JP2019524681A - 新規抗体フォーマット - Google Patents
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Abstract
Description
加齢黄斑変性は、工業国で50歳以上の人々に不可逆的な盲目を引き起こす、最も一般的な眼疾患である。現在の治療法は、例えば、抗体/抗体フォーマットによるVEGF阻害に基づき、4〜6週間間隔で硝子体内への反復注射を必要とする。さらに、利用可能な抗VEGF単独療法に応答しない患者もいる。すでに証明されている抗VEGF医薬品及び/又は新規標的分子に基づき、処置の有効性及び安全性を高めかつ注射頻度を低下させる目的を有する、組合せ療法に関する徹底的な研究が実施されている。
本明細書には、新規治療剤を作製するための基盤としての役目を果たし得る、新規で2本鎖で低分子量の二価抗体が報告されている。このような抗体は、例えば、眼科的疾患、例えば加齢黄斑変性に使用することができる。なぜなら、それは眼科適用において改善された特性を有するからである。同様にこのフォーマットは、腫瘍疾患、神経疾患(血液脳関門の通過を含む)、及び抗炎症疾患にも適用を有し得る。
a)N末端からC末端の方向に
i)第一の結合部位の第一の部分、
ii)第一の多量体化ドメイン、及び
iii)第二の結合部位の第一の部分
を含む第一のポリペプチド、並びに
b)N末端からC末端の方向に
i)第一の結合部位の第二の部分、
ii)第二の多量体化ドメイン、及び
iii)第二の結合部位の第二の部分
を含む第二のポリペプチド
を含む(二価)抗体であり、
ここで、第一の結合ドメインの第一の部分及び第一の結合ドメインの第二の部分は一緒に第一の結合部位を形成し、第二の結合ドメインの第一の部分及び第二の結合ドメインの第二の部分は一緒に第二の結合部位を形成し、
ここで、第一の結合部位及び第二の結合部位は、互いに独立して、(異なる)エピトープ/標的/抗原に特異的に結合し、そして
ここで、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドは、互いに多量体化ドメインを介して非共有結合又は共有結合している。
a)N末端からC末端の方向に
i)第一の結合部位の第一の部分、
ii)第一の多量体化ドメイン、及び
iii)第一の結合部位の第二の部分
を含む第一のポリペプチド、並びに
b)N末端からC末端の方向に
i)第二の結合部位の第一の部分、
ii)第二の多量体化ドメイン、及び
iii)第二の結合部位の第二の部分
を含む第二のポリペプチド
を含む(二価)抗体であり、
ここで、第一の結合部位の第一の部分及び第一の結合部位の第二の部分は一緒に(機能的な)第一の結合部位を形成し、第二の結合部位の第一の部分及び第二の結合部位の第二の部分は一緒に第二の(機能的な)結合部位を形成し、
ここで、第一の結合部位及び第二の結合部位は、互いに独立して、(異なる)エピトープ/標的/抗原に特異的に結合し、そして
ここで、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドは、互いに多量体化ドメインを介して非共有結合又は共有結合/会合している。
−抗体重鎖可変ドメインは、多量体化ドメインの一方の末端に(直接的に又は第一の(ペプチド)リンカーを介してのいずれかで)融合し、
−抗体軽鎖可変ドメインは、多量体化ドメインのそれぞれの他方の末端に(直接的に又は第二の(ペプチド)リンカーを介してのいずれかで)融合し、
−抗体重鎖可変ドメイン又は抗体軽鎖可変ドメインは、多量体化ドメインに対する(ペプチド内/鎖内)ジスルフィド結合を有する。
ここで、
−抗体重鎖可変ドメインは、多量体化ドメインの一方の末端に(直接的に又は第一の(ペプチド)リンカーを介してのいずれかで)融合し、
−抗体軽鎖可変ドメインは、多量体化ドメインのそれぞれの他方の末端に(直接的に又は第二の(ペプチド)リンカーを介してのいずれかで)融合し、
−抗体重鎖可変ドメイン又は抗体軽鎖可変ドメインは、多量体化ドメインに対する(ペプチド内/鎖内)ジスルフィド結合を有する。
a)第一の抗体重鎖可変ドメイン、
第一の抗体軽鎖可変ドメイン、及び
第一の多量体化ドメイン
を含む第一のポリペプチド、並びに
b)第二の抗体重鎖可変ドメイン、
第二の抗体軽鎖可変ドメイン、及び
第二の多量体化ドメイン
を含む第二のポリペプチド
を含む(二価)抗体であり、
ここで、第一及び第二の抗体可変ドメインは、第一の(機能的な)抗原/標的結合部位を形成している(同族)VH/VL対であり、第三及び第四の抗体可変ドメインは、第二の(機能的な)抗原/標的結合部位を形成している(同族)VH/VL対であり、
ここで、第一及び第二のポリペプチドは、互いに多量体化ドメイン内で共有結合又は非共有結合し、
ただし、第一及び第二の多量体化ドメインは、免疫グロブリンヒンジ領域を含まない。
a)第一の抗体重鎖可変ドメイン、
第一の抗体軽鎖可変ドメイン、及び
第一の多量体化ドメイン
を含む第一のポリペプチド、並びに
b)第二の抗体重鎖可変ドメイン、
第二の抗体軽鎖可変ドメイン、及び
第二の多量体化ドメイン
を含む第二のポリペプチド
を含む(二価)抗体であり、
ここで、第一のポリペプチドの可変ドメインは、第一の標的に特異的に結合する第一の(機能的な)結合部位を形成し、第二のポリペプチドの可変ドメインは、第二の標的に特異的に結合する第二の(機能的な)結合部位を形成し、
ここで、第一及び第二のポリペプチドは、互いに多量体化ドメイン内で/多量体化ドメインによって共有結合又は非共有結合している。
−第一及び第二の多量体化ドメインは、抗体CH3抗ドメイン又はその断片若しくは変異体であるか、あるいは、
−多量体化ドメインの一方は抗体CH1ドメイン又はその断片若しくは変異体であり、それぞれの他方の多量体化ドメインは、抗体CLドメイン又はその断片若しくは変異体である。
−一方のCH3ドメインは、T366W突然変異を有し、他方のCH3ドメインは、T366S、L368A、及びY407Vの突然変異(番号付けはKabatEUインデックスによる)を有し、
−一方のCH3ドメインはさらに、Y349C突然変異を有し、他方のCH3ドメインはさらに、E356C又はS354Cの突然変異(番号付けはKabatEUインデックスによる)を有する。
加齢黄斑変性に対する新規な治療剤を作製するための基本的なフォーマットとしてとりわけ使用され得、一般的に眼科のための改善された特性を有する、新規抗体フォーマットが本明細書において報告されている。
本明細書において、全ての抗体定常ドメイン(CH1、ヒンジ、CH2、CH3)のアミノ酸の位置は、Kabatの番号付け体系に従って示され(Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))、番号付けは、「Kabatによる番号付け」と称される。特に、Kabatの番号付け体系(Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)の647〜660頁参照)は、κ及びλアイソタイプの抗体軽鎖定常ドメイン(CL)の番号付けに使用され、KabatEU番号付けインデックスは、抗体重鎖の定常ドメインのために使用される(661〜723頁参照;CH1、ヒンジ、CH2、及びCH3)。
のアミノ酸配列を有する。
のアミノ酸配列を有する。
のアミノ酸配列を有する。
のアミノ酸配列を有する。
のアミノ酸配列を有する。
(a)アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)、及び96〜101(H3)に存在している超可変ループ(Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b)アミノ酸残基24〜34(L1)、50〜56(L2)、89〜97(L3)、31〜35b(H1)、50〜65(H2)、及び95〜102(H3)に存在しているCDR(Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242);
(c)アミノ酸残基27c〜36(L1)、46〜55(L2)、89〜96(L3)、30〜35b(H1)、47〜58(H2)、及び93〜101(H3)に存在している抗原との接触部(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));並びに
(d)HVRアミノ酸残基46〜56(L2)、47〜56(L2)、48〜56(L2)、49〜56(L2)、26〜35(H1)、26〜35b(H1)、49〜65(H2)、93〜102(H3)及び94〜102(H3)を含む、(a)、(b)、及び/又は(c)の組合せ
を含む。
眼の大半の空間を充填するマトリックスは、硝子体液/硝子体として示される。
眼科は、眼疾患及びその処置に関する医学の一部門である。眼科の分野においては、罹患したヒトの視力に大きな影響を及ぼし、頻繁に盲目に至る、数多くの深刻な疾患が存在する。糖尿病性黄斑浮腫(DME)、糖尿病性網膜症(DR)、及び加齢黄斑変性(AMD)に、ドイツだけでほぼ500万人が罹患し、罹患者数は増え続けている([1])。AMDは、世界中で3番目に多い眼疾患である。それは視力の深刻な障害をもたらし、症例の8.7%は全盲にさえ至る([2]、[3])。工業国では、それは50歳以上のヒトにおいて最も多い眼疾患であり、不可逆的な盲目を引き起こす([4]、[5])。1億9600万人の人々が、2020年までにAMDに罹患するだろうと推定されている([6])。
医薬品の硝子体内半減期、及びそれによる硝子体内注射回数は、とりわけ、眼における医薬品の拡散特性及びその安定性によって決定される。
−高い分子量(IgG、例えばPEGを、ディアボディ、Fabなどのより小さなフォーマットに付加)、
−標的に対する高い親和性及び結合力(より低い有効薬物濃度により、より頻度の少ない投薬が行なわれる)、
−37℃での高い熱的安定性、
−硝子体液及び血液網膜関門(BRB)を横断する分子の拡散の減少、
−最適な荷電又はpI
によって達成され得る。
−FcRnへの結合を低減させるために、Fc領域を工学操作すること、
−(より)低い分子量(Fab、ディアボディ、DARPIN)、
−低い投薬用量(用量は親和性にも依存する)
によって達成され得る。
一価の単一特異的な抗原結合断片(Fab)は、完全な軽鎖、並びに、重鎖のVHドメイン及びCH1ドメインを含む。Fabは、約50kDaの分子量を有する。
本明細書に報告されているような(二価)抗体は、「オフタボディ」と呼ばれる新規抗体フォーマットである。それは、Fab断片よりも僅かにより高い分子量を有し、それ故、おそらく、幾分より長い硝子体内半減期を有するだろう。他方でそれは依然として、腎臓を介して全身循環から迅速に除去されるのに十分なほどに小さくあるべきである。高い熱的安定性と組み合わせた低分子量及び分子構造により、改善された特性が得られる。この理論に束縛されるものではないが、IgGと比較してより低い分子量により、組織への浸透も改善され得る。
本明細書に報告されているような(二価)抗体は、組換え手段によって生成される。したがって、本明細書に報告されているような1つの態様は、本明細書に報告されているような(二価)抗体をコードしている核酸であり、さらなる態様は、本明細書に報告されているような(二価)抗体をコードしている核酸を含む細胞である。組換え産生のための方法は、最先端の技術分野において広く知られており、原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質の発現、続いて、(二価)抗体の単離、及び通常は薬学的に許容できる純度までの精製を含む。宿主細胞における前記のような(二価)抗体の発現のために、それぞれの(改変された)軽鎖及び重鎖をコードしている核酸を、標準的な方法によって発現ベクターに挿入する。発現を、CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母細胞、又は大腸菌(E.coli)細胞のような適切な原核宿主細胞又は真核宿主細胞において実施し、(二価)抗体を、細胞(培養上清又は溶解後の細胞)から回収する。抗体の一般的な組換え産生法は最先端の技術分野において周知であり、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202, Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282, Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160、及びWerner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説論文に記載されている。抗体はまた、例えば、米国特許第4,816,567号に記載のような組換え法及び製剤を使用して産生されてもよい。
a)(二価)抗体をコードしている核酸分子を含む1つ以上のベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程、
b)宿主細胞を、(二価)抗体の合成を可能とする条件下で培養する工程、及び
c)培養液から(二価)抗体を回収する工程
を含む、本明細書に報告されているような(二価)抗体の調製法である。
本明細書に報告されているような(二価)抗体は、価値ある有効性/安全性プロファイルを有し得、それぞれの療法を必要としている患者にとって利点を提供し得る。
本明細書において提供される(二価)抗体のいずれかを、治療法に使用し得る。
本明細書に報告されているような別の態様では、上記の障害の治療、予防及び/又は診断に有用な材料を含有している製品が提供される。製品は、容器と、容器の上又は容器と共に付随しているラベル又は添付文書とを含む。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静注液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は製剤を保持し、この製剤は単独であるか、あるいは容態を治療、予防及び/又は診断するのに有効な別の製剤と配合されている。製剤中の少なくとも1つの活性薬剤は、本明細書に報告されているような(二価)抗体である。ラベル又は添付文書は、該製剤が、選択された容態の処置のために使用されることを示す。さらに、製品は、(a)第一容器(この中に製剤が含有されている)(ここでの製剤は本明細書に報告されているような(二価)抗体を含む);及び(b)第二の容器(この中に製剤が含有されている)(ここでの製剤はさらに他の治療剤を含む)を含み得る。本明細書に報告されているようなこの実施態様における製品は、該製剤を特定の容態を処置するために使用することができることを示した添付文書をさらに含み得る。代替的に又は追加的に、製品はさらに、薬学的に許容される緩衝液を含む第二(又は第三)の容器を含み得る。それはさらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジをはじめとする、商業的見地及びユーザーの見地から望ましい他の材料も含み得る。
さらなる態様では、上記のいずれかの実施態様による(二価)抗体は、以下の第1〜5章に記載のように、特色のいずれかを単独で又は組み合わせて取り込み得る。
特定の実施態様では、本明細書において提供される(二価)抗体は、その標的のいずれかに対して100nM以下、10nM以下(例えば10−7M以下、例えば10−7M〜10−13M、例えば10−8M〜10−13M)の平衡解離定数(KD)を有する。
特定の実施態様では、本明細書において提供される(二価)抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体の1つ又は2つの抗体結合部位を含む。
特定の実施態様では、本明細書において提供される(二価)抗体は、ヒト抗体の1つ又は2つの抗体結合部位を含む。
本明細書に報告されているような(二価)抗体は、所望の活性又は活性群を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離された抗体の1つ又は2つの抗体結合部位を含み得る。
特定の実施態様では、本明細書において提供される(二価)抗体のアミノ酸配列変異体が考えられる。例えば、(二価)抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。(二価)抗体のアミノ酸配列変異体は、適切な改変を、(二価)抗体をコードしているヌクレオチド配列に導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。このような改変としては、例えば、(二価)抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び/又は該残基への挿入、及び/又は該残基の置換を含む。最終構築物に到達するために、欠失、挿入、及び置換の任意の組合せを行ない得、ただし、最終構築物は所望の特徴、例えば抗原との結合を有する。
特定の実施態様では、1つ以上のアミノ酸置換を有する(二価)抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発のための関心対象の部位としてはHVR及びFRが挙げられる。保存的置換は、以下の表に「好ましい置換」の表題で示されている。より実質的な変化が、「例示的な置換」の表題で以下の表において、及びアミノ酸側鎖クラスに言及して以下にさらに記載されているように提供されている。アミノ酸置換を、関心対象の(二価)抗体に導入し得、そして産物を所望の活性、例えば保持された/改善された抗原との結合、低減された免疫原性、又は改善されたADCC若しくはCDCについてスクリーニングし得る。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu:
(4)塩基性:His、Lys、Arg:
(5)側鎖の方向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
特定の実施態様では、本明細書において提供される(二価)抗体は、(二価)抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるために改変される。(二価)抗体へのグルコシル化部位の付加又は欠失は、1つ以上のグリコシル化部位が作られるか又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって慣用的に成し遂げられ得る。
特定の実施態様では、1つ以上のさらなるアミノ酸改変を、本明細書において提供されている(二価)抗体の多量体化ドメイン(群)に導入し得、これにより、多量体化ドメイン変異体を生成し得る。該変異体は、1つ以上のアミノ酸の位置においてアミノ酸改変(例えば置換/突然変異)を含む少なくとも1つのヒトCH3ドメイン配列(例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4のCH3ドメイン)を含み得る。
ヘテロ二量体化を強化するためのCH3改変のためのいくつかのアプローチが存在し、これは、例えば国際公開公報第96/27011号、国際公開公報第98/050431号、欧州特許第1870459号、国際公開公報第2007/110205号、国際公開公報第2007/147901号、国際公開公報第2009/089004号、国際公開公報第2010/129304号、国際公開公報第2011/90754号、国際公開公報第2011/143545号、国際公開公報第2012058768号、国際公開公報第2013157954号、国際公開公報第2013096291号に十分に記載されている。典型的には、全てのこのようなアプローチにおいて、第一のCH3ドメイン及び第二のCH3ドメインは両方共に相補的に工学操作されることにより、各CH3ドメイン(又はそれを含む重鎖)はもはや自分自身とホモ二量体化することができないが、相補的に工学操作された他方のCH3ドメインとヘテロ二量体化するようになる(よって、第一のCH3ドメインと第二のCH3ドメインはヘテロ二量体化し、2つの第一のCHドメイン間又は2つの第二のCH3ドメイン間のホモ二量体は形成されない)。改善された重鎖へテロ二量体化のためのこれらの異なるアプローチは、軽鎖誤対合すなわちベンスジョーンズ型副産物を減少させる、本発明による(二価)抗体における重鎖−軽鎖改変(1つの結合アームにおけるVH及びVLの交換/置換、並びに、CH1/CL界面に逆の荷電を有する荷電アミノ酸の置換の導入)と組み合わせた、異なる選択肢であるとと考えられる。
(二価)抗体の第一のポリペプチドの第一のCH3ドメイン及び(二価)抗体の第二のポリペプチドの第二のCH3ドメインは各々、CH3ドメイン間の元来の界面を含む界面において遭遇することを特徴とし、
該界面は、(二価)抗体の形成を促進するように改変され、ここでの改変は、
i)一方のポリペプチドのCH3ドメインが改変され、よって、(二価)抗体内の一方のポリペプチドのCH3ドメインの元来の界面に遭遇する他方のポリペプチドのCH3ドメインの元来の界面内において、アミノ酸残基を、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換することにより、一方のポリペプチドのCH3ドメインの界面内に突起が作られ、これは他方のポリペプチドのCH3ドメインの界面内の空洞に配置することができ、そして
ii)他方のポリペプチドのCH3ドメインが改変され、よって、(二価)抗体内の第一のCH3ドメインの元来の界面に遭遇した第二のCH3ドメインの元来の界面内において、アミノ酸残基を、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換することにより、第二のCH3ドメインの界面内に空洞が作られ、この中に第一のCH3ドメインの界面内の突起を配置することができる。
材料及び方法
分取用の制限酵素消化物
最初に、クローニングベクター 3μgを、20Uの制限酵素HindIII−HF及びNheI−HFを用いて切り出した。同様に、挿入される予定の合成遺伝子断片 2μg(ジーンアート社、レーゲンベルク、ドイツ)を、20Uの制限酵素HindIII−HF及びNheI−HFを用いて切り出した。バッチを続いて、37℃で60分間インキュベートした。次いで、バッチをゲル電気泳動によって分析した。
5Uの制限酵素及び構築物の分取液(約500ng)を、定性用の制限酵素消化物のバッチのために使用した。バッチを続いて、37℃で60分間インキュベートした。次いで、バッチをゲル電気泳動によって分析した。
各場合において、1%アガロースゲル及び0.5μgのサイズ標準物質を、分取用の消化物及び定性用の制限酵素消化物の分析のために使用した。10×ローディング緩衝液と事前に混合しておいた全消化物のバッチを、分取用消化物の範囲内に適用した。臭化エチジウムと配合した1×TBE緩衝液を泳動緩衝液として使用した。ゲル電気泳動を、100Vの電圧で約45分間実施した。ゲルを続いて、UVシステムを使用して分析し、記述した。
約120mgのゲルを取り出す、X−TRACTA第II世代カッターを切り出しに使用した。ロシュ製のHigh Pure PCR Product Purificationキットを製造業者の仕様書に従って使用することにより、アガロースゲル切片から関心対象の区域のDNAが得られた。類似の手順を使用することにより、切り出しクローニングベクターが得られた。
Rapid DNAライゲーションキットを製造業者の仕様書に従ってクローニングベクターと挿入断片のライゲーションのために使用した。クローニングベクターを、rAPidアルカリホスファターゼキットを使用して事前に脱リン酸化することにより、自己ライゲーションを防いだ。キットは同様に製造業者の仕様書に従って使用された。再ライゲーション対照では、クローニングベクターのみをライゲーション用バッチに加えた。
形質転換は、製造業者の仕様書に従って可能な最大の程度まで実施された。しかしながら、細胞から構成されるバッチ及びライゲーション用バッチを、氷上でたったの15分間インキュベートした。熱ショック及び氷上でのインキュベーション後、300μL〜600μLのSOC培地を、形質転換用バッチのサイズに応じて添加した。バッチを続いてサーモミキサー中で37℃で300rpmで1時間インキュベートした。次いで、30μL〜50μLのバッチを栄養寒天プレート(100μg/mLのアンピシリンを含む)上に蒔き、これを37℃で一晩インキュベートした。
ロシュ製のHigh Pure Plasmid Isolationキットを製造業者の仕様書に従って使用した。栄養寒天プレートからコロニー形成単位(CFU)の構築物を拾い上げ、アンピシリンと配合したLB培地 4mLに接種することによって、事前に微量培養液に接種した。このバッチを37℃及び200rpmで一晩インキュベートした。最大培養液を生成するために、微量培養液 200μLを使用して、アンピシリンと配合したLB培地 350mLに接種した。このバッチを同様に37℃及び200rpmでインキュベートした。
キアゲン社製のHiSpeed Plasmid Maxiキットを使用して単離された特定の容量の組換えDNAを沈降させた。この目的を達成するために、3Mの酢酸ナトリウム溶液(pH5.2)の1/10容量を、単離されたDNAに加え、ボルテックスにかけた。100%エタノールの21/2容量を続いて加え、混合した。バッチを室温で5分間インキュベートした。バッチを続いて、卓上遠心機で13,000rpmで5分間遠心分離にかけた。上清を廃棄した。DNAペレットを1mLの70%エタノールと配合し、バッチを前後に振り、次いで室温で5分間インキュベートした。バッチをもう一回卓上遠心機で13,000rpmで5分間遠心分離にかけた。トランスフェクション用の無菌DNAを得るために、チューブをクリーンベンチの下に移動し、そこで上清を注意深く除去した。ペレットを蓋の開いたエッペンドルフチューブ中で乾燥させた。最後に、乾燥させたペレットを、再蒸留水に4℃で一晩溶解した。DNA濃度を決定するために、再蒸留水に溶かしたDNAを、10mMのトリス−HCl緩衝液(pH7.5)で1:10に希釈し、希釈度をナノドロップ機器を使用して測定した。
手順を、6mL/Lのペニシリン・ストレプトマイシン溶液と事前に配合しておいたギブコ社製のF17培地中に保持していたHEK293F懸濁培養液を用いて実施した。細胞を3日目〜4日目毎に分割した。細胞を、温度37℃、CO2飽和度7%、及び相対室内湿度80%のインキュベーター中で135rpmで撹拌した。
HEK293F懸濁培養液の生存力及び細胞数を、CASYモデルTTセルカウンター及びアナライザーを使用して決定した。電解質溶液(CASY(登録商標)ton)中の細胞を測定した[32]。
トランスフェクションは、ノバゲン社製の293フリートランスフェクション試薬を使用して製造業者の仕様書に従って実施された。たった1回のトランスフェクション後工程が挿入された。20mL/Lの45%グルコース及び20mL/LのL−グルタミンを、トランスフェクション後の初日に細胞に加えた。発現され分泌されたタンパク質を6日目又は7日目に収集した。この目的を達成するために、全トランスフェクションバッチを4℃及び500×gで20分間遠心分離にかけた。上清を続いて、新たな容器に移し、さらに20分間4℃で3452×gで遠心分離にかけた。最後に、上清を発現され分泌されたタンパク質と一緒に滅菌ろ過した。
CaptureSelect C−タグアフィニティクロマトグラフィーでは、カラムマトリックス上に固定されたラクダ抗体断片は、C−キャップペプチドEPEAを認識する。これにより所望のタンパク質が結合し、上清から精製される。
表面共鳴測定は、無細胞相互作用アッセイを含む。表面共鳴測定は、抗体が抗原に結合する親和性を決定することを可能とする。親和性は、「会合速度」及び「解離速度」から構成される。「会合速度」については、抗体が抗原と結合する時間が決定される。「解離速度」は、抗体が抗原から解離するまでどれだけ長く結合したままでいるかを示す。2つの抗原の同時結合を測定するために、一方の抗原をチップ上に固定し、抗体及び第二の抗原を連続して注入する。
細胞アッセイでは、分析される予定の分子がどれだけ良好に、結合される予定の分子が関与する特定のシグナルカスケードを妨げるかを決定するために試験を実施する。細胞アッセイの範囲内において、安定なトランスフェクションの結果として特定の受容体を発現しているHEK細胞を使用する。この受容体は、調べられる予定の抗体によって認識されかつ結合する抗原に結合する。
このアッセイでは、結合される予定の抗原1は、それが適合する受容体と結合した場合にシグナルカスケードをトリガーする。このシグナルカスケードによりルシフェラーゼが発現する。ルシフェラーゼは、5’−フルオロルシフェリンからオキシフルオロルシフェリンへの反応を触媒し、結果として発光が起こる。相対的な発光単位(RLU)はルシフェラーゼシグナルに相関する。抗体が抗原1と結合した場合、後者はもはや受容体には結合できないので、シグナルカスケードはトリガーされず、ルシフェラーゼシグナルは存在しない。
このアッセイは、抗原2と結合中の抗原受容体の自己リン酸化に基づく。リン酸化の程度はELISAによって決定される。多層プレートを、抗原受容体に対する「捕捉抗体」で覆う。細胞を抗原2及び抗体と共にインキュベートし、溶解し、プレート上に置く。溶解液に由来する抗原受容体は、プレート上の捕捉抗体に結合する。受容体のリン酸化チロシンは、ビオチンに結合させた抗リン酸化チロシン抗体によって検出される。ビオチン基は次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合させたストレプトアビジンに結合する。最後に、セイヨウワサビペルオキシダーゼの基質のTMBを加え、これはペルオキシダーゼによって変換され、その結果、物質の吸収が起こる。反応は終了し、光学密度を測定する。
標準的な方法を使用して、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1989)に記載のようにDNAを操作した。分子生物学的試薬は製造業者の説明書に従って使用した。
所望の遺伝子区画を、ジーンアート社(レーゲンベルク、ドイツ)の所与の仕様書に従って注文した。
DNA配列は、MediGenomix社(マルティンスリート、ドイツ)又はSequiServe社(ファーターシュテッテン、ドイツ)で実施された二本鎖シークエンスによって決定された。
GCG(ジェネティクスコンピューターグループ、マジソン、ウィスコンシン州)ソフトウェアパッケージバージョン10.2及びインフォマックス社製Vector NT1 Advanceスイートバージョン8.0を、配列の作製、マッピング、分析、アノテーション、及び説明のために使用した。
記載の抗体の発現のために、CMV−イントロンAプロモーターを有する若しくは有さないcDNA構成、又はCMVプロモーターを有するゲノム構成のいずれかに基づいた、一過性発現(例えばHEK293−F細胞における)のための発現プラスミドを使用した。
−5'末端における独特な制限酵素部位(群)、
−ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサー及びプロモーター、
−cDNA構成の場合にはイントロンA配列、
−ヒト免疫グロブリン遺伝子の5’非翻訳領域、
−免疫グロブリン重鎖シグナル配列をコードしている核酸、
−cDNAとしての又は免疫グロブリンのエキソン−イントロン構成を有するゲノム構成のいずれかで、ヒト抗体鎖(野生型又はドメインが交換された)をコードしている核酸、
−ポリアデニル化シグナル配列を有する3’−非翻訳領域、及び
−3’ 末端における独特な制限酵素部位(群)。
−E.coliにおけるこのプラスミドの複製を可能とする複製起点、
−E.coliにおけるアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子、及び
−真核細胞における選択マーカーとしてのハツカネズミ(Mus musculus)由来のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含有していた。
標準的な細胞培養技術を、Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Incに記載のように使用した。
トランスフェクション及びタンパク質の精製
HEK293−F細胞における2つのDNA構築物の共トランスフェクションは、各々の場合において、精製され滅菌された組換えDNAを使用して実施された。タンパク質を続いて、上清からアフィニティクロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
質量分析
タンパク質の分子量を、エレクトロスプレーイオン化(ESI)質量分析計を使用して分析し、アミノ酸配列に基づいて決定された理論的分子量と比較した。質量及び同一性を、全ての発現したタンパク質変異体について確認した。
熱的安定性の決定
タンパク質を、Avacta Optim機器を使用して熱的安定性について調べ、融点及び凝集温度を決定した。
結合アッセイ
結合アッセイは、ビアコア機器で、表面共鳴法を使用して実施された。ビアコアアッセイを使用して、オフタボディ変異体が抗原1及び2に結合する親和性を決定した。親和性は「会合速度」及び「解離速度」から構成される。二重特異的IgGをもう一度、基準標準物質として使用した。
Tie−2に対するhuANG−2の結合の阻害(ELISA)
相互作用ELISAを、384ウェルマイクロタイタープレート(MicroCoat、ドイツ、カタログ番号464718)上で室温で実施した。各インキュベーション工程の後、プレートをPBSTで3回洗浄した。ELISAプレートを、5μg/mlのTie−2タンパク質を用いて1時間(h)かけてコーティングした。その後、ウェルを、0.2%Tween−20及び2%BSA(ロシュ・ダイアグノスティックス社、ドイツ)の補充されたPBSを用いて1時間かけてブロックした。精製抗体のPBS希釈液を、0.2μg/mlのヒトアンジオポエチン−2(R&Dシステムズ社、イギリス、カタログ番号623−AN)と一緒に室温で1時間インキュベートした。洗浄後、0.5μg/mlのビオチニル化抗アンジオポエチン−2クローンBAM0981(R&Dシステムズ社、イギリス)と1:3000に希釈されたストレプトアビジンHRP(ロシュ・ダイアグノスティックス社、ドイツ、カタログ番号11089153001)の混合物を1時間かけて加えた。その後、プレートをPBSTで3回洗浄した。プレートを、新たに調製されたABTS試薬(ロシュ・ダイアグノスティックス社、ドイツ、緩衝液の番号204 530 001、タブレット番号11 112 422 001)を用いて室温で30分間かけて展開した。405nmにおける吸光度を測定し、IC50を決定した。
動態の特徴付け
ANG2:
ヒトANG2受容体結合部位−マウスFc領域融合物に対する二重特異的抗体の結合を、ビアコアT200機器(GEヘルスケア社)を使用して表面プラズモン共鳴によって調べた。約4000RUの抗マウスFc領域抗体(10μg/mlの抗マウス(Fc)抗体)を、シリーズSのCM5チップ(GEヘルスケア社のBR−1005−30)上にpH5.0で、GEヘルスケア社によって供給されたアミンカップリングキットを使用することによって結合させた。HBS−N(10mM HEPES、150mM NaCl(pH7.4)、GEヘルスケア社)を、固定化手順中のランニング緩衝液として使用した。以下の動態の特徴付けのための試料及びランニング緩衝液はHBS−P(10mM HEPES、150mM NaCl(pH7.4)、0.05%界面活性剤P20;GEヘルスケア社)であった。フローセルを25℃に設定し、試料ブロックは12℃に設定し、動態の特徴付けの前にランニング緩衝液を用いて2回プライミングした。
ヒトVEGFアイソフォーム121に対する二重特異的抗体の結合を、ビアコアT200機器(GEヘルスケア社)を使用して表面プラズモン共鳴によって調べた。抗ヘキサヒスチジン抗体を、CM5チップ(GEヘルスケア社のBR−1005−30)上に製造業者の説明書に従って、GEヘルスケア社によって供給されたアミンカップリングキットを使用することによって結合させた。HBS−N(10mM HEPES、150mM NaCl(pH7.4)、GEヘルスケア社)を、固定化手順中のランニング緩衝液として使用した。以下の動態の特徴付けのための試料及びランニング緩衝液はHBS−P(10mM HEPES、150mM NaCl(pH7.4)、0.05%界面活性剤P20;GEヘルスケア社)であった。フローセルを25℃に設定し、試料ブロックは12℃に設定し、動態の特徴付けの前にランニング緩衝液を用いて2回プライミングした。
動的光散乱(DLS)による凝集温度
熱的に誘導されたタンパク質の凝集が起こる温度が、動的光散乱(DLS)によって決定された。DLSにより、マイクロ秒の尺度で散乱光の強度の変動から導かれた、溶液中の巨大分子のサイズ分布に関する情報が得られる。試料を徐々に加熱すると、凝集がある温度で始まり、これにより、粒径の成長がもたらされる。粒径が増加し始める温度は、凝集温度として定義される。凝集温度及び変性温度は必ずしも同一である必要はない。なぜなら、変性は必ずしも凝集にとっての必要条件ではない場合があるからである。
Claims (21)
- 抗体重鎖可変ドメイン、多量体化ドメイン、及び抗体軽鎖可変ドメインを含む融合ポリペプチドであって、
−該抗体重鎖可変ドメインは、多量体化ドメインの一方の末端に(直接的に又は第一の(ペプチド)リンカーを介してのいずれかで)融合し、
−該抗体軽鎖可変ドメインは、多量体化ドメインのそれぞれの他方の末端に(直接的に又は第二の(ペプチド)リンカーを介してのいずれかで)融合し、そして
−該抗体重鎖可変ドメイン又は該抗体軽鎖可変ドメインは、多量体化ドメインに対する(ペプチド内)ジスルフィド結合を有する、融合ポリペプチド。 - ジスルフィド結合が、抗体重鎖可変ドメインと多量体化ドメインとの間に存在する、請求項1記載の融合ポリペプチド。
- 重鎖可変ドメインが、82b位(Kabatによる)にシステインアミノ酸残基を含み、ジスルフィド結合が、前記重鎖可変ドメインの82b位のシステイン残基と多量体化ドメインとの間に存在する、請求項2記載の融合ポリペプチド。
- 多量体化ドメインが、抗体CH3ドメイン、抗体CH1ドメイン、又は抗体CLドメイン、又はその各々の断片若しくは変異体に由来する、請求項1〜3のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 多量体化ドメインが、433位(番号付けはKabatEUインデックスによる)にシステインアミノ酸残基を有する抗体CH3ドメイン又はその断片若しくは変異体であり、ジスルフィド結合が、重鎖可変ドメインの82b位のシステイン残基とCH3ドメインの433位のシステイン残基との間に存在する、請求項4記載の融合ポリペプチド。
- 請求項1〜5のいずれか一項記載の2つの融合ポリペプチドからなる抗体。
- a)第一の抗体重鎖可変ドメイン、
第一の抗体軽鎖可変ドメイン、及び
第一の多量体化ドメイン
を含む第一のポリペプチド、並びに
b)第二の抗体重鎖可変ドメイン、
第二の抗体軽鎖可変ドメイン、及び
第二の多量体化ドメイン
を含む第二のポリペプチド
を含む抗体であって、
第一のポリペプチドの可変ドメインは、第一の標的に特異的に結合する第一の機能的結合部位を形成し、第二のポリペプチドの可変ドメインは、第二の標的に特異的に結合する第二の機能的結合部位を形成し、
第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドは、多量体化ドメイン内で/多量体化ドメインによって互いに共有結合又は非共有結合している、抗体。 - −第一及び第二の多量体化ドメインが、抗体CH3抗体ドメイン又はその断片若しくは変異体であるか、あるいは
−多量体化ドメインの一方が、抗体CH1ドメイン又はその断片若しくは変異体であり、それぞれの他方の多量体化ドメインが、抗体CLドメイン又はその断片若しくは変異体である、請求項6〜7のいずれか一項記載の抗体。 - −一方のCH3ドメインが、T366W突然変異を含有し、他方のCH3ドメインが、T366S、L368A、及びY407Vの突然変異を含有し(番号付けはKabatEUインデックスによる)、
−一方のCH3ドメインがさらにY349C突然変異を含有し、他方のCH3ドメインがさらにE356C又はS354Cの突然変異を含有している(番号付けはKabatによる)、請求項6〜8のいずれか一項記載の抗体。 - 抗体が二重特異的抗体である、請求項6〜9のいずれか一項記載の抗体。
- 融合ポリペプチド又は抗体が、VEGF、ANG2、PDGF、及びIL−1βからなる群より選択された1つの抗原に特異的に結合する、請求項1〜5のいずれか一項記載の融合ポリペプチド、又は請求項6〜10のいずれか一項記載の抗体。
- 抗体が、VEGF、ANG2、PDGF、及びIL−1βからなる群より互いに独立して選択された2つの抗原に特異的に結合する、請求項6〜11のいずれか一項記載の抗体。
- 医薬品としての使用のための請求項6〜12のいずれか一項記載の抗体。
- 眼血管疾患の処置のための請求項6〜12のいずれか一項記載の抗体。
- 眼血管疾患が加齢黄斑変性又は糖尿病性網膜症である、請求項14記載の抗体。
- 請求項1〜5のいずれか一項記載の融合ポリペプチド又は請求項6〜12のいずれか一項記載の抗体を含有している医薬製剤。
- 請求項6〜12のいずれか一項記載の抗体を投与する工程を含む、眼血管疾患の処置法。
- 医薬品を生産するための請求項1〜5のいずれか一項記載の融合ポリペプチド又は請求項6〜12のいずれか一項記載の抗体の使用。
- 加齢黄斑変性又は糖尿病性網膜症の処置のための請求項18記載の使用。
- 有効量の請求項6〜12のいずれか一項記載の抗体を個体に投与する工程を含む、眼血管疾患を有する個体を処置する方法。
- 血管新生を抑制するために有効量の請求項6〜12のいずれか一項記載の抗体を個体に投与する工程を含む、個体の眼における血管新生を抑制する方法。
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