CN110256567A - 用于选择并产生含有至少两种不同结合实体的定制靶向实体的方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文中报道了一种用于产生双特异性抗体的方法，包括步骤：孵育(i)在20个C末端氨基酸残基范围内包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO:01)的抗体Fab片段或scFv抗体，(ii)包含全长抗体重链、全长抗体轻链和Fc重链的单臂抗体，其中全长抗体重链和全长抗体轻链是形成抗原结合位点的同族抗体链，其中全长抗体重链和Fc重链通过形成抗体铰链区的一个或多个二硫键彼此共价连接，并且其中Fc重链在其N末端具有寡甘氨酸氨基酸序列，和(iii)分选酶A。

Description

用于选择并产生含有至少两种不同结合实体的定制靶向实体 的方法及其用途
本申请是申请日为2013年6月25日、发明名称为“用于选择并产生含有至少两种不同结合实体的定制高度选择性和多特异性靶向实体的方法及其用途”的中国专利申请201380033554.5的分案申请。
本文中报道了通过使用转肽酶如分选酶A选择并产生多特异性实体的方法，其中可以彼此独立地选择特异性，和这种方法用于产生新的定制多特异性抗体的用途。
发明背景
单克隆抗体在当今的医学领域中具有巨大治疗潜能并且发挥重要作用。在最近十年期间，制药业中的一个明显趋势已经是开发单克隆抗体(mAb)和抗体Fc-融合多肽(可结晶片段-融合多肽)作为跨多样临床环境的治疗剂，包括肿瘤学、慢性炎性疾病、移植、传染病、心血管医学或眼科疾病(Carter,J.P.,Nature Reviews Immunology 6(2006)343-357；Chan,A.C.和Carter,J.P.,Nature Reviews Immunology 10(2010)301-316)。
治疗性抗体的临床效率主要依赖于两种官能性：i)由Fv域介导的靶特异性结合，和ii)免疫介导的效应子功能如由抗体Fc区介导的ADCC(抗体依赖的细胞介导细胞毒性)、CDC(补体依赖的细胞毒性)和ADCP(抗体依赖的细胞吞噬作用)。IgG类别的免疫球蛋白的Fc区包含铰链区和两个恒定结构域(CH2和CH3)。Fc区还与新生FcRn受体相互作用并且因而决定抗体在体内的半寿期。铰链区是抗体分子的臂形成Y样结构的区域，所述Y样结构使得分子中在此处的灵活性成为可能。一种或多种IgG亚类在二硫键数目和铰链区长度方面不同。
与抗体Fc区相关的效应子功能随抗体类别和亚类变动并且包括例如抗体通过其Fc区与细胞上特定Fc受体(FcR)结合，这触发多种生物学反应(参见例如Jiang,X.-R.等人,Nature Reviews Drug Discovery 10(2011)101-110；Presta,L.G.,Current Opinion inImmunology 20(2008)460-470)。
构成融合多肽或缀合物的抗体或Fc区的铰链区参与至少部分的抗体功能如抗原结合和Fc区介导的抗体效应子功能。尽管抗原结合(尤其二价亲合抗体结合)取决于特定/天然铰链区的灵活性、长度和空间取向，Fc区介导的效应子功能依赖于抗体的类别和亚类。与其他IgG抗体的二价相比，对一些人IgG4抗体观察到的功能性单价是显示Fc区参与抗原结合特性的另一个例子(Salfeld,J.G.,Nature Biotechnology 12(2007)1369-1372；Presta,L.G.,Current Opinion in Immunology 20(2008)460-470)。
Levary,D.A.等人报道由分选酶A催化的蛋白质-蛋白质融合(PLOS ONE 6(2011))。Madej,M.P.等人报道了将抗表皮生长因子受体抗体工程化成单链样式并通过分选酶A介导的蛋白质连接标记(Biotechnol.Bioeng.109(2012)1461-1470)。Ta,H.T.等人报道了酶促单链抗体加标签过程作为心血管疾病中靶向的分子成像和细胞归巢的通用方法(Cir.Res.109(2011)365-373)。Popp,M.等人报道使用分选酶产生和破坏肽键–蛋白质工程(Angew.Chem.Int.Ed.Eng.50(2011)5024-5032)。在WO2010/087994中报道了用于连接的方法及其用途。
发明简述
本文中报道了提供定制的高度特异性治疗性分子用于治疗需要治疗的患者中的疾病如癌症的方法，其中治疗性分子适应于患者的疾病特征和/或患者的基因型/表型。
通过考虑患者的带疾/患病细胞的基因型/表型而产生定制分子，实现这种适应性。
在第一步骤中，确定意在用治疗性分子靶向的细胞基因型/表型(例如疾病特异性细胞表面抗原的存在和数目/量)。这可以例如使用荧光标记的单特异性(治疗或诊断)抗体，通过例如来自如血液和/或活组织检查材料的患者细胞的细胞成像技术如免疫组织化学染色(IHC，免疫组织化学)实现。备选地，可以在用标记的治疗性或诊断性抗体染色后使用基于FACS的方法，分析细胞的基因型/表型。还可以使用体内成像技术以确定患者的疾病相关细胞的基因型/表型，所述体内成像技术包括光学成像、分子成像、荧光成像、生物发光成像、MRI、PET、SPECT、CT和活体内显微术。取决于患者的疾病相关细胞的确定的基因型/表型，可以/选择定制的靶向/结合实体组合并且将它们在治疗性分子中组合。这种治疗性分子可以例如是双特异性抗体。
这类定制治疗性分子i)将是高度特异的，ii)将具有良好功效，并且iii)与常规选择的治疗剂相比，将引起更少副作用。这可以通过以下方式实现：授予治疗性分子改进的靶向作用和/或改进的定制递送特性，例如对其预期作用位点的治疗性有效负载。
可以通过与常规选择的治疗性分子相比靶向治疗分子的更高/增加的选择性和/或特异性实现改善治疗性分子递送至其作用位点，如例如癌细胞。治疗性分子包含与不同抗原(例如两个不同表面标志物)或与相同抗原上的不同表位(例如相同表面标志物上的两个不同表位)特异性结合的至少两种实体。
可以通过两种靶向实体与其各自靶/表位同时结合，实现定制治疗性分子的增加的选择性和/或特异性，即通过亲合力效应实现。特别适合的是对其各自靶/表位具有低亲和力至中等亲和力的两种结合实体的组合。另外，脱靶结合大幅度减少或可以甚至完全消除。
已经发现可以使用分选酶A，利用在第一结合实体如基于darpin结构域的结合实体、基于抗运载蛋白(anticalin)结构域的结合实体、基于T细胞受体片段样scTCR结构域的结合实体、基于骆驼VH结构域的结合实体、基于第十纤连蛋白3结构域的结合实体、基于生腱蛋白结构域的结合实体、基于钙黏着蛋白结构域的结合实体、基于ICAM结构域的结合实体、基于肌联蛋白结构域的结合实体、基于GCSF-R结构域的结合实体、基于细胞因子受体结构域的结合实体、基于糖苷酶抑制剂结构域的结合实体、基于超氧化物歧化酶结构域的结合实体或在其C末端氨基酸序列区域中包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基)的抗体片段(Fab或scFv片段)和包含与同族全长轻链配对的全长抗体重链的单臂抗体片段(OA-Fc)以及在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m＝2、或3、或4、或5)的抗体重链Fc区多肽之间的酶促缀合反应，提供定制双特异性靶向和结合分子。
已经发现采用如本文中报道的方法，可以定制例如特异性针对细胞(如癌细胞)表面上存在的两种表面标志物的双特异性抗体。由于结合特异性由起始组分单独提供，所以可以单纯通过确定细胞上(如细胞癌细胞上)存在的表面标志物并且通过酶促过程缀合与这些表面标志物或其各自配体特异性结合的各个抗体片段，定制多特异性靶向和结合分子。由于通过分选酶A进行酶促缀合，所以得到的双特异性抗体以存在氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基)为特征。
如本文中报道的一个方面是用于产生多特异性结合分子的方法，所述方法包括步骤：孵育
(i)在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基)的第一结合实体，
(ii)包含全长抗体重链、全长抗体轻链和抗体重链Fc区多肽的抗体片段，
以此全长抗体重链和全长抗体轻链是同族抗体链并且其可变结构域对(VH和VL)形成抗原结合位点，
以此全长抗体重链和抗体重链Fc区多肽通过形成抗体铰链区的一个或多个二硫键彼此共价连接，并且
以此抗体重链Fc区多肽在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m＝2、或3、或4、或5)氨基酸序列，
和
(iii)分选酶A
并且因而产生多特异性结合分子。
如本文中报道的一个方面是用于产生多特异性结合分子的方法，所述方法包括以下步骤
(i)确定存在于含有细胞的样品中的细胞表面标记物和i)选择其至少第一细胞表面标记物和第二细胞表面标记物，或ii)选择与多特异性结合分子的结合特异性数目相对应的其多种细胞表面标记物，
(ii)孵育(a)与第一细胞表面标记物或其配体特异性结合，并且在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基)的第一结合实体，(b)包含全长抗体重链、全长抗体轻链和抗体重链Fc区多肽的抗体片段，以此全长抗体重链和全长抗体轻链是同族抗体链并且其可变结构域对(VH和VL)形成与第二细胞表面标记物或其配体特异性结合的抗原结合位点，以此全长抗体重链和抗体重链Fc区多肽通过形成抗体铰链区的一个或多个二硫键彼此共价连接，并且以此抗体重链Fc区多肽在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m＝2、或3、或4、或5)氨基酸序列，和(c)分选酶A
并且因而产生多特异性结合分子。
如本文中报道的一个方面是从通过以下方式在单个多特异性结合分子中组装的结合实体集合/文库中选择至少两种结合实体用作治疗剂的方法：孵育(a)与第一表位或抗原特异性结合和在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基)的第一结合实体，(b)包含全长抗体重链、全长抗体轻链和抗体重链Fc区多肽的抗体片段，以此全长抗体重链和全长抗体轻链是同族抗体链并且其可变结构域对(VH和VL)形成与第二表位或抗原特异性结合的抗原结合位点，以此全长抗体重链和抗体重链Fc区多肽通过形成抗体铰链区的一个或多个二硫键彼此共价连接，并且以此抗体重链Fc区多肽在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m＝2、或3、或4、或5)氨基酸序列，和(c)分选酶A酶。这种活性剂具有改进的靶向/递送特性。
如本文中报道的一个方面是用于产生双特异性抗体的方法，所述方法包括步骤：孵育
(i)在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基)的抗体Fab片段或scFv抗体，
(ii)包含全长抗体重链、全长抗体轻链和抗体重链Fc区多肽的单臂抗体片段，
以此全长抗体重链和全长抗体轻链是彼此互补的同族抗体链并且其可变结构域对(VH和VL)形成抗原结合位点，
以此全长抗体重链和抗体重链Fc区多肽通过形成抗体铰链区的一个或多个二硫键彼此共价连接，并且
以此抗体重链Fc区多肽在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m＝2、或3、或4、或5)氨基酸序列，
和
(iii)分选酶A
并且因而产生双特异性抗体。
如本文中报道的一个方面是用于产生双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤
(i)确定存在于含有细胞的样品中的细胞表面标记物并且选择其至少第一细胞表面标记物和第二细胞表面标记物，
(ii)孵育(a)在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基)的抗体Fab片段或scFv抗体，以此Fab片段或scFv抗体与第一细胞表面标记物或其配体特异性结合，(b)包含全长抗体重链、全长抗体轻链和抗体重链Fc区多肽的单臂抗体片段，以此全长抗体重链和全长抗体轻链是彼此互补的同族抗体链并且其可变结构域对(VH和VL)形成与第二细胞表面标记物或其配体特异性结合的抗原结合位点，以此全长抗体重链和抗体重链Fc区多肽通过形成抗体铰链区的一个或多个二硫键彼此共价连接，并且以此抗体重链Fc区多肽在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m＝2、或3、或4、或5)氨基酸序列，和(c)分选酶A
并且因而产生双特异性抗体。
如本文中报道的一个方面是用于确定多特异性结合分子的结合实体的组合的方法，所述方法包括以下步骤
(i)确定多种多特异性结合分子的结合特异性和/或选择性和/或亲和力和/或效应子功能和/或体内半寿期，以此在多种多特异性结合分子中包含结合实体的每种(可能)的组合，
并且
(ii)选择具有合适的结合特异性和/或选择性和/或亲和力和/或效应子功能和/或体内半寿期的多特异性结合分子并且因而确定抗原结合位点的组合。
如本文中报道的一个方面是用于确定抗原结合位点的组合的方法，包括以下步骤
(i)确定通过如下方式制备的多种双特异性抗体的结合特异性和/或选择性和/或亲和力和/或效应子功能和/或体内半寿期：组合(a)第一多种抗体Fab片段或scFv抗体片段的每个成员，以此每个成员在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基)，以此Fab片段或scFv抗体与第一表位或抗原特异性结合，与(b)多种包含全长抗体重链、全长抗体轻链和抗体重链Fc区多肽的单臂抗体片段的每个成员，以此全长抗体重链和全长抗体轻链是彼此互补的同族抗体链并且其可变结构域对(VH和VL)形成与第二表位或抗原特异性结合的抗原结合位点，以此全长抗体重链和抗体重链Fc区多肽通过形成抗体铰链区的一个或多个二硫键彼此共价连接，并且以此抗体重链Fc区多肽在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m＝2、或3、或4、或5)氨基酸序列，和(c)分选酶A
并且
(ii)选择具有合适的结合特异性和/或选择性和/或亲和力和/或效应子功能和/或体内半寿期的双特异性抗体并且因而确定抗原结合位点的组合。
在一个实施方案中，结合实体彼此独立地选自基于darpin结构域的结合实体、基于抗运载蛋白(anticalin)结构域的结合实体、基于T细胞受体片段样scTCR结构域的结合实体、基于骆驼VH结构域的结合实体、基于第十纤连蛋白3结构域的结合实体、基于生腱蛋白结构域的结合实体、基于钙黏着蛋白结构域的结合实体、基于ICAM结构域的结合实体、基于肌联蛋白结构域的结合实体、基于GCSF-R结构域的结合实体、基于细胞因子受体结构域的结合实体、基于糖苷酶抑制剂结构域的结合实体、基于超氧化物歧化酶结构域的结合实体，或抗体片段如Fab或scFv片段。
在全部方面的一个实施方案中，多特异性结合分子是双特异性抗体，和/或第一结合实体是抗体Fab片段或scFv抗体。
在一个实施方案中，组合的特征在于：将抗体Fab片段或scFv抗体片段和包含全长抗体重链、全长抗体轻链和抗体重链Fc区多肽的抗体片段与分选酶A孵育。
在一个实施方案中，Fab片段或scFv抗体片段在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基)。
在一个实施方案中，单臂抗体片段的全长抗体重链和全长抗体轻链是同族抗体链并且其可变结构域对(VH和VL)形成与第二表面标记物特异性结合的抗原结合位点，以此全长抗体重链和抗体重链Fc区多肽通过形成抗体铰链区的一个或多个二硫键彼此共价连接，并且抗体重链Fc区多肽在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m＝2、或3、或4、或5)氨基酸序列。
在全部方面的一个实施方案中，抗体Fab片段或scFv抗体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GnSLPX1TG(SEQ ID NO:02，其中X1可以是任何氨基酸残基，n＝1、2或3)。
在全部方面的一个实施方案中，抗体Fab片段或scFv抗体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GSLPX1TGGSGS(SEQ ID NO:03，其中X1可以是任何氨基酸残基)。
在全部方面的一个实施方案中，抗体Fab片段或scFv抗体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GGGSLPX1TGGSGS(SEQ ID NO:04，其中X1可以是任何氨基酸残基)。
在全部方面的一个实施方案中，抗体Fab片段或scFv抗体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGSGS(SEQ ID NO:05，其中X1可以是任何氨基酸残基)，以此X2可以是除G之外的任何氨基酸残基。
在全部方面的一个实施方案中，抗体Fab片段或scFv抗体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GnSLPX1TGGSGSX3(SEQ ID NO:06，其中X1可以是任何氨基酸残基，n＝1、2或3)，以此X3是氨基酸序列标签。
在全部方面的一个实施方案中，抗体Fab片段或scFv抗体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGSGSX3(SEQ ID NO:07，其中X1可以是任何氨基酸残基)，以此X2可以是除G之外的任何氨基酸残基，并且以此X3是氨基酸序列标签。
在全部方面的一个实施方案中，抗体重链Fc区多肽在其N末端包含两个甘氨酸残基。
在全部方面的一个实施方案中，单臂抗体片段在其重链的N末端包含氨基酸序列GGCPX4C(SEQ ID NO:08)，以此X4是S或P。
在全部方面的一个实施方案中，X1是E。
如本文中报道的一个方面是通过如本文中报道的方法获得的多特异性结合分子。
一个方面是在其重链之一中包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基)的多特异性结合分子。
在一个实施方案中，多特异性结合分子在其重链之一中包含氨基酸序列GnSLPX1TG(SEQ ID NO:02，其中X1可以是任何氨基酸残基，n＝1、2或3)。
在一个实施方案中，多特异性结合分子在其重链之一中包含氨基酸序列GnSLPX1TGGCPX4C(SEQ ID NO:09，其中X1可以是任何氨基酸残基，其中X4可以是S或P，n＝1、2或3)。
在一个实施方案中，多特异性结合分子在其重链之一中包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGCPX4C(SEQ ID NO:10，其中X1可以是任何氨基酸残基，其中X4可以是S或P)，以此X2可以是除G之外的任何氨基酸残基。
如本文中报道的一个方面是通过如本文中报道的方法获得的双特异性抗体。
一个方面是在其重链之一中包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基)的双特异性抗体。
在一个实施方案中，双特异性抗体在其重链之一中包含氨基酸序列GnSLPX1TG(SEQ ID NO:02，其中X1可以是任何氨基酸残基，n＝1、2或3)。
在一个实施方案中，双特异性抗体在其重链之一中包含氨基酸序列GnSLPX1TGGCPX4C(SEQ ID NO:09，其中X1可以是任何氨基酸残基，其中X4可以是S或P，n＝1、2或3)。
在一个实施方案中，双特异性抗体在其重链之一中包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGCPX4C(SEQ ID NO:10，其中X1可以是任何氨基酸残基，其中X4可以是S或P)，以此X2可以是除G之外的任何氨基酸残基。
如本文中报道的一个方面是包含如本文中报道的多特异性结合分子的药物制剂。
如本文中报道的一个方面是如本文中报道的多特异性结合分子在制造药物中的用途。
在一个实施方案中，该药物用于治疗癌症。
如本文中报道的一个方面是用于治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括向该个体施用有效量如本文中报道的多特异性结合分子。
如本文中报道的一个方面是用于摧毁个体中癌细胞的方法，所述方法包括向该个体施用有效量如本文中报道的多特异性结合分子。
如本文中报道的一个方面是包含如本文中报道的双特异性抗体的药物制剂。
如本文中报道的一个方面是如本文中报道的双特异性抗体在制造药物中的用途。
在一个实施方案中，该药物用于治疗癌症。
如本文中报道的一个方面是用于治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括向该个体施用有效量如本文中报道的双特异性抗体。
如本文中报道的一个方面是用于摧毁个体中癌细胞的方法，所述方法包括向该个体施用有效量如本文中报道的双特异性抗体。在如本文中报道的全部方面的一个实施方案中，Fc区是人Fc区或其变体。
在一个实施方案中，人抗体Fc区是人IgG1亚类的，或人IgG2亚类的，或人IgG3亚类的，或人IgG4亚类的。
在一个实施方案中，抗体Fc区是人IgG1亚类的或人IgG4亚类的人抗体Fc区。
在一个实施方案中，人抗体Fc区包含至少在以下氨基酸位置228、233、234、235、236、237、297、318、320、322、329和/或331中一个处天然存在氨基酸残基向不同残基的突变，其中抗体Fc区中的残基根据Kabat的EU索引编号。
在一个实施方案中，人抗体Fc区包含在第329位置处天然存在氨基酸残基的突变和至少一个氨基酸残基向不同残基的至少一个其他突变，所述至少一个氨基酸残基选自包含在第228、233、234、235、236、237、297、318、320、322和331位置的氨基酸残基的组，其中Fc区中的残基根据Kabat的EU索引编号。与未修饰的(野生型)Fc区相比，这些特定氨基酸残基的变化导致Fc区的效应子功能改变。
在一个实施方案中，与包含相应野生型IgGFc区的缀合物相比，人抗体Fc区针对人FcγRIIIA、和/或FcγRIIA和/或FcγRI具有减低的亲和力。
在一个实施方案中，人抗体Fc区中第329位置处的氨基酸残基用甘氨酸、或精氨酸、或大到足以摧毁Fc区内部脯氨酸夹层的氨基酸残基置换。
在一个实施方案中，人抗体Fc区中天然存在氨基酸残基的突变是以下至少一种：S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、P329G和/或P331S。
在一个实施方案中，如果抗体Fc区属于人IgG1亚类，则突变是L234A和L235A，或如果抗体Fc区属于人IgG4亚类，则突变是S228P和L235E。
在一个实施方案中，抗体Fc区包含突变P329G。
在一个实施方案中，抗体Fc区在第一重链Fc区多肽中包含突变T366W并且在第二重链Fc区多肽中包含突变T366S、L368A和Y407V，其中根据Kabat的EU索引编号。
在一个实施方案中，抗体Fc区在第一重链Fc区多肽中包含突变S354C并且在第二重链Fc区多肽中包含突变Y349C。
本发明的实施方式的具体描述
I.定义
在本说明书和权利要求中，免疫球蛋白重链Fc区中残基的编号是Kabat的EU索引编号(Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)，NIHPublication 91-3242，所述文献通过引用的方式明确并入本文)。
术语“改变”指例如至少包含Fc区的FcRn结合部分的抗体或融合多肽的亲本氨基酸序列中突变、添加或缺失一个或多个氨基酸残基以获得变体抗体或融合多肽。
术语“氨基酸突变”指在亲本氨基酸序列的氨基酸序列中的修饰。示例性修饰包括氨基酸置换、***和/或缺失。在一个实施方案中，氨基酸突变是置换。术语“在某位置的氨基酸突变”指置换或缺失指定的残基或相邻于指定的残基***至少一个氨基酸残基。术语“相邻于指定的残基***”指在一个至两个残基内部***该残基。***可以相对于指定的残基是N末端或C末端。
术语“氨基酸置换”指将预先确定的亲本氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基替换为不同的“替换”氨基酸残基。该替换残基或多个残基可以是“天然存在的氨基酸残基”(即由遗传密码编码)并且选自：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)：亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。在一个实施方案中，替换残基不是半胱氨酸。本文的氨基酸置换定义中还涵盖用一种或多种非天然存在的氨基酸残基置换。“非天然存在的氨基酸残基”指除上文所列的那些天然存在氨基酸残基之外，能够共价结合多肽链中相邻(一个或多个)氨基酸残基的残基。非天然存在的氨基酸残基的例子包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸、aib和其他氨基酸残基类似物，如在Ellman等人,Meth.Enzym.202(1991)301-336中描述的那些。为了产生这类非天然存在的氨基酸残基，可以使用Noren等人(Science 244(1989)182)和/或Ellman等人(上文)的方法。简而言之，这些方法涉及用非天然存在的氨基酸残基化学活化激活阻抑tRNA，随后体外转录并翻译RNA。也可以通过化学地合成肽并随后使这些肽与重组产生的多肽如抗体或抗体片段融合，将非天然存在的氨基酸掺入肽中。
术语“氨基酸***”指将至少一个额外的氨基酸残基掺入预先确定的亲本氨基酸序列中。尽管***通常将由***一个或两个氨基酸残基组成，但是本申请构思更大的“肽***”，例如***约3个至约5个或甚至至多约10个氨基酸残基。***的(一个或多个)残基可以是如上文定义天然存在或非天然存在的。
术语“氨基酸缺失”指在氨基酸序列中的预定位置处移除至少一个氨基酸残基。
在本申请范围内无论何时提到氨基酸改变，它总是人为的氨基酸改变并且不是随机氨基酸修饰。
术语“氨基酸序列标签”指通过具有特异性结合特性的肽键彼此连接的氨基酸残基的序列。在一个实施方案中，氨基酸序列标签是亲和标签或纯化标签。在一个实施方案中、氨基酸序列标签选自Arg标签、His标签、FLAG标签、3xFlag标签、Strep标签、纳米标签、SBP标签、c-myc标签、S标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、壳多糖结合结构域、GST标签或MBP标签。在一个实施方案中，氨基酸序列标签选自SEQ ID NO:11(RRRRR)、或SEQ IDNO:12(RRRRRR)、或SEQ ID NO:13(HHHHHH)、或SEQ ID NO:14(KDHLIHNVHKEFHAHAHNK)、或SEQ ID NO:15(DYKDDDDK)、或SEQ ID NO:16(DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK)、或SEQ ID NO:17(AWRHPQFGG)、或SEQ ID NO:18(WSHPQFEK)、或SEQ ID NO:19(MDVEAWLGAR)、或SEQ ID NO:20(MDVEAWLGARVPLVET)、或SEQ ID NO:21(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP)、或SEQ ID NO:22(EQKLISEEDL)、或SEQ ID NO:23(KETAAAKFERQHMDS)、或SEQ ID NO:24(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL)、或SEQ ID NO:25(纤维素结合结构域)、或SEQ ID NO:26(纤维素结合结构域)、或SEQ ID NO:27(TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQ)、或SEQ ID NO:28(GST标签)、或SEQ ID NO:29(MBP标签)。
术语“抗体片段”指包含完整抗体的一部分的非完整抗体的分子，其结合与完整抗体结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)、和从抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段和下文描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134。关于scFv片段的综述，见例如Plueckthun,A.,引自The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore(编著),(Springer-Verlag,New York(1994),第269-315页；还见WO 93/16185；US 5,571,894和US 5,587,458。关于包含救援受体(salvagereceptor)结合表位残基和具有增加的体内半寿期的Fab和F(ab')2片段的讨论，见US 5,869,046。
双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述两个抗原结合位点可以是双价或双特异性的。见，例如，EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134；和Holliger,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448。三体抗体和四体抗体还在Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134)中描述。
单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或全部或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。
可以通过多种技术产生抗体片段，所述多种技术包括但不限于蛋白酶解消化完整抗体以及由重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。
术语“双特异性抗体”指可以与第一抗原或表位并且与第二抗原或表位特异性结合的抗原结合分子，以此第一抗原或表位不同于第二抗原或表位。
双特异性抗体样式例如在WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO2010/145793中描述。
术语“抗体依赖的细胞介导细胞毒性”，简写为“ADCC”，指细胞介导的反应，所述反应中表达FcR的非抗原特异性细胞毒细胞(例如天然杀伤细胞(NK细胞)、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)通过与免疫球蛋白Fc区结合识别靶细胞并随后造成靶细胞溶解。用于介导ADCC的主要细胞即NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页上的表3中。
术语“抗体依赖的细胞吞噬作用”，简写为短“ADCP”，指一种过程，其中通过与免疫球蛋白Fc区结合的吞噬性免疫细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞或树突细胞)藉此完整或部分地内化抗体包覆的细胞。
术语“与Fc受体结合”指例如在BIAcore(R)测定法(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,瑞典)中Fc区与Fc受体结合。
在BIAcore(R)测定法中，Fc受体与表面结合并且通过表面等离子体共振(SPR)测量对分析物(例如包含Fc区的融合多肽或抗体)的结合。结合的亲和力由术语ka(缔合常数：Fc区融合多肽或缀合物缔合以形成Fc区/Fc受体复合体的速率常数)、kd(解离常数；Fc区融合多肽或缀合物从Fc区/Fc受体复合体解离的速率常数)和KD(kd/ka)定义。备选地，可以就共振信号高度和解离行为方面，将SPR传感图的结合信号与参比物的响应信号直接比较。
术语“C1q”指包含免疫球蛋白Fc区的结合位点的多肽。C1q连同两种丝氨酸蛋白酶C1r和C1一起形成复合物C1，补体依赖细胞毒性(CDC)途径的第一组分。人C1q可以例如从加利福尼亚州圣迭戈Quidel商购。
术语“CH2结构域”指抗体重链多肽的约从EU位置231延伸至EU位置340的部分(根据Kabat的EU编号体系)。在一个实施方案中，CH2结构域具有氨基酸序列APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQESTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID NO:30)。CH2结构域的独特性在于它不与另一个结构域紧密配对。相反，两个N连接的分枝的糖链间插在完整天然Fc区的两个CH2结构域之间。已经推测糖可以提供结构域-结构域配对作用的替代并且有助于稳定CH2结构域。Burton,Mol.Immunol.22(1985)161-206。
术语“CH3结构域”指抗体重链多肽的约从EU位置341延伸至EU位置446的部分。在一个实施方案中，CH3结构域具有氨基酸序列GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ IDNO:31)。
术语抗体的“类别”指其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。人类中存在五个主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
术语“补体依赖的细胞毒性”，简写为“CDC”，指引起细胞死亡的机制，其中结合靶的Fc区融合多肽或缀合物的Fc区激活一系列酶促反应，以靶细胞膜中形成孔为终结。一般，抗原-抗体复合物如抗体包覆的靶细胞上的那些，结合并激活补体组分C1q，后者转而激活补体级联，导致靶细胞死亡。补体活化还可以导致补体组分沉积在靶细胞表面上，这通过结合白细胞上的补体受体(例如，CR3)促进ADCC或ADCP。
术语“效应子功能”指归因于抗体Fc区的那些生物活性，这些活性随抗体亚类变动。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)；吞噬(ADCP)；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)；和B细胞活化。这种功能可以例如通过Fc区与具有吞噬活性或溶解活性的免疫细胞上的Fc受体结合或通过Fc区与补体***的组分结合来实现。
活性剂(例如，药物制剂)的“有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗性或预防性结果的量。
术语“减少的效应子功能”指与对照分子(例如具有野生型Fc区的多肽)相比，减少与分子相关的特定效应子功能(例如ADCC或CDC)至少20％。术语“强烈减少的效应子功能”指与对照分子相比，减少与分子相关的特定效应子功能(例如ADCC或CDC)至少50％。
术语“Fc区”指免疫球蛋白的C末端区域。Fc区是包含两个二硫键连接的抗体重链片段(重链Fc区多肽链)的二聚体分子。Fc区可以通过木瓜蛋白酶消化或IdeS消化或胰蛋白酶消化完整(全长)抗体产生或可以重组产生。
从全长抗体或免疫球蛋白可获得的Fc区至少包含全长重链的残基226(Cys)至C末端，并且因此包含一部分铰链区和2个或3个恒定结构域，即CH2结构域、CH3结构域和IgE类和IgM类抗体上的另外/额外的CH4结构域。从US 5,648,260和US 5,624,821已知，修饰Fc区中限定的氨基酸残基产生表型效应。
构成两个相同或不相同抗体重链片段的二聚体Fc区的形成由所包含的CH3结构域的非共价二聚化介导(对于涉及的氨基酸残基，参见例如Dall'Acqua,Biochem.37(1998)9266-9273)。通过在铰链区中形成二硫键，共价地稳定Fc区(参见例如Huber等人,Nature264(1976)415-420；Thies等人,J.Mol.Biol.293(1999)67-79)。为了破坏CH3-CH3结构域相互作用的二聚化而在CH3结构域内部引入氨基酸残基变化并未不利地影响新生Fc受体(FcRn)结合，原因在于参与CH3-CH3结构域二聚化的残基的位置在CH3结构域的内界面上，而参与Fc区-FcRn相互作用的残基位于CH2-CH3结构域外部。
与Fc区的效应子功能相关的残基位于如对全长抗体分子所测定的铰链区、CH2结构域和/或CH3结构域中。Fc区相关/介导的功能是：
(i)抗体依赖的细胞毒性(ADCC)，
(ii)补体(C1q)结合、激活和补体依赖的细胞毒性(CDC)，
(iii)吞噬/清除抗原-抗体复合物，
(iv)在一些情况下释放细胞因子，和
(v)抗体和抗原-抗体复合物的半寿期/清除率。
通过Fc区与效应子功能特异性分子或受体相互作用，启动Fc区相关的效应子功能。大多数情况下，IgG1亚类抗体可以实现受体激活，而IgG2亚类和IgG4亚类抗体不具有效应子功能或具有有限的效应子功能。
激发效应子功能的受体是Fc受体类型(和亚型)FcγRI、FcγRII和FcγRIII。可以通过在下部铰链区中引入参与FcγR和C1q结合的特定氨基酸变化如L234A和/或L235A，减少与IgG1亚类相关的效应子功能。另外，某些氨基酸残基，尤其位于CH2结构域和/或CH3结构域中的残基，与抗体分子或Fc区融合多肽在血流中的循环半寿期相关。循环半寿期由Fc区与新生Fc受体(FcRn)的结合决定。
Fc区糖结构上存在的唾液酸残基参与Fc区的抗炎介导活性(参见例如Anthony,R.M.等人,Science 320(2008)373-376)。
抗体恒定区中氨基酸残基的编号根据Kabat的EU索引进行(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)，NIH Publication 91 3242)。
术语“人Fc区”指人源免疫球蛋白重链的C末端区域，其至少含有一部分的铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在一个实施方案中，人IgG抗体重链Fc区从约Glu216、或从约Cys226或从约Pro230延伸至重链的羧基端。然而，抗体Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。
术语“变体Fc区”指因至少一个“氨基酸改变/突变”而与“天然”或“野生型”Fc区氨基酸序列不同的氨基酸序列。在一个实施方案中，与天然Fc区或与亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸突变，例如从约1个至约10个氨基酸突变，并且在一个实施方案中，在天然Fc区中的或在亲本多肽的Fc区中具有约1个至约5个氨基酸突变。在一个实施方案中，(变体)Fc区与野生型Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性，并且在一个实施方案中，变体Fc区具有至少约90％同源性，在一个实施方案中，变体Fc区具有至少约95％同源性。
如本文中报道的变体Fc区由所含的氨基酸改变定义。因此，例如，术语P329G指相对于亲本(野生型)Fc区在氨基酸位置329处具有脯氨酸至甘氨酸突变的变体Fc区。野生型氨基酸的身份可以是未指定的，在这种情况下前述变体称作329G。对于在本发明中讨论的全部位置，根据EU索引进行编号。EU索引或如Kabat或EU编号方案中的EU索引指EU抗体的编号(Edelman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1969)78-85，因而通过引用的方式完整并入)。改变可以是添加、缺失或突变。术语“突变”指天然存在氨基酸的变化以及非天然存在氨基酸的变化，参见例如US 6,586,207、WO 98/48032、WO 03/073238、US 2004/0214988、WO2005/35727、WO 2005/74524，Chin,J.W.等人,J.Am.Chem.Soc.124(2002)9026-9027；Chin,J.W.和Schultz,P.G.,ChemBioChem 11(2002)1135-1137；Chin,J.W.等人,PICAS UnitedStates of America 99(2002)11020-11024；以及Wang,L.和Schultz,P.G.,Chem.(2002)1-10(全部文献均通过引用的方式完整并入本文)。
IgG1亚类的野生型人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
带有突变L234A、L235A的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
带有T366S、368A和Y407V突变的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
带有T366W突变的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
带有L234A、L235A和T366S、368A及Y407V突变的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
带有L234A、L235A和T366W突变的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
带有P329G突变的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
带有L234A、L235A和P329G突变的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
带有P239G和T366S、368A和Y407V突变的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
带有P329G和T366W突变的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
带有L234A、L235A、P329G及T366S、368A和Y407V突变的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
带有L234A、L235A、P329G和T366W突变的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
IgG4亚类的野生型人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
带有S228P和L235E突变的IgG4亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
带有S228P、L235E和P329G突变的IgG4亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
术语“Fc受体”，简写为“FcR”，指与Fc区结合的受体。在一个实施方案中，FcR是天然序列人FcR。另外，在一个实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR(Fcγ受体)并且包括受体FcγRI、FcγRII、和FcγRIII亚类，包括其等位变体及备选地包括其剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，它们具有主要在其胞质结构域内不同的相似氨基酸序列。激活性受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见例如M.,Annu.Rev.Immunol.15(1997)203-234)。FcR综述于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492，Capel等人，Immunomethods 4(1994)25-34，de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341中。本文中的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来待鉴定的那些。该术语还包括新生儿受体，FcRn，其负责母源IgG转移至胎儿(参见例如Guyer等人，J.Immunol.117(1976)587；Kim等人，J.Immunol.24(1994)249)。
术语“Fcγ受体”，简写为“FcγR”，指结合IgG抗体Fc区并且由FcγR基因编码的蛋白家族的任何成员。在人类中，这个家族包括但不局限于FcγRI(CD64)，包括同工型FcγRIA、FcγRIB和FcγRIC；FcγRII(CD32)，包括同工型FcγRIIA(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIB(包括FcγRIIB-1和FcγRIIB-2)和FcγRIIC，以及FcγRIII(CD16)，包括同工型FcγRIIIA(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIB(包括同种异型FcγRIIB-NA1和FcγRIIB-NA2)(参见例如Jefferis等人，Immunol.Lett.82(2002)57-65，通过引用的方式完整并入)，以及任何未发现的人FcγRs或FcγR同工型或同种异型。FcγR可以来自任何生物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同工型或同种异型。参与Fc区-FcγR相互作用的氨基酸残基是234-239(下部铰链区)、265-269(B/C环)、297-299(D/E环)和327-332(F/G)环(Sondermann等人，Nature 406(2000)267-273)。导致FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的结合/亲和力降低的氨基酸突变包括N297A(同时伴随降低的免疫原性和延长的半寿期结合/亲和力)(Routledge等人,Transplantation 60(1995)847；Friend等人,Transplantation 68(1999)1632；Shields等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)、残基233-236(Ward和Ghetie,Ther.Immunol.2(1995)77；Armour等人,Eur.J.Immunol.29(1999)2613-2624)。US 7,355,008和US 7,381,408中描述了一些示例性氨基酸置换。
术语“新生Fc受体”，简写为“FcRn”，指结合IgG抗体Fc区并且至少部分地由FcRn基因编码的蛋白质。FcRn可以来自任何生物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。如本领域已知，有功能的FcRn蛋白包含两种多肽，经常称作重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白并且重链由FcRn基因编码。除非本文中另外指出，否则FcRn或FcRn蛋白指FcRn重链与β-2-微球蛋白的复合物。Fc区与FcRn的相互作用的氨基酸残基在CH2结构域和CH3结构域的交界附近。Fc区-FcRn接触残基均在单条IgG重链内部。涉及的氨基酸残基是248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314(全部在CH2结构域中)和氨基酸残基385-387、428和433-436(全部在CH3结构域中)。导致对FcRn的结合/亲和力增加的氨基酸突变包括T256A、T307A、E380A和N434A(Shields等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
术语“全长抗体”指具有与天然抗体结构基本上相同的结构和氨基酸序列的抗体以及包含如本文中报道的Fc区的多肽。
术语“全长抗体重链”指以N末端至C末端方向包含抗体可变结构域、第一恒定结构域、抗体重链铰链区、第二恒定结构域和第三恒定结构域的多肽。
术语“抗体重链Fc区”指包含抗体重链铰链区、第一恒定结构域和第二恒定结构域的多肽。
术语“全长抗体轻链”指以N末端至C末端方向包含抗体可变结构域和恒定结构域的多肽。
术语“铰链区”指抗体重链多肽的部分，所述部分在野生型抗体重链中连接CH1结构域和CH2结构域，例如根据Kabat的EU编号体系从约位置216至约位置230，或根据Kabat的EU编号体系从约位置226至约位置230。可以通过与IgG1亚类序列的铰链区半胱氨酸残基比对，确定其他IgG亚类的铰链区。
铰链区正常情况下是由具有相同氨基酸序列的两条多肽组成的二聚体分子。铰链区通常包含约25个氨基酸残基并且是柔性的，允许抗原结合区独立地移动。铰链区可以再划分成三个结构域：上部、中部和下部铰链结构域(参见例如Roux等人，J.Immunol.161(1998)4083)。
术语Fc区的“下部铰链区”指C末端紧邻于铰链区的一段氨基酸残基，即根据Kabat的EU编号Fc区残基233至239。
术语“野生型Fc区”指与自然界中存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。野生型人Fc区包含天然人IgG1Fc区(非A同种异型和A同种异型)，天然人IgG2Fc区、天然人IgG3Fc区和天然人IgG4Fc区及其天然存在的变体。
术语“个体”或“对象”指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或对象是人。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为比对序列并根据需要引入空位以实现最大序列同源性百分数并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.授权，并且源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区美国版权办公室，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序从Genentech,Inc.,South San Francisco,加利福尼亚州可公开获得或可以从源代码汇编。应当将ALIGN-2程序汇编在UNIX操作***(包括数字式UNIX V4.0D)上使用。全部序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不变动。
在使用ALIGN-2比较氨基酸序列的情况下，如下计算给定氨基酸序列A与、同或针对给定氨基酸序列B(这可以备选地描述为与、同或针对给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％是：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对结果中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将可以理解在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性值％如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“药物制剂”指一种制备物，所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的活性成分的生物活性有效，并且不含有对于将会施用该制剂的对象不可接受地有毒的额外组分。
“可药用载体”指药物制剂中除活性成分之外的对对象无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“患者的表型”指在一类来自患者的细胞中细胞表面受体的组成。该组成可以是定性以及定量组成。确定/给出基因型的细胞可以是单个细胞或包含多个细胞的样品。
术语“位置”指氨基酸残基在多肽的氨基酸序列中的位置。可以将位置依次或根据建立的格式(例如用于抗体编号的Kabat的EU索引)编号。
术语“改变的”FcR结合亲和力或ADCC活性指与亲本多肽(例如包含野生型Fc区的多肽)相比，具有增强或削弱的FcR结合活性和/或ADCC活性的多肽。与FcR“具有增加的结合”的变体多肽以比亲本或野生型多肽更低的解离常数(即更好/更高的亲和力)结合至少一种FcR。与FcR“具有降低的结合”的变体多肽以比亲本或野生型多肽更高的解离常数(即更差/更低的亲和力)结合至少一种FcR。显示降低的FcR结合的这类变体可以拥有极少或不可评估的FcR结合，例如，与野生型或亲本IgGFc区相比0–20％的FcR结合。
与亲本或野生型多肽相比以“减少的亲和力”结合FcR的多肽是当多肽变体和亲本多肽的量在结合测定法中(基本上)大致相同时，与亲本多肽相比，以(实质地)减少的结合亲和力结合上文鉴定的任一种或多种FcR的多肽。例如，与其中测定FcR结合亲和力的亲本多肽相比，FcR结合亲和力减少的多肽变体可以在FcR结合亲和力方面显示1.15倍至约100倍、例如1.2倍至约50倍减少。
在人效应细胞存在下比亲本多肽更低效地“介导抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)”的包含变体Fc区的多肽是这样的多肽，其中当测定法中所用的变体多肽和亲本多肽的量(基本上)大致相同时，所述多肽在体外或在体内在介导ADCC方面(实质地)更低效。通常，将使用如本文中公开的体外ADCC测定法鉴定这类变体，但是构思了用于确定ADCC活性的其他测定法或方法，例如在动物模型中确定等。在一个实施方案中，变体在介导ADCC方面(例如在本文中公开的体外测定法中)比亲本更低效约1.5倍至约100倍，例如约2倍至约50倍。
术语“受体”指能够结合至少一种配体的多肽。在一个实施方案中，受体是具有胞外配体结合结构域和任选地其他结构域(例如跨膜结构域、胞内结构域和/或膜锚定物)的细胞表面受体。本文所述的测定法中待评价的受体可以是完整受体或者其片段或衍生物(例如包含受体的结合结构域与一种或多种异源多肽融合的融合蛋白)。另外，待评价其结合特性的受体可以存在于细胞中或是分离的并任选地包被在测定法平板或某些其他固体相上。
如本文所用，“治疗”(和其语法变型如“治疗”或“治疗”)指意欲改变正在治疗的个体的天然过程的临床介入，并且可以为了预防或在临床病理学过程期间进行。想要的治疗效果包括，但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，本发明的抗体用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
II.定制多特异性结合分子
在大多数基于细胞的疾病中，通过基于抗体的受体分子结合靶向疾病相关细胞是一个有前景的方案。然而，临床上相关的表面受体(＝靶)的表达水平在患者间不同并且基于标准化抗体的药物的功效因此非常不同。这特别适用于其作用模式为同时靶向两个不同表位/受体的双特异性结合分子和多特异性结合分子的特异性。
一个有前景的方法是专门为相应患者的具体/单个情况设计药物(这里，双特异性结合分子或多特异性结合分子)。
就表达的细胞表面分子(如受体)的数目和种类而言，来自个体的每个细胞是不同的。对于癌细胞和非癌细胞，尤其如此。因此，细胞可以由呈递的细胞表面分子表征。
基于患者的疾病相关性细胞上临床上相关的表面受体的表达谱数据，一系列的结合实体(例如Fab片段)特别地从文库选出并且组合成多特异性结合分子作为患者特异性药物。基于例如表面受体的表达水平和并且因此个体患者的需要和表型，相对于相应的疾病相关性细胞如例如肿瘤细胞，具体地选择这些选择的结合分子。
这种表征可以通过基于体外和体内的细胞成像技术实现。体内成像技术例如包括光学成像、分子成像、荧光成像、生物发光成像、MRI、PET、SPECT、CT和活体内显微术。体外成像技术例如包括用例如识别特定细胞表面标记物的荧光标记的抗体对患者细胞的免疫组织化学染色和通过显微术分析荧光信号。备选地，可以在用标记的治疗性或诊断性抗体染色后使用基于FACS的方法，分析细胞的基因型/表型。
在一个实施方案中，通过基于FACS的方法确定患者来源的细胞的基因型/表型。在一个实施方案中，通过使用荧光标记的诊断抗体或治疗性抗体确定细胞表面标记物。在一个实施方案中，使用荧光标记的治疗性抗体。
某些疾病可能与特定细胞表面分子的数目变化或与新细胞表面分子的出现相关。
患有这种疾病的个体将在某些范围中显示疾病和/或个体特异性细胞表面标记物样式。
应当考虑这一点以向此类个体提供定制的靶向疗法。
已知针对细胞表面分子及其配体的许多治疗性抗体，所述治疗性抗体可以用于选择和构建定制的多特异性靶向实体，如Rituxan/MabThera/利妥昔单抗、2H7/奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、Zevalin/替伊莫单抗(Ibrizumomab)、Arzerra/奥法木单抗(Ofatumumab)(CD20)、HLL2/依帕珠单抗、奥英妥珠单抗(Inotuzomab)(CD22)、Zenapax/达克珠单抗、Simulect/巴利昔单抗(Basiliximab)(CD25)、赫赛汀/曲妥珠单抗、帕妥珠单抗(Her2/ERBB2)、Mylotarg/吉妥珠单抗(CD33)、Raptiva/依法珠单抗(Cd11a)、爱必妥(Erbitux)/西妥昔单抗(EGFR，表皮生长因子受体)、IMC-1121B(VEGF受体2)、Tysabri/那他珠单抗(α4β1和α4β7整联蛋白的α4亚基)、ReoPro/阿昔单抗(Abciximab)(gpIIb-gpIIa和αvβ3整联蛋白)、Orthoclone OKT3/莫罗单抗CD3(CD3)、Benlysta/贝利单抗(Belimumab)(BAFF)、Tolerx/Oteliximab(CD3)、Soliris/依库珠单抗(Eculizumab)(C5补体蛋白)、Actemra/托珠单抗(Tocilizumab)(IL-6R)、Panorex/依决洛单抗(EpCAM，上皮细胞黏附分子)、CEA-CAM5/拉贝珠单抗(Labetuzumab)(CD66/CEA，癌胚抗原)、CT-11(PD-1，编程死亡-1 T细胞抑制性受体，CD-d279)、H224G11(c-Met受体)、SAR3419(CD19)、IMC-A12/西妥木单抗(Cixutumumab)(IGF-1R、***1受体)、MEDI-575(PDGF-R、血小板衍生生长因子受体)、CP-675、206/曲美木单抗(Tremelimumab)(细胞毒性T淋巴细胞抗原4)、RO5323441(胎盘生长因子或PGF)、HGS1012/马帕木单抗(Mapatumumab)(TRAIL-R1)、SGN-70(CD70)、维多汀-35)/贝伦妥单抗(Brentuximab)(CD30)、和ARH460-16-2(CD44)。
已知用于确定例如患者的样品中存在的细胞表面标记物的不同方法。一个示例性方法基于荧光激活的细胞分选(FACS)，尤其，特异性染色和分选的细胞群体的分析。在这种方法中，通过以下方式实现样品(细胞群体)的表型分型：使用针对这些标志物的荧光标记抗体，任选地包括细胞群体中表面标志物的统计分布，就呈递的细胞表面标记物分析单个细胞。特别合适的是使用出于这个目的已经用荧光标记物标记的治疗性抗体，因为这确保后一种定制的多特异性结合分子将与诊断性抗体相同的表位结合。如本文中报道的多特异性结合分子/双特异性抗体可以用于制备药物，所述药物用于治疗例如肿瘤学疾病、心血管疾病、传染病、炎性疾病、自身免疫疾病、代谢(例如，内分泌)疾病或神经学(例如神经变性)疾病。这些疾病的示例性非限制例子是阿尔茨海默病、非霍奇金淋巴瘤、B细胞急性和慢性淋巴样白血病、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多毛细胞白血病、急性和慢性髓样白血病、T细胞淋巴瘤和白血病、多发性骨髓瘤、胶质瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、癌(如口腔癌、胃肠道癌、结肠癌、胃癌、肺气道(pulmonarytract)癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、子宫癌、子宫内膜癌、子***、膀胱癌、胰癌、骨癌、肝脏癌、胆囊癌、肾癌、皮肤癌、睾丸癌)、黑色素瘤、肉瘤、胶质瘤、和皮肤癌、急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、Sydenham舞蹈病、重症肌无力、***性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多内分泌腺综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、Henoch-Schonlein紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、Takayasu动脉炎、阿狄森病、类风湿性关节炎、多发性硬化、肉样瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多发性动脉炎、强直性脊柱炎、肺出血肾炎综合征、闭塞性血栓性脉管炎、Sjogren综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格纳肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、膜性肾病、肌萎缩侧索硬化、脊髓痨(tabes dorsalis)、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、快速进展性肾小球肾炎、银屑病或纤维化肺泡炎。
许多细胞表面标记物及其配体是已知的。例如已经报道癌细胞表达至少一种以下细胞表面标记物和/或配体，包括但不限于碳酸酐酶IX、α-胎蛋白、α-辅肌动蛋白-4、A3(A33抗体特异性的抗原)、ART-4、B7、Ba-733、BAGE、BrE3抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CDS、CD8、CD1-1A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-l-α、结肠特异性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c-met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、GROB、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺素释放激素(HCG)及其亚基、HER2/neu、HMGB-1、低氧诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2或la、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、***-1(IGF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞移行抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、胰腺癌黏蛋白、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、***酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、P1GF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标志物、bcl-2、bcl-6、KRAS、cMET、癌基因标志物和癌基因产物(例如参见，Sensi等人,Clin.CancerRes.12(2006)5023-5032；Parmiani,等人,J.Immunol.178(2007)1975-1979；Novellino等人,Cancer Immunol.Immunother.54(2005)187-207)。
因此，识别特定细胞表面受体(包括其配体)的抗体可以用于特异性和选择性靶向并结合至许多/多种与疾病相关的细胞表面标记物。细胞表面标记物是位于例如与信号传导事件或配体结合相关的细胞(例如疾病相关细胞)的表面上的多肽。
在一个实施方案中，为了治疗癌症/肿瘤，使用靶向肿瘤相关抗原的多特异性结合分子/双特异性抗体，如在Herberman,"Immunodiagnosis of Cancer",Fleisher(编著),"The Clinical Biochemistry of Cancer",第347页(American Association of ClinicalChemists(1979))中和在US 4,150,149；US 4,361,544和US 4,444,744中报道的那些。
关于肿瘤相关抗原(TAA)的报告包括Mizukami等人(Nature Med.11(2005)992-997)；Hatfield等人(Curr.Cancer Drug Targets 5(2005)229-248)；Vallbohmer等人(JClin.Oncol.23(2005)3536-3544)和Ren等人(Ann.Surg.242(2005)55-63)，每篇文献就鉴定的TAA而言通过引用方式并入本文。
在疾病涉及淋巴瘤、白血病或自身免疫疾病的情况下，靶向的抗原可以选自CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD54、CD67、CD74、CD79a、CD80、CD126、CD138、CD154、CXCR4、B7、MUC1或la、HM1.24、HLA-DR、生腱蛋白、VEGF、P1GF、ED-B纤连蛋白、癌基因、癌基因产物(例如，c-met或PLAGL2)、CD66a-d、坏死抗原、IL-2、T101、TAG、IL-6、MIF、TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)。
已知许多双特异性抗体针对两种不同靶如BCMA/CD3、处于组合的不同HER家族抗原(EGFR、HER2、HER3)、CD19/CD3、IL17RA/IL7R、IL-6/IL-23、IL-1-β/IL-8、IL-6或IL-6R/IL-21或IL-21R，第一特异性针对选自Lewis x-结构、Lewis b-结构和Lewis y-结构、GloboH-结构、KH1、Tn抗原、TF抗原的抗原的糖表位和黏蛋白、CD44、糖脂和糖鞘脂如Gg3、Gb3、GD3、GD2、Gb5、Gm1、Gm2、唾液酰四糖基神经酰胺的糖结构并且第二特异性针对选自EGFR、HER2、HER3和HER4、GD2a的ErbB受体酪氨酸激酶，所述第二特异性与下述第二抗原结合位点组合，所述第二抗原结合位点与选自T-淋巴细胞NK细胞、B-淋巴细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、间充质干细胞、神经干细胞的免疫细胞、ANG2/VEGF、VEGF/PDGFR-β、血管内皮生长因子(VEGF)接纳体2/CD3、PSMA/CD3、EPCAM/CD3、选自VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、FLT3、c-FMS/CSF1R、RET、c-Met、EGFR、Her2/neu、HER3、HER4、IGFR、PDGFR、C-kit、BCR、整联蛋白和MMP的抗原组合、与选自VEGF、EGF、PIGF、PDGF、HGF和血管生成素、ERBB-3/C-MET、ERBB-2/C-MET、EGF受体1/CD3、EGFR/HER3、PSCA/CD3、C-MET/CD3、内皮唾液酸蛋白(endosialin)/CD3、EPCAM/CD3、IGF-1R/CD3、FAPALPHA/CD3、EGFR/IGF-1R、IL17A/F、EGF受体1/CD3和CD19/CD16的水溶性配体缔合。
因此，已经发现通过使用如本文中报道的模块化方法，可以提供定制的双特异性抗体治疗性抗体。根据需要治疗的个体的细胞上实际存在的细胞表面分子或根据与这种细胞表面分子相互作用的配体，定制这些抗体。通过确定个体的细胞表面分子状态，可以选择治疗靶的定制组合。
在通过组合2种单一治疗性分子以同时靶向并结合至两个不同表位而这样定制产生双特异性治疗剂的情况下，与单一治疗性分子相比，可以期望加合/协同效应。
通过使用已经可获得的单特异性治疗性结合实体，如衍生自治疗性抗体的那些，可以实现所需多特异性结合分子的快速和简便产生。
这些亲合力工程化的结合分子/抗体可以结合单个细胞上存在的两种或更多种细胞表面标记物。如果全部/两种结合实体同时与细胞结合，则这种结合是唯一想要的。为此目的，中等至低亲合力抗体特别适合。在另一方面，这还允许在筛选过程期间排除较低特异性的结合特异性组合。
选择的患者特异性的多特异性结合分子可以在多种细胞体外测定法/细胞样品中针对有关标准(例如最佳结合/结合配偶体、最佳接头长度等)测试：
-确定磷酸酪氨酸激酶的磷酸化状态
-确定c-Jun N末端激酶(JNK)抑制作用
-确定分子诱导的凋亡
-相对于多特异性结合分子用单特异性结合分子进行的结合测定法
-确定增殖抑制作用
采用这种方法，可以产生定制的和因此高度有效率的治疗性分子。这些分子将因改进的靶向/递送(例如肿瘤细胞的有效负载)而具有减少的副作用并且改进的对靶细胞的靶向基于靶向组分(包含至少两个结合分子)的更高选择性和特异性。
多特异性结合分子的更高选择性和特异性归因于通过两个“低亲和力结合物”的组合所致的同时结合(亲合力)，这减少可能的“脱靶结合”。
如本文中报道的方法
如本文中报道的一个方面是用于产生双特异性抗体的方法，所述方法包括步骤：孵育
(i)在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基)的抗体Fab片段或scFv抗体，
(ii)包含全长抗体重链、全长抗体轻链和抗体重链Fc区多肽的抗体片段，
以此全长抗体重链和全长抗体轻链是同族抗体链并且其可变结构域对(VH和VL)形成抗原结合位点，
以此全长抗体重链和抗体重链Fc区多肽通过形成抗体铰链区的一个或多个二硫键彼此共价连接，并且
以此抗体重链Fc区在其N末端具有寡甘氨酸氨基酸序列，
和
(iii)分选酶A
并且因而产生双特异性抗体。
如本文中报道的一个方面是用于产生双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤
(i)确定在样品中细胞表面上存在的表面标志物并且选择其第一表面标记物和第二表面标记物，
(ii)孵育(a)在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基)的抗体Fab片段或scFv抗体片段，以此Fab片段或scFv与第一表面标记物特异性结合，(b)包含全长抗体重链、全长抗体轻链和抗体重链Fc区多肽的抗体片段，以此全长抗体重链和全长抗体轻链是同族抗体链并且其可变结构域对(VH和VL)形成与第二表面标记物特异性结合的抗原结合位点，以此全长抗体重链和抗体重链Fc区多肽通过形成抗体铰链区的一个或多个二硫键彼此共价连接，并且以此抗体重链Fc区在其N末端具有寡甘氨酸氨基酸序列，和(c)分选酶A
并且因而产生双特异性抗体。
如本文中报道的一个方面是用于确定抗原结合位点的组合的方法，包括以下步骤
(i)确定多种双特异性抗体的结合特异性和/或亲和力和/或效应子功能和/或体内半寿期，所述多种双特异性抗体是通过组合第一多种抗体Fab片段或scFv抗体片段的每个成员与包含全长抗体重链、全长抗体轻链和抗体重链Fc区多肽的第二多种抗体片段的每个成员制备的，
以此第一多种抗体与第一细胞表面分子特异性结合并且第二多种抗体与第二细胞表面分子特异性结合，
并且
(ii)选择具有合适的结合特异性和/或亲和力和/或效应子功能和/或体内半寿期的双特异性抗体并且因而确定抗原结合位点的组合。
在一个实施方案中，组合的特征在于：将抗体Fab片段或scFv抗体片段和包含全长抗体重链、全长抗体轻链和抗体重链Fc区多肽的抗体片段与分选酶A孵育。
在一个实施方案中，Fab片段或scFv抗体片段在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基)。
在一个实施方案中，单臂抗体片段的全长抗体重链和全长抗体轻链是同族抗体链并且其可变结构域对(VH和VL)形成与第二表面标记物特异性结合的抗原结合位点，全长抗体重链和抗体重链Fc区多肽通过形成抗体铰链区的一个或多个二硫键彼此共价连接，并且抗体重链Fc区多肽在其N末端具有寡甘氨酸氨基酸序列。
在全部方面的一个实施方案中，抗体Fab片段或scFv抗体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GnSLPX1TG(SEQ ID NO:02，其中X1可以是任何氨基酸残基，n＝1、2或3)。
在全部方面的一个实施方案中，抗体Fab片段或scFv抗体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GSLPX1TGGSGS(SEQ ID NO:03，其中X1可以是任何氨基酸残基)。
在全部方面的一个实施方案中，抗体Fab片段或scFv抗体包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGSGS(SEQ ID NO:05，其中X1可以是任何氨基酸残基)，以此X2可以是除G之外的任何氨基酸残基。
在全部方面的一个实施方案中，抗体Fab片段或scFv抗体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GnSLPX1TGGSGSX3(SEQ ID NO:06，其中X1可以是任何氨基酸残基，n＝1、2或3)，以此X3是氨基酸序列标签。
在全部方面的一个实施方案中，抗体Fab片段或scFv抗体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGSGSX3(SEQ ID NO:07，其中X1可以是任何氨基酸残基)，以此X2可以是除G之外的任何氨基酸残基并且X3是氨基酸序列标签。
在全部方面的一个实施方案中，抗体重链Fc区多肽在其N末端包含两个甘氨酸残基。
在全部方面的一个实施方案中，单臂抗体Fc区在其重链Fc区多肽的N末端包含氨基酸序列GGCPX4C(SEQ ID NO:08)，其中X4是S或P。
在全部方面的一个实施方案中，X1是E。
如本文中报道的一个方面是通过如本文中报道的方法获得的多特异性结合分子/双特异性抗体。
一个方面是在其重链之一中包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基)的多特异性结合分子/双特异性抗体。
在一个实施方案中，多特异性结合分子/双特异性抗体在其重链之一中包含氨基酸序列GnSLPX1TG(SEQ ID NO:02，其中X1可以是任何氨基酸残基，n＝1、2或3)。
在一个实施方案中，多特异性结合分子/双特异性抗体在其重链之一中包含氨基酸序列GnSLPX1TGGCPX4C(SEQ ID NO:09，其中X1可以是任何氨基酸残基，其中X4可以是S或P，n＝1、2或3)。
在一个实施方案中，多特异性结合分子/双特异性抗体在其重链之一中包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGCPX4C(SEQ ID NO:10，其中X1可以是任何氨基酸残基，其中X4可以是S或P)，其中X2可以是除G之外的任何氨基酸残基。
在一个实施方案中，X1是E。
如本文中报道的一个方面是包含如本文中报道的抗体/多特异性结合分子的药物制剂。
如本文中报道的一个方面是如本文中报道的双特异性抗体/多特异性结合分子在制造药物中的用途。
在一个实施方案中，该药物用于治疗癌症。
如本文中报道的一个方面是用于治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括向该个体施用有效量如本文中报道的双特异性抗体/多特异性结合分子。
如本文中报道的一个方面是用于摧毁个体中癌细胞的方法，所述方法包括向该个体施用有效量如本文中报道的双特异性抗体/多特异性结合分子。
在如本文中报道的全部方面的一个实施方案中，Fc区是人Fc区或其变体。
在一个实施方案中，人Fc区是人IgG1亚类的，或人IgG2亚类的，或人IgG3亚类的，或人IgG4亚类的。在一个实施方案中，Fc区是人IgG1亚类的或人IgG4亚类的人Fc区。
在一个实施方案中，人Fc区包含至少在以下氨基酸位置228、233、234、235、236、237、297、318、320、322、329和/或331中一个处天然存在氨基酸残基向不同残基的突变，其中Fc区中的残基根据Kabat的EU索引编号。
在一个实施方案中，人Fc区包含在第329位置处天然存在氨基酸残基的突变和至少一个氨基酸向不同残基的至少一个其他突变，所述至少一个氨基酸选自包含在第228、233、234、235、236、237、297、318、320、322和331位置的氨基酸残基的组，其中Fc区中的残基根据Kabat的EU索引编号。与未修饰的(野生型)Fc区相比，这些特定氨基酸残基的变化导致Fc区的效应子功能改变。
在一个实施方案中，与包含相应野生型IgGFc区的缀合物相比，人Fc区针对人FcγRIIIA、和/或FcγRIIA和/或FcγRI具有减低的亲和力。
在一个实施方案中，人Fc区中第329位置处的氨基酸残基用甘氨酸、或精氨酸、或大到足以摧毁Fc区内部脯氨酸夹层的氨基酸残基置换。
在一个实施方案中，天然存在氨基酸残基的突变是S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、P329G和/或P331S。在一个实施方案中，如果该Fc区属于人IgG1亚类，则突变是L234A和L235A，或如果该Fc区属于人IgG4亚类，则突变是S228P和L235E。在一个实施方案中，该Fc区包含突变P329G。
通过在Fc区中限定的位置组合两种突变，可以实现Fc区相关效应子功能的彻底减少。
对激发效应子功能的Fc区的选择依赖于多特异性结合分子/双特异性抗体的预期用途。
如果想要的用途是功能性中和可溶性靶，则应当选择不激发效应子功能的亚类或变体。
如果想要的用途是移除(可溶性)靶，则应当选择激发效应子功能的亚类或变体。
如果想要的用途是拮抗细胞结合的靶，则应当选择不激发效应子功能的亚类或变体。
如果想要的用途是移除靶呈递细胞，则应当选择激发效应子功能的亚类或变体。
可以通过调节Fc区-FcRn相互作用影响抗体或抗体Fc区缀合物的循环半寿期。
可以通过所谓铰链区氨基酸变化/置换实现抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)的最小化或甚至消除。
可以通过所谓铰链区氨基酸变化/置换实现经典补体级联激活的最小化或甚至消除。
抗体或抗体Fc区缀合物的循环半寿期的增加可以通过增加的对新生Fc受体的结合实现，并且导致改进的功效、减少的剂量或施用频率，或改进的向靶递送。抗体或抗体Fc区缀合物的循环半寿期的减少可以通过减少的对新生Fc受体的结合实现，并且导致减少的全身暴露或改进的靶比非靶结合比例。
通常，如本文中报道的方法适用于产生包含野生型Fc区或改变的/变体Fc区的抗体Fc区缀合物。
在一个实施方案中，Fc区是人Fc区。
在一个实施方案中，Fc区是“观念性的”，并且尽管它不实际存在，但是抗体工程师可以决定待使用的变体Fc区。
在一个实施方案中，改变编码抗体Fc区缀合物的Fc区部分的核酸分以产生编码抗体Fc区缀合物的变体Fc区部分的变体核酸序列。
可以通过本领域已知的多种方法制备编码抗体Fc区缀合物的Fc区部分的氨基酸序列的核酸。这些方法包括，但不限于通过位点定向(或寡核苷酸介导)诱变、PCR诱变和较早制备的编码编码抗体Fc区缀合物多肽的DNA的盒诱变来制备。
Fc区与许多受体或配体相互作用，包括但不限于Fc受体(例如FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA)、补体蛋白C1q和其他分子如蛋白A和蛋白G。这些相互作用是多种效应子功能和下游信号传导事件必需的，包括但不限于抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖细胞毒性(CDC)。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物(如采用如本文中报道的方法产生的)具有至少一个或更多个以下特性：减少或消除的效应子功能(ADCC和/或CDC和/或ADCP)、减少或消除的对Fc受体的结合、减少或消除的对C1q的结合，或减少或消除的毒性。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物(如采用如本文中报道的方法产生的)包含具有至少两个氨基酸突变、添加或缺失的野生型Fc区。
在一个实施方案中，与包含野生型人Fc区的抗体或抗体Fc区缀合物相比，抗体Fc区缀合物(如采用如本文中报道的方法产生的)对人Fc受体(FcγR)和/或人补体受体具有减少的亲和力。
在一个实施方案中，与包含野生型人Fc区的抗体或抗体Fc区缀合物相比，抗体Fc区缀合物(如采用如本文中报道的方法产生的)包含对人Fc受体(FcγR)和/或人补体受体具有减少的亲和力的Fc区。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物(如采用如本文中报道的方法产生的)对FcγRI、FcγRII和/或FcγRIIIA至少之一具有减少的亲和力。在一个实施方案中，对FcγRI和FcγRIIIA的亲和力减少。在一个实施方案中，对FcγRI、FcγRII和FcγRIIIA的亲和力减少。
在一个实施方案中，对FcγRI、FcγRIIIA和C1q的亲和力减少。
在一个实施方案中，对FcγRI、FcγRII、FcγRIIIA和C1q的亲和力减少。
在一个实施方案中，与包含野生型Fc区的抗体或抗体Fc缀合物相比，抗体Fc区缀合物(如采用如本文中报道的方法产生的)具有减少的ADCC。在一个实施方案中，与包含野生型Fc区的Fc区融合多肽或缀合物诱导的ADCC相比，ADCC减少至少20％。
在一个实施方案中，与包含野生型Fc区的抗体Fc区缀合物相比，抗体Fc区缀合物(如采用如本文中报道的方法产生的)具有降低或消除的Fc区诱导的ADCC和CDC。
在一个实施方案中，与包含野生型Fc区的OA-Fc区缀合物相比，抗体Fc区缀合物(如采用如本文中报道的方法产生的)具有降低的ADCC、CDC和ADCP。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物在Fc区中包含至少一个氨基酸置换，所述氨基酸置换选自包含S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、P329G、和P331S的组。
在一个实施方案中，野生型Fc区是人IgG1Fc区或人IgG4Fc区。
在一个实施方案中，除第329位置处的氨基酸残基脯氨酸突变之外，抗体Fc区在Fc区中包含与增加的抗体Fc区缀合物稳定性相关的至少一个其他氨基酸残基添加、突变或缺失。
在一个实施方案中，如果Fc区属于IgG4亚类，则Fc区中的其他氨基酸残基添加、突变或缺失在Fc区的第228和/或235位置处。在一个实施方案中，第228位置处的氨基酸残基丝氨酸和/或第235位置处的氨基酸残基亮氨酸由另一种氨基酸置换。在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物在第228位置处包含脯氨酸残基(丝氨酸残基至脯氨酸残基的突变)。在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物在第235位置处包含谷氨酸残基(亮氨酸残基至谷氨酸残基的突变)。
在一个实施方案中，Fc区包含三个氨基酸突变。在一个实施方案中，这三个氨基酸突变是P329G、S228P和L235E突变(P329G/SPLE)。
在一个实施方案中，如果Fc区属于IgG1亚类，则Fc区中的其他氨基酸残基添加、突变或缺失在Fc区的第234和/或235位置处。在一个实施方案中，第234位置处的氨基酸残基亮氨酸和/或第235位置处的氨基酸残基亮氨酸突变成另一种氨基酸。
在一个实施方案中，Fc区在第234位置处包含氨基酸突变，其中亮氨酸氨基酸残基突变成丙氨酸氨基酸残基。
在一个实施方案中，Fc区在第235位置处包含氨基酸突变，其中亮氨酸氨基酸残基突变成丙氨酸氨基酸残基。
在一个实施方案中，Fc区包含在第329位置处的氨基酸突变，其中脯氨酸氨基酸残基突变成甘氨酸氨基酸残基、在第234位置处的氨基酸突变，其中亮氨酸氨基酸残基突变成丙氨酸氨基酸残基，和在第235位置处的氨基酸突变，其中亮氨酸氨基酸残基突变成丙氨酸氨基酸残基。
具有对FcRn增加的亲和力的Fc区变体具有较长血清半寿期，并且这类分子将在治疗哺乳动物的方法中具有可用应用，其中需要所施用的抗体Fc区缀合物的长久全身性半寿期，例如，以治疗慢性疾病或病症。
具有降低的FcRn结合亲和力的抗体Fc区缀合物具有较短血清半寿期，并且这类分子将在治疗哺乳动物的方法中具有可用应用，其中期望所施用的抗体Fc区缀合物的较短全身性半寿期，例如，以避免毒性副作用或用于体内诊断性成像应用。具有降低的FcRn结合亲和力的Fc区融合多肽或缀合物较不可能穿过胎盘，并且因此可以用于治疗怀孕女性中的疾病或病症。
在一个实施方案中，具有对FcRn改变的结合亲和力的Fc区是在以下一个多个氨基酸位置具有氨基酸改变的Fc区：238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439和/或447。
在一个实施方案中，该Fc区是在氨基酸位置252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439和/或447具有一个或多个氨基酸改变的Fc区。
在一个实施方案中，显示增加的对FcRn的结合的Fc区在氨基酸位置238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424和/或434包含一个或多个氨基酸改变。
在一个实施方案中，Fc区是IgG1亚类的Fc区并且包含氨基酸突变P329G和/或L234A和L235A。
在一个实施方案中，Fc区是IgG4亚类的Fc区并且包含氨基酸突变P329G和/或S228P和L235E。
在一个实施方案中抗体Fc区在第一重链Fc区多肽中包含突变T366W并在第二重链Fc区多肽中包含突变T366S、L368A和Y407V，其中根据Kabat的EU索引编号。
在一个实施方案中抗体Fc区在第一重链Fc区多肽中包含突变S354C并在第二重链Fc区多肽中包含突变Y349C。
使用分选酶A的酶促缀合
可以通过使用分选酶A获得包含单臂抗体(OA-Fc)和一个或多个抗原结合结构域的双特异性抗体。
许多***使用分选酶以将多种表面蛋白(包括毒力因子)共价地锚定至它们的细胞壁(肽聚糖)上。分选酶是胞外膜结合酶。野生型金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分选酶A(SrtA)是具有N末端跨膜区的206个氨基酸的多肽。在第一步骤中，分选酶A识别含有LPX1TG氨基酸序列基序的底物蛋白并且借助活性位点Cys切割Thr和Gly之间的酰胺键。这种肽切割反应产生分选酶A硫酯中间体。在第二步骤中，通过亲核性攻击含有寡甘氨酸的第二底物多肽(对应于金黄色葡萄球菌中肽聚糖的五甘氨酸单元)的氨基，消除硫酯酰基-酶中间体，导致共价连接的细胞壁蛋白和分选酶A再生。在不存在寡甘氨酸亲核体的情况下，酰基-酶中间体由水分子水解。
分选酶介导的连接/缀合已经开始用于多种蛋白质工程和生物缀合目的。这种新技术能够将天然和非天然官能团引入加LPX1TG标签的重组或化学合成的多肽。例子包括共价接合寡甘氨酸衍生化聚合物(例如PEG)、荧光团、维生素(例如生物素和叶酸)脂质、糖、核酸、合成肽和蛋白质(例如GFP)(Tsukiji,S.和Nagamune,T.,ChemBioChem 10(2009)787-798；Popp,M.W.-L.和Ploegh,H.L.,Angew.Chem.Int.Ed.50(2011)5024-5032)。
已经显示氨基组分的三甘氨酸和甚至二甘氨酸基序足够用于SrtA介导的连接步骤(Clancy,K.W.等人,Peptide Science 94(2010)385-396)。
为了酶促缀合，可以使用缺少跨膜区的可溶性截短分选酶A(SrtA；金黄色葡萄球菌SrtA的氨基酸残基60-206)(Ton-That,H.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(1999)12424-12429；Ilangovan,H.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(2001)6056-6061)。可以在大肠杆菌中产生截短的可溶性分选酶A变体。
至少在其N末端之一包含寡甘氨酸(Gm，m＝2、或3、或4、或5)的抗体Fc区可以从真核细胞(例如HEK293细胞、CHO细胞)表达并且从其上清液纯化。
在一条多肽链的C末端包含SrtA识别基序的结合实体(例如单链抗原结合多肽如scFv、scFab或darpin，或多链抗原结合多肽如dsFv或Fab)可以从真核细胞(例如HEK293细胞、CHO细胞)表达并且从其上清液纯化。
如本文中报道的一个方面是通过如下方式获得的双特异性抗体：使用酶分选酶A将抗原结合多肽/结构域(例如scFv或Fab)与单臂抗体变体(OA-Fc)缀合，其中分选酶识别序列位于单链抗原结合多肽(例如scFv、scFab或darpin)的C末端或多链抗原结合复合体(例如dsFv或Fab)的一条多肽链的C末端，并且其中二甘氨酸或三甘氨酸基序位于单臂抗体变体(OA-Fc-Gm；m＝2或3)的Fc-链的N末端处。可以通过使用(i)在其C末端区域包含氨基酸序列GnSLPX1TG(SEQ IDNO:02，其中X1可以是任何氨基酸残基，其中n＝1、2或3)的多肽、(ii)在其N末端包含寡甘氨酸的重链Fc区多肽和(iii)分选酶A，在酶促缀合过程中以高产率获得包含抗体Fab片段(OA-Fc～Fab)或scFv抗体片段(OA-Fc～scFv)的单臂抗体Fab或scFv缀合物和单臂抗体(OA-Fc)。
采用这种试剂组合，可以减少或甚至消除正常情况下在反应时间增加时出现的
i)将产物缀合物内部的LPX1TG氨基酸序列识别为底物的逆反应，和/或
ii)封端水解多肽片段(通过由水而不由Gm-抗体Fc区亲核体切割硫代酰基-结合实体分选酶A中间体所产生的LPX1TG识别序列被切去或不切去的多肽)的产生。
已经测试了C末端和N末端氨基酸序列组合的不同组合。
更详细地，作为示例性结合实体，使用抗体Fab片段，并且作为示例性抗体Fc区，使用单臂抗体Fc区(OA-Fc区＝一对全长抗体重链及其同族轻链和重链抗体Fc区多肽)。使用示例性转肽酶分选酶A分别在抗体Fab片段VH-CH1重链的C末端和在OA-Fc区N末端缀合三种不同序列。获得9种不同缀合物。在不同时间点确定偶联反应的进程/效率。为此目的，通过SDS-PAGE分析转肽反应的等分试样。从凝胶以密度测定方式估计连接的效率。下表1中给出结果。
表1.
在一个实施方案中，Fab抗体片段或scFv抗体片段在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GSLPX1TGGSGS(SEQ ID NO:03，其中X1可以是任何氨基酸残基)。
在一个实施方案中，Fab抗体片段或scFv抗体片段包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGSGS(SEQ ID NO:05，其中X1可以是任何氨基酸残基)，以此X2可以是除G之外的任何氨基酸残基。
在一个实施方案中，Fab抗体片段或scFv抗体片段在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GnSLPX1TGGSGSX3(SEQ ID NO:06，其中X1可以是任何氨基酸残基，n＝1、2或3)，以此X3是氨基酸序列标签。
在一个实施方案中，Fab抗体片段或scFv抗体片段在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGSGSX3(SEQ ID NO:07，其中X1可以是任何氨基酸残基，n＝1、2或3)，以此X2可以是除G之外的任何氨基酸残基并且X3是氨基酸序列标签。
“Combimatrix”方案
理想的是将第一结合实体如抗体Fab片段与另一种特异性结合实体如包含全长重链及其同族轻链和二硫键连接的重链Fc区多肽的第二抗体Fab片段或单臂抗体片段组合。此外当第一结合实体与许多不同其他结合实体连接时，可以筛选第一结合实体是否显示更好的特性。使用所谓的Combimatrix方案，可以用便利方式确定结合实体的多种组合。应当指出第二结合实体可以与不同靶/表位/抗原结合，或可以与相同抗原结合但是结合至不同表位，或可以与相同表位结合，不过是单一结合实体的不同变体(例如人源化候选物)。
在这种情况下，自动化平台可以执行移液、纯化和组合结合实体及其反应或衍生物的任务。使用例如96孔板或其他高通量模式的任何平台是合适的，如EppendorfepMotion 5075vac移液机器人。
首先，进行编码结合实体的构建体的克隆。通常通过如下方式获得带有编码结合实体的核酸的质粒：基因合成，其中一种编码的结合实体的C末端区域含有分选酶基序和His标签并且相应的另一种结合实体的一个N末端区域包含寡甘氨酸基序，或经由B-细胞PCR和序列非依赖性及连接非依赖性克隆(SLIC)，将可变结构域克隆至分别含有必需元件如恒定区、分选酶基序和His标签的适宜载体中。将质粒各自转移至多孔板的分开的板孔中(可以加载整块平板)。此后，质粒用切下结合实体编码区的限制性酶混合物消化。理想的是以全部质粒仅需要一种限制性酶混合物的方式设计全部基因合成。此后，任选的清洁步骤产生纯化的DNA片段。将这些片段连接至已经用与如上文提到的相同的限制性酶混合切去受体载体的质粒骨架中。备选地，克隆流程可以由SLIC介导的克隆步骤执行(参见例如PCT/EP 2012/076155)。在连接后，自动化平台将全部连接混合物转移至另外的具有感受态大肠杆菌细胞的多孔板(例如Top10Multi Shot，Invitrogen)，并且进行转化反应。将细胞培育至所需的密度。从培养混合物的等分试样可以获得甘油贮藏物。从培养物分离质粒(例如使用质粒分离微量试剂盒(例如NucleoSpin 96 Plasmid，Macherey&Nagel))。通过用适宜的限制酶混合物消化等分试样和聚丙烯酰胺凝胶电泳(例如E-Gel 48，Invitrogen)检验质粒身份。此后，新平板可以用质粒的等分试样加载以进行对照测序反应。
在下一个步骤中表达结合实体。因此，将HEK细胞接种到多孔板(例如48孔-平板)或小摇瓶上并且用分离的质粒(在适宜的骨架载体中含有结合实体编码区)转染。将转染的HEK细胞培育几日并收获(例如通过使用真空工作站经1.2μm和0.22μm滤板过滤)。可以通过实施例如ELISA监测滴度。
利用分选酶介导的转肽反应，结合实体可以彼此连接。第一结合实体、第二结合实体和分选酶反应混合物可以按多孔模式组合。在37℃孵育4-72小时(例如16小时)后，可以通过使用负向His标签选择程序收获缀合物(将混合物施加到例如His MultiTrap HP板(GEHealthcare)上并过滤，以此仍然具有His标签的全部分子结合在层析柱上，而缀合物存在于滤液中；应当与滤液进行缓冲剂交换，例如通过施加缀合物到超滤膜上或通过使用含有对结合实体之一特异的亲和介质的平板。
可以使用Combimatrix”方案产生多特异性结合分子，参见下表。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
A 1A 2A 3A 4A 5A 6A 7A 8A 9A 10A 11A
B 1B … … … … … … … … … …
C 1C … … … … … … … … … …
D 1D … … … … … … … … … …
E 1E … … … … … … … … … …
F 1F … … … … … … … … … …
G 1G … … … … … … … … 10G 11G
在多孔板的第一排中，将等摩尔浓度的包含C末端分选酶基序的不同第一结合实体吸入以***数字(例如1至11)命名的每个孔中(不包括第一排的第一孔)。在同一平板的第一列中，将等摩尔浓度的在N末端区域包含寡甘氨酸的不同第二结合实体吸入以字母字(例如A至G)命名的每个孔中(不包括第一列的第一孔)。此后第一排的全部第一结合实体与第一列的全部第二结合实体组合(例如，在96孔板中产生77种组合)，由数字和字母组合命名(例如1A至11G)。向全部组合添加在适宜缓冲液中的分选酶。在已经进行酶促缀合后，可以进行任选的纯化步骤。多特异性结合分子随后做好准备在基于细胞的测定法中评价。
III.重组方法
可以使用重组方法和组合物产生OA-Fc区缀合物、特别是单臂抗体变体(OA-Fc-Gm)和单链抗原结合多肽(例如scFv、scFab或darpin)或多链抗原结合复合体(例如dsFv或Fab)的连接组分，参见例如US 4,816,567。
在一个方面，提供制备OA-Fc～多肽缀合物的方法，其中该方法包括(i)在适于表达/分泌单臂抗体变体(OA-Fc-Gm)的条件下培养包含编码缀合物的单臂抗体变体(OA-Fc-Gm)部分的核酸的第一宿主细胞并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收OA-Fc-Gm部分和(ii)在适于表达/分泌多肽的条件下培养包含编码缀合物的多肽部分的核酸的第二宿主细胞并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收多肽部分和(iii)使用分选酶A介导的转肽，酶促缀合重组产生的OA-Fc～多肽缀合物的部分。
为了重组产生OA-Fc～多肽缀合物的OA-Fc-Gm部分和多肽部分，将例如如上文所述的编码OA-Fc-Gm部分和OA-Fc～多肽缀合物的多肽部分的核酸分离并***一种或多种载体中以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达/分泌。可以使用常规流程轻易地分离和/或产生这种核酸。
用于克隆或表达/分泌编码多肽的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生多肽，尤其当不需要糖基化和Fc效应子功能时(参见，例如，US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523，Charlton,Methods in MolecularBiology 248(2003)245-254(B.K.C.Lo(编著),Humana Press,Totowa,NJ)，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段)。在表达后，多肽可以从细菌细胞糊在可溶性部分中分离或可以从可以溶解的所谓包涵体的不溶性部分分离并再折叠成生物活性形式。此后，可以进一步纯化多肽。
除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码多肽的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的多肽的真菌和酵母菌株(参见例如Gerngross,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414和Li等人,Nat.Biotech.24(2006)210-215)。
用于表达糖基化多肽的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞一起使用、尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒毒株。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主(例如，见US 5,959,177、US 6,040,498、US6,420,548,US 7,125,978和US 6,417,429(描述在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术))。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是COS-7细胞系(由SV40转化的猴肾CV1细胞)；HEK293细胞系(人胚肾)；BHK细胞系(幼仓鼠肾)；TM4小鼠支持细胞系(在例如Mather,Biol.Reprod.23(1980)243-251中所述的TM4细胞)；CV1细胞系(猴肾细胞)；VERO-76细胞系(非洲绿猴肾细胞)；HELA细胞系(人***细胞)；MDCK细胞系(犬肾细胞)；BRL-3A细胞系(布法罗大鼠肝细胞)；W138细胞系(人肺细胞)；HepG2细胞系(人肝细胞)；MMT060562细胞系(小鼠乳腺瘤细胞)；如在例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述的TRI细胞系；MRC5细胞系；和FS4细胞系。其他可用的哺乳动物宿主细胞系包括CHO细胞系(中国仓鼠卵巢细胞)，包括DHFR阴性CHO细胞系(Urlaub,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77(1980)4216)；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0细胞系。关于适于产生多肽的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu,Methods inMolecular Biology,Antibody Engineering 248(2004)255-268(B.K.C.Lo,(编著),Humana Press,Totowa,NJ)。
IV.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文提供的任一种双特异性抗体可用于检测1种和/或2种抗原在生物样品中的存在。如本文所用，术语“检测”涵盖定量性或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包括细胞或组织，如癌细胞的活组织检查样品。
在一个实施方案中，提供在诊断或检测方法中使用的双特异性抗体。在又一个方面，提供检测癌细胞在生物样品中存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括使生物样品与如本文所述的双特异性抗体在允许双特异性抗体与其一种或多种抗原结合的条件下接触并且检测是否在双特异性抗体和其一种或多种抗原之间形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。
可以使用本发明抗体诊断的示例性病症包括癌症。
在某些实施方案中，提供标记的双特异性抗体。标记物包括但不限于，直接检测到(如荧光、有色、电子致密、化学发光和放射性标记物)的标记物或部分，以及间接检测到(例如借助酶促反应或分子相互作用)的部分，如酶或配体。示例性标记物包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I、荧光团如稀土元素螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(US4,737,456)、萤光素、2,3-二氢二氮杂萘二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，其与利用过氧化氢来氧化染料前体的酶如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶偶联、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定自由基等。
V.药物制剂
通过以下方式制备冻干制剂或水溶液剂形式的如本文所述的双特异性抗体的药物制剂：将具有所需纯度的这种抗体与一种或多种任选的可药用载体混合(Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.(编著)(1980))。可药用载体总体上在所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖；形成盐的反离子如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rhuPH20(Baxter International,Inc.)。在US 2005/0260186和US2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rhuPH20。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外的糖胺聚糖如软骨素酶组合。
在US 6,267,958中描述了示例性冻干抗体制剂。水性抗体制剂包括在US 6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些制剂，后一类制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文中的制剂也可以含有正在治疗的特定适应症所需要的多于一种活性成分，优选地是具有并未相互不利影响的互补活性的那些活性成分。这种活性成分以有效用于预期目的的量适当地存在。
活性成分可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶体药物递送***(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或粗乳液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.(编著)(1980)中公开。
可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有抗体的固态疏水性聚合物的半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以例如用通过无菌滤膜过滤轻易地实现无菌。
VI.治疗方法和组合物
本文提供的任何双特异性抗体可以用于治疗方法中。
在一个方面，提供了作为药物使用的双特异性抗体。在其他方面，提供了用于治疗癌症的双特异性抗体。在某些实施方案中，提供用于治疗方法中的双特异性抗体。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗患有癌症的个体的方法中的双特异性抗体，所述方法包括向个体施用有效量的双特异性抗体。在一个这种实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如下文描述。在其他实施方案中，本发明提供用于移除/杀伤/溶解癌细胞的双特异性抗体。在某些实施方案中，本发明提供在移除/杀伤/溶解个体中癌细胞的方法中使用的双特异性抗体，所述方法包括向该个体施用有效量的移除/杀伤/溶解癌细胞的双特异性抗体。根据以上实施方案中任一个的“个体”可以是人。
在又一个方面，本发明提供双特异性抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗癌症。在又一个实施方案中，该药物用于治疗癌症的方法中，所述方法包括向患有癌症的个体施用有效量的药物。在一个这种实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如下文描述。在又一个实施方案中，药物用于移除/杀伤/溶解癌细胞。在又一个实施方案中，药物用于移除/杀伤/溶解个体内癌细胞的方法中，所述方法包括向该个体施用有效量的移除/杀伤/溶解癌细胞的药物。根据以上实施方案中任一个的“个体”可以是人。
在又一个方面，本发明提供用于治疗癌症的方法。在一个实施方案中，该方法包括向患有癌症的个体施用有效量的双特异性抗体。在这样一个实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外治疗剂，如下文描述。根据以上实施方案中任一个的“个体”可以是人。
在又一个方面，本发明提供用于移除/杀伤/溶解个体中癌细胞的方法。在一个实施方案中，该方法包括向个体施用有效量的移除/杀伤/溶解癌细胞的双特异性抗体。在一个实施方案中，“个体”是人。
在又一个方面，本发明提供了包含本文提供的任何双特异性抗体的药物制剂，例如，用于前述任一个治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何双特异性抗体和可药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何双特异性抗体的和至少一种额外的治疗剂，例如，如下文描述。
本发明的抗体可以在疗法中单独或与其他药物组合使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种额外治疗剂共施用。在某些实施方案中，额外治疗剂是细胞毒性药物或化疗药。
上文所示的这类组合疗法涵盖组合的施用(其中在相同或独立的制剂中包含两种或更多种治疗剂)，和独立施用，在这种情况下，本发明抗体的施用可以在施用额外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后进行。本发明的抗体也可以与放射疗法组合使用。
本发明的抗体(和任何额外的治疗剂)可以通过任何合适的手段施用，所述的合适手段包括肠胃外、肺内和鼻内以及，如果局部治疗需要，病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是否为短暂或长期。本文中构思了多种给药方案，包括但不限于单次或在多个时间点多次施用、团注施用和脉冲输注。
本发明的抗体将以符合良好医学规范的方式配制、给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的特别的病症、正在治疗的特别的哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、送递活性剂的部位、施用方法、施用计划和医疗执业者已知的其他因素。该抗体不需要，但任选地与目前用来预防或治疗所讨论病症的一种或多种活性剂一起配制。这类其他活性剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量、疾病或疗法类型，和上文讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量并且采用与本文所述相同的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本发明抗体的适宜剂量(当单独或与一种或多种其他额外治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和过程，抗体是否出于预防或治疗目的施用、先前疗法、患者的临床史和对抗体的反应以及主治医师的决定。将抗体适当地按一次或经过一系列治疗施用至患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg-10mg/kg)抗体可以是向患者施用的起始候选剂量，无论是否例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注来施用。取决于上文提到的因素，一个常见的每日剂量可能是从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几日或更长时间范围内重复施用，取决于病状，治疗通常将持续直至所需的疾病症状抑制出现。抗体的一个示例性剂量将处于从约0.05mg/kg至约10mg/kg范围。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的一种或多种剂量(或其任意组合)。这类剂量可以间断地施用，例如，每周或每3周(例如，从而，患者接受从约2个至约20个或例如约6个剂量的抗体)。可以施用较高的初始负荷剂量，随后是一个或多个较低剂量。示例性给药方案包括施用[[如果已知，附加示例性给药方案]]例如“初始加载剂量约4mg/kg，随后每周维持疗剂量约2mg/kg的抗体”。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法容易地监测这种疗法的进程。
可以理解，前述任一种制剂或治疗方法可以使用本发明免疫缀合物替代双特异性抗体或除双特异性抗体之外还使用本发明免疫缀合物来实施。
VII.制造品
在本发明的另一个方面，提供制造品，所述制造品含有上文描述的可用于治疗、预防和/或诊断病症的物质。该制造品包括容器和在该容器上或与之结合的标签或包装说明书。合适的容器例如包括瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。容器可以从多种材料如玻璃或塑料中形成。该容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病状的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是具有皮下注射针头可穿透的塞子的静脉内输液袋或小药瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装说明书提示组合物用于治疗选择的病状。另外，制造品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其他细胞毒性活性剂或治疗剂。在本发明的这个实施方案中制造品还可以包含指示组合物可以用来治疗特定病状的包装说明书。备选或额外地，该制造品可以还包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲液，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点看受欢迎的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
可以理解，替代双特异性抗体或除双特异性抗体之外，前述任一制造品可以包含本发明的免疫缀合物。
对序列表的描述
SEQ ID NO:01至07和66至67 分选酶基序
SEQ ID NO:08 Fc区亲核体
SEQ ID NO:09至10 缀合物中的分选酶基序剩余部分
SEQ ID NO:11至29 氨基酸序列标签
SEQ ID NO:30 人CH2结构域
SEQ ID NO:31 人CH3结构域
SEQ ID NO:32至46示例性野生型和变体抗体重链Fc区多肽
SEQ ID NO:47至65实施例中使用的序列。
实施例
以下实施例是本发明方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上文提供的一般表述，可以实施多种其他实施方案。
虽然已经出于清晰理解目的，以说明和举例方式某种程度地详细描述前述发明，但是这些说明和例子不应当解释为限制本发明的范围。
材料和方法
重组DNA技术
如Sambrook,J.等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)中所述的标准方法用来操作DNA。根据制造商的说明书使用分子生物学试剂。
基因合成
通过化学合成在Geneart GmbH(雷根斯堡，德国)制备想要的基因区段。将合成的基因片段克隆至用于增殖/扩增的大肠杆菌质粒中。通过DNA测序验证亚克隆基因片段的DNA序列。
蛋白质测定
通过使用基于多肽的氨基酸序列计算的摩尔消光系数在280nm测定光密度(OD)，确定纯化的多肽的蛋白质浓度。
实施例1
表达质粒的产生
基本/标准哺乳动物表达质粒的描述
通过瞬时转染人胚肾细胞(HEK293)表达想要的蛋白质。为了表达想要的基因/蛋白质(例如全长抗体重链、全长抗体轻链或在其N末端含有寡甘氨酸的Fc-链)，使用包含以下功能性元件的转录单位：
-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子(P-CMV)，包含内含子A，
-人重链免疫球蛋白5'非翻译区域(5’UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列(SS)，
-待表达的基因/蛋白质(例如全长抗体重链)，和
-牛生长激素多聚腺苷化序列(BGH pA)。
除了包含待表达的想要的基因的表达单元/盒之外，基本/标准哺乳动物表达质粒含有
-来自载体pUC18的复制起点，其允许这个质粒在大肠杆菌中复制，和
-在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
构建了编码以下多肽/蛋白质的表达质粒：
-与含有T366W突变的IgG1亚类的人重链恒定区组合的帕妥珠单抗重链可变结构域：
-与人κ轻链恒定区组合的帕妥珠单抗轻链可变结构域：
-与含有T366S、L368A和Y407V突变的I gG1亚类的人重链恒定区组合的曲妥珠单抗重链可变结构域：
-与人κ轻链恒定区组合的曲妥珠单抗轻链可变结构域：
-包含帕妥珠单抗重链可变结构域和含有C末端GGGSLPETGGSGSHHHHHH氨基酸序列的IgG1亚类的人重链恒定区1(CH1)的抗体Fab片段：
-包含帕妥珠单抗重链可变结构域和含有C末端GSLPETGGSGSHHHHHH序列的IgG1亚类的人重链恒定区1(CH1)的抗体Fab片段：
-包含帕妥珠单抗重链可变结构域和含有C末端LPETGGSGSHHHHHH序列的IgG1亚类的人重链恒定区1(CH1)的抗体Fab片段：
-包含曲妥珠单抗重链可变结构域和含有C末端GGGSLPETGGSGSHHHHHH序列的IgG1亚类的人重链恒定区1(CH1)的抗体Fab片段：
-包含曲妥珠单抗重链可变结构域和含有C末端GSLPETGGSGSHHHHHH序列的IgG1亚类的人重链恒定区1(CH1)的抗体Fab片段：
-包含曲妥珠单抗重链可变结构域和含有C末端LPETGGSGSHHHHHH序列的IgG1亚类的人重链恒定区1(CH1)的抗体Fab片段：
-具有T366S、L368A和Y407V突变的含有N末端GGGDKTHTCPPC序列的重链Fc区多肽(人IgG1(CH2-CH3))：
-具有T366S、L368A和Y407V突变的含有N末端GGHTCPPC序列的重链Fc区多肽(人IgG1(CH2-CH3))：
-具有T366S、L368A和Y407V突变的含有N末端GGCPPC序列的重链Fc区多肽(人IgG1(CH2-CH3))：
-具有T366W突变的含有N末端GGGDKTHTCPPC序列的重链Fc区多肽(人IgG1(CH2-CH3))：
-具有T366W突变的含有N末端GGHTCPPC序列的重链Fc区多肽(人IgG1(CH2-CH3))：
-具有T366W突变的含有N末端GGCPPC序列的重链Fc区多肽(人IgG1(CH2-CH3))：
实施例2
瞬时表达、纯化和分析性表征
通过瞬时转染在F17培养基(Invitrogen Corp.))中培养的(人胚肾细胞系293衍生的)HEK293细胞产生抗体链。为了转染，使用“293-Fectin”转染试剂(Invitrogen)。从三种不同质粒表达抗体链，所述质粒编码全长重链(帕妥珠单抗结或曲妥珠单抗孔)、相应全长轻链和作为结变体或作为孔变体的含有N末端寡甘氨酸序列之一的重链Fc区多肽。转染时，三种质粒以等摩尔质粒比例使用。如制造商的说明书中所述进行转染。转染后7日收获含有抗体Fc区的细胞培养上清液。将上清液冷冻贮藏直至纯化。
将含有抗体Fc区的培养上清液过滤并通过两个层析步骤纯化。使用以PBS(1mMKH2PO4、10mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl)pH7.4平衡的HiTrap MabSelectSuRe(GEHealthcare)，通过亲和层析捕获抗体Fc区。通过用平衡缓冲液洗涤移除未结合的蛋白质，并且用pH3.0的0.1M柠檬酸缓冲液回收抗体Fc区。在洗脱后溶液立即用1M Tris-碱，pH9.0中和至pH 6.0。使用Superdex 200TM(GE Healthcare)上的大小排阻层析作为第二纯化步骤。大小排阻层析在40mM Tris-HCl缓冲剂，0.15M NaCl，pH7.5中进行。将洗脱的抗体Fc区用配备Biomax-SK膜(Millipore，Billerica，MA)的Ultrafree-CL离心滤器单元浓缩并贮存在-80℃。
通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定抗体Fc区的蛋白质浓度。在还原剂(5mM1,4-二硫苏糖醇)存在和不存在下通过SDS-PAGE和考马斯亮兰染色，分析纯度和正确的抗体Fc区形成。
实施例3
含有C末端LPX1TG基序的抗体Fab片段的瞬时表达、纯化和分析性表征
通过瞬时转染在F17培养基(Invitrogen Corp.))中培养的(人胚肾细胞系293衍生的)HEK293细胞产生抗体Fab片段。为了转染，使用“293-Fectin”转染试剂(Invitrogen)。从两种不同质粒表达抗体Fab片段，所述质粒编码全长轻链(帕妥珠单抗或曲妥珠单抗)和含有C末端LPX1TG序列之一的相应截短的重链。转染时，两种质粒以等摩尔质粒比例使用。如制造商的说明书中所述进行转染。转染后7日收获含有Fab片段的细胞培养上清液。将上清液冷冻贮藏直至纯化。
将含有Fab片段的培养上清液过滤并通过两个层析步骤纯化。使用以PBS和20mM咪唑(1mM KH2PO4、10mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl、20mM咪唑)pH7.4平衡的HisTrap HPNi-NTA柱(GE Healthcare)，通过亲和层析捕获Fab片段。通过用平衡缓冲液洗涤移除未结合的蛋白质。将加组氨酸标签的蛋白质用PBS(1mM KH2PO4、10mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl、400mM咪唑)中的20mM至400mM线性咪唑梯度以10个柱体积洗脱。使用Superdex200TM(GE Healthcare)上的大小排阻层析作为第二纯化步骤。大小排阻层析在40mM Tris-HCl缓冲剂，0.15M NaCl，pH7.5中进行。将Fab片段用配备Biomax-SK膜(Millipore，Billerica，MA)的Ultrafree-CL离心滤器单元浓缩并贮存在-80℃。
通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定Fab片段的蛋白质浓度。在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)存在和不存在下通过SDS-PAGE和考马斯亮兰染色，分析纯度和正确的Fab形成。
实施例4
分选酶A介导的抗体Fc区和结合实体(Fab片段)的连接
对于分选酶介导的转肽反应，使用N末端截短的金黄色葡萄球菌分选酶A(Δ1-59)。反应在含有50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5的缓冲液(分选酶-缓冲液)中进行。在反应中，连接在VH-CH1重链C末端(…KSC)和分选酶基序N末端之间不包含或包含2个不同连接用短氨基酸序列的VH-CH1-重链的C末端处携带分选酶基序(LPETG)(LPETGGSGSHHHHHH，SEQID NO:63、GSLPETGGSGSHHHHHH，SEQ ID NO:64和GGGSLPETGGSGSHHHHHH，SEQ ID NO:65))的Fab片段和在其重链Fc区多肽的N末端携带寡甘氨酸基序和三个不同铰链序列(分别是GGCPPC，SEQ ID NO:8，其中X4＝P，GGHTCPPC，SEQ ID NO:66和GGGDKTHTCPPC，SEQ ID NO:67)的单臂抗体，产生抗体Fc区缀合物。为了进行反应，将全部试剂均溶解于分选酶缓冲液中。在第一步骤中，混合抗体Fc区和抗体Fab片段，并且通过接着添加分选酶A和5mM CaCl2启动反应。将组分通过抽吸混合并在37℃孵育72小时。随后，通过冷冻反应混合物终止反应并且储存在-20℃直至分析。
摩尔比Fab:单臂抗体:分选酶＝20:4:1
结果
通过分选酶A分别缀合在Fab的C末端和在抗体的N末端的三种不同序列以获得抗体Fc区缀合物的9种不同组合。在不同时间点评价偶联反应的效率。为此目的，通过SDS-PAGE分析转肽反应的等分试样。从SDS PAGE凝胶以密度测定方式估计连接的效率。在表2中对各个序列描述反应72小时后的结果。
表2：Fab片段与单臂抗体缀合
序列表
<110> 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
<120> 用于选择并产生含有至少两种不同结合实体的定制靶向实体的方法及其用途
<130> 31069 WO
<150> EP12173875.1
<151> 2012-06-27
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<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分选酶氨基酸序列标签
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X可以是任何氨基酸残基
<400> 1
Leu Pro Xaa Thr Gly
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分选酶氨基酸序列标签2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X = G或GG或GGG
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X = 任何氨基酸残基
<400> 2
Xaa Ser Leu Pro Xaa Thr Gly
1 5
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分选酶氨基酸序列标签3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X = 任何氨基酸残基
<400> 3
Gly Ser Leu Pro Xaa Thr Gly Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分选酶氨基酸序列标签3a
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X = 任何氨基酸残基
<400> 4
Gly Gly Gly Ser Leu Pro Xaa Thr Gly Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分选酶氨基酸序列标签5
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X = 除G以外的任何氨基酸残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X = 任何氨基酸残基
<400> 5
Xaa Gly Ser Leu Pro Xaa Thr Gly Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分选酶氨基酸序列标签5
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X = G或GG或GGG
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X = 任何氨基酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X = 氨基酸序列标签
<400> 6
Xaa Ser Leu Pro Xaa Thr Gly Gly Ser Gly Ser Xaa
1 5 10
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分选酶氨基酸序列标签6
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X = 除G以外的任何氨基酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X = 任何氨基酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> X = 氨基酸序列标签
<400> 7
Xaa Gly Ser Leu Pro Xaa Thr Gly Gly Ser Gly Ser Xaa
1 5 10
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链亲核物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X = S或P
<400> 8
Gly Gly Cys Pro Xaa Cys
1 5
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分选酶产物特征氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X = G或GG或GGG
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X = 任何氨基酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X = S或P
<400> 9
Xaa Ser Leu Pro Xaa Thr Gly Gly Cys Pro Xaa Cys
1 5 10
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分选酶产物特征氨基酸序列2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X =除G以外的任何氨基酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X = 任何氨基酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X = S或P
<400> 10
Xaa Gly Ser Leu Pro Xaa Thr Gly Gly Cys Pro Xaa Cys
1 5 10
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg-标签
<400> 11
Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg-标签2
<400> 12
Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His-标签
<400> 13
His His His His His His
1 5
<210> 14
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 14
Lys Asp His Leu Ile His Asn Val His Lys Glu Phe His Ala His Ala
1 5 10 15
His Asn Lys
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 15
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 16
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 16
Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr
1 5 10 15
Lys Asp Asp Asp Asp Lys
20
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签#
<400> 17
Ala Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 18
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 19
Met Asp Val Glu Ala Trp Leu Gly Ala Arg
1 5 10
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 20
Met Asp Val Glu Ala Trp Leu Gly Ala Arg Val Pro Leu Val Glu Thr
1 5 10 15
<210> 21
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 21
Met Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly
1 5 10 15
Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro
20 25 30
Gln Gly Gln Arg Glu Pro
35
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 22
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 23
Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser
1 5 10 15
<210> 24
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 24
Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn Arg
1 5 10 15
Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu
20 25
<210> 25
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 25
Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr
1 5 10 15
Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser
20 25 30
Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu
35 40 45
<210> 26
<211> 32
<212> PRT
<213> 溶纤维丁酸弧菌
<400> 26
Met Asp Trp Asn Ala Asn Ile Ala Pro Gly Asn Ser Val Glu Phe Gly
1 5 10 15
Ile Gln Gly Ala Gly Ser Val Gly Asn Val Ile Asp Ile Thr Val Glu
20 25 30
<210> 27
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 几丁质结合结构域
<400> 27
Thr Asn Pro Gly Val Ser Ala Trp Gln Val Asn Thr Ala Tyr Thr Ala
1 5 10 15
Gly Gln Leu Val Thr Tyr Asn Gly Lys Thr Tyr Lys Cys Leu Gln Pro
20 25 30
His Thr Ser Leu Ala Gly Trp Glu Pro Ser Asn Val Pro Ala Leu Trp
35 40 45
Gln Leu Gln
50
<210> 28
<211> 209
<212> PRT
<213> 角叉菜
<400> 28
Met Pro Glu Ile Lys Leu Thr Tyr Phe Asp Met Arg Gly Arg Ala Glu
1 5 10 15
Ala Ser Arg Leu Ala Leu Val Val Gly Glu Ile Pro Phe Glu Asp Glu
20 25 30
Arg Val Val Phe Asp His Trp Lys Glu Ala Lys Pro Lys Thr Pro Tyr
35 40 45
Ala Ala Leu Pro Met Leu Thr Val Asp Gly Met Gln Val Ala Gln Ser
50 55 60
Asp Ala Ile Leu Arg Tyr Cys Gly Lys Leu Ala Gly Leu Tyr Pro Ser
65 70 75 80
Asp Pro Leu Glu Ala Ala Lys Val Asp Glu Val Gly Gly Val Ile Asp
85 90 95
Asp Val Thr His Ala Met Tyr Arg Tyr Arg Gly Asp Asp Lys Asp Lys
100 105 110
Leu Arg Glu Glu Arg Asp Lys Phe Ser Lys Val Asp Val Pro Arg Tyr
115 120 125
Val Gly Ala Leu Glu Lys Arg Leu Glu Ala Phe Gly Asp Gly Pro Trp
130 135 140
Ala Val Gly Gly Asn Met Thr Ile Ala Asp Leu His Ile Cys His Leu
145 150 155 160
Val Thr Asn Ile Arg Cys Gly Met Leu Asp Phe Val Asp Lys Asp Leu
165 170 175
Leu Glu Gly Tyr Val Arg Ile Val Lys Ser Tyr Ser Ala Val Met Glu
180 185 190
His Pro Lys Val Thr Glu Trp Tyr Glu Lys Lys Pro Val Lys Met Phe
195 200 205
Ser
<210> 29
<211> 396
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 29
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Gly Lys
20 25 30
Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu
35 40 45
Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu
50 55 60
His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly
65 70 75 80
Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr
85 90 95
Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln
100 105 110
Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys
115 120 125
Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn
130 135 140
Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala
145 150 155 160
Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn
165 170 175
Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly
180 185 190
Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly
195 200 205
Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu
210 215 220
Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu
225 230 235 240
Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp
245 250 255
Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val
260 265 270
Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu
275 280 285
Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu
290 295 300
Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn
305 310 315 320
Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu
325 330 335
Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys
340 345 350
Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala
355 360 365
Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp
370 375 380
Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Arg Ile Thr Lys
385 390 395
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Trp Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Glu Ser Thr Tyr Arg Trp Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
65 70 75 80
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
85 90 95
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105
<210> 31
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 32
<211> 222
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 33
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有突变L234A, L235A 的IgG1同种型的变体人Fc区
<400> 33
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 34
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有孔突变的IgG1同种型的变体人Fc区
<400> 34
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 35
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有结突变的IgG1同种型的变体人Fc区
<400> 35
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 36
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A,L235A和孔突变的IgG1同种型的变体人Fc区
<400> 36
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 37
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A,L235A和结突变的IgG1同种型的变体人Fc区
<400> 37
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 38
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有P329G突变的IgG1同种型的变体人Fc区
<400> 38
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 39
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A, L235A和P329G 突变的IgG1同种型的变体人Fc区
<400> 39
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 40
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有P239G 和孔突变的IgG1同种型的变体人Fc区
<400> 40
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 41
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有P329G和结突变的IgG1同种型的变体人Fc区
<400> 41
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 42
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A，L235A，P329G和孔突变的IgG1同种型的变体人Fc区
<400> 42
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 43
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A, L235A, P329G和结突变的IgG1同种型的变体人Fc区
<400> 43
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 44
<211> 222
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215 220
<210> 45
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有S228P和L235E突变的IgG4同种型的变体人Fc区
<400> 45
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215 220
<210> 46
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有S228P, L235E和P329G突变的gG4同种型的变体人Fc区
<400> 46
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215 220
<210> 47
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与含有T366W突变的IgG1亚类的人重链恒定区组合的帕妥珠单抗重链可变结构域
<400> 47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 48
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与人κ轻链恒定区组合的帕妥珠单抗轻链可变结构域
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 49
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与含有T366S、L368A和Y407V突变的IgG1亚类的人重链恒定区组合的曲妥珠单抗重链可变结构域
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 50
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与人κ轻链恒定区组合的曲妥珠单抗轻链可变结构域
<400> 50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 51
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含帕妥珠单抗重链可变结构域和含有C末端GGGSLPETGGSGSHHHHHH氨基酸序列的IgG1亚类的人重链恒定区1(CH1)的抗体Fab片段
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Leu Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gly Ser His His His His His
225 230 235 240
His
<210> 52
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含帕妥珠单抗重链可变结构域和含有C末端GSLPETGGSGSHHHHHH序列的IgG1亚类的人重链恒定区1(CH1)的抗体Fab片段
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Ser
210 215 220
Leu Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gly Ser His His His His His His
225 230 235
<210> 53
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含帕妥珠单抗重链可变结构域和含有C末端LPETGGSGSHHHHHH序列的IgG1亚类的人重链恒定区1(CH1)的抗体Fab片段
<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Leu Pro
210 215 220
Glu Thr Gly Gly Ser Gly Ser His His His His His His
225 230 235
<210> 54
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含曲妥珠单抗重链可变结构域和含有C末端 GGGSLPETGGSGSHHHHHH序列的IgG1亚类的人重链恒定区1(CH1)的抗体Fab片段
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Leu Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gly Ser His His His His
225 230 235 240
His His
<210> 55
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含曲妥珠单抗重链可变结构域和含有C末端 GSLPETGGSGSHHHHHH序列的IgG1亚类的人重链恒定区1(CH1)的抗体Fab片段
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly
210 215 220
Ser Leu Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gly Ser His His His His His His
225 230 235 240
<210> 56
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含曲妥珠单抗重链可变结构域和含有C末端 LPETGGSGSHHHHHH序列的IgG1亚类的人重链恒定区1(CH1)的抗体Fab片段
<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Leu
210 215 220
Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gly Ser His His His His His His
225 230 235
<210> 57
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有T366S、L368A和Y407V突变的含有N末端GGGDKTHTCPPC序列的重链Fc区多肽(人IgG1(CH2-CH3))
<400> 57
Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
20 25 30
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
35 40 45
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
50 55 60
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
85 90 95
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
100 105 110
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
115 120 125
Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
130 135 140
Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145 150 155 160
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys
180 185 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
195 200 205
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 58
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有T366S、L368A和Y407V突变的含有N末端GGHTCPPC序列的重链Fc区多肽(人IgG1(CH2-CH3))
<400> 58
Gly Gly His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
1 5 10 15
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
20 25 30
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
35 40 45
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
50 55 60
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
65 70 75 80
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
85 90 95
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
100 105 110
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
115 120 125
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
130 135 140
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
145 150 155 160
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
165 170 175
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
180 185 190
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
195 200 205
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
210 215 220
Gly Lys
225
<210> 59
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有T366S、L368A和Y407V突变的含有N末端GGCPPC序列的重链Fc区多肽(人IgG1(CH2-CH3))
<400> 59
Gly Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 60
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有T366W突变的含有N末端GGGDKTHTCPPC序列的重链Fc区多肽(人IgG1(CH2-CH3))
<400> 60
Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
20 25 30
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
35 40 45
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
50 55 60
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
85 90 95
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
100 105 110
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
115 120 125
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
130 135 140
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145 150 155 160
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
180 185 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
195 200 205
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 61
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有T366W突变的含有N末端GGHTCPPC序列的重链Fc区多肽(人IgG1(CH2-CH3))
<400> 61
Gly Gly His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
1 5 10 15
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
20 25 30
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
35 40 45
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
50 55 60
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
65 70 75 80
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
85 90 95
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
100 105 110
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
115 120 125
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
130 135 140
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
145 150 155 160
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
165 170 175
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
180 185 190
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
195 200 205
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
210 215 220
Gly Lys
225
<210> 62
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有T366W突变的含有N末端GGCPPC序列的重链Fc区多肽(人IgG1(CH2-CH3))
<400> 62
Gly Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 63
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab片段C末端
<400> 63
Leu Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gly Ser His His His His His His
1 5 10 15
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab片段C末端2
<400> 64
Gly Ser Leu Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gly Ser His His His His His
1 5 10 15
His
<210> 65
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab片段C末端3
<400> 65
Gly Gly Gly Ser Leu Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gly Ser His His His
1 5 10 15
His His His
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分选酶标签7
<400> 66
Gly Gly His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5
<210> 67
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分选酶标签8
<400> 67
Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10

Claims (4)

1.用于产生双特异性抗体的方法，包括步骤：孵育
(i)抗体Fab片段，所述抗体Fab片段在其C末端具有氨基酸序列KSCGGGSLPETGGSGSHHHHHH或KSCGSLPETGGSGSHHHHHH，
(ii)包含全长抗体重链、全长抗体轻链，和抗体重链Fc区多肽的单臂抗体片段，
以此全长抗体重链和全长抗体轻链是彼此互补的同族抗体链并且其可变结构域对(VH和VL)形成抗原结合位点，
以此全长抗体重链和抗体重链Fc区多肽通过形成抗体铰链区的一个或多个二硫键彼此共价连接，并且
以此抗体重链Fc区多肽在其N末端具有氨基酸序列GGCPPC，
和
(iii)分选酶A
并且因而产生双特异性抗体。
2.用于产生双特异性抗体的方法，包括以下步骤
(i)确定存在于含有细胞的样品中的细胞表面标记物并且选择其至少第一细胞表面标记物和第二细胞表面标记物，
(ii)孵育(a)抗体Fab片段，所述抗体Fab片段在其C末端具有氨基酸序列KSCGGGSLPETGGSGSHHHHHH或KSCGSLPETGGSGSHHHHHH，以此Fab片段与第一细胞表面标记物或其配体特异性结合，(b)包含全长抗体重链、全长抗体轻链，和抗体重链Fc区多肽的单臂抗体片段，以此全长抗体重链和全长抗体轻链是彼此互补的同族抗体链并且其可变结构域对(VH和VL)形成与第二细胞表面标记物或其配体特异性结合的抗原结合位点，以此全长抗体重链和抗体重链Fc区多肽通过形成抗体铰链区的一个或多个二硫键彼此共价连接，并且以此抗体重链Fc区多肽在其N末端具有氨基酸序列GGCPPC，和(c)分选酶A
并且因而产生双特异性抗体。
3.用于确定抗原结合位点的组合的方法，包括以下步骤
(i)确定通过如下方式制备的多种双特异性抗体的结合特异性和/或选择性和/或亲和力和/或效应子功能和/或体内半寿期：组合(a)第一多种抗体Fab片段的每个成员，以此每个成员在其C末端具有氨基酸序列KSCGGGSLPETGGSGSHHHHHH或KSCGSLPETGGSGSHHHHHH，以此Fab片段与第一表位或抗原特异性结合，与(b)多种包含全长抗体重链、全长抗体轻链，和抗体重链Fc区多肽的单臂抗体片段的每个成员，以此全长抗体重链和全长抗体轻链是彼此互补的同族抗体链并且其可变结构域对(VH和VL)形成与第二表位或抗原特异性结合的抗原结合位点，以此全长抗体重链和抗体重链Fc区多肽通过形成抗体铰链区的一个或多个二硫键彼此共价连接，并且以此抗体重链Fc区多肽在其N末端具有氨基酸序列GGCPPC，和(c)分选酶A组合
并且
(ii)选择具有合适的结合特异性和/或选择性和/或亲和力和/或效应子功能和/或体内半寿期的双特异性抗体并且因而确定抗原结合位点的组合。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，特征在于Fc区包含在第329位置处天然存在氨基酸残基的突变和至少一个氨基酸残基向不同残基的至少一个其他突变，所述至少一个氨基酸残基选自包含在第228、233、234、235、236、237、297、318、320、322和331位置处的氨基酸残基的组，其中Fc区中的残基根据Kabat的EU索引编号，其中天然存在氨基酸残基的突变是S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、P329G，和/或P331S。
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