其中N表示A、T、C、或G中任一核苷酸。

在另一优选例中，所述的单链DNA优选为荧光标记的单链DNA。

在另一优选例中，所述核酸探针为单链DNA；所述的单链DNA优选为两端分别标记荧光基团和荧光淬灭基团的单链DNA；所述的单链DNA优选为在5'端标记荧光基团并在3'端标记淬灭基团的单链探针；所述的单链DNA优选为在3'端标记荧光基团并在3'端标记淬灭基团的单链探针；所述的单链DNA优选为在内部分别含有荧光基团标记和淬灭基团标记的单链探针；所述的单链DNA优选为在5'端标记FAM荧光基团并在3'端标记淬灭基团BHQ1后的荧光探针。

在另一优选例中，所述的单链DNA为在5'端标记荧光基团HEX并在3'端标记淬灭基团BHQ1后的单链探针。

在另一优选例中，所述核酸探针的检测方法为荧光检测法。

在另一优选例中，所述的荧光检测法为使用酶标仪或者荧光分光光度计进行检测的方法。

在另一优选例中，所述的待核验样品是对检测样品进行扩增反应后形成的反应体系。

所述扩增选自下组：PCR扩增、LAMP扩增、RPA扩增、连接酶链式反应、分支DNA扩增、NASBA、SDA、转录介导扩增、滚环扩增、HDA,SPIA,NEAR,TMA和SMAP2。

在另一优选例中，所述的扩增为PCR扩增。

在另一优选例中，所述的扩增选自下组：qPCR、RT-PCR、或其组合。

在另一优选例中，所述的反应体系中的待检靶标核酸分子是经过PCR或qPCR或qRT-PCR扩增后得到的。

在另一优选例中，所述的反应体系的qPCR或者qRT-PCR的Ct值≥35，更佳地≥40,更佳地≥45。

在另一优选例中，所述的反应体系的qPCR或者qRT-PCR的Ct值≤50。

在另一优选例中，所述的反应体系的qPCR或者qRT-PCR的Ct为32-45，较佳地为35-40。

在另一优选例中，所述的反应体系是用选自下组的引物进行扩增所获得的反应体系；或其扩增产物中含有与下组引物对扩增产物有>20bp重叠的序列：

在另一优选例中，所述的引物是选自下组的任一引物对：

在另一优选例中，所述的靶标核酸分子选自下组：病原微生物的核酸分子、基因突变的核酸分子、和特异靶标核酸分子。

在另一优选例中，所述的病原微生物包括病毒、细菌、衣原体、支原体。

在另一优选例中，所述的病毒包括：冠状病毒、流感病毒、HIV、肝炎病毒、副流感病毒。

在另一优选例中，所述的冠状病毒选自下组：SARS-CoV-2、SARS-CoV。

在另一优选例中，所述的核酸分子包括DNA、RNA、或cDNA。

在另一优选例中，所述的增敏核酸探针被可检测的标记物所标记。

在另一优选例中，当增敏核酸探针处于未被切割状态时，所述的标记物不发出可检测信号，而当增敏核酸探针处于被切割状态时，所述的标记物发出可检测信号。

在另一优选例中，当增敏核酸探针处于未被切割状态时，所述的标记物发出可检测信号，而当增敏核酸探针处于被切割状态时，所述的标记物不发出可检测信号，或发出不同的检测信号。

在另一优选例中，所述的标记物包括荧光基团和淬灭基团，其中，当所述增敏核酸探针未被切割时，所述淬灭基团导致所述荧光基团被淬灭，从而导致不发出荧光；而当所述增敏核酸探针被切割时，所述荧光基团不再被所述淬灭基团所淬灭，从而导致发出荧光。

在另一优选例中，当含靶标序列的扩增产物、向导RNA和Cas蛋白形成三元复合体时，该复合物会切割体系中增敏探针，从而发出可检测信号。

在另一优选例中，当待检测靶标核酸被扩增后，其扩增产物被向导RNA和Cas蛋白结合而形成三元复合体。一旦形成三元复合物后，该复合物会切割体系中单链的增敏核酸探针，并发出可被检测的荧光信号。

在另一优选例中，在靶向SARS-CoV-2病毒基因组序列的向导RNA引导下，Cas12a蛋白特异结合扩增体系中存在的靶标DNA，形成三元复合物，并切碎体系中的单链增敏核酸探针，发出可被检测的荧光信号。

在另一优选例中，在靶向SARS-CoV-2病毒基因组序列的向导RNA引导下，Cas12b蛋白特异结合扩增体系中存在的靶标DNA，形成三元复合物，并切碎体系中的单链增敏核酸探针，发出可被检测的荧光信号。

在另一优选例中，在靶向SARS-CoV-2病毒基因组序列的向导RNA引导下，Cas14蛋白特异结合扩增体系中存在的单链靶标DNA或经过处理后形成的单链靶标DNA，形成三元复合物，并切碎体系中的单链增敏核酸探针，发出可被检测的荧光信号。

在另一优选例中，所述的检测样本是用选自下组样本制备的核酸样本：咽拭子、鼻拭子、尿液、粪便、体液、或其组合。

在另一优选例中，所述的检测方法是非诊断性和非治疗性的。

在本发明的第二方面，提供了一种靶标核酸分子的检测试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)用于扩增靶标核酸分子的扩增试剂，所述扩增试剂包括：

(a1)用于扩增靶标核酸分子的引物对，所述引物对用于进行基于所述靶核酸分子的特异性扩增反应，从而产生特异的核酸扩增产物；

(a2)任选的第一探针，所述的第一探针用于在所述扩增反应中与核酸扩增产物结合，从而产生第一可检测信号；

(a3)任选的用于扩增反应的聚合酶；

(b)用于对扩增反应进行增敏的增敏试剂，所述的增敏试剂包括：向导RNA、Cas蛋白、和增敏核酸探针。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：

(c)用于逆转录反应的逆转录试剂，所述的逆转录试剂包括：逆转录酶或具备逆转录酶活性的Bst酶(或其突变体)。

在另一优选例中，所述试剂盒含有以下优选的试剂组合：

针对SARS-CoV-2 ORF1ab：

引物对2:SEQ ID No:20和21,Taqman探针：SEQ ID No:8；

crRNA：SEQ ID No:11(其向导序列为SEQ ID No:1)'

和/或，针对SARS-CoV-2 N基因：

引物对10:SEQ ID No:36和37,Taqman探针：SEQ ID No:9,

crRNA7:SEQ ID No:17(其向导序列为SEQ ID No:1)。

在另一优选例中，增敏核酸探针为FAM-N₁₂-BHQ1，其中N表示A、T、C、或G中任一核苷酸。

在本发明的第三方面，提供了一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，所述检测体系包含：

(a)Cas蛋白，所述Cas蛋白是Cas12a或者具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白，或者是Cas12b或者具有与Cas12b的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白，或者是Cas14或者具有与Cas14的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白；

(b)向导RNA，所述向导RNA引导Cas蛋白特异性结合于靶标核酸分子；和

(c)增敏核酸探针，所述增敏核酸探针为单链DNA；

其中，所述的靶标核酸分子为靶标DNA；

(d)一含核酸扩增产物的待核验样品，其中所述的核酸扩增产物为对疑似含有靶标核酸分子的检测样本进行基于所述靶核酸分子的特异性扩增而获得的扩增产物。

在另一优选例中，所述的检测体系还含有(e)缓冲液。

在另一优选例中，所述的待检测的靶标核酸分子(或相应的扩增产物)在所述检测体系中的浓度为100拷贝/微升或10¹⁵拷贝/微升，较佳地10³-10¹⁰拷贝/微升，更佳地10⁴-10⁸拷贝/微升。

在另一优选例中，所述的检测体系中，所述增敏核酸探针与所述靶标核酸分子的摩尔比为1：10¹⁰至10¹⁰：1，较佳地1：1至1：100。

在另一优选例中，所述的向导RNA的向导长度为15-30nt，较佳地17-23nt。

在另一优选例中，所述的靶标DNA包括cDNA。

在另一优选例中，所述的靶标DNA选自下组：单链DNA、双链DNA、或其组合。

在另一优选例中，所述的增敏核酸探针带有荧光基团和淬灭基团。

在另一优选例中，所述的荧光基团和淬灭基团各自独立地位于所述增敏核酸探针的5'端、3'端和内部。

在另一优选例中，所述的增敏核酸探针的长度为3-300nt，较佳地5-100nt，更佳地6-50nt，最佳地2-12nt。

在另一优选例中，所述靶标核酸分子包括来源于选自下组的靶标核酸分子：植物、动物、昆虫、微生物、病毒、或其组合。

在另一优选例中，所述的靶标DNA是人工合成或天然存在的DNA。

在另一优选例中，所述的靶标DNA包括野生型或突变型的DNA。

在另一优选例中，所述的靶标DNA包括由RNA逆转录或扩增而获得的DNA，如cDNA等。

在另一优选例中，所述的Cas12a选自下组：FnCas12a、AsCas12a、LbaCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a、Lb4Cas12a或其组合；更佳地，所述的Cas12a为LbaCas12a。

在另一优选例中，所述的具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白选自下组：Cas12b(即C2c1)。

在另一优选例中，所述的具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白选自下组：Cas14。

在另一优选例中，所述的增敏核酸探针包括带有可检测标记的单链DNA。

在另一优选例中，所述的单链DNA为荧光和生物素标记的单链DNA。

在另一优选例中，所述的单链DNA为荧光标记的单链DNA。

在另一优选例中，所述的单链DNA为在5'端标记荧光基团FAM并在3'端标记淬灭基团BHQ1后的荧光探针。

在本发明的第四方面，提供了一种用于检测靶标核酸分子的试剂盒，所述试剂盒包括：

(i)第一容器以及位于第一容器内的Cas蛋白，所述Cas蛋白是Cas12a或者具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白，或者是Cas12b或者具有与Cas12b的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白，或者是Cas14或者具有与Cas14的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白；

(ii)第二容器以及位于第二容器内的向导RNA，所述向导RNA引导所述Cas蛋白特异性结合于靶标核酸分子；

(iii)第三容器以及位于第三容器内的增敏核酸探针；

(iv)第四容器以及位于第四容器内用于扩增靶标核酸分子的扩增试剂；和(v)任选的第五容器以及位于第五容器内的缓冲液；

其中，所述的靶标核酸分子为靶标DNA。

在另一优选例中，所述扩增试剂包括：

(a2)任选的第一探针，所述的第一探针用于在所述扩增反应中与核酸扩增产物结合，从而产生第一可检测信号；和

(a3)任选的用于扩增反应的聚合酶。

在另一优选例中，所述的位于第五容器内的缓冲液包括：用于扩增反应的缓冲液、和/或用于增敏反应的缓冲液。

在另一优选例中，所述的第一容器、第二容器、第三容器、第四容器和第五容器中的任何二个、三个、四个或全部可以是相同或不同容器。

在本发明的第五方面，提供了一种检测样本中是否存在靶标核酸分子的方法，包括以下步骤：

(a)提供本发明第三方面所述的用于检测靶标核酸分子的检测体系；和

(b)检测所述检测体系中的增敏核酸探针是否被Cas蛋白进行切割，所述的切割为旁路单链DNA的反式切割；

其中，所述增敏核酸探针被Cas蛋白切割，则表示所述样本中存在靶标核酸分子；而所述增敏核酸探针不被Cas蛋白切割，则表示所述样本中不存在靶标核酸分子。

在另一优选例中，在所述检测体系中，所述的含核酸扩增产物的待核验样品是用选自下组的核酸扩增方法制备的：PCR扩增、LAMP扩增、RPA扩增、连接酶链式反应、分支DNA扩增、NASBA、SDA、转录介导扩增、滚环扩增、HDA,SPIA,NEAR,TMA和SMAP2。

在另一优选例中，所述的PCR包括高温PCR、常温PCR、低温PCR。

在另一优选例中，所述方法用于检测靶位点处的核酸是否在SNP、点突变、缺失、和/或***。

在另一优选例中，当所述的靶位点的上下游(-20nt至+20nt范围内，较佳地-15nt至+15nt范围内，更佳地-10nt至+10nt范围内)缺乏PAM序列时，采用引入PAM的引物进行核酸扩增。

在另一优选例中，所述的引入PAM的引物具有从5'-3'的式I结构：

P1-P2-P3 (I)

式中，

P1为位于5'端的与靶标核酸分子的序列互补或非互补的5'区段序列；

P2为PAM序列；

P3为位于3'端的与靶标核酸分子的序列互补3'区段序列。

在另一优选例中，所述的PAM引物特异性结合于靶标核酸分子的上游或下游。

在另一优选例中，P1的长度为0-20nt。

在另一优选例中，P3的长度为5-20nt。

在另一优选例中，所述的PAM引物的长度为18-50nt，较佳地20-35nt。

在另一优选例中，所述的互补包括完全互补和部分互补。

在另一优选例中，所述的核酸扩增中使用至少一条引物含有PAM序列。

在另一优选例中，当所述的靶位点的上下游(-20nt至+20nt范围内，较佳地-15nt至+15nt范围内，更佳地-10nt至+10nt范围内)含有PAM序列时，则可采用含有或不含有PAM序列的引物，并且扩增出的扩增产物含有所述PAM序列。

在另一优选例中，在步骤(b)中的检测包括荧光检测法。

在另一优选例中，所述荧光检测法采用酶标仪或者荧光分光光度计进行检测。

在本发明的第六方面，提供了一种增敏试剂的用途，它被用于制备一制剂，所述制剂用于增强待检测靶标核酸分子的检测信号。

在另一优选例中，所述的增强是利用CRISPR-Cas蛋白增强靶标核酸分子的检测信号。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了针对ORF1ab扩增产物序列的crRNA探针的筛选。ORF1ab的扩增使用引物对2。扩增产物经过SENA反应后，使用荧光定量PCR仪(ABI StepOne Plus)实时检测荧光值，每个循环设置的时长为30s。使用crRNA1时，Cas12a的反式切割活性最高。

图2显示了针对N基因扩增产物序列的crRNA探针的筛选。N基因的扩增使用引物对10。扩增产物经过SENA反应后，使用荧光定量PCR仪(ABI StepOne Plus)实时检测荧光值，每个循环设置的时长为30s。使用crRNA7时，Cas12a的反式切割活性最高。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，通过对Cas酶(如Cas12a，Cas12b和Cas14酶)的切割特性的研究，开发了一种增敏的靶标核酸检测的技术方案，该方案在对靶标核酸分子扩增后进一步通过增敏反应进行检测。出乎意料地，实验结果表明，可以对原本通过qRT-PCR等检测方法难以获得有效检测结果的检测样本(如咽拭子、鼻拭子等)，本发明方法可以快速、简便、高效而准确地检测SARS-CoV-2等病原体，从而为确诊或防疫提供有力的检测结果。在此基础上完成了本发明。

根据本发明方法的特点，将其命名为SENA(Specific Enhancement for NucleicAcid Amplification Assays)，可用于新冠病毒PCR反应产物的专一增敏。研究表明，本发明方法特别适合检测SARS-CoV-2病毒核酸分子。

术语

术语“CRISPR”是指成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)，该序列是许多原核生物的免疫***。

术语“Cas蛋白”是指CRISPR-associated蛋白，它是CRISPR***中的相关蛋白。

术语“向导RNA”是指引导Cas蛋白特异性结合靶标核酸序列的RNA；通常包含CRISPR RNA(即crRNA)和trans-activating crRNA(即tracrRNA)，但对于部分Cas蛋白如Cas12a，仅需crRNA便可引导Cas蛋白特异结合靶标核酸。

术语“向导序列”是指向导RNA中与靶标核酸特异配对的RNA序列。

术语“crRNA”是指CRISPR RNA，是短的引导Cas蛋白到结合到靶标核酸序列的向导RNA。

术语“Cas12a”(旧称“Cpf1”)是指crRNA依赖的内切酶，它是CRISPR***分类中V-A型(type V-A)的酶。

术语“Cas12b”，“C2c1”可互换使用，是指crRNA依赖的内切酶，它是CRISPR***分类中V-B型(type V-B)的酶。

术语“PAM”是指前间区序列邻近基序(protospacer-adjacent motif)，是Cas蛋白切割所必须，例如，FnCas12a的PAM为TTN序列，LbaCas12a的PAM为TTTN序列，AacCas12b的PAM为TTN。

术语“LAMP”是环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermalamplification),是一种适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术。

术语“PCR”是聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction)，是一种适用于靶标核酸扩增的技术。

检测方法

本发明公开了一种靶标核酸分子的检测方法，将含有待检靶标核酸分子的反应体系中，向导RNA、Cas蛋白、核酸探针、缓冲液，然后对其进行荧光检测。

所述Cas蛋白为Cas12a或者Cas12b或者Cas14；

所述的Cas12a优选为FnCas12a、AsCas12a、LbaCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a中一种；所述的Cas12a优选为LbaCas12a。

所述的Cas12b优选为AacCas12b、Aac2Cas12b、AkCas12b、AmCas12b、AhCas12b、AcCas12b。

所述的Cas14优选为Cas14a、Cas14b、Cas14c。

向导RNA是指引导Cas蛋白特异性靶向DNA序列的RNA。

待检靶标核酸分子的反应体系中的待检靶标核酸分子经过扩增后得到。

该检测方法可检测病原微生物、基因突变或特异靶标DNA。

一种Cas蛋白在靶标核酸分子的检测方法中的用途。

靶标DNA、向导RNA和Cas蛋白形成三元复合体时，该复合物会切割体系中其他的单链DNA分子。

向导RNA是指引导Cas蛋白特异性靶向DNA序列的RNA。

试剂盒

本发明还提供了一种试剂盒，包括增敏试剂(向导RNA、Cas蛋白、和增敏核酸探针)。此外，本发明试剂盒还可包括缓冲液。

本发明提供了一种高特异性地快速检测靶标核酸分子的检测方法。一旦靶标DNA(单链或者双链)、向导RNA和有反式切割活性的Cas蛋白(Cas12a，Cas12b和Cas14)形成三元复合体时，该复合物会切割体系中其他的单链DNA分子。通过向检测体系中加入向导RNA和有反式切割活性的Cas蛋白；当靶标DNA存在时，有反式切割活性的Cas蛋白与向导RNA以及靶标DNA形成三元复合体，同时该复合物行使其反式切割的活性并切割带荧光信号标记的单链DNA(两头分别连有发光基团和淬灭基团，被切断后发光基团可以发光)，从而发出荧光。因此，通过检测荧光即可得知待检测体系中是否含有靶标DNA分子。使用本发明的方法可快速检测样品的扩增液中是否含有特异的DNA扩增产物，从而推断原始的样本中是否含有特异的核酸序列。相比于传统的PCR(包括qPCR和qRT-PCR)技术，本检测方法通过将CRISPR反式切割与PCR技术进行结合，可大幅度提高靶标核酸检测的灵敏度。本发明中的核酸探针优选为荧光探针。

SENA分析

本发明提供了基于Cas12a、Cas12b、Cas14等Cas酶在核酸检测中增敏的应用。以下以Cas12a为例进行描述。

根据研究，Cas12a具有反式切割的活力，即一旦靶标DNA、crRNA和Cas12a蛋白形成三元复合体时，会随机切割体系中其他的单链DNA。根据这一原理设计了SENA特异性增敏的方法。首先，将旁路DNA设计成荧光探针，其组成是12nt的随机序列，并在5'端标记荧光基团FAM在3'端标记淬灭基团BHQ1(FAM-N₁₂-BHQ1)。将一定体积的PCR(或qPCR或qRT-PCR)扩增产物与SENA反应液(保护特异crRNA和Cas12a蛋白)混合，当待检测体系中含有标靶DNA的扩增产物时，crRNA和Cas12a蛋白将与靶标DNA的扩增产物形成三元复合体，并激活Cas12a蛋白的反式切割活性，将体系中的荧光探针切碎，从而发出可被检测的荧光。利用Cas蛋白-crRNA特异识别扩增的靶标DNA来激发Cas蛋白反式切割活性并切碎单链荧光探针以发出可被检测的荧光，我们称这种方法为SENA。

当同时检测多个靶标核酸时，需要将特异靶向靶标核酸的多crRNA与Cas12a蛋白混合，然后加入PCR(或qPCR或qRT-PCR)扩增产物进行SENA反应。当体系中任意一种靶标核酸被特异扩增时，SENA便可以发出可被检测的荧光信号。

本发明的主要优点在于：

(1)快速：在扩增完成的情况下，只需10分钟便可以获得SENA检测结果。

(2)灵敏：在q(RT)-PCR的Ct值在40左右甚至得不出Ct值的情况下，SENA仍然可以非常特异、灵敏地检测中扩增体系中是否存在特异的扩增产物，即q(RT)-PCR的扩增是否为特异性扩增。此外，在q(RT)-PCR无法测定出Ct值的情况下，SENA仍然可以鉴定一部分假阴性样本。

(3)特异：本发明使用了CRISPR-Cas蛋白特异结合靶标核酸的特性。由于Cas蛋白的特异性很高(可区别单碱基的错配)，本发明亦具备非常高的特异性，可以严格区分特异扩增和非特异扩增。

(4)简单：没有特殊复杂的步骤，且无需改变现有样本检测的操作流程；只需要在现有的扩增完成后取出部分扩增试剂进行SENA反应即可。如果将SENA制成试剂盒以及设定好程序，只需简单的加入核酸扩增产物即可完成操作。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

本发明中所涉及的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。

材料

RNA酶抑制剂购自TaKaRa公司；基因或引物(寡核苷酸)或荧光探针由上海生工合成；T7RNA聚合酶购自Thermo公司；rNTPs购自上海生工；RNA纯化与浓缩试剂盒(RNA Clean&ConcentratorTM-5)购自Zymo Research；

SV Gel and PCR Clean-Up System购自Promega公司；培养基(如，Tryptone，Yeast Extract等)均购自OXOID公司；SARS-CoV-2RNA标准品购自菁良基因科技(深圳)有限公司；qRT-PCR试剂盒购自上海伯杰医疗科技有限公司或自行合成引物和探针序列后自制qRT-PCR预混液；LbaCas12a、Cas12b和Cas14蛋白由上海吐露港生物科技有限公司生产。

向导序列

	序列(5'-3')	SEQ ID No
			向导序列1	UGGCUGUAGUUGUGAUCAACUCC	1
向导序列2	AUCACAACUACAGCCAUAAC	2
			向导序列3	GCGGAGUUGAUCACAACUACAGC	3
向导序列4	AAAACACAGUCUGUACCGUCUGC	4
			向导序列5	CUCUCAAGCUGGUUCAAUCUGUC	5
向导序列6	CUGCUGCUUGACAGAUUGAACCA	6
			向导序列7	CUUUGCUGCUGCUUGACAGAUUG	7

生成向导RNA的序列

实施例1

1.1 靶向SARS-CoV-2 ORF1ab的SENA分析

在本实施例中，为了筛选合适的向导RNA来靶向SARS-CoV-2 ORF1ab中特异扩增的序列，根据中国CDC推荐的引物(见引物对2，SEQ ID No:20和21)以及配套的qRT-PCR扩增的Taqman荧光探针序列(5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'，SEQ ID No:8)确定ORF1ab的qRT-PCR的扩增区间。

从扩增的序列中设计以下crRNA序列：

	序列(5'-3')	SEQ ID No:
			crRNA向导序列1：	5'-UGGCUGUAGUUGUGAUCAACUCC-3'	1
crRNA向导序列2：	5'-AUCACAACUACAGCCAUAAC-3'	2
			crRNA向导序列3：	5'-GCGGAGUUGAUCACAACUACAGC-3'	3
crRNA向导序列4：	5'-AAAACACAGUCUGUACCGUCUGC-3'	4

为制备crRNA探针，将T7-crRNA-F与合成的寡核苷酸，进行退火来制备转录模板。具体是，将配对的寡核苷酸(4μM)在1×PCR缓冲液(Tolo Biotech.)中退火，总体积为50μL，然后进行退火程序：在95℃初始变性5分钟，然后从95℃冷却至20℃，使用热循环仪每分钟降低1℃。使用T7RNA聚合酶体外合成crRNA，并且反应在37℃下反应4-16小时。然后使用DNase I处理以去除模板DNA，再用RNA纯化与浓缩试剂盒纯化crRNA，并用NanoDrop 2000C(Thermo Fisher Scientific)定量。最后将纯化好的向导RNA探针稀释为10μM浓度并保存到-80℃冰箱中备用。

以合成的含有ORF1ab的序列为模板，用上述CDC推荐的引物和探针进行qPCR扩增。取qPCR扩增反应液2μL加入到18μL预混的含有不同的crRNA序列的SENA反应体系(含有LbaCas12a、不同的crRNA、FAM-N₁₂-BHQ1和反应缓冲液)中，于37度反应10分钟，并持续检测FAM荧光值。

如图1所示，测试结果显示，LbaCas12a与crRNA 1的切割活性最高，且在最短时间(3分钟)内达到信号饱和；crRNA 2和crRNA 3的反式切割活性次之，在8分钟内信号达到饱和；crRNA 4的反式切割活性最低，在10分钟仍然没有达到信号饱和。因此，后续的反式切割实验均选择crRNA 1用于检测SARS-CoV-2 ORF1ab的扩增产物。

1.2 靶向SARS-CoV-2 N基因的SENA分析

类似地，根据中国CDC推荐的引物(见引物对10，SEQ ID No:36和37)以及qRT-PCR的荧光探针序列(5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'，SEQ ID No:9)确定N基因的qRT-PCR的扩增区间。

从扩增的序列中设计以下向导RNA序列：

	序列(5'-3')	SEQ ID No:
			crRNA向导序列5：	5'-CUCUCAAGCUGGUUCAAUCUGUC-3'	5
crRNA向导序列6：	5'-CUGCUGCUUGACAGAUUGAACCA-3'	6
			crRNA向导序列7：	5'-CUUUGCUGCUGCUUGACAGAUUG-3'	7

用上述类似的方法进行体外转录、纯化、定量crRNA。

以合成的含有N基因的序列为模板，用上述CDC推荐的引物和探针进行qRT-PCR扩增。取qRT-PCR扩增反应液2μL加入到18μL预混的含有不同的crRNA序列的SENA反应体系(含有LbaCas12a、不同的crRNA、FAM-N₁₂-BHQ1和反应缓冲液)中，于37度反应10分钟，并持续检测FAM荧光值。

如图2所示，测试结果显示，Cas12a与crRNA 7的切割活性最高，且在10分钟内达到信号饱和；crRNA 6的反式切割活性次之，crRNA 5反式切割活性最低，且在10分钟都没有达到信号饱和。因此，后续的反式切割实验均选择crRNA 7用于检测SARS-CoV-2 N基因的扩增产物。

因此，基于实施例1,可以确定的优选的试剂组合如下：

针对SARS-CoV-2 ORF1ab：

引物对2:SEQ ID No:20和21,Taqman探针：SEQ ID No:8；

crRNA：SEQ ID No:11(其向导序列为SEQ ID No:1)

针对SARS-CoV-2 N基因：

引物对10:SEQ ID No:36和37,Taqman探针：SEQ ID No:9,

crRNA7:SEQ ID No:17(其向导序列为SEQ ID No:1)

实施例2

在本实施例中，将SARS-CoV-2 RNA标准品对照用HEK293T的总RNA进行梯度稀释，分别进行qRT-PCR反应和SENA增敏反应。阴性对照和阳性对照分别为水和合成的SARS-CoV-2 ORF1ab片段；所使用的qRT-PCR扩增引物和探针为中国CDC推荐的引物(见引物对2)及配套的Taqman荧光探针。

经过qRT-PCR反应后，取2μL qRT-PCR的反应液加入18μL预混好的SENA反应体系中(LbaCas12a，crRNA1，FAM-N₁₂-BHQ1和反应缓冲液)，于37度反应10分钟。

qRT-PCR和SENA的反应结果如下表1所示。其中，qRT-PCR的检测灵敏度只能检出5号样本，而SENA则可以有效检测8号样本，比qRT-PCR的灵敏度高至少8倍。其中，UD表示qRT-PCR未扩增出曲线，也没有有效的Ct值。“-”表示SENA反应阴性；“+”表示SENA反应阳性。

表1.SARS-CoV-2的RNA标准品的梯度稀释测试结果

实施例3

在本实施例中，将合成的含有SARS-CoV-2 N基因片段的DNA阳性对照用人的咽拭子提取液进行梯度稀释，分别进行qPCR反应和SENA增敏反应。所使用的qPCR扩增引物为中国CDC推荐的引物(见引物对10)和配套的Taqman荧光探针。经过qPCR反应后，取2μL qPCR的反应液加入预混好的18μL SENA反应体系中(LbaCas12a、crRNA7、FAM-N₁₂-BHQ1和反应缓冲液)，于37度反应10分钟。

阳性对照样本经过梯度稀释后分别进行qPCR和SENA增敏实验的结果如下表2所示。当qPCR反应体系中的靶标DNA分子少于32时，qPCR无法获得稳定的、有效的扩增Ct值。相比之下，SENA的检测限可以达到2个靶标核酸分子，即原始qPCR反应体系中只要有2个靶标分子或以上，经过扩增后即可以使用SENA进行有效检测。因此，针对该靶标基因的检测时，SENA比qPCR的灵敏度高16倍。虽然，在使用qPCR和SENA检测不同的靶标核酸时，可能获得不同的qPCR检测极限和SENA的检测极限，但是SENA的检测灵敏度很明显高于qPCR的检测灵敏度。

表2.人工合成的SARS-CoV-2的DNA阳性对照的梯度稀释测试结果

讨论

SENA增敏技术是基于CRISPR技术开发的一种高灵敏、高专一、高效率的核酸检测技术，是对qPCR或qRT-PCR反应之后的产物进行进一步的增敏反应。其检测原理是在样本扩增完成后，利用CRISPR-Cas12和特异的crRNA结合扩增体系中靶标DNA，形成三元复合物后激活Cas蛋白的ssDNA反式切割活力；该反式切割活力能将体系中的ssDNA荧光报告探针快速切碎而发出可被检测的荧光信号。

SENA反应的操作过程简单，只需取出少量扩增反应液，加入到配制好的SENA信号增强反应预混液中，再次读取荧光值，可在10-30分钟内完成整个反应。本发明具有操作简便、信号扩增显著、反应速度快等优点。

通过SENA增敏反应，可确诊qPCR结果为“弱阳性”的样本(Ct值为37-39)，甚至还可能发现少量被误判为“阴性”的极弱阳性样本(Ct值≥39)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种靶标核酸分子的检测方法，其特征在于，包括步骤：

2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述Cas蛋白为Cas12a或者具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白；

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，向导RNA是指引导Cas蛋白特异性结合靶标DNA的RNA。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述增敏核酸探针为单链DNA或含有部分DNA序列的单链核酸探针；

优选地，所述增敏核酸探针为FAM-N₁₂-BHQ1，其中N表示A、T、C、或G中任一核苷酸。

5.根据权利要求1至4中任意一项所述的检测方法，其特征在于，所述的待核验样品是对检测样品进行扩增反应后形成的反应体系。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的靶标核酸分子选自下组：病原微生物的核酸分子、基因突变的核酸分子、和特异靶标核酸分子。

7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的检测样本是用选自下组样本制备的核酸样本：咽拭子、鼻拭子、尿液、粪便、体液、或其组合。

8.一种靶标核酸分子的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：