KR20150023889A - 2 개 이상의 상이한 결합 단위를 함유하는 맞춤-제작된 고도로 선별적이고 다중-특이적인 표적화 단위의 선별 및 제조 방법 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본원에는 하기 (i) 내지 (iii) 을 인큐베이션하는 단계를 포함하는 2-특이적 항체의 제조 방법이 보고된다:
(i) 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPX1TG (SEQ ID NO: 01) 을 포함하는 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체,
(ii) 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 및 Fc-중쇄를 포함하는 외-분지 (one-armed) 항체,
전장 항체 중쇄 및 전장 항체 경쇄는 항원 결합 부위를 형성하는 동족 항체 사슬이고,
전장 항체 중쇄 및 Fc-중쇄는 항체 힌지 영역을 형성하는 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 서로 공유 연결되고,
Fc-중쇄는 그의 N-말단에 올리고글라이신 아미노산 서열을 가짐,
및
(iii) 소르타제 A 효소.

Description

2 개 이상의 상이한 결합 단위를 함유하는 맞춤-제작된 고도로 선별적이고 다중-특이적인 표적화 단위의 선별 및 제조 방법 및 이의 용도 {METHOD FOR SELECTION AND PRODUCTION OF TAILOR-MADE HIGHLY SELECTIVE AND MULTI-SPECIFIC TARGETING ENTITIES CONTAINING AT LEAST TWO DIFFERENT BINDING ENTITIES AND USES THEREOF}
본원에는 트랜스펩티다제, 에컨대, 소르타제 A (Sortase A) 를 사용함으로써 다중특이적 단위를 선별 및 제조하기 위한 방법 (상기 특이성은 서로 독립적으로 선택될 수 있음) 및 신규한 맞춤-제작 다중특이적 항체의 생성을 위해 상기 방법의 용도가 보고된다.
모노클로날 항체는 큰 치료 잠재성을 갖고, 오늘날의 의료 포트폴리오에서 중요한 역할을 수행한다. 지난 10 년간, 제약 산업의 중요한 트렌드는 종양학, 만성 염증 질환, 이식, 감염 질환, 심혈관 의약 또는 안과 질환을 포함하는 다양한 임상 설정에 걸치는 치료제로서의 모노클로날 항체 (mAb) 및 항체 Fc-융합 폴리펩티드 (결정성 분절-융합 폴리펩티드) 의 개발이었다 (Carter, J.P., Nature Reviews Immunology 6 (2006) 343-357; Chan, A.C. 및 Carter, J.P., Nature Reviews Immunology 10 (2010) 301-316).
치료 항체의 임상 효율은 주로 하기 2 개의 기능에 의존한다: i) Fv-도메인에 의해 매개되는 표적-특이적 결합, 및 ii) 항체 Fc-영역에 의해 매개되는 면역-매개되는 효과기 기능 예컨대 ADCC (항체-의존적 세포-매개되는 세포독성), CDC (보체-의존적 세포독성), 및 ADCP (항체-의존적 세포성 식세포작용). IgG 클래스의 면역글로불린의 Fc-영역은 힌지 영역 및 2 개의 불변 도메인 (CH2 및 CH3) 을 포함한다. Fc 영역은 또한 신생아 FcRn 수용체와 상호작용하고, 그에 의해 생체내에서의 항체 반감기를 결정한다. 힌지 영역은 이 지점에서 항체 분자의 분지가 Y-유사 구조를 형성하여 분자 내에서 유연성을 부여하는 영역이다. IgG 서브클래스/서브클래스들은 디설파이드 결합의 개수 및 힌지 영역의 길이에서 상이하다.
항체의 Fc-영역과 연관되는 효과기 기능은 항체의 클래스 및 서브클래스에 따라 다르고, 예를 들어, 세포 상의 특정 Fc 수용체 (FcR) 에 대한 그것의 Fc-영역을 통한 항체의 결합으로 다양한 생물학적 응답을 유발하는 것을 포함한다 (예를 들어, Jiang, X.-R., et al., Nature Reviews Drug Discovery 10 (2011) 101-110; Presta, L.G., Current Opinion in Immunology 20 (2008) 460-470 참고).
항체 또는 Fc-영역 포함 융합 폴리펩티드 또는 접합체의 힌지 영역은 항체 기능의 적어도 일부 예컨대 항원 결합 및 Fc-영역-매개되는 항체 효과기 기능에 관여한다. 항원 결합 (특히 2 가 아비드 (avid) 항체 결합) 은 특정/선천 힌지 영역의 유연성, 길이 및 공간 배향에 의존하지만, Fc-영역-매개되는 효과기 기능은 항체의 클래스 및 서브클래스에 의존적이다. 다른 IgG 항체에 대한 2 가와 비교하여 일부 인간 IgG4 항체에 대해 관찰되는 기능적 1 가는 항원 결합 특성에서 Fc-영역의 관여를 보여주는 또다른 예이다 (Salfeld, J.G., Nature Biotechnology 12 (2007) 1369-1372; Presta, L.G., Current Opinion in Immunology 20 (2008) 460-470).
문헌 [Levary, D.A., et al.] 에는 소르타제 A 에 의해 촉매되는 단백질-단백질 융합이 보고된다 (PLOS ONE 6 (2011)). 단일 사슬 형태로의 항-표피 성장 인자 수용체 항체의 조작 및 소르타아제 A-매개 단백질 라이게이션에 의한 라벨링이 Madej, M.P., et al. (Biotechnol. Bioeng. 109 (2012) 1461-1470) 에 의해 보고되어 있다. 문헌 [Ta, H.T., et al.] 에는 심혈관 질환에서 표적된 분자 이미지화 및 세포 회귀 (homing) 에 대한 범 접근법으로서 효소적 단쇄 항체 태그화가 보고되어 있다 (Cir. Res. 109 (2011) 365-373). 문헌 [Popp, M., et al.] 에는 펩티드 결합의 제조 및 파괴 - 소르타제를 사용하는 단백질 조작법이 보고되어 있다 (Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 50 (2011) 5024-5032). WO 2010/087994 에서는 라이게이션 방법 및 이의 용도가 보고되어 있다.
본원에는 치료를 필요로 하는 환자에서 질환, 예컨대 암의 치료를 위한 맞춤-제작된, 고도로 특이적인 치료 분자를 제공하기 위한 방법이 보고되어 있고, 치료 분자는 환자의 질환 특성 및/또는 환자의 유전자형/표현형에 맞게 조정된다.
이러한 조정은 환자의 질환 잠복/영향 세포의 유전자형/표현형을 고려하는 맞춤-제작 분자의 제작에 의해 달성된다.
첫번째 단계에서, 치료 분자로 표적화되는 것이 의도되는 세포의 유전자형/표현형 (예를 들어, 질환-특이적 세포 표면 항원의 존재 및 수/양) 이 결정된다. 이것은 예를 들어, 형광 표지된 1-특이적 (치료 또는 진단) 항체를 사용하여, 예를 들어, 혈액 및/또는 생검 물질로부터 유래된 환자의 세포의 면역조직화학 염색 (IHC, 면역조직화학) 과 같은 세포 이미지화 기법에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로 세포의 유전자형/표현형은 FACS-기반 방법을 사용하는 표지된 치료 또는 진단 항체를 사용하는 염색 후 분석될 수 있다. 광학 이미지화, 분자 이미지화, 형광 이미지화, 생체발광 이미지화, MRI, PET, SPECT, CT, 및 인트라바이탈 (intravital) 현미경을 비롯한 생체 내 이미지화 기법이 또한 환자의 질환-관련 세포의 유전자형/표현형의 결정에 대해 사용될 수 있다. 환자의 질환-관련 세포의 결정된 유전자형/표현형에 따라, 표적/결합 단위의 맞춤-제작 조합이 선택될 수 있고, 치료 분자에서 조합된다. 이러한 치료 분자는 예를 들어, 2-특이적 항체일 수 있다.
이러한 맞춤-제작 치료 분자는 i) 고도로 특이적일 것이고, ii) 양호한 효능을 가질 것이고, iii) 통상적으로 선택된 치료제와 비교해 부작용을 덜 유도할 것이다. 이들은 예를 들어, 치료 적재량의 이의 의도되는 작용 부위로의 개선된 표적화 및/또는 개선된 맞춤-제작 전달 특성을 치료 분자에 부여함으로써 달성될 수 있다.
치료 분자의 이의 작용 부위, 예컨대 예를 들어, 암 세포로의 개선된 전달은, 통상적으로 선택된 치료 분자와 비교하여 표적화된 치료 분자의 높은/증가된 선택성 및/또는 특이성에 의해 달성될 수 있다. 치료 분자는 상이한 항원 (예를 들어, 2 개의 상이한 표면 마커) 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프 (예를 들어, 동일한 표면 마커 상의 2 개의 상이한 에피토프) 에 특이적으로 결합하는 2 개 이상의 단위를 포함한다.
맞춤-제작된 치료 분자의 증가된 선택성 및/또는 특이성은 이들의 각각의 표적/에피토프에 대해 두 표적 단위의 동시 결합에 의해 달성될 수 있다, 즉, 이들은 결합능 (avidity) 영향에 의해 달성된다. 특히 적합한 것은 이들의 각각의 표적/에피토프에 대해 낮은 내지 중간 친화성을 갖는 2 개의 결합 단위의 조합이다. 부가적으로는, 표적을 벗어난 (off-target) 결합이 크게 감소하거나 심지어 완전히 제거될 수 있다.
맞춤-제작된 2-특이적 표적 및 결합 분자가 효소 소르타제 A 를 사용하여, 첫번째 결합 단위, 예컨대 다르핀 도메인 기반 결합 단위, 안티칼린 도메인 기반 결합 단위, T-세포 수용체 단편 예컨대 scTCR 도메인 기반 결합 단위, 카멜 VH 도메인 기반 결합 단위, 열번째 (tenth) 피브로넥틴 3 도메인 기반 결합 단위, 테나신 도메인 기반 결합 단위, 캐드헤린 도메인 기반 결합 단위, ICAM 도메인 기반 결합 단위, 티틴 도메인 기반 결합 단위, GCSF-R 도메인 기반 결합 단위, 사이토카인 수용체 도메인 기반 결합 단위, 글리코시다제 억제제 도메인 기반 결합 단위, 슈퍼옥사이드 디스무타제 도메인 기반 결합 단위, 또는 항체 단편 (Fab 또는 scFv 단편) (그의 C-말단 아미노산 서열 영역 내에 아미노산 서열 LPX1TG (SEQ ID NO: 01, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함함) 과 외-분지 항체 단편 (OA-Fc) (이것은 이의 N 말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5) 이 있는 항체 중쇄 Fc 영역 폴리펩티드 및 동족 전장 경쇄와 쌍을 이룬 전장 항체 중쇄를 포함한다
사이의 효소적 접합 반응을 사용하여 제공될 수 있다는 것이 밝혀졌다.
본원에 보고된 방법으로 세포, 예컨대 암 세포의 표면 상에서 발견되는 2 개의 표면 마커에 특이적으로 지정되는, 예를 들어 2-특이적 항체를 맞춤-제작하는 것이 가능하다는 것이 밝혀졌다. 결합 특이성이 출발 성분에 의해 개별적으로 제공되므로, 세포 상에, 예를 들어, 암 세포 상에 존재하는 표면 마커를 결정하고, 효소 절차에 의해 상기 표면 마커 또는 이들의 각각의 리간드에 특이적으로 결합하는 각각의 항체 단편을 접합시킴으로써 간단히 다중특이적 표적 및 결합 분자를 맞춤-제작하는 것이 가능하다. 효소적 접합이 효소 소르타제 A 에 의해 수행되므로, 산출되는 2-특이적 항체는 아미노산 서열 LPX1TG ((SEQ ID NO: 01, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 의 존재를 특징으로 한다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는 2-특이적 항체의 제조 방법이다:
하기 (i) 내지 (iii) 을 인큐베이션하는 단계:
(i) 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPX1TG (SEQ ID NO: 01, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 을 포함하는 첫번째 결합 단위,
(ii) 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 및 항체 중쇄 Fc 영역 폴리펩티드를 포함하는 항체 단편,
전장 항체 중쇄 및 전장 항체 경쇄는 동족 항체 사슬이고 이의 가변 도메인 (VH 및 VL) 의 쌍은 항원 결합 부위를 형성하고,
전장 항체 중쇄 및 항체 중쇄 Fc 영역 폴리펩티드는 항체 힌지 영역을 형성하는 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 서로 공유 연결되고,
항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 그의 N-말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5) 아미노산 서열을 가짐,
및
(iii) 소르타제 A 효소,
및 이에 의해 다중특이적 결합 분자를 제조하는 단계.
본원에 보고되는 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는 다중특이적 결합 분자의 제조 방법이다:
(i) 세포 함유 샘플에 존재하는 세포 표면 마커를 결정하는 단계 및 i) 첫번째 세포 표면 마커 및 두번째 세포 표면 마커를 적어도 선별하는 단계, 또는 ii) 다중특이적 결합 분자의 결합 특이성의 수에 상응하는 다수의 세포 표면 마커를 선별하는 단계,
(ii) (a) 첫번째 세포 표면 마커 또는 이의 리간드에 특이적으로 결합하고, 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPX1TG (SEQ ID NO: 01, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는 첫번째 결합 단위, (b) 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 항체 단편, 전장 항체 중쇄 및 전장 항체 경쇄는 동족 항체 사슬이고 이의 가변 도메인 (VH 및 VL) 의 쌍은 두번째 세포 표면 마커 또는 이의 리간드에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, 전장 항체 중쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 항체 힌지 영역을 형성하는 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로 공유 연결되고, 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 그의 N-말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5) 아미노산 서열을 가짐, 및 (c) 소르타제 A 효소를 인큐베이션하는 단계
및 이에 의해 다중특이적 결합 분자를 제조하는 단계.
본원에 보고되는 하나의 양상은 치료제로서 사용하기 위해, 하기 (a) 내지 (c) 를 인큐베이션함으로써 단일 다중특이적 결합 분자 내에 어셈블된 결합 단위의 수집/라이브러리로부터 2 개 이상의 결합 단위의 선별을 위한 방법이다: (a) 첫번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하고, 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPX1TG (SEQ ID NO: 01, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 을 포함하는 첫번째 결합 단위, (b) 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 항체 단편, 전장 항체 중쇄 및 전장 항체 경쇄는 동족 항체 사슬이고 이의 가변 도메인 (VH 및 VL) 의 쌍은 두번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, 전장 항체 중쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 항체 힌지 영역을 형성하는 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로 공유 연결되고, 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 그의 N-말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5) 아미노산 서열을 가짐, 및 (c) 소르타제 A 효소. 이러한 작용제는 개선된 표적/전달 특성을 갖는다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는 2-특이적 항체의 제조 방법이다:
하기 (i) 내지 (iii) 을 인큐베이션하여:
(i) 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPX1TG (SEQ ID NO: 01, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 을 포함하는 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체,
(ii) 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 외-분지 (one-armed) 항체 단편,
전장 항체 중쇄 및 전장 항체 경쇄는 서로 상보적인 동족 항체 사슬이고 이의 가변 도메인 (VH 및 VL) 의 쌍은 항원 결합 부위를 형성하고,
전장 항체 중쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 항체 힌지 영역을 형성하는 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 서로 공유 연결되고,
항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 그의 N-말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5) 아미노산 서열을 가짐,
및
(iii) 소르타제 A 효소,
2-특이적 항체를 제조하는 단계.
본원에 보고되는 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는 2-특이적 항체의 제조 방법이다:
(i) 세포 함유 샘플에 존재하는 세포 표면 마커를 결정하고 적어도 첫번째 세포 표면 마커 및 두번째 세포 표면 마커를 선별하는 단계,
(ii) (a) 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPX1TG (SEQ ID NO: 01, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체, 상기 Fab 단편 또는 scFv 항체는 첫번째 세포 표면 마커 또는 이의 리간드에 특이적으로 결합함, (b) 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 외-분지 항체 단편, 상기 전장 항체 중쇄 및 전장 항체 경쇄는 서로 상보적인 동족 항체 사슬이고 이의 가변 도메인 (VH 및 VL) 의 쌍은 두번째 세포 표면 마커 또는 이의 리간드에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, 전장 항체 중쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 항체 힌지 영역을 형성하는 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로 공유 연결되고, 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 그의 N-말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5) 아미노산 서열을 가짐, 및 (c) 소르타제 A 효소를 인큐베이션하는 단계
및 이에 의해 2-특이적 항체를 제조하는 단계.
본원에 보고되는 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는 다중특이적 결합 분자에 대한 결합 단위의 조합의 결정 방법이다:
(i) 다수의 다중특이적 결합 분자의 결합 특이성 및/또는 선택성 및/또는 친화성 및/또는 효과기 기능 및/또는 생체 내 반감기를 측정하는 단계, 다수의 다중특이적 결합 분자에는 결합 단위의 각각의 (가능한) 조합이 포함됨,
및
(ii) 적합한 결합 특이성 및/또는 선택성 및/또는 친화성 및/또는 효과기 기능 및/또는 생체 내 반감기를 가진 다중특이적 결합 분자를 선택하여, 항원 결합 부위의 조합을 결정하는 단계.
본원에 보고되는 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는 항원 결합 부위의 조합의 결정 방법이다:
(i) (a) 첫번째 다수의 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체 단편의 각각의 멤버 (각각의 멤버는 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPX1TG (SEQ ID NO: 01, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하고, Fab 단편 또는 scFv 항체는 첫번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합함) 와, (b) 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 다수의 외-분지 항체 단편의 각각의 멤버를 조합함으로써 제조된 다수의 2-특이적 항체의 결합 특이성 및/또는 선택성 및/또는 친화성 및/또는 효과기 기능 및/또는 생체 내 반감기를 결정하는 단계, 전장 항체 중쇄 및 전장 항체 경쇄는 서로 상보적인 동족 항체 사슬이고 이의 가변 도메인 (VH 및 VL) 의 쌍은 두번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, 전장 항체 중쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 항체 힌지 영역을 형성하는 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로 공유 연결되고, 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 그의 N-말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5) 아미노산 서열을 가짐, 및 (c) a 소르타제 A 효소
및
(ii) 적합한 결합 특이성 및/또는 선택성 및/또는 친화성 및/또는 효과기 기능 및/또는 생체 내 반감기를 갖는 2-특이적 항체를 선택하여 항원 결합 부위의 조합을 결정하는 단계.
하나의 구현예에서, 결합 단위는 서로 독립적으로 다르핀 도메인 기반 결합 단위, 안티칼린 도메인 기반 결합 단위, T-세포 수용체 단편 예컨대 scTCR 도메인 기반 결합 단위, 카멜 VH 도메인 기반 결합 단위, 열번째 (tenth) 피브로넥틴 3 도메인 기반 결합 단위, 테나신 도메인 기반 결합 단위, 캐드헤린 도메인 기반 결합 단위, ICAM 도메인 기반 결합 단위, 티틴 도메인 기반 결합 단위, GCSF-R 도메인 기반 결합 단위, 사이토카인 수용체 도메인 기반 결합 단위, 글리코시다제 억제제 도메인 기반 결합 단위, 슈퍼옥사이드 디스무타제 도메인 기반 결합 단위, 또는 항체 단편, 예컨대 Fab 또는 scFv 단편으로부터 선택된다.
모든 양상의 하나의 구현예에서 다중특이적 결합 분자는 2-특이적 항체이고, 및/또는 첫번째 결합 단위는 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체이다.
하나의 구현예에서, 조합은 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체 단편 및 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 항체 단편을, 소르타제 A 효소와 인큐베이션하는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서, Fab 단편 또는 scFv 항체 단편은 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPX1TG (SEQ ID NO: 01, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 외-분지 항체 단편의 전장 항체 중쇄 및 전장 항체 경쇄는 동족 항체 사슬이고 이의 가변 도메인 (VH 및 VL) 의 쌍은 두번째 표면 마커에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, 전장 항체 중쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 항체 힌지 영역을 형성하는 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 서로 공유 연결되고, 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 그의 N-말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5) 아미노산 서열을 갖는다.
모든 양상의 하나의 구현예에서, 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체는 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 GnSLPX1TG (SEQ ID NO: 02, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, n = 1, 2 또는 3 임) 을 포함한다.
모든 양상의 하나의 구현예에서, 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체는 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 GSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 03, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 을 포함한다.
모든 양상의 하나의 구현예에서, 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체는 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 GGGSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 04, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 을 포함한다.
모든 양상의 하나의 구현예에서, 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체는 아미노산 서열 X2GSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 05, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 을 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 포함하고, 이 때 X2 는 G 를 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있다.
모든 양상의 하나의 구현예에서, 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체는 아미노산 서열 GnSLPX1TGGSGSX3 (SEQ ID NO: 06, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, n=1, 2 또는 3 임) 을 20 개의 C 말단 아미노산 잔기 내에 포함하고, 이 때 X3 은 아미노산 서열 태그이다.
모든 양상의 하나의 구현예에서, 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체는 아미노산 서열 X2GSLPX1TGGSGSX3 (SEQ ID NO: 07, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 을 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 포함하고, 이 때 X2 는 G 를 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X3 은 아미노산 서열 태그이다.
모든 양상의 하나의 구현예에서, 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 그의 N-말단에서 2 개의 글라이신 잔기를 포함한다.
모든 양상의 하나의 구현예에서, 외-분지 항체 단편은 아미노산 서열 GGCPX4C (SEQ ID NO: 08) 를 그의 중쇄의 N-말단에 포함하고, 이 때 X4 는 S 또는 P 이다.
모든 양상의 하나의 구현예에서 X1 은 E 이다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 본원에 보고된 방법에 의해 수득된 다중특이적 결합 분자이다.
하나의 양상은 그의 중쇄 중 하나에 아미노산 서열 LPX1TG (SEQ ID NO: 01, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는 다중특이적 결합 분자이다.
하나의 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 그의 중쇄 중 하나에 아미노산 서열 GnSLPX1TG (SEQ ID NO: 02, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, n = 1, 2 또는 3 임) 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 그의 중쇄 중 하나에 아미노산 서열 GnSLPX1TGGCPX4C (SEQ ID NO: 09, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X4 는 S 또는 P 일 수 있고, n = 1, 2 또는 3 임) 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 그의 중쇄 중 하나에 아미노산 서열 X2GSLPX1TGGCPX4C (SEQ ID NO: 10, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X4 는 S 또는 P 일 수 있음) 를 포함하고, 이 때 X2 는 G 를 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 본원에 보고된 방법에 의해 수득된 2-특이적 항체이다.
하나의 양상은 그의 중쇄 중 하나에 아미노산 서열 LPX1TG (SEQ ID NO: 01, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는 2-특이적 항체이다.
하나의 구현예에서, 2-특이적 항체는 그의 중쇄 중 하나에 아미노산 서열 GnSLPX1TG (SEQ ID NO: 02, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, n=1, 2 또는 3 임) 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 2-특이적 항체는 그의 중쇄 중 하나에 아미노산 서열 GnSLPX1TGGCPX4C (SEQ ID NO: 09, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X4 는 S 또는 P 일 수 있고, n = 1, 2 또는 3 임) 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 2-특이적 항체는 그의 중쇄 중 하나에 아미노산 서열 X2GSLPX1TGGCPX4C (SEQ ID NO: 10, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X4 는 S 또는 P 일 수 있음) 를 포함하고, 이 때 X2 는 G 를 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 본원에 보고된 다중특이적 결합 분자를 포함하는 약학 조성물이다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 의약의 제조에서의 본원에 보고된 다중특이적 결합 분자의 용도이다.
하나의 구현예에서, 의약은 암의 치료를 위한 것이다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 본원에 보고된 다중특이적 결합 분자의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 가지고 있는 개체의 치료 방법이다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 본원에 보고된 다중특이적 결합 분자의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 세포를 파괴하기 위한 방법이다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 본원에 보고된 2-특이적 항체를 포함하는 약학 조성물이다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 의약의 제조에서의 본원에 보고된 2-특이적 항체의 용도이다.
하나의 구현예에서, 의약은 암의 치료를 위한 것이다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 본원에 보고된 2-특이적 항체의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 가진 개체의 치료 방법이다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 본원에 보고된 2-특이적 항체의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 세포를 파괴하기 위한 방법이다. 본원에 보고된 모든 양상의 하나의 구현예에서 Fc-영역은 인간 Fc-영역 또는 이의 변이체이다.
하나의 구현예에서, 인간 항체 Fc-영역은 인간 IgG1 서브클래스, 또는 인간 IgG2 서브클래스, 또는 인간 IgG3 서브클래스, 또는 인간 IgG4 서브클래스의 것이다.
하나의 구현예에서, 항체 Fc-영역은 인간 IgG1 서브클래스, 또는 인간 IgG4 서브클래스의 인간 항체 Fc-영역이다.
하나의 구현예에서, 인간 항체 Fc-영역은 하기 아미노산 위치 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322, 329, 및/또는 331 중 하나 이상에서 상이한 잔기로의 자연 발생적 아미노산 잔기의 돌연변이를 포함하고, 항체 Fc-영역 내의 잔기는 Kabat 의 EU 인덱스에 따라 번호지정된다.
하나의 구현예에서, 인간 항체 Fc-영역은 위치 329 에서 자연 발생적 아미노산 잔기의 돌연변이 및 위치 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322 및 331 에서 아미노산 잔기를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기의 상이한 잔기로의 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함하고, Fc-영역 내의 잔기는 Kabat 의 EU 인덱스에 따라 번호지정된다. 상기 특정 아미노산 잔기의 변화는 비-개질된 (야생형) Fc-영역과 비교해 Fc-영역의 효과기 기능을 변화시키는 결과를 낳는다.
하나의 구현예에서, 인간 항체 Fc-영역은 상응하는 야생형 IgG Fc-영역을 포함하는 접합체와 비교해 인간 FcγRIIIA, 및/또는 FcγRIIA, 및/또는 FcγRI 에 대한 감소된 친화성을 갖는다.
하나의 구현예에서, 인간 항체 Fc-영역 내 위치 329 에서 아미노산 잔기는 글라이신, 또는 아르기닌, 또는 Fc 영역 내에 프롤린 샌드위치를 파괴할 정도로 충분히 큰 아미노산 잔기로 치환된다.
하나의 구현예에서, 자연 발생적 아미노산 잔기의 인간 항체 Fc-영역 내 돌연변이는 S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, P329G, 및/또는 P331S 중 하나 이상이다.
하나의 구현예에서, 돌연변이는 항체 Fc-영역이 인간 IgG1 서브클래스의 것인 경우 L234A 및 L235A 이거나, 또는 항체 Fc-영역이 인간 IgG4 서브클래스의 것인 경우 S228P 및 L235E 이다.
하나의 구현예에서, 항체 Fc-영역은 돌연변이 P329G 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체 Fc-영역은 제 1 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 내에 돌연변이 T366W 를, 제 2 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 를 포함하고, 번호지정은 Kabat 의 EU 인덱스에 따른다.
하나의 구현예에서, 항체 Fc-영역은 제 1 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 내에 돌연변이 S354C 를, 제 2 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 내에 돌연변이 Y349C 를 포함한다.
I. 정의
본 명세서 및 청구항에서 면역글로불린 중쇄 Fc-영역 내의 잔기의 번호지정은 Kabat 의 EU 인덱스에 따른다 (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91 3242, 본원에 참조로 명백히 포함됨).
용어 "변경" 은 변이체 항체 또는 융합 폴리펩티드를 수득하는, 예를 들어, 항체 또는 적어도 Fc-영역의 FcRn 결합 부분을 포함하는 융합 폴리펩티드의, 부모 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이, 부가, 또는 결실을 의미한다.
용어 "아미노산 돌연변이" 는 부모 아미노산 서열의 아미노산 서열 내의 수식을 의미한다. 예시적 수식은 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함한다. 하나의 구현예에서 아미노산 돌연변이는 치환이다. 용어 "위치에서의 아미노산 돌연변이" 는 명시된 잔기의 치환 또는 결실, 또는 명시된 잔기에 인접한 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입을 의미한다. 용어 "명시된 잔기에 인접한 삽입" 은 그의 1 개 내지 2 개의 잔기 내의 삽입을 의미한다. 삽입은 명시된 잔기의 N-말단 또는 C-말단에 있을 수 있다.
용어 "아미노산 치환" 은 소정의 부모 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 상이한 "대체" 아미노산 잔기로의 대체를 의미한다. 대체 잔기 또는 잔기들은 "자연 발생적 아미노산 잔기" (즉, 유전 부호에 의해 인코딩됨) 일 수 있고, 하기로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다: 알라닌 (Ala); 아르기닌 (Arg); 아스파라긴 (Asn); 아스파르트산 (Asp); 시스테인 (Cys); 글루타민 (Gln); 글루탐산 (Glu); 글라이신 (Gly); 히스티딘 (His); 이소류신 (Ile): 류신 (Leu); 라이신 (Lys); 메티오닌 (Met); 페닐알라닌 (Phe); 프롤린 (Pro); 세린 (Ser); 트레오닌 (Thr); 트립토판 (Trp); 티로신 (Tyr); 및 발린 (Val). 하나의 구현예에서 대체 잔기는 시스테인이 아니다. 하나 이상의 비-자연 발생적 아미노산 잔기에 의한 치환이 또한 본원에서 아미노산 치환의 정의에 포함된다. "비-자연 발생적 아미노산 잔기" 는 폴리펩티드 사슬 내의 인접한 아미노산 잔기(들)에 공유 결합할 수 있는, 위에 열거된 자연 발생적 아미노산 잔기 이외의, 잔기를 의미한다. 비-자연 발생적 아미노산 잔기의 예는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린, 아이브 (aib) 및 기타 아미노산 잔기 유사체 예컨대 Ellman, et al., Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336 에 기재된 것을 포함한다. 그러한 비-자연 발생적 아미노산 잔기를 생성하기 위해, Noren, et al. (Science 244 (1989) 182) 및/또는 Ellman, et al. (상기) 의 절차가 사용될 수 있다. 간략히, 이들 절차는 비-자연 발생적 아미노산 잔기에 의한 억제 tRNA 의 화학적 활성화 이후, RNA 의 시험관내 전사 및 번역을 수반한다. 비-자연 발생적 아미노산은 또한 화학적 펩티드 합성 및 이들 펩티드와 재조합적으로 생산된 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 항체 분절의 후속 융합을 통해 펩티드 내로 통합될 수 있다.
용어 "아미노산 삽입" 은 소정의 부모 아미노산 서열 내로의 하나 이상의 부가적 아미노산 잔기의 통합을 의미한다. 삽입은 통상적으로 1 개 또는 2 개의 아미노산 잔기의 삽입으로 이루어질 것이지만, 본 출원은 더 큰 "펩티드 삽입", 예를 들어, 약 3 개 내지 약 5 개 또는 심지어는 약 10 개 이하의 아미노산 잔기의 삽입을 고려한다. 삽입된 잔기(들)은 위에 정의된 바와 같이 자연 발생적 또는 비-자연 발생적일 수 있다.
용어 "아미노산 결실" 은 아미노산 서열 내의 소정의 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 제거를 의미한다.
이 출원에서 아미노산 변경이 언급될 때마다, 그것은 의도적 아미노산 변경이지, 무작위 아미노산 수식이 아니다.
용어 "아미노산 서열 태그" 는 특이적 결합 특성을 갖는 펩티드 결합을 통해 서로 연결된 아미노산 잔기의 서열을 의미한다. 하나의 구현예에서 아미노산 서열 태그는 친화도 또는 정제 태그이다. 하나의 구현예에서 아미노산 서열 태그는 Arg-태그, His-태그, Flag-태그, 3xFlag-태그, Strep-태그, Nano-태그, SBP-태그, c-myc-태그, S-태그, 칼모듈린-결합-펩티드, 셀룰로오스-결합-도메인, 키틴-결합-도메인, GST-태그, 또는 MBP-태그로부터 선택된다. 하나의 구현예에서 아미노산 서열 태그는 SEQ ID NO: 11 (RRRRR), 또는 SEQ ID NO: 12 (RRRRRR), 또는 SEQ ID NO: 13 (HHHHHH), 또는 SEQ ID NO: 14 (KDHLIHNVHKEFHAHAHNK), 또는 SEQ ID NO: 15 (DYKDDDDK), 또는 SEQ ID NO: 16 (DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK), 또는 SEQ ID NO: 17 (AWRHPQFGG), 또는 SEQ ID NO: 18 (WSHPQFEK), 또는 SEQ ID NO: 19 (MDVEAWLGAR), 또는 SEQ ID NO: 20 (MDVEAWLGARVPLVET), 또는 SEQ ID NO: 21 (MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP), 또는 SEQ ID NO: 22 (EQKLISEEDL), 또는 SEQ ID NO: 23 (KETAAAKFERQHMDS), 또는 SEQ ID NO: 24 (KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL), 또는 SEQ ID NO: 25 (셀룰로오스 결합 도메인), 또는 SEQ ID NO: 26 (셀룰로오스 결합 도메인), 또는 SEQ ID NO: 27 (TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEP SNVPALWQLQ), 또는 SEQ ID NO: 28 (GST-태그), 또는 SEQ ID NO: 29 (MBP-태그) 로부터 선택된다.
용어 "항체 분절" 은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 의미한다. 항체 분절의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 분절로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 그에 제한되지 않는다.
항체 단편에는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 기타 단편이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 항체 단편의 리뷰를 위해, Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134 를 참조한다. scFv 단편의 리뷰를 위해, 예를 들어, Plueckthun, A., In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315 를 참조하고; 또한 WO 93/16185; US 5,571,894 및 US 5,587,458 을 참조한다. 구조 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체 내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해서는, US 5,869,046 을 참조한다.
다이아바디는 2-원자가 또는 2-특이적일 수 있는 2 개의 항원-결합 부위를 가진 항체 단편이다. 예를 들어, EP 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; 및 Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디가 또한 Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134) 에 기재된다.
단일-도메인 항체는 중쇄 가변 도메인의 모두 또는 일부 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 모두 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, 미국 특허 번호 6,248,516 B1 을 참조한다).
항체 단편은 온전한 항체의 단백질가수분해 소화 뿐 아니라 본원에 기재된 바와 같은 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 대장균 (E. coli) 또는 파지) 에 의한 생성을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기법에 의해 제조될 수 있다.
용어 "2-특이적 항체" 는 첫번째 항원 또는 에피토프 및 두번째 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 분자를 의미하며, 이 때 첫번째 항원 또는 에피토프는 두번째 항원 또는 에피토프와 상이하다.
2-특이적 항체 형태는 예를 들어, WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792, 및 WO 2010/145793 에 기재되어 있다.
용어 "항체-의존적 세포-매개되는 세포독성", 약어 "ADCC" 는 FcR 을 발현하는 비-항원 특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 살해 세포 (NK 세포), 호중구, 및 대식세포) 가 면역글로불린 Fc-영역에 결합함으로써 표적 세포를 인지하고, 후속적으로 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개되는 반응이다. ADCC 을 매개하는 1 차 세포인, NK 세포는 오직 FcγRIII 만을 발현하지만, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현이 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492 의 464 페이지의 표 3 에 요약되어 있다.
용어 "항체-의존적 세포성 식세포작용", 약어 "ADCP" 는 면역글로불린 Fc-영역에 결합하는 식균 면역 세포 (예를 들어, 마크로파지, 호중구, 또는 수지상 세포) 에 의해 항체-코팅된 세포가, 전체적으로 또는 부분적으로, 내부화되는 과정을 의미한다.
용어 "Fc 수용체에 결합하는" 은, 예를 들어, BIAcore(R) 검정 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden) 에서, Fc 수용체에 대한 Fc-영역의 결합을 의미한다.
BIAcore(R) 검정에서 Fc 수용체는 표면에 결합되어 있고, 분석물, 예를 들어, 융합 폴리펩티드를 포함하는 Fc-영역 또는 항체의 결합은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 에 의해 측정된다. 결합의 친화도는 용어 ka (연합 상수: Fc-영역/Fc 수용체 복합체를 형성하는 Fc-영역 융합 폴리펩티드 또는 접합체의 연합에 대한 속도 상수), kd (해리 상수; Fc-영역/Fc 수용체 복합체로부터의 Fc-영역 융합 폴리펩티드 또는 접합체의 해리에 대한 속도 상수), 및 KD (kd/ka) 에 의해 정의된다. 대안적으로, SPR 센서그램의 결합 신호는, 공명 신호 높이 및 해리 거동에 관하여, 레퍼런스의 응답 신호와 직접 비교될 수 있다.
용어 "C1q" 는 면역글로불린의 Fc-영역에 대한 결합 자리를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. C1q 는 2 개의 세린 프로테아제, C1r 및 C1s 와 함께, 보체 의존적 세포독성 (CDC) 경로의 제 1 성분인, 복합체 C1 을 형성한다. 인간 C1q 는, 예를 들어, Quidel, San Diego, Calif 로부터 구입할 수 있다.
용어 "CH2 도메인" 은 대략적으로 EU 위치 231 에서부터 EU 위치 340 (Kabat 에 따른 EU 번호지정 시스템) 까지 이르는 항체 중쇄 폴리펩티드의 부분을 의미한다. 하나의 구현예에서 CH2 도메인은:
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQESTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK (SEQ ID NO: 30) 의 아미노산 서열을 갖는다. CH2 도메인은 또다른 도메인과 가까이에서 짝을 이루고 있지 않다는 점에서 독특하다. 대신에, 2 개의 N-연결된 분지형 탄화수소 사슬이 온전한 선천 Fc-영역의 2 개의 CH2 도메인 사이에 끼어 들어가 있다. 상기 탄수화물은 도메인-도메인 짝짓기를 대체하고 CH2 도메인 안정화를 도울 수 있다고 추측되어 왔다 (Burton, Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206).
용어 "CH3 도메인" 은 대략적으로 EU 위치 341 에서부터 EU 위치 446 까지 이르는 항체 중쇄 폴리펩티드의 부분을 의미한다. 하나의 구현예에서 CH3 도메인은:
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 31) 의 아미노산 서열을 갖는다.
용어 항체의 "클래스" 는 그것의 중쇄에 의해 보유되는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 의미한다. 인간에서는 항체의 5 가지 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 가 존재하고, 이들 중 여럿은 서브클래스 (동형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ 로 호칭된다.
용어 "보체-의존적 세포독성", 약어 "CDC" 는 표적-결합된 Fc-영역 융합 폴리펩티드 또는 접합체의 Fc-영역이 표적 세포 막 내에 구멍을 형성하는 것으로 끝이 나는 일련의 효소 반응을 활성화시키는 세포 사망을 유도하는 메카니즘을 의미한다. 전형적으로, 항원-항체 복합체 예컨대 항체-코팅된 표적 세포 상의 항원-항체 복합체는 보체 성분 C1q 에 결합하여 활성화시키고, 이는 결국 보체 캐스케이드를 활성화시켜 표적 세포 사망을 초래한다. 보체의 활성화는 또한 표적 세포 표면에 보체 성분의 침전을 초래하여, 백혈구 상의 보체 수용체 (예를 들어, CR3) 에 결합함으로써 ADCC 또는 ADCP 를 촉진할 수 있다.
용어 "효과기 기능" 은 항체의 Fc-영역에 기인하는 생물학적 활성이며, 항체 서브클래스에 따라 다르다. 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개되는 세포독성 (ADCC); 식세포작용 (ADCP); 세포 표면 수용체 (예를 들어, B-세포 수용체) 의 하향조절; 및 B-세포 활성화. 그러한 기능은, 예를 들어, 식균 또는 용균 활성을 갖는 면역 세포 상의 Fc 수용체에 대한 Fc-영역의 결합에 의해, 또는 보체계의 성분들에 대한 Fc-영역의 결합에 의해 달성될 수 있다.
작용제, 예를 들어, 약학 조성물의 "유효량" 은 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위한, 필요한 용량 및 시간 기간 동안의 유효량을 말한다.
용어 "감소된 효과기 기능" 은 대조군 분자 (예를 들어 야생형 Fc-영역을 갖는 폴리펩티드) 와 비교하여, 분자와 연관되는 특정 효과기 기능, 예컨대 예를 들어 ADCC 또는 CDC 의 20 % 이상의 감소를 의미한다. 용어 "크게 감소된 효과기 기능" 은 대조군 분자와 비교하여, 분자와 연관되는 특정 효과기 기능, 예컨대 예를 들어 ADCC 또는 CDC 의 50 % 이상의 감소를 의미한다.
용어 "Fc-영역" 은 면역글로불린의 C-말단 영역을 의미한다. Fc-영역은 2 개의 디설파이드-연결된 항체 중쇄 단편 (중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 사슬) 을 포함하는 이합체 분자이다. Fc-영역은 온전한 (전장) 항체의 파파인 소화, 또는 IdeS 소화, 또는 트립신 소화에 의해 생성될 수 있거나 재조합적으로 생산될 수 있다.
전장 항체 또는 면역글로불린으로부터 수득가능한 Fc-영역은 적어도 전장 중쇄의 잔기 226 (Cys) 에서 C-말단까지를 포함하고, 따라서, 힌지 영역의 일부 및 2 개 또는 3 개의 불변 도메인, 즉, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 IgE 및 IgM 클래스 항체 상의 부가적/추가의 CH4 도메인을 포함한다. US 5,648,260 및 US 5,624,821 로부터 Fc-영역 내의 정의된 아미노산 잔기의 수식은 표현형 효과를 초래하는 것이 알려져 있다.
2 개의 동일한 또는 동일하지 않은 항체 중쇄 단편을 포함하는 이합체 Fc-영역의 형성은 포함된 CH3 도메인의 비-공유적 이합체화에 의해 매개된다 (관여하는 아미노산 잔기에 대해 예를 들어, Dall'Acqua, Biochem. 37 (1998) 9266-9273 참고). Fc-영역은 힌지 영역 내의 디설파이드 결합의 형성에 의해 공유적으로 안정화된다 (예를 들어, Huber, et al., Nature 264 (1976) 415-420; Thies, et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 67-79 참고). CH3-CH3 도메인 상호작용의 이합체화를 파괴하기 위한 CH3 도메인 내의 아미노산 잔기 변화의 도입은 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 결합에 악영향을 미치지 않는데, 그 이유는 CH3-CH3-도메인 이합체화 관여 잔기는 CH3 도메인의 내부 경계면에 위치하지만, Fc-영역-FcRn 상호작용에 관여하는 잔기는 CH2-CH3 도메인의 외부에 위치하기 때문이다.
Fc-영역의 효과기 기능과 연관되는 잔기는 힌지 영역, CH2, 및/또는 CH3 도메인 내에 위치하며, 이는 전장 항체 분자에 대해 확인되었다. Fc-영역 연관되는/매개되는 기능은 다음과 같다:
(i) 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC),
(ii) 보체 (C1q) 결합, 활성화 및 보체-의존적 세포독성 (CDC),
(iii) 항원-항체 복합체의 식세포작용/제거,
(iv) 경우에 따라 사이토카인 방출, 및
(v) 항체 및 항원-항체 복합체의 반감기/제거 속도.
Fc-영역 연관되는 효과기 기능은 Fc-영역과 효과기 기능 특이적 분자 또는 수용체의 상호작용에 의해 개시된다. 주로 IgG1 서브클래스의 항체는 수용체 활성화를 달성할 수 있지만, IgG2 및 IgG4 서브클래스의 항체는 효과기 기능을 갖지 않거나 제한된 효과기 기능을 갖는다.
효과기 기능 유발 수용체는 Fc 수용체 유형 (및 하위-유형) FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 이다. IgG1 서브클래스와 연관되는 효과기 기능은 FcγR 및 C1q 결합에 관여하는, 하부 힌지 영역, 예컨대 L234A 및/또는 L235A 에 특정 아미노산 변화를 도입함으로써 감소될 수 있다. 또한, 특히 CH2 및/또는 CH3 도메인 내에 위치하는, 특정 아미노산 잔기는 혈류 내의 항체 분자 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드의 순환 반감기와 연관된다. 순환 반감기는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 에 대한 Fc-영역의 결합에 의해 결정된다.
Fc-영역 당구조 (glycostructure) 상에 존재하는 시알릴 잔기는 Fc-영역의 항-염증 매개되는 활성에 관여한다 (예를 들어, Anthony, R.M., et al. Science 320 (2008) 373-376 참고).
항체의 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 번호지정은 Kabat 의 EU 인덱스에 따른다 (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91 3242).
용어 "인간 Fc-영역" 은 적어도 힌지 영역의 일부, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 함유하는 인간 기원의 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 의미한다. 하나의 구현예에서, 인간 IgG 항체 중쇄 Fc-영역은 약 Glu216, 또는 약 Cys226, 또는 약 Pro230 에서부터, 중쇄의 카르복실-말단까지 이른다. 그러나, 항체 Fc-영역의 C-말단 라이신 (Lys447) 은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다.
용어 "변이체 Fc-영역" 은 하나 이상의 "아미노산 변경/돌연변이" 에 의해 "선천" 또는 "야생형" Fc-영역 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 의미한다. 하나의 구현예에서 변이체 Fc-영역은 선천 Fc-영역 또는 부모 폴리펩티드의 Fc-영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 예를 들어, 약 1 개 내지 약 10 개의 아미노산 돌연변이를 갖고, 하나의 구현예에서 선천 Fc-영역 또는 부모 폴리펩티드의 Fc-영역 내에 약 1 개 내지 약 5 개의 아미노산 돌연변이를 갖는다. 하나의 구현예에서 (변이체) Fc-영역은 야생형 Fc-영역 및/또는 부모 폴리펩티드의 Fc-영역과 약 80 % 이상의 상동성을 갖고, 하나의 구현예에서 변이체 Fc-영역은 약 90 % 상동성의 상동성을 갖고, 하나의 구현예에서 변이체 Fc-영역은 약 95 % 이상의 상동성을 갖는다.
본원에서 보고되는 변이체 Fc-영역은 함유되어 있는 아미노산 변경에 의해 정의된다. 따라서, 예를 들어, 용어 P329G 는 부모 (야생형) Fc-영역과 비교하여 아미노산 위치 329 에서 프롤린이 글라이신으로 돌연변이된 변이체 Fc-영역을 의미한다. 야생형 아미노산의 실체는 불특정 상태일 수 있고, 그러한 경우에 앞서 언급된 변이체는 329G 로 언급된다. 본 발명에서 논의되는 모든 위치에 대해, 번호지정은 EU 인덱스에 따른다. EU 인덱스 또는 Kabat 또는 EU 번호지정 규약에서와 같은 EU 인덱스는 EU 항체의 번호지정을 언급한다 (Edelman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85, 전문이 본원에 참조로 포함됨). 변경은 부가, 결실, 또는 돌연변이일 수 있다. 용어 "돌연변이" 는 자연 발생적 아미노산에 대한 변화 뿐만 아니라 비-자연 발생적 아미노산에 대한 변화를 의미하며, 예를 들어, US 6,586,207, WO 98/48032, WO 03/073238, US 2004/0214988, WO 2005/35727, WO 2005/74524, Chin, J.W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 9026-9027; Chin, J.W. and Schultz, P.G., ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137; Chin, J.W., et al., PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024; 및, Wang, L. and Schultz, P.G., Chem. (2002) 1-10 (모두 전문이 본원에 참조로 포함됨) 을 참고한다.
IgG1 서브클래스의 야생형 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 32).
돌연변이 L234A, L235A 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 33).
T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 34).
T366W 돌연변이를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 35).
L234A, L235A 및 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 36).
L234A, L235A 및 T366W 돌연변이를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 37).
P329G 돌연변이를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 38).
L234A, L235A 및 P329G 돌연변이를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 39).
P239G 및 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 40).
P329G 및 T366W 돌연변이를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 41).
L234A, L235A, P329G 및 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 42).
L234A, L235A, P329G 및 T366W 돌연변이를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 43).
IgG4 서브클래스의 야생형 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
CPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 44).
S228P 및 L235E 돌연변이를 갖는 IgG4 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
CPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 45).
S228P, L235E 및 P329G 돌연변이를 갖는 IgG4 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
CPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 46).
용어 "Fc 수용체", 약어 "FcR" 은 Fc-영역에 결합하는 수용체를 의미한다. 하나의 구현예에서 FcR 은 선천 서열 인간 FcR 이다. 더욱이, 하나의 구현예에서 FcR 은 IgG 항체에 결합하는 FcR (Fc 감마 수용체) 이고, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를, 대립유전자 변이체 및 대안적으로 그의 스플라이싱된 형태 (spliced form) 를 포함하여, 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("저해 수용체") 를 포함하고, 이들은 주로 그의 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA 는 그것의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM) 를 함유한다. 저해 수용체 FcγRIIB 는 그것의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기반 저해 모티프 (ITIM) 를 함유한다 (예를 들어, Daeron, M., Annu. Rev. Immunol. 15 (1997) 203-234 참조). FcR 은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492, Capel, et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34, de Haas, et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341 에서 리뷰되어 있다. 그 밖의 FcR 은, 장래에 식별될 것들을 포함하여, 본원에서의 용어 "FcR" 에 포괄된다. 상기 용어는 또한 신생아 수용체, FcRn 을 포함하며, 이는 어머니 IgG 의 태아로의 전달을 책임진다 (예를 들어, Guyer, et al., J. Immunol. 117 (1976) 587; Kim, et al., J. Immunol. 24 (1994) 249 참고).
용어 "Fc 감마 수용체", 약어 "FcγR" 은 IgG 항체 Fc-영역에 결합하는 단백질의 패밀리의 임의의 일원을 의미하고, FcγR 유전자에 의해 인코딩된다. 인간에서 이러한 패밀리는 FcγRI (CD64) [동형 (isoform) FcγRIA, FcγRIB, 및 FcγRIC 를 포함함], FcγRII (CD32) [동형 FcγRIIA (동종이인자형 H131 및 R131 을 포함함), FcγRIIB (FcγRIIB-1 및 FcγRIIB-2 를 포함함), 및 FcγRIIC 를 포함함], 및 FcγRIII (CD16) [동형 FcγRIIIA (동종이인자형 V158 및 F158 을 포함함) 및 FcγRIIIB (동종이인자형 FcγRIIB-NA1 및 FcγRIIB-NA2 를 포함함) 를 포함함] (예를 들어, Jefferis, et al., Immunol. Lett. 82 (2002) 57-65 참고, 전문이 참조로 포함됨), 뿐만 아니라 임의의 발견되지 않은 인간 FcγR 또는 FcγR 동형 또는 동종이인자형을 포함하나 그에 제한되지 않는다. FcγR 은, 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 및 원숭이를 포함하나 그에 제한되지 않는, 임의의 유기체에서 기원할 수 있다. 마우스 FcγR 은 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16), 및 FcγRIII-2 (CD16-2), 뿐만 아니라 임의의 발견되지 않은 마우스 FcγR 또는 FcγR 동형 또는 동종이인자형을 포함하나 그에 제한되지 않는다. Fc-영역-FcγR 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기는 234-239 (하부 힌지 영역), 265-269 (B/C 루프), 297-299 (D/E 루프), 및 327-332 (F/G) 루프이다 (Sondermann, et al., Nature 406 (2000) 267-273). FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, 및/또는 FcγRIIIA 에 대한 감소된 결합/친화도를 초래하는 아미노산 돌연변이는 N297A (부수적으로 감소된 면역원성 및 연장된 반감기 결합/친화도와 함께) (Routledge, et al., Transplantation 60 (1995) 847; Friend, et al., Transplantation 68 (1999) 1632; Shields, et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604), 잔기 233-236 (Ward and Ghetie, Ther. Immunol. 2 (1995) 77; Armour, et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624) 를 포함한다. 일부 예시적 아미노산 치환이 US 7,355,008 및 US 7,381,408 에 기재되어 있다.
용어 "신생아 Fc 수용체", 약어 "FcRn" 은 IgG 항체 Fc-영역에 결합하는 단백질을 의미하고, 적어도 부분적으로 FcRn 유전자에 의해 인코딩된다. FcRn 은 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 및 원숭이를 포함하나 그에 제한되지 않는 임의의 유기체에서 기원할 수 있다. 기술분야에서 알려져 있는 바와 같이, 기능적 FcRn 단백질은, 흔히 중쇄 및 경쇄로 언급되는, 2 개의 폴리펩티드를 포함한다. 경쇄는 베타-2-마이크로글로불린이고, 중쇄는 FcRn 유전자에 의해 인코딩된다. 본원에서 다르게 언급되지 않으면, FcRn 또는 FcRn 단백질은 FcRn 중쇄와 베타-2-마이크로글로불린의 복합체를 언급한다. Fc-영역과 FcRn 의 상호작용 아미노산 잔기는 CH2 및 CH3 도메인의 연결지점 (junction) 근처에 있다. Fc-영역-FcRn 접촉 잔기는 모두 단일 IgG 중쇄 내에 있다. 관여하는 아미노산 잔기는 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311, 및 314 (모두 CH2 도메인 내) 및 아미노산 잔기 385-387, 428, 및 433-436 (모두 CH3 도메인 내) 이다. FcRn 에 대한 증가된 결합/친화도를 초래하는 아미노산 돌연변이는 T256A, T307A, E380A, 및 N434A 를 포함한다 (Shields, et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).
용어 "전장 항체" 는 선천 항체 구조와 실질적으로 동일한 구조 및 아미노산 서열을 갖는 항체 뿐만 아니라 본원에서 보고되는 Fc-영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다.
용어 "전장 항체 중쇄" 는 N- 에서 C-말단 방향으로 항체 가변 도메인, 제 1 불변 도메인, 항체 중쇄 힌지 영역, 제 2 불변 도메인, 및 제 3 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다.
용어 "항체 중쇄 Fc-영역" 은 항체 중쇄 힌지 영역, 제 1 불변 도메인, 및 제 2 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다.
용어 "전장 항체 경쇄" 는 N- 에서 C-말단 방향으로 항체 가변 도메인 및 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다.
용어 "힌지 영역" 은 야생형 항체 중쇄 내에서 CH1 도메인 및 CH2 도메인을 연결하는 항체 중쇄 폴리펩티드의 부분, 예를 들어 Kabat 의 EU 번호 시스템에 따른 위치 216 근처에서부터 위치 230 근처까지, 또는 Kabat 의 EU 번호 시스템에 따른 위치 226 근처에서부터 위치 230 근처까지를 의미한다. 그 밖의 IgG 서브클래스의 힌지 영역은 IgG1 서브클래스 서열의 힌지-영역 시스테인 잔기와 나란히 정렬시킴으로써 확인될 수 있다.
힌지 영역은 보통 동일한 아미노산 서열을 갖는 2 개의 폴리펩티드로 이루어지는 이합체 분자이다. 힌지 영역은 일반적으로 약 25 아미노산 잔기를 포함하고, 유연하여 항원 결합 영역이 독립적으로 움직이는 것을 허용한다. 힌지 영역은 3 개의 도메인으로 하위분류될 수 있다: 상부, 중간, 및 하부 힌지 도메인 (예를 들어, Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083 참고).
용어 Fc-영역의 "하부 힌지 영역" 은 힌지 영역의 바로 C-말단에 있는 아미노산 잔기의 스트레치 (stretch), 즉, Kabat 의 EU 번호지정에 따른 Fc-영역의 잔기 233 내지 239 를 의미한다.
용어 "야생형 Fc-영역" 은 자연에서 발견되는 Fc-영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 의미한다. 야생형 인간 Fc-영역은 선천 인간 IgG1 Fc-영역 (비-A 및 A 동종이인자형), 선천 인간 IgG2 Fc-영역, 선천 인간 IgG3 Fc-영역, 및 선천 인간 IgG4 Fc-영역 뿐만 아니라 그의 자연 발생적 변이체를 포함한다.
용어 "개체" 또는 "대상" 은 포유류를 의미한다. 포유류에는 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 랫트) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구현예에서, 개체 또는 대상은 인간이다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성" 은 서열을 정렬하고, 갭을 도입하여 (필요한 경우) 최대 퍼센트 서열 동일성을 획득하고, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 후의 기준 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당해 기술분야의 통상의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 획득하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열 정렬에 적당한 파라미터를 결정할 수 있다. 본원에서의 목적을 위해, 그러나, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2 를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 저작자가 Genentech, Inc. 이고, 소스 코드는 사용자 문서와 함께 미국 저작권청 (U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559) 에 제출되었고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc., South San Francisco, California 로부터 공개적으로 입수가능하고, 또는 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지탈 UNIX V4.0D 를 포함하는, UNIX 운영 체제에서 사용하기 위해 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 다르지 않다.
ALIGN-2 가 아미노산 서열 비교에 이용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B 와의, 또는 그에 대한 주어진 아미노산 서열 A 의 % 아미노산 서열 동일성 (이는 대안적으로 주어진 아미노산 서열 B 와의, 또는 그에 대한 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖는 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A 로서 표현될 수 있음) 은 다음과 같이 계산된다:
100 곱하기 분수 X/Y
여기서, X 는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 에 의해 그 프로그램의 A 및 B 의 정렬에서 동일한 매치 (match) 로서 채점된 아미노산 잔기의 개수이고, Y 는 B 내의 아미노산 잔기의 총수임. 아미노산 서열 A 의 길이가 아미노산 서열 B 의 길이와 동일하지 않은 경우에, B 에 대한 A 의 % 아미노산 서열 동일성은 A 에 대한 B 의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않다고 이해될 것이다. 구체적으로 다르게 언급되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 바로 직전 단락에서 기재된 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수득된다.
용어 "약학 조성물" 은 그안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 형태이고, 제형이 투여될 대상에게 수용불가능할 정도로 독성인 부가적 성분을 함유하지 않는 제제를 의미한다.
"약학적으로 허용가능한 담체" 는 대상에게 비독성인, 활성 성분 이외의, 약학 조성물 내의 성분을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하나, 그에 제한되지 않는다.
용어 "환자의 표현형" 은 환자로부터의 세포 종류 내의 세포 표면 수용체의 조성을 의미한다. 조성은 정량적 뿐 아니라 정성적 조성일 수 있다. 유전자형이 결정되는/제시되는 세포는 단일 세포 또는 다중 세포를 포함하는 샘플일 수 있다.
용어 "위치" 는 폴리펩티드의 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기의 위치를 의미한다. 위치는 순차적으로, 또는 확립된 형식, 예를 들어 항체 번호지정에 관한 Kabat 의 EU 인덱스에 따라 번호지정될 수 있다.
용어 "변경된" FcR 결합 친화도 또는 ADCC 활성은 부모 폴리펩티드 (예를 들어, 야생형 Fc-영역을 포함하는 폴리펩티드) 와 비교하여 증강된 또는 감소된 FcR 결합 활성 및/또는 ADCC 활성을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. FcR 에 대한 "증가된 결합도를 갖는" 변이체 폴리펩티드는 하나 이상의 FcR 에 부모 또는 야생형 폴리펩티드보다 더 낮은 해리 상수 (즉, 더 나은/더 높은 친화도) 로 결합한다. FcR 에 대한 "감소된 결합도를 갖는" 폴리펩티드 변이체는 하나 이상의 FcR 에 부모 또는 야생형 폴리펩티드보다 더 높은 해리 상수 (즉, 더 나쁜/더 낮은 친화도) 로 결합한다. FcR 에 대한 감소된 결합도를 나타내는 그러한 변이체는 야생형 또는 부모 IgG Fc-영역과 비교하여 FcR 에 대한 적은 또는 눈에 띄지 않는 결합도, 예를 들어, 0 - 20 % 를 보유할 수 있다.
FcR 에 부모 또는 야생형 폴리펩티드와 비교하여 "감소된 친화도" 로 결합하는 폴리펩티드는, 결합 검정에서 폴리펩티드 변이체 및 부모 폴리펩티드의 양이 (본질적으로) 대략 동일할 때, 위에 식별된 FcR 중 임의의 하나 이상에 부모 폴리펩티드에 비해 (실질적으로) 감소된 결합 친화도로 결합하는 폴리펩티드이다. 예를 들어, 감소된 FcR 결합 친화도를 갖는 폴리펩티드 변이체는 FcR 결합 친화도가 결정되는 부모 폴리펩티드와 비교하여 FcR 결합 친화도에서 약 1.15 배 내지 약 100 배, 예를 들어, 약 1.2 배 내지 약 50 배 감소를 나타낼 수 있다.
부모 폴리펩티드보다 "덜 효과적으로 인간 효과기 세포의 존재 하에 항체-의존적 세포-매개되는 세포독성 (ADCC) 을 매개하는" 변이체 Fc-영역을 포함하는 폴리펩티드는 시험관내에서 또는 생체내에서 검정에서 사용되는 변이체 폴리펩티드 및 부모 폴리펩티드의 양이 (본질적으로) 대략 동일할 때 ADCC 의 매개에서 (실질적으로) 덜 효과적인 것이다. 일반적으로, 그러한 변이체는 본원에 개시된 시험관내 ADCC 검정을 사용하여 식별될 것이나, 예를 들어, 동물 모델 등에서, ADCC 활성을 확인하는 기타 검정 또는 방법이 고려된다. 하나의 구현예에서 변이체는, 예를 들어, 본원에 개시된 시험관내 검정에서 부모보다 ADCC 의 매개에서 약 1.5 배 내지 약 100 배, 예를 들어, 약 2 개의 배 내지 약 50 배 덜 효과적이다.
용어 "수용체" 는 하나 이상의 리간드에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 의미한다. 하나의 구현예에서 수용체는 세포외 리간드-결합 도메인 및, 임의로, 기타 도메인 (예를 들어, 막관통 도메인, 세포내 도메인 및/또는 막 앵커 (anchor)) 을 갖는 세포-표면 수용체이다. 본원에 기재된 검정에서 평가되는 수용체는 온전한 수용체 또는 그의 단편 또는 유도체 (예를 들어, 하나 이상의 이종 폴리펩티드에 융합된 수용체의 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질) 일 수 있다. 더욱이, 그것의 결합 특성에 대해 평가되는 수용체는 세포 내에 존재하거나 단리되고 임의로 검정 플레이트 또는 일부 기타 고상에 코팅될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은, "치료" (및 이의 문법적 변형, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하기") 는 치료하고자 하는 개체의 자연적 경과를 변형하기 위한 시도의 임상적 개입을 말하고, 예방을 위해 또는 임상 병리학 과정 동안 수행될 수 있다. 원하는 치료 효과에는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 소실, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 저하시키기 위해 사용된다.
II. 맞춤-제조된 다중특이적 결합 분자
대부분의 세포 기반 질환에서, 수용체 분자의 항체 기반 결합을 통한 질환-관련 세포의 표적화는 하나의 유망한 접근법이다. 그러나, 임상적으로 관련된 표면 수용체 (=표적) 의 발현 수준은 환자마다 상이하며, 표준화된 항체 기반 약물의 효능이 따라서 상이하다. 이것은 그 작용 방식이 2 개의 상이한 에피토프/수용체를 동시에 표적하는 것인 2-특이적 및 다중특이적 결합 분자에 특이적으로 적용된다.
하나의 유망한 접근법은 각각의 환자의 특정한/개별 상황에 대해 특이적으로 약물 (본원에서, 2-특이적 또는 다중특이적 결합 분자) 을 디자인하는 것이다.
개체로부터의 각각의 세포는 발현된 세포 표면 분자, 예컨대 수용체의 관점에서 수 및 종류가 상이하다. 이것은 특히 암 세포 및 비-암 세포에 대해 사실이다. 따라서, 세포는 제시된 세포 표면 분자를 특징으로 할 수 있다.
환자의 질환-관련 세포 상의 임상적으로 관련된 표면 수용체의 발현 프로파일 데이터에 근거해, 일련의 결합 단위 (예를 들어, Fab 단편) 는 라이브러리로부터 특이적으로 선택되고, 환자 특이적 약물로서 다중특이적 결합 분자와 조합된다. 상기 선별된 결합 분자는 예를 들어, 표면 수용체의 발현 수준, 및 따라서 개별 환자의 필요 및 표현형에 근거하여, 각각의 질환-관련 세포, 예컨대 종양 세포에 대해 특이적으로 선택된다.
이러한 특성은 시험관 내 및 생체 내 기반 세포 이미지화 기법에 의해 영향을 받을 수 있다. 생체 내 이미지화 기법에는 예를 들어, 광학 이미지화, 분자 이미지화, 형광 이미지화, 생체발광 이미지화, MRI, PET, SPECT, CT, 및 인트라바이탈 현미경이 포함된다. 시험관 내 이미지화 기법에는 예를 들어, 특이적 세포 표면 마커를 인지하는 예를 들어 형광 표지된 항체로 환자 세포를 면역조직화학 염색하고 현미경에 의해 형광 신호를 분석하는 것이 포함된다. 대안적으로 세포의 유전자형/표현형은 FACS-기반 방법을 사용하여 표지된 치료 또는 진단 항체로 염색 후 분석할 수 있다.
하나의 구현예에서, 환자-유래 세포의 유전자형/표현형은 FACS-기반 방법에 의해 결정된다. 하나의 구현예에서, 세포 표면 마커는 형광 표지된 진단 또는 치료 항체를 사용함으로써 결정된다. 하나의 구현예에서, 형광 표지된 치료 항체가 사용된다.
특정 질환은 특이적 세포 표면 분자의 수의 변화 또는 신규한 세포 표면 분자의 발생과 연관될 수 있다.
이러한 질환에 의해 영향을 받은 개체는 특정 범위 내에서 질환 및/또는 개체-특이적 세포 표면 마커 패턴을 나타낼 것이다.
이것은 이러한 개체에게 맞춤-제작된, 표적화된 치료법을 제공하기 위해 고려해야만 한다.
세포 표면 분자 및 이들의 리간드에 대한 다수의 치료 항체는 맞춤-제작된 다중-특이적 표적화 단위의 선별 및 구축을 위해 사용될 수 있는 것, 예컨대 리툭산 (Rituxan)/MabThera/리툭시맙 (Rituximab), 2H7/오크렐리주맙 (Ocrelizumab), 제발린 (Zevalin)/이브리주모맙 (Ibrizumomab), Arzerra/오파투무맙 (Ofatumumab) (CD20), HLL2/에프라투주맙 (Epratuzumab), 이노투조맙 (Inotuzomab) (CD22), Zenapax/다실리주맙 (Daclizumab), Simulect/바실리시맙 (Basiliximab) (CD25), 허셉틴 (Herceptin)/트라스투주맙 (Trastuzumab), 페르투주맙(Pertuzumab) (Her2/ERBB2), Mylotarg/젬투주맙 (Gemtuzumab) (CD33), Raptiva/에팔리주맙 (Efalizumab) (Cd11a), Erbitux/세툭시맙 (Cetuximab) (EGFR, 표피 성장 인자 수용체), IMC-1121B (VEGF 수용체 2), Tysabri/나탈리주맙 (Natalizumab) (α4ß1 및 α4ß7 인테그린의 α4-서브유닛), ReoPro/압식시맙 (Abciximab) (gpIIb-gpIIa 및 αvß3-인테그린), Orthoclone OKT3/무로모납 (Muromonab)-CD3 (CD3), Benlysta/벨리무맙 (Belimumab) (BAFF), Tolerx/오텔리시맙 (Oteliximab) (CD3), Soliris/에쿨리주맙 (Eculizumab) (C5 보체 단백질), Actemra/토실리주맙 (Tocilizumab) (IL-6R), Panorex/에드레콜로맙 (Edrecolomab) (EpCAM, 상피 세포 부착 분자), CEA-CAM5/라베투주맙 (Labetuzumab) (CD66/CEA, 암-배아 항원), CT-11 (PD-1, 프로그램된 사멸-1 T-세포 억제 수용체, CD-d279), H224G11 (c-Met 수용체), SAR3419 (CD19), IMC-A12/시숙투무맙 (Cixutumumab) (IGF-1R, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체), MEDI-575 (PDGF-R, 혈소판-유래 성장 인자 수용체), CP-675, 206/트레멜리무맙 (Tremelimumab) (세포독성 T 림프구 항원 4), RO5323441 (태반 성장 인자 또는 PGF), HGS1012/마파투무맙 (Mapatumumab) (TRAIL-R1), SGN-70 (CD70), Vedotin(SGN-35)/브렌투시맙 (Brentuximab) (CD30), 및 ARH460-16-2 (CD44) 로 공지된다.
예를 들어, 환자의 샘플에 존재하는 세포 표면 마커의 결정을 위해서, 상이한 방법이 알려져 있다. 하나의 예시적인 방법은 형광 활성화된 세포 분류 (FACS), 특히, 특이적으로 염색되고 분류된 세포 집단의 분석에 기반한 것이다. 본 방법에서, 샘플 (세포 집단) 의 표현형화는 세포 집단 내 표면 마커의 통계적 분포를 임의로 포함하여, 상기 마커에 대해 형광 표지된 항체를 사용하는 제시된 세포 표면 마커에 대해 개별 세포를 분석함으로써 달성된다. 상기 맞춤-제작된 다중특이적 결합 분자가 진단 항체와 동일한 에피토프에 결합할 것이라는 것이 확실하므로, 상기 목적을 위해 형광 표지로 표지된 치료 항체를 사용하는 것이 특히 적합하다. 본원에 보고된 다중특이적 결합 분자/2-특이적 항체는 예를 들어, 종양 질환, 심혈관 질환, 감염성 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환, 대사성 (예를 들어, 내분비성) 질환, 또는 신경학적 (예를 들어, 신경병성) 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서 사용될 수 있다. 상기 질환의 예시적인 비-제한적인 예는 알쯔하이머 질환, 비-호지킨 림프종, B-세포 급성 및 만성 림프구성 백혈병, 버킷 림프종, 호지킨 림프종, 모발 세포 백혈병, 급성 및 만성 골수성 백혈병, T-세포 림프종 및 백혈병, 다발성 골수종, 신경교종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 상피성 암종 (예컨대 구강, 위장관, 결장, 위, 폐의 관, 폐, 유방, 난소, 전립선, 자궁, 자궁내막, 자궁경부, 방광, 췌장, 뼈, 간, 담낭, 신장, 피부, 및 고환의 암종), 흑색종, 육종, 신경교종, 및 피부 암, 급성 특발 혈소판감소 자색반증, 만성 특발 혈소판감소 자색반증, 피부근염, 시드남 무도병, 중증 근무력증, 전신 홍반성 루프스, 홍반성 신염, 류마티스성 열, 다선성 증후군, 수포성 유천포창, 진성 당뇨병, 헤노흐-쇤라인 자반병, 연쇄상 구균감염후 사구체 신염, 결절성 홍반, 타카야수 동맥염, 에디슨 질환, 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 유육종증, 궤양성 대장염, 다형홍반, IgA 신증, 결절성 다발성 동맥염, 강직성 척추염, 굿파스처 증후군, 폐쇄성 혈전혈관염, 쇼그렌 증후군, 원발성 담즙성 간경변, 하시모토 갑상선염, 갑상샘항진증, 공피증, 만성 활성 간염, 다발근육염/피부근염, 다발연골염, 심상성 천포창, 베게너 육아종증, 막성 콩팥병, 근위축성 측삭 경화증, 척수매독, 거세포 동맥염/다발근육통증, 악성 빈혈, 급속 진행 사구체신염, 건선, 또는 섬유성 폐렴이다.
다수의 세포 표면 마커 및 이들의 리간드가 알려져 있다. 예를 들어, 암 세포는 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는 하기 세포 표면 마커 및 또는 리간드 중 하나를 발현하는 것으로 보고되어 있다: 탄산 탈수효소 IX, 알파 태아단백질, 알파-액티닌-4, A3 (A33 항체에 특이적인 항원), ART-4, B7, Ba-733, BAGE, BrE3-항원, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8/m, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CDS, CD8, CD1-1A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CDC27, CDK-4/m, CDKN2A, CXCR4, CXCR7, CXCL12, HIF-1-알파, 결장-특이적 항원-p (CSAp), CEA (CEACAM5), CEACAM6, c-met, DAM, EGFR, EGFRvIII, EGP-1, EGP-2, ELF2-M, Ep-CAM, Flt-1, Flt-3, 엽산 수용체, G250 항원, GAGE, GROB, HLA-DR, HM1.24, 인간 융모막 성 생식선 자극 호르몬 (HCG) 및 이의 서브유닛, HER2/neu, HMGB-1, 저산소증 유도 인자 (HIF-1), HSP70-2M, HST-2or la, IGF-1R, IFN-감마, IFN-알파, IFN-베타, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL- 25, 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1), KC4-항원, KS-1-항원, KS1-4, Le-Y, LDR/FUT, 대식세포 이동 억제 인자 (MIF), MAGE, MAGE-3, MART-1, MART-2, NY-ESO-1, TRAG-3, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUM-1/2, MUM-3, NCA66, NCA95, NCA90, 췌장암 뮤신, 태반 성장 인자, p53, PLAGL2, 프로스타트산 (prostatic acid) 포스파타아제, PSA, PRAME, PSMA, P1GF, ILGF, ILGF-1R, IL-6, IL-25, RS5, RANTES, T101, SAGE, S100, 서바이빈, 서바이빈-2B, TAC, TAG-72, 테나신, TRAIL 수용체, TNF-알파, Tn-항원, Thomson-Friedenreich 항원, 종양 괴사 항원, VEGFR, ED-B 피브로넥틴, WT-1, 17-1A-항원, 보체 인자 C3, C3a, C3b, C5a, C5, 혈관형성 마커, bcl-2, bcl-6, Kras, cMET, 종양 마커 및 종양 생성물 (예를 들어, Sensi, et al., Clin. Cancer Res. 12 (2006) 5023-5032; Parmiani, et al, J. Immunol. 178 (2007) 1975-1979; Novellino, et al., Cancer Immunol. Immunother. 54 (2005) 187-207 참조).
따라서, 리간드를 비롯한 특이적 세포 표면 수용체를 인지하는 항원은 질환과 연관된 다수의 세포 표면 마커에 특이적이고 선택적으로 표적화하고 결합하는데 사용될 수 있다. 세포 표면 마커는 예를 들어, 신호 사건 또는 리간드 결합과 관련된 세포 (예를 들어, 질환-관련 세포) 의 표면에 위치한 폴리펩티드이다.
하나의 구현예에서, 암/종양의 치료를 위해 종양-연관 항원을 표적하는 다중특이적 결합 분자/2-특이적 항체, 예컨대 문헌 Herberman, "Immunodiagnosis of Cancer", in Fleisher (ed.), "The Clinical Biochemistry of Cancer", 페이지 347 (American Association of Clinical Chemists (1979)) 및 US 4,150,149; US 4,361,544; 및 US 4,444,744 에 보고된 것이 사용된다.
종양 연관 항원 (TAA) 에 대한 보고서에는 Mizukami, et al., (Nature Med. 11 (2005) 992-997); Hatfield, et al., (Curr. Cancer Drug Targets 5 (2005) 229-248); Vallbohmer, et al., (J Clin. Oncol. 23 (2005) 3536-3544); 및 Ren, et al., (Ann. Surg. 242 (2005) 55-63) 이 포함되고, 각각은 확인된 TAA 와 관련하여 참조로서 본원에 인용된다.
질환이 림프종, 백혈병 또는 자가면역 질환과 연관되는 경우, 표적된 항원은 CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD54, CD67, CD74, CD79a, CD80, CD126, CD138, CD154, CXCR4, B7, MUC1 또는 la, HM1.24, HLA-DR, 테나신, VEGF, P1GF, ED-B 피브로넥틴, 종양유전자, 종양유전자 생성물 (예를 들어, c-met 또는 PLAGL2), CD66a-d, 괴사 항원, IL-2, T101, TAG, IL-6, MIF, TRAIL-R1 (DR4) 및 TRAIL-R2 (DR5) 로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
다수의 2-특이적 항체는 2 개의 상이한 표적, 예컨대 BCMA/CD3, 조합으로의 HER 계열의 상이한 항원 (EGFR, HER2, HER3), CD19/CD3, IL17RA/IL7R, IL-6/IL-23, IL-1-베타/IL-8, IL-6 또는 IL 6R/ IL-21 또는 IL-21R 에 대항하는 것으로 알려져 있고, 첫번째 특이성은 Lewis x-, Lewis b- 및 Lewis y-구조, Globo H-구조, KH1, Tn-항원, TF-항원 및 뮤신 (Mucin) 의 탄화수소 구조, CD44, 당지질 및 당스핑고지질, 예컨대 Gg3, Gb3, GD3, GD2, Gb5, Gm1, Gm2, 시알릴테트라오실세라마이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원의 당에피토프 (glycoepitope) 에 대한 것이고, 두번째 특이성은 EGFR, HER2, HER3 및 HER4 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 ErbB 수용체 티로신 키나아제에 대한 것이고, 두번째 항원 결합 부위와 조합으로의 GD2 는 T 림프구 NK 세포, B-림프구, 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, ANG2/VEGF, VEGF/PDGFR-베타, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 허용체 2/CD3, PSMA/CD3, EPCAM/CD3 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 면역학적 세포와 연관되고, 항원의 조합은 VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, FLT3, c FMS/CSF1R, RET, c-Met, EGFR, Her2/neu, HER3, HER4, IGFR, PDGFR, c-KIT, BCR, 인테그린 및 MMP 로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 수용성 리간드는 VEGF, EGF, PIGF, PDGF, HGF, 및 안지오포이에틴, ERBB-3/C-MET, ERBB-2/C-MET, EGF 수용체 1/CD3, EGFR/HER3, PSCA/CD3, C-MET/CD3, ENDOSIALIN/CD3, EPCAM/CD3, IGF-1R/CD3, FAPALPHA/CD3, EGFR/IGF-1R, IL 17A/F, EGF 수용체 1/CD3, 및 CD19/CD16 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
따라서, 본원에 보고된 모듈화 접근법을 사용함으로써 맞춤-제작된 2-특이성 치료 항체가 제공될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 상기 항체는 그러한 세포 표면 분자와 상호작용하는 리간드에 대해 또는 치료를 필요로 하는 개체의 세포 상에 실제로 존재하는 세포 표면 분자에 대해 맞춤-제작된다. 개체의 세포 표면 분자 상태를 결정함으로써 치료 표적의 맞춤-제작 조합을 선택할 수 있다.
2 개의 상이한 에피토프에 대한 동시 표적 및 결합을 위해 2 개의 단일 치료 분자의 조합에 의한 2-특이적 치료제의 상기 맞춤-제작 생성으로, 단일 치료 분자와 비교하여 첨가/시너지 효과가 예상될 수 있다.
이미 이용가능한 1-특이적 치료 결합 단위, 예컨대 치료 항체로부터 유래되는 것을 사용함으로써, 필요한 다중특이적 결합 분자의 빠르고 손쉬운 생성이 달성될 수 있다.
상기 결합능 (avidity) 조작된 결합 분자/항체는 단일 세포 상에 존재하는 2 개 이상의 세포 표면 마커에 결합될 수 있다. 상기 결합은 모든/양쪽 결합 단위가 세포에 동시에 결합하는 경우에만 결합 (avid) 된다. 상기 목적을 위해 중간 내지 낮은 친화성의 항체가 특히 적합하다. 이것은 또한 한편으로는 스크리닝 과정 동안 결합 특이성의 덜 특이적인 조합을 배제하는 것을 가능하게 한다.
선택된 환자 특이적 다중특이적 결합 분자는 관련 범주에 대해 다양한 세포 시험관 내 검정/세포 샘플에서 시험될 수 있다 (예를 들어, 최적 결합/결합 파트너, 최적 연결자 길이 등):
- 포스포 티로신 키나아제의 인산화 상태의 측정
- c-Jun N-말단 키나아제 (JNK) 억제의 측정
- 분자 유도된 세포자멸사의 측정
- 1-특이적 대 다중특이적 결합 분자로 실시한 결합 검정
- 증식 억제의 측정
이러한 접근법으로 맞춤-제작의 발생 및, 따라서, 고도로 효과적인 치료 분자가 가능하다. 상기 분자는 개선된 표적/전달 (예를 들어, 종양 세포에 대한 적재량) 에 의해 감소된 부작용을 보일 것이고, 표적 세포에 대한 개선된 표적화는 표적 성분의 높은 선택성 및 특이성 (2 개 이상의 결합 분자를 포함하는) 을 기반으로 한다.
다중특이적 결합 분자의 더 높은 선택성 및 특이성은 2 개의 "저 친화성" 결합제의 조합에 의한 동시 결합 (결합능) 때문이고, 이것은 가능한 "표적을 벗어난" 결합을 감소시킨다.
본원에 보고되는 방법
본원에 보고되는 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는 2-특이적 항체의 제조 방법이다:
하기 (i) 내지 (iii) 을 인큐베이션하여:
(i) 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPX1TG (SEQ ID NO: 01, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 을 포함하는 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체,
(ii) 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 항체 단편,
전장 항체 중쇄 및 전장 항체 경쇄는 동족 항체 사슬이고 이의 가변 도메인 (VH 및 VL) 의 쌍은 항원 결합 부위를 형성하고,
전장 항체 중쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 항체 힌지 영역을 형성하는 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 서로 공유 연결되고,
항체 중쇄 Fc-영역은 그의 N-말단에 올리고글라이신 아미노산 서열을 가짐,
및
(iii) 소르타제 A 효소,
2-특이적 항체를 제조하는 단계.
본원에 보고되는 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는 2-특이적 항체의 제조 방법이다:
(i) 샘플 내의 세포의 표면 상에 존재하는 표면 마커를 결정하고 첫번째 표면 마커 및 두번째 표면 마커를 선별하는 단계,
(ii) (a) 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPX1TG (SEQ ID NO: 01, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체 단편, Fab 단편 또는 scFv 는 첫번째 표면 마커에 특이적으로 결합함, (b) 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 항체 단편, 전장 항체 중쇄 및 전장 항체 경쇄는 동족 항체 사슬이고 이의 가변 도메인 (VH 및 VL) 의 쌍은 두번째 표면 마커에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, 전장 항체 중쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 항체 힌지 영역을 형성하는 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로 공유 연결되고, 항체 중쇄 Fc-영역은 그의 N-말단에 올리고글라이신 아미노산 서열을 가짐, 및 (c) 소르타제 A 효소를 인큐베이션하는 단계
및 이에 의해 2-특이적 항체를 제조하는 단계.
본원에 보고되는 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는 항원 결합 부위의 조합의 결정 방법이다:
(i) 첫번째 다수의 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체 단편의 각각의 일원과, 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 두번째 다수의 항체 단편의 각각의 일원을 조합함으로써 제조되는, 다수의 2-특이적 항체의 결합 특이성 및/또는 친화성 및/또는 효과기 기능 및/또는 생체 내 반감기를 결정하는 단계,
첫번째 다수는 첫번째 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하고, 두번째 다수는 두번째 세포 표면 분자에 특이적으로 결합함,
및
(ii) 적합한 결합 특이성 및/또는 친화성 및/또는 효과기 기능 및/또는 생체 내 반감기를 가진 2-특이적 항체를 선택하여, 항원 결합 부위의 조합을 결정하는 단계.
하나의 구현예에서, 조합은 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체 단편 및 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 항체 단편을, 소르타제 A 효소와 인큐베이션하는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서, Fab 단편 또는 scFv 항체 단편은 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPX1TG (SEQ ID NO: 01, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 외-분지 항체 단편의 전장 항체 중쇄 및 전장 항체 경쇄는 동족 항체 사슬이고 이의 가변 도메인 (VH 및 VL) 의 쌍은 두번째 표면 마커에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, 전장 항체 중쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 항체 힌지 영역을 형성하는 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 서로 공유 연결되고, 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 그의 N-말단에 올리고글라이신 아미노산 서열을 갖는다.
모든 양상의 하나의 구현예에서, 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체는 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 GnSLPX1TG (SEQ ID NO:02, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, n=1, 2 또는 3 임) 을 포함한다.
모든 양상의 하나의 구현예에서, 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체는 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 GSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 03, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 을 포함한다.
모든 양상의 하나의 구현예에서, 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체는 아미노산 서열 X2GSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 05, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2 는 G 를 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함한다.
모든 양상의 하나의 구현예에서, 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체는 아미노산 서열 GnSLPX1TGGSGSX3 (SEQ ID NO: 06, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, n=1, 2 또는 3 임) 을 20 개의 C 말단 아미노산 잔기 내에 포함하고, 이 때 X3 은 아미노산 서열 태그이다.
모든 양상의 하나의 구현예에서, 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체는 아미노산 서열 X2GSLPX1TGGSGSX3 (SEQ ID NO: 07, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 을 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 포함하고, 이 때 X2 는 G 를 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X3 은 아미노산 서열 태그이다.
모든 양상의 하나의 구현예에서, 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 그의 N-말단에서 2 개의 글라이신 잔기를 포함한다.
모든 양상의 하나의 구현예에서 외-분지 항체 Fc-영역은 아미노산 서열 GGCPX4C (SEQ ID NO: 08) 를 그의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 N-말단에 포함하고, 이 때 X4 는 S 또는 P 이다.
모든 양상의 하나의 구현예에서 X1 은 E 이다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 본원에서 보고되는 방법에 의해 수득된 다중특이적 결합 분자/2-특이적 항체이다.
하나의 양상은 그의 중쇄 중 하나에 아미노산 서열 LPX1TG (SEQ ID NO: 01, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는 다중특이적 결합 분자/2-특이적 항체이다.
하나의 구현예에서, 다중특이적 결합 분자/2-특이적 항체는 그의 중쇄 중 하나에 아미노산 서열 GnSLPX1TG (SEQ ID NO: 02, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, n=1, 2 또는 3 임) 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 다중특이적 결합 분자/2-특이적 항체는 그의 중쇄 중 하나에 아미노산 서열 GnSLPX1TGGCPX4C (SEQ ID NO: 09, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X4 는 S 또는 P 일 수 있고, n=1, 2 또는 3 임) 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 다중특이적 결합 분자/2-특이적 항체는 그의 중쇄 중 하나에 아미노산 서열 X2GSLPX1TGGCPX4C (SEQ ID NO: 10, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X4 는 S 또는 P 일 수 있음) 를 포함하고, 이 때 X2 는 G 를 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있다.
하나의 구현예에서, X1 은 E 이다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 본원에 보고된 항체/다중특이적 결합 분자를 포함하는 약학 조성물이다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 의약의 제조에서의 본원에 보고된 2-특이적 항체/다중특이적 결합 분자의 용도이다.
하나의 구현예에서, 의약은 암의 치료를 위한 것이다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 본원에 보고된 2-특이적 항체/다중특이적 결합 분자의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 가지고 있는 개체의 치료 방법이다.
본원에 보고되는 하나의 양상은 본원에 보고된 2-특이적 항체/다중특이적 결합 분자의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 세포를 파괴하기 위한 방법이다.
본원에 보고되는 모든 양상의 하나의 구현예에서 Fc-영역은 인간 Fc 영역, 또는 이의 변이체이다.
하나의 구현예에서, 인간 Fc-영역은 인간 IgG1 서브클래스, 또는 인간 IgG2 서브클래스, 또는 인간 IgG3 서브클래스, 또는 인간 IgG4 서브클래스의 것이다. 하나의 구현예에서, Fc-영역은 인간 IgG1 서브클래스 또는 인간 IgG4 서브클래스의 인간 Fc-영역이다.
하나의 구현예에서, 인간 Fc-영역은 하기 아미노산 위치 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322, 329, 및/또는 331 중 하나 이상에서 상이한 잔기로의 자연 발생적 아미노산 잔기의 돌연변이를 포함하고, Fc-영역 내의 잔기는 Kabat 의 EU 인덱스에 따라 번호지정된다.
하나의 구현예에서, 인간 Fc-영역은 위치 329 에서 자연 발생적 아미노산 잔기의 돌연변이 및 위치 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322 및 331 에서 아미노산 잔기를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기의 상이한 잔기로의 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함하고, Fc-영역 내의 잔기는 Kabat 의 EU 인덱스에 따라 번호지정된다. 상기 특정 아미노산 잔기의 변화는 비-개질된 (야생형) Fc-영역과 비교해 Fc-영역의 효과기 기능을 변화시키는 결과를 낳는다.
하나의 구현예에서, 인간 Fc-영역은 상응하는 야생형 IgG Fc-영역을 포함하는 접합체와 비교해 인간 FcγRIIIA, 및/또는 FcγRIIA, 및/또는 FcγRI 에 대한 감소된 친화성을 갖는다.
하나의 구현예에서, 인간 항체 Fc-영역 내 위치 329 에서 아미노산 잔기는 글라이신, 또는 아르기닌, 또는 Fc 영역 내에 프롤린 샌드위치를 파괴할 정도로 충분히 큰 아미노산 잔기로 치환된다.
하나의 구현예에서, 자연 발생적 아미노산 잔기의 돌연변이는 S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, P329G, 및/또는 P331S 이다. 하나의 구현예에서, 돌연변이는 Fc-영역이 인간 IgG1 서브클래스의 것인 경우 L234A 및 L235A 이거나, 또는 Fc-영역이 인간 IgG4 서브클래스의 것인 경우 S228P 및 L235E 이다. 하나의 구현예에서, Fc-영역은 돌연변이 P329G 를 포함한다.
Fc-영역 내의 규정된 위치에서의 2 개의 돌연변이의 조합에 의해 Fc-영역 연관된 효과기 기능의 완전한 감소가 달성될 수 있다.
효과기 기능 유발 Fc-영역의 선택은 다중특이적 결합 분자/2-특이적 항체의 의도되는 용도에 의존적이다.
의도되는 용도가 가용성 표적의 기능적 중화인 경우에 비-효과기 기능 유발 서브클래스 또는 변이체가 선택되어야 한다.
의도되는 용도가 표적의 제거인 경우에 효과기 기능 유발 서브클래스 또는 변이체가 선택되어야 한다.
의도되는 용도가 세포-결합된 표적의 길항작용인 경우에 비-효과기 기능 유발 서브클래스 또는 변이체가 선택되어야 한다.
의도되는 용도가 표적 제시 세포의 제거인 경우에 효과기 기능 유발 서브클래스 또는 변이체가 선택되어야 한다.
항체 또는 항체 Fc-영역 접합체의 순환 반감기는 Fc-영역-FcRn 상호작용을 조정함으로써 영향을 받을 수 있다.
항체-의존적 세포-매개되는 세포독성 (ADCC) 및 보체-의존적 세포독성 (CDC) 의 최소화 또는 심지어는 제거는 소위 힌지-영역 아미노산 변화/치환에 의해 달성될 수 있다.
고전적 보체 캐스케이드의 활성화의 최소화 또는 심지어는 제거는 소위 힌지-영역 아미노산 변화/치환에 의해 달성될 수 있다.
항체 또는 항체 Fc-영역 접합체의 순환 반감기의 증가는 신생아 Fc 수용체에 대한 증가된 결합도에 의해 달성될 수 있고, 개선된 효능, 감소된 투여량 또는 투여 빈도, 또는 표적에 대한 개선된 전달을 초래한다. 항체 또는 항체 Fc-영역 접합체의 순환 반감기의 감소는 신생아 Fc 수용체에 대한 감소된 결합도에 의해 달성될 수 있고, 감소된 전신 노출 또는 개선된 표적-대-비-표적 결합 비율을 초래한다.
일반적으로, 본원에서 보고되는 방법은 야생형 Fc-영역 또는 변경된/변이체 Fc-영역을 포함하는 항체 Fc-영역 접합체의 생산에 적용가능하다.
하나의 구현예에서, Fc-영역은 인간 Fc-영역이다.
하나의 구현예에서, Fc-영역은 "개념적" 이고, 그것이 물리적으로 존재하지 않지만, 항체 기술자는 변이체 Fc-영역을 사용할 것을 결정할 수 있다.
하나의 구현예에서, 항체 Fc-영역 접합체의 Fc-영역 부분을 인코딩하는 핵산은 변경되어 항체 Fc-영역 접합체의 변이체 Fc-영역 부분을 인코딩하는 변이체 핵산 서열을 생성한다.
항체 Fc-영역 접합체의 Fc-영역 부분의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산은 당 기술분야에 알려진 여러 가지 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들 방법은 항체 Fc-영역 접합체의 폴리펩티드를 인코딩하는 이전에 제조된 DNA 의 자리 지정 (또는 올리고뉴클레오티드-매개되는) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 카세트 돌연변이유발을 포함하나, 그에 제한되지 않는다.
Fc-영역은 Fc 수용체 (예를 들어, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA), 보체 단백질 C1q, 및 기타 분자 예컨대 단백질 A 및 G 를 포함하나 그에 제한되지 않는 다수의 수용체 또는 리간드와 상호작용한다. 이들 상호작용은 항체 의존적 세포-매개되는 세포독성 (ADCC), 항체 의존적 세포성 식세포작용 (ADCP) 및 보체 의존적 세포독성 (CDC) 을 포함하나, 그에 제한되지 않는 여러 가지 효과기 기능 및 하류 신호전달 사건에 필수적이다.
하나의 구현예에서, 항체 Fc-영역 접합체 (본원에서 보고되는 방법으로 생성됨) 는 하나 이상의 하기 특성을 갖는다: 감소된 또는 제거된 효과기 기능 (ADCC 및/또는 CDC 및/또는 ADCP), Fc 수용체에 대한 감소된 또는 제거된 결합도, C1q 에 대한 감소된 또는 제거된 결합도, 또는 감소된 또는 제거된 독성.
하나의 구현예에서, 항체 Fc-영역 접합체 (본원에서 보고되는 방법으로 생성됨) 는 적어도 2 개의 아미노산 돌연변이, 부가, 또는 결실을 갖는 야생형 Fc-영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체 Fc-영역 접합체 (본원에서 보고되는 방법으로 생성됨) 는 야생형 인간 Fc-영역을 포함하는 항체 또는 항체 Fc-영역 접합체에 비해 인간 Fc 수용체 (FcγR) 및/또는 인간 보체 수용체에 대한 감소된 친화도를 갖는다.
하나의 구현예에서, 항체 Fc-영역 접합체 (본원에서 보고되는 방법으로 생성됨) 는 야생형 인간 Fc-영역을 포함하는 항체 또는 항체 Fc-영역 접합체에 비해 인간 Fc 수용체 (FcγR) 및/또는 인간 보체 수용체에 대한 감소된 친화도를 갖는 Fc-영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체 Fc-영역 접합체 (본원에서 보고되는 방법으로 생성됨) 는 FcγRI, FcγRII, 및/또는 FcγRIIIA 중 하나 이상에 대해 감소된 친화도를 갖는다. 하나의 구현예에서 FcγRI 및 FcγRIIIA 에 대한 친화도가 감소된다. 하나의 구현예에서 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIIIA 에 대한 친화도가 감소된다.
하나의 구현예에서, FcγRI, FcγRIIIA 및 C1q 에 대한 친화도가 감소된다.
하나의 구현예에서, FcγRI, FcγRII, FcγRIIIA 및 C1q 에 대한 친화도가 감소된다.
하나의 구현예에서, 항체 Fc-영역 접합체 (본원에서 보고되는 방법으로 생성됨) 는 야생형 Fc-영역을 포함하는 항체 또는 항체 Fc 접합체에 비해 감소된 ADCC 를 갖는다. 하나의 구현예에서 ADCC 는 야생형 Fc-영역을 포함하는 Fc-영역 융합 폴리펩티드 또는 접합체에 유도되는 ADCC 에 비해 적어도 20 % 감소된다.
하나의 구현예에서, 항체 Fc-영역 접합체 (본원에서 보고되는 방법으로 생성됨) 는 야생형 Fc-영역을 포함하는 항체 Fc-영역 접합체에 비해 감소된 또는 제거된 Fc-영역에 의해 유도되는 ADCC 및 CDC 를 갖는다.
하나의 구현예에서, 항체 Fc-영역 접합체 (본원에서 보고되는 방법으로 생성됨) 는 야생형 Fc-영역을 포함하는 OA-Fc-영역 접합체에 비해 감소된 ADCC, CDC, 및 ADCP 를 갖는다.
하나의 구현예에서, 항체 Fc-영역 접합체는 S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, P329G, 및 P331S 를 포함하는 군으로부터 선택되는 Fc-영역 내의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
하나의 구현예에서, 야생형 Fc-영역은 인간 IgG1 Fc-영역 또는 인간 IgG4 Fc-영역이다.
하나의 구현예에서, 항체 Fc-영역은 위치 329 에서의 아미노산 잔기 프롤린의 돌연변이 외에도 항체 Fc-영역 접합체의 증가된 안정성과 상관관계가 있는 Fc-영역 내의 아미노산 잔기의 하나 이상의 추가의 부가, 돌연변이, 또는 결실을 포함한다.
하나의 구현예에서, Fc-영역 내의 아미노산 잔기의 추가의 부가, 돌연변이, 또는 결실은 Fc-영역이 IgG4 서브클래스인 경우에 Fc-영역의 위치 228 및/또는 235 에 있다. 하나의 구현예에서, 위치 228 에서의 아미노산 잔기 세린 및/또는 위치 235 에서의 아미노산 잔기 류신은 또다른 아미노산에 의해 치환되어 있다. 하나의 구현예에서, 항체 Fc-영역 접합체는 위치 228 에서 프롤린 잔기를 포함한다 (세린 잔기의 프롤린 잔기로의 돌연변이). 하나의 구현예에서, 항체 Fc-영역 접합체는 위치 235 에서 글루탐산 잔기를 포함한다 (류신 잔기의 글루탐산 잔기로의 돌연변이).
하나의 구현예에서, Fc-영역은 3 개의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 하나의 구현예에서, 3 개의 아미노산 돌연변이는 P329G, S228P 및 L235E 돌연변이 (P329G / SPLE) 이다.
하나의 구현예에서, Fc-영역 내의 아미노산 잔기의 추가의 부가, 돌연변이, 또는 결실은 Fc-영역이 IgG1 서브클래스인 경우에 Fc-영역의 위치 234 및/또는 235 에 있다. 하나의 구현예에서, 위치 234 에서의 아미노산 잔기 류신 및/또는 위치 235 에서의 아미노산 잔기 류신은 또다른 아미노산으로 돌연변이되어 있다.
하나의 구현예에서, Fc-영역은 위치 234 에서 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기서 류신 아미노산 잔기는 알라닌 아미노산 잔기로 돌연변이되어 있다.
하나의 구현예에서, Fc-영역은 235 에서 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기서 류신 아미노산 잔기는 알라닌 아미노산 잔기로 돌연변이되어 있다.
하나의 구현예에서, Fc-영역은 위치 329 에서 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기서 프롤린 아미노산 잔기는 글라이신 아미노산 잔기로 돌연변이되어 있고, 위치 234 에서 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기서 류신 아미노산 잔기는 알라닌 아미노산 잔기로 돌연변이되어 있고, 및 위치 235 에서 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기서 류신 아미노산 잔기는 알라닌 아미노산 잔기로 돌연변이되어 있다.
FcRn 에 대한 증가된 친화도를 갖는 Fc-영역 변이체는 더 긴 혈청 반감기를 갖고, 그러한 분자는 투여되는 항체 Fc-영역 접합체의 긴 전신 반감기가 요망되는 포유류의 치료 방법에서, 예를 들어, 만성 질환 또는 장애의 치료에서 유용한 적용을 갖는다.
감소된 FcRn 결합 친화도를 갖는 항체 Fc-영역 접합체는 더 짧은 혈청 반감기를 갖고, 그러한 분자는 투여되는 항체 Fc-영역 접합체의 더 짧은 전신 반감기가 요망되는 포유류의 치료 방법에서, 예를 들어, 독성 부작용의 회피 또는 생체내 진단 영상화 응용물에서 유용한 적용을 갖는다. 감소된 FcRn 결합 친화도를 갖는 Fc-영역 융합 폴리펩티드 또는 접합체는 태반을 통과할 가능성이 더 낮고, 따라서 임신한 여성의 질환 또는 장애의 치료에서 이용될 수 있다.
FcRn 에 대한 변경된 결합 친화도를 갖는 Fc-영역은 하나의 구현예에서 아미노산 위치 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439, 및/또는 447 중 하나 이상에서 아미노산 변경을 갖는 Fc-영역이다.
Fc-영역은 하나의 구현예에서 아미노산 위치 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439, 및/또는 447 에서 하나 이상의 아미노산 변경을 갖는 Fc-영역이다.
FcRn 에 대한 증가된 결합도를 나타내는 Fc-영역은 하나의 구현예에서 아미노산 위치 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 및/또는 434 에서 하나 이상의 아미노산 변경을 포함한다.
하나의 구현예에서, Fc-영역은 IgG1 서브클래스의 Fc-영역이고, 아미노산 돌연변이 P329G, 및/또는 L234A 및 L235A 를 포함한다.
하나의 구현예에서, Fc-영역은 IgG4 서브클래스의 Fc-영역이고, 아미노산 돌연변이 P329G, 및/또는 S228P 및 L235E 를 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체 Fc-영역은 제 1 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 내에 돌연변이 T366W 및 제 2 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 내에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 를 포함하고, 여기서 번호지정은 Kabat 의 EU 인덱스에 따른다.
하나의 구현예에서, 항체 Fc-영역은 제 1 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 내에 돌연변이 S354C 및 제 2 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 내에 돌연변이 Y349C 를 포함한다.
소르타제 A 를 사용하는 효소적 접합
외-분지 항체 (OA-Fc) 및 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 2-특이적 항체는 효소 소르타제 A 를 사용하여 수득될 수 있다.
많은 그람-양성 박테리아는 소르타제를 사용하여 균력 인자를 포함하는 여러 가지 표면 단백질을 그들의 세포벽에 공유적으로 고정한다 (펩티도글리칸). 소르타제는 세포외 막 연합된 효소이다. 야생형 황색포도상구균 소르타제 A (SrtA) 는 N-말단 막 관통 영역을 갖는 206 개의 아미노산의 폴리펩티드이다. 제 1 단계에서, 소르타제 A 는 LPX1TG 아미노산 서열 모티프를 함유하는 기질 단백질을 인지하고, Thr 과 Gly 사이의 아미드 결합을 활성-부위 Cys 에 의해 절단한다. 이러한 펩티드 절단 반응은 소르타제 A 티오에스테르 중간체를 초래한다. 제 2 단계에서 티오에스테르 아실-효소 중간체는 올리고글라이신 함유 제 2 기질 폴리펩티드 (황색포도상구균 내의 펩티도글리칸의 펜타글라이신 단위체에 상응함) 의 아미노 기의 친핵성 공격에 의해 분해되어, 공유적으로 연결된 세포벽 단백질 및 소르타제 A 의 재생을 초래한다. 올리고글라이신 친핵체의 부재시에, 아실-효소 중간체는 물 분자에 의해 가수분해된다.
소르타제-매개되는 라이게이션/접합은 여러 가지 단백질 조작 및 생물접합 목적을 위해 적용되기 시작했다. 이러한 새로운 기술은 LPX1TG-태그된 재조합 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드 내로 자연적 및 비자연적 기능의 도입을 가능하게 해준다. 예는 올리고글라이신 유도된 중합체 (예를 들어, PEG), 형광단, 비타민 (예를 들어, 비오틴 및 폴레이트) 지질, 탄수화물, 핵산, 합성 펩티드 및 단백질 (예를 들어, GFP) 의 공유적 부착을 포함한다 (Tsukiji, S. and Nagamune, T., ChemBioChem 10 (2009) 787-798; Popp, M.W.-L. 및 Ploegh, H.L., Angew. Chem. Int. Ed. 50 (2011) 5024-5032).
아미노 성분의 트리글라이신 및 심지어는 디글라이신 모티프가 SrtA-매개되는 라이게이션 단계에 충분하다고 밝혀졌다 (Clancy, K.W., et al., Peptide Science 94 (2010) 385-396).
효소적 접합을 위해 막 관통 영역을 결여하는 가용성 절두된 (truncated) 소르타제 A (SrtA; 황색포도상구균 SrtA 의 아미노산 잔기 60-206) 가 사용될 수 있다 (Ton-That, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 12424-12429; Ilangovan, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 6056-6061). 절두된 가용성 소르타제 A 변이체는 대장균 (E.coli) 에서 생산될 수 있다.
적어도 하나의 N-말단에서 올리고글라이신 (Gm, m=2, 또는 3, 또는 4, 또는 5) 을 포함하는 항체 Fc-영역은 진핵 세포 (예를 들어, HEK293 세포, CHO 세포) 의 상청액으로부터 별현 및 정제될 수 있다.
하나의 폴리펩티드 사슬의 C-말단에서 SrtA 인지 모티프를 포함하는 결합 단위 (예를 들어, 단일 사슬 항원 결합 폴리펩티드 예컨대 scFv, scFab, 또는 다르핀, 또는 다중 사슬 항원 결합 폴리펩티드 예컨대 dsFv 또는 Fab) 은 진핵 세포 (예를 들어, HEK293 세포, CHO 세포) 의 상청액으로부터 별현 및 정제될 수 있다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 효소 소르타제 A 를 사용하여 항원 결합 폴리펩티드/도메인 (예를 들어, scFv 또는 Fab) 을 외-분지 항체 변이체 (OA-Fc) 에 접합시킴으로써 수득되는 2-특이적 항체이며, 여기서 소르타제 인지 서열은 단일 사슬 항원 결합 폴리펩티드 (예를 들어, scFv, scFab 또는 다르핀) 의 C-말단 또는 다중 사슬 항원 결합 복합체 (예를 들어, dsFv 또는 Fab) 의 하나의 폴리펩티드 사슬의 C-말단에 위치하고, 이중 또는 삼중 글라이신 모티프는 외-분지 항체 변이체의 Fc 사슬의 N-말단 (OA-Fc-Gm; m=2 또는 3) 에 위치한다. 항체 Fab 단편 (OA-Fc~Fab) 또는 scFv 항체 단편 (OA-Fc~scFv) 및 외-분지 항체 (OA-Fc) 를 포함하는 외-분지 항체 Fab 또는 scFv 접합체는 (i) 이의 C-말단 영역 내에 아미노산 서열 GnSLPX1TG (SEQ ID NO:02, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, n=1, 2 또는 3 임) 를 포함하는 폴리펩티드, (ii) 이의 N-말단에 올리고글라이신을 포함하는 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드, 및 (iii) 효소 소르타제 A 를 사용함으로써 효소적 접합으로 고 수율로 수득될 수 있다.
시약의 상기 조합으로, 증가된 반응 시간에서 정상적으로 일어나는
i) 기질로서 생성 접합체 내의 LPX1TG 아미노산 서열을 인지하는 역 반응, 및/또는
ii) 막다른 가수분해 폴리펩티드 단편 (Gm-항체 Fc-영역 친핵체에 의한 것 대신 물에 의한 티오아실-결합 단위 소르타제 A 중간체의 분할을 통해 생성된 분할된 LPX1TG 인지 서열이 있는 또는 없는 폴리펩티드) 의 생성
이 감소되거나 심지어 제거될 수 있다.
C-말단 및 N-말단 아미노산 서열 조합의 상이한 조합이 시험되었다.
더욱 상세하게는, 예시적 결합 단위로서 항체 Fab 단편이 사용되었고, 예시적 항체 Fc-영역으로서 외-분지 항체 Fc-영역 (OA-Fc-영역 = 전장 항체 중쇄 및 이의 동족 경쇄 및 중쇄 항체 Fc-영역 폴리펩티드의 쌍) 이 사용되었다. 항체 Fab 단편 VH-CH1 중쇄의 C-말단에서의 및 OA-Fc-영역의 N-말단에서의 3 개의 상이한 서열은 각각 예시적 트랜스펩티다아제 소르타제 A 를 사용하여 접합되었다. 9 개의 상이한 접합체가 수득되었다. 커플링 반응의 과정/효율은 상이한 시점에서 측정하였다. 이를 위해, 펩티드전이 반응의 분취물을 SDS-PAGE 에 의해 분석하였다. 라이게이션 효율은 젤로부터 농도계에 의해 추정되었다. 결과는 하기 표 1 에 제시된다.
표 1
Figure pct00001

하나의 구현예에서, Fab 항체 단편 또는 scFv 항체 단편은 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 GSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 03, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 을 포함한다.
하나의 구현예에서, Fab 항체 단편 또는 scFv 항체 단편은 아미노산 서열 X2GSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 05, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X2 는 G 를 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함한다.
하나의 구현예에서, Fab 항체 단편 또는 scFv 항체 단편은 아미노산 서열 GnSLPX1TGGSGSX3 (SEQ ID NO: 06, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, n=1, 2 또는 3 임) 을 20 개의 C 말단 아미노산 잔기 내에 포함하고, 이 때 X3 은 아미노산 서열 태그이다.
하나의 구현예에서, Fab 항체 단편 또는 scFv 항체 단편은 아미노산 서열 X2GSLPX1TGGSGSX3 (SEQ ID NO: 07, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, n=1, 2 또는 3 임) 을 20 개의 C 말단 아미노산 잔기 내에 포함하고, 이 때 X2 는 G 를 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있고, X3 은 아미노산 서열 태그이다.
"콤비매트릭스 (Combimatrix)" 접근법
첫번째 결합 단위, 예컨대 항체 Fab 단편을, 또다른 특이적 결합 단위, 예컨대 두번째 항체 Fab 단편 또는 전장 중쇄 및 이의 동족 경쇄 및 디술파이드 연결된 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 외-분지 항체 단편과 조합시키는 것이 바람직하다. 또한, 첫번째 결합 단위가 다수의 상이한 기타 결합 단위에 연결될 때 이것이 더 양호한 특성을 갖는지를 스크리닝하는 것이 가능하다. 소위 콤비매트릭스 접근법이라고 불리는 것을 사용해서, 결합 단위의 다수의 조합이 용이한 방식으로 다뤄질 수 있다. 두번째 결합 단위가 상이한 표적/에피토프/항원에 결합할 수 있거나, 동일한 항원이지만 상이한 에피토프에 결합할 수 있거나, 동일한 에피토프이지만 단일 결합 부분의 상이한 변이체 (예를 들어, 인간화 후보자) 에 결합할 수 있다는 것이 지적되어야만 한다.
본 시나리오에서, 자동화된 플랫폼은 결합 단위 및 이들의 반응 또는 유도체를 파이펫팅하고, 정제 및 결합시키는 임무를 수행할 수 있다. 예를 들어, 96-웰 플레이트 또는 기타 고 출력 포맷을 사용하는 임의의 플랫폼 (예컨대 Eppendorf epMotion 5075vac 파이펫팅 로봇) 이 적합하다.
먼저, 결합 단위를 인코딩하는 구축물의 클로닝을 수행한다. 결합 단위를 인코딩하는 핵산을 가진 플라스미드는, 하나의 인코딩된 결합 단위의 C-말단 영역은 소르타제-모티브 (motive) 및 His-태그를 함유하고, 각각의 기타 결합 단위의 하나의 N-말단 영역이 올리고글라이신 모티프 상에 포함되는 통상 유전자 합성에 의해, 또는 B-세포 PCR 및 서열- 및 라이게이션-독립적 클로닝 (SLIC) 을 통한 가변 도메인의 불변 영역과 같은 필수적인 요소, 소르타제 모티브 및 His-태그를 각각 함유하는 적합한 벡터 내로의 클로닝에 의해 수득된다. 플라스미드는 다중-웰 플레이트의 개별 웰 내로 개별적으로 옮겨진다 (전체 플레이트가 로딩될 수 있음). 이후, 플라스미드를 결합 단위-코딩 영역을 절단해내는 제한 효소 믹스로 소화시킨다. 오직 하나의 제한 효소 믹스가 모든 플라스미드에 대해 필요한 방식으로 모든 유전자 합성을 디자인하는 것이 바람직하다. 이후, 임의의 세정 단계는 정제된 DNA 단편을 산출한다. 상기 단편은 상기 언급된 바와 같은 동일한 제한 믹스로 허용체 벡터를 절단해 낸 플라스미드 백본 내로 라이게이션된다. 대안적으로는, 클로닝 절차는 SLIC-매개 클로닝 단계에 의해 수행될 수 있다 (예를 들어, PCT/EP2012/076155 참조). 라이게이션 후, 자동화된 플랫폼이 모든 라이게이션 믹스를 적격 대장균 (E. coli) 세포 (예를 들어, Top10 Multi Shot, Invitrogen) 가 있는 추가의 다중-웰 플레이트 내로 옮기고, 형질전환 반응을 수행한다. 세포를 원하는 밀도로 배양한다. 배양 혼합물의 분취액으로부터 글리세롤 저장액을 수득할 수 있다. 배양물로부터 플라스미드를 (예를 들어, 플라스미드 단리 미니 키트 (예를 들어, NucleoSpin 96 Plasmid, Macherey& Nagel) 를 사용하여) 단리한다. 플라스미드 정체는 적합한 제한 믹스 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (예를 들어, E-Gel 48, Invitrogen) 으로 분취액을 소화시킴으로써 확인된다. 이후, 신규 플레이트에, 대조 서열분석 반응을 수행하기 위해 플라스미드의 분취액을 적재할 수 있다.
다음 단계에서, 결합 단위가 발현된다. 따라서, HEK 세포를 다중-웰 플레이트 (예를 들어, 48-웰-플레이트) 또는 소형 진탕 플라스크 상에 시딩하고, 단리된 플라스미드 (적합한 백본 벡터 내에 결합 단위-코딩 영역을 함유하는) 로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션된 HEK 세포를 수 일 동안 배양하고, 수확하였다 (예를 들어, 진공 스테이션 (station) 을 사용함으로써 1.2 μm 및 0.22 μm 필터 플레이트를 통한 여과에 의해). 예를 들어, ELISA 를 수행함으로써 적정농도를 모니터링 할 수 있다.
결합 단위는 sortase-매개 펩티드전이 반응을 사용하여 서로 연결될 수 있다. 첫번째 결합 단위, 두번째 결합 단위, 및 sortase 반응 믹스가 다중-웰 포맷에서 결합될 수 있다. 37℃ 에서 4-72 시간 (예를 들어, 16 시간) 동안 인큐베이션 후, 접합체는 음성 His-태그 선별 절차 (혼합물을 예를 들어, His MultiTrap HP 플레이트 (GE Healthcare) 상에 적용함) 를 사용하여 수확하고, 여과할 수 있는데, His-태그를 여전히 가지고 있는 모든 분자는 크로마토그래피 컬럼 상에 결합되는 반면, 접합체는 여과액에서 발견되며; 여과액으로는 완충액 교환이 예를 들어, 접합체를 초여과 막 상에 적용함으로서, 또는 결합 단위 중 하나에 특이적인 친화성 매질을 함유하는 플레이트를 사용함으로써 이뤄져야만 한다.
다중특이적 결합 분자는 콤비매트릭스 (Combimatrix) 접근법을 사용하여 제조될 수 있다 (하기 표 참조).
Figure pct00002
다중-웰 플레이트의 첫번째 행에 동등한 몰 농도의 C 말단 Sortase 모티프를 포함하는 상이한 첫번째 결합 단위를 각각의 웰 (첫번째 행의 첫번째 웰을 제외하고) 내에 파이펫팅하고, 아라비아 숫자 (예를 들어, 1 내지 11) 로 지정하였다. 동일한 플레이트의 첫번째 컬럼에서, 동등한 몰 농도의 N-말단 영역 내에 올리고글라이신을 포함하는 상이한 두번째 결합 단위를 각각의 웰 (첫번째 열의 첫번째 웰을 제외하고) 내에 파이펫팅하고, 글자 (예를 들어, A 내지 G) 로 지정하였다. 이후 첫번째 행의 모든 첫번째 결합 단위를 첫번째 열의 모든 두번째 결합 단위와 조합시키고 (예를 들어, 96-웰 플레이트 중 77 개의 조합을 산출함), 숫자 및 글자의 조합 (예를 들어, 1A 내지 11G) 으로 지정하였다. 모든 조합에, 적합한 완충액 중의 Sortase 를 첨가한다. 효소적 접합을 수행한 후, 임의의 정제 단계가 수행될 수 있다. 다중특이적 결합 분자를 이후 세포-기반 검정에서 평가할 준비를 하였다.
III. 재조합 방법
OA-Fc-영역 접합체의 라이게이션 성분, 특히, 외-분지 항체 변이체 (OA-Fc-Gm) 및 단일 사슬 항원 결합 폴리펩티드 (예를 들어, scFv, scFab 또는 다르핀) 또는 다중 사슬 항원 결합 복합체 (예를 들어, dsFv 또는 Fab) 는 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산될 수 있으며, 예를 들어, US 4,816,567 을 참고한다.
하나의 양상에서 OA-Fc~폴리펩티드 접합체의 제조 방법이 제공되고, 여기서 상기 방법은 (i) 접합체의 외-분지 항체 변이체 (OA-Fc-Gm) 부분을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 숙주 세포를 외-분지 항체 변이체 (OA-Fc-Gm) 의 발현/분비에 적합한 조건 하에 배양하고, 임의로 OA-Fc-Gm 부분을 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 회수하는 단계, 및 (ii) 접합체의 폴리펩티드 부분을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 숙주 세포를 폴리펩티드의 발현/분비에 적합한 조건 하에 배양하고, 임의로 폴리펩티드 부분을 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 회수하는 단계, 및 (iii) OA-Fc~폴리펩티드 접합체의 재조합적으로 생산된 부분들을 소르타제 A 매개 펩티드전이를 사용하여 효소적으로 접합시키는 단계를 포함한다.
OA-Fc~폴리펩티드 접합체의 OA-Fc-Gm 부분 및 폴리펩티드 부분의 재조합 생산을 위해, 예를 들어, 위에 기재된 바와 같은, OA-Fc~폴리펩티드 접합체의 OA-Fc-Gm 부분 및 폴리펩티드 부분을 인코딩하는 핵산을 단리하고, 후속적인 숙주 세포에서의 클로닝 및/또는 발현/분비를 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 그러한 핵산은 종래의 절차를 사용하여 용이하게 단리 및/또는 생산될 수 있다.
폴리펩티드-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현/분비에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능가 필요하지 않을 때, 폴리펩티드는 박테리아에서 생산될 수 있다 (예를 들어, US 5,648,237, US 5,789,199, 및 US 5,840,523, Charlton, Methods in Molecular Biology 248 (2003) 245-254 (B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ) (대장균에서의 항체 분절의 발현을 기재함) 참고). 발현 후에, 폴리펩티드는 박테리아 세포 페이스트로부터 가용성 분획 중에 단리될 수 있거나, 또는 가용화되어 생체활성 형태로 되접힐 수 있는 불용성 분획 소위 봉입체로부터 단리될 수 있다. 이후 폴리펩티드는 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물에 더하여, 진핵 미생물 예컨대 사상 진균 또는 효모가 폴리펩티드-인코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이며, 글리코실화 경로가 "인간화" 되어, 일부 또는 전부 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩티드의 생성을 초래하는 진균 및 효모 균주를 포함한다 (예를 들어, Gerngross, Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414, 및 Li, et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215 참고).
글리코실화된 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포성 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 에서 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 수많은 배큘로바이러스 균주가 식별되었다.
식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다 (예를 들어, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978, 및 US 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체의 생산을 위한 PLANTIBODIES™ 기술을 기재함) 참고).
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장하도록 적응된 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 COS-7 세포주 (SV40 에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포; HEK293 세포주 (인간 배아 신장) BHK 세포주 (아기 햄스터 신장); TM4 마우스 세르톨리 세포주 (TM4 세포, 예를 들어, Mather, Biol. Reprod. 23 (1980) 243-251 에 기재됨); CV1 세포주 (원숭이 신장 세포); VERO-76 세포주 (아프리카 녹색 원숭이 신장 세포); HELA 세포주 (인간 자궁경부암 세포); MDCK 세포주 (개 신장 세포); BRL-3A 세포주 (버팔로 랫트 간 세포); W138 세포주 (인간 폐 세포); HepG2 세포주 (인간 간 세포); MMT 060562 세포주 (마우스 유방암 세포); TRI 세포주 (예를 들어, Mather, et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 에 기재됨); MRC5 세포주; 및 FS4 세포주이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 CHO 세포주 (중국 햄스터 난소 세포), 예를 들어 DHFR 음성 CHO 세포주 (Urlaub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216), 및 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0 세포주를 포함한다. 폴리펩티드 생산에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주의 리뷰에 대해, 예를 들어, Yazaki, and Wu, Methods in Molecular Biology, Antibody Engineering 248 (2004) 255-268 (B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ) 을 참고한다.
IV. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 구현예에서, 본원에 제공된 2-특이적 항체 중 임의의 것이 생물학적 샘플 내에 하나 또는 두 항원의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에 사용되는 용어 "검출하기" 는 정량 또는 정성 검출을 포함한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대 암 세포의 생검을 포함한다.
하나의 구현예에서, 진단 또는 검출 방법에서 사용하기 위한 2-특이적 항체가 제공된다. 추가의 양상에서, 생물학적 샘플 내의 암 세포의 존재의 검출 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 방법은 생물학적 샘플을 본원에 기재된 2-특이적 항체와 2-특이적 항체의 이의 항원 또는 항원들과의 결합을 허용하는 조건 하에서 접촉시키고, 복합체가 2-특이적 항체와 이의 항원 또는 항원들 사이에 형성되는지를 측정하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관 내 또는 생체 내 방법일 수 있다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적 질환에는 암이 포함된다.
특정 구현예에서, 표지된 2-특이적 항체가 제공된다. 표지에는 직접적으로 검출되는 표지 또는 부분 (예컨대 형광, 발색단, 전자-밀도, 화학발광 및 방사능 표지) 뿐 아니라, 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 부분, 예컨대 효소 또는 표지가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 표지에는 방사능동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라아제, 예를 들어, 반딧불 루시페라아제 및 박테리아 루시페라아제 (US 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 호스래디시 퍼옥시다아제 (HRP), 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 당류 옥시다아제, 예를 들어, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제, 및 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제, 헤테로시클릭 옥시다아제, 예컨대 헤테로시클릭 옥시다아제, 예컨대 유리카아제 및 잔틴 옥시다아제 (염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소와 커플링됨), 예컨대 HRP, 락토퍼록시다아제, 또는 마이크로퍼옥시다아제, 비오틴/아비딘, 스핀 라벨, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
V. 약학 조성물
본원에 기재된 2-특이적 항체의 약학 조성물은 원하는 순도를 갖는 이러한 항체를 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용가능한 담체 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.), (1980)) 와 혼합함으로써, 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 무독성이고, 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대, 옥타데실 디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤즈알코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저 분자량 (약 10 개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리 (비닐피롤리돈); 아미노산, 예컨대 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 본원의 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체에는 추가로 사이질 약물 분산액 제제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다아제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예컨대 rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.) 이 포함된다. rhuPH20 을 비롯한, 특정의 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 US 2005/0260186 및 US 2006/0104968 에 기재되어 있다. 하나의 양상에서, sHASEGP 는 하나 이상의 부가적인 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형은 US 6,267,958 에 기재되어 있다. 수성 항체 제형에는 US 6,171,586 및 WO 2006/044908 에 기재된 것들이 포함되고, 상기 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본원의 제형은 또한 치료되는 특정 증상에 필요한 것인 1 개 초과의 유효 성분, 바람직하게는 서로에게 악영향을 주지 않는 상보적 활성을 가진 것들을 함유할 수 있다. 이러한 유효 성분은 의도되는 목적에 유효한 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.
유효 성분은 예를 들어, 코아세르베이션 (coacervation) 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 내에 또는 마크로에멀젼 내에 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기법은 문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980) 에 기재되어 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 성형품의 형태, 예를 들어, 필름, 또는 마이크로캡슐이다.
생체 내 투여에 사용하고자 하는 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균은, 예를 들어, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
VI. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 2-특이적 항체 중 임의의 것이 치료 방법에서 사용될 수 있다.
하나의 양상에서, 의약으로서 사용하기 위한 2-특이적 항체가 제공된다. 추가의 양상에서, 암을 치료하는데 사용하기 위한 2-특이적 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 치료 방법에서 사용하기 위한 2-특이적 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 개체에게 2-특이적 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 암을 가진 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 2-특이적 항체를 제공한다. 하나의 이러한 구현예에서, 방법은 개체에게 예를 들어 하기에 기재되는 바와 같은 하나 이상의 부가적인 치료제의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 암 세포를 제거/살해/용리시키기는데 사용하기 위한 2-특이적 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 개체에게 암 세포를 제거/살해/용리시키기 위해 2-특이적 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 세포를 제거/살해/용리시키는 방법에서 사용하기 위한 2-특이적 항체를 제공한다. 상기 구현예 중 임의의 것에 따른 "개체" 는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 의약의 제조 또는 제제에서의 2-특이적 항체의 용도를 위해 제공된다. 하나의 구현예에서, 의약은 암의 치료를 위한 것이다. 추가의 구현예에서, 의약은 암을 가진 개체에게 유효량의 의약을 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법에서 사용하기 위한 것이다. 하나의 이러한 구현예에서, 방법은 개체에게 예를 들어 하기에 기재되는 바와 같은 하나 이상의 부가적인 치료제의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서, 의약은 암 세포를 제거/살해/용리시키기 위한 것이다. 추가의 구현예에서, 의약은 개체에게 암 세포를 제거/살해/용리시키기 위한 유효량의 의약을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서의 암 세포를 제거/살해/용리시키는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 상기 구현예 중 임의의 것에 따른 "개체" 는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 암 치료 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 방법은 암을 가진 개체에게 유효량의 2-특이적 항체를 투여하는 것을 포함한다. 하나의 이러한 구현예에서, 본 방법은 개체에게 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 부가적인 치료제의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기 구현예 중 임의의 것에 따른 "개체" 는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 개체에서 암 세포를 제거/살해/용리시키기 위한 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 방법은 개체에게 암 세포를 제거/살해/용리시키기 위해 유효량의 2-특이적 항체를 투여하는 것을 포함한다. 하나의 구현예에서, "개체" 는 인간이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 예를 들어, 상기 치료 방법 중 임의의 것에서 사용하기 위한, 본원에 제공된 2-특이적 항체 중 임의의 것을 포함하는 약학 제형을 제공한다. 하나의 구현예에서, 약학 제형은 본원에 제공된 2-특이적 항체 중 임의의 것 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또다른 구현예에서, 약학 제형은 본원에 제공된 2-특이적 항체 중 임의의 것 및 예를 들어 하기에 기재되는 바와 같은 하나 이상의 부가적인 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체는 요법에서 단독으로 또는 다른 제제와 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 하나 이상의 부가적인 치료제와 동시에 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 부가적인 치료제는 세포독성제 또는 화학치료제이다.
상기 명시된 이러한 조합 요법은 조합 투여 (2 가지 이상의 치료제가 동일한 또는 별도의 제형 내에 포함됨), 및 개별 투여를 포함하는데, 이 경우 본 발명의 항체의 투여는 부가적인 치료제 및/또는 면역보강제의 투여 전에, 이와 동시에 및/또는 이후에 일어날 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 방사선 요법과 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 (및 임의의 부가적인 치료제) 는 비경구, 폐내, 및 비강내, 및, 국소 치료가 요망되는 경우, 병반내 투여를 비롯한 임의의 적합한 방식에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여가 포함된다. 투여는 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 주사, 예컨대 부분적으로는 투여가 간단한지 또는 만성적인지에 따라, 정맥내 또는 피하 주사에 의해 실시될 수 있다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 일시 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 투여 스케줄이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체는 양호한 의료적 실시와 일치하는 방식으로 제형화되고, 투약되고, 투여될 것이다. 본 문맥에서 고려되는 인자에는, 치료할 특정 질환, 치료할 특전 포유류, 개별 환자의 임상적 상태, 질환의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 의사에게 공지된 기타 인자가 포함된다. 항체는 반드시 그런 것은 아니지만, 논의되는 질환을 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 임의로 제형화될 필요도 있다. 이러한 기타 제제의 유효량은 제형 내에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 기타 인자에 따라 다르다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 것과 동일한 투여량과 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99% 로, 또는 경함적으로/임상적으로 적합한 것으로 결정되는 임의의 투여량 및 임의의 경로로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체 (단독으로 또는 하나 이상의 기타 부가적인 치료제와 조합으로 사용되는 경우) 의 적합한 투여량은 치료하고자 할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 경중도 및 경과, 항체가 예방적 또는 치료적 목적을 위해 투여되는지의 여부, 이전 요법, 환자의 임상적 이력 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 다를 것이다. 항체는 환자에게 1 회에 또는 일련의 치료에 걸쳐 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 경중도에 따라, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.5 mg/kg - 10 mg/kg) 의 항체는, 예를 들어, 1 회 이상의 개별 투여에 의한, 또는 연속 주입에 의한 것이든지 환자에 대한 투여를 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 전형적인 일일 투여량은 상기 언급되는 인자에 따라, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 것이다. 상태에 따라, 수 일 또는 그 이상의 기간에 걸친 반복된 투여를 위해서는, 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 일어날때까지 지속될 것이다. 항체의 하나의 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이의 임의의 조합) 의 1 회 이상의 투여량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 투여량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주 또는 매 3 주 (예를 들어, 환자가 약 2 내지 약 20, 또는 예를 들어, 약 6 투여량의 항체를 수여받는 식) 투여될 수 있다. 초기의 높은 적재 투여량, 후 1 회 이상의 적은 투여량이 투여될 수 있다. 예시적 투여 섭생은 [[예시적 투여 섭생을 첨가하기, 알려져 있다면, 예를 들어, "약 4 mg/kg 의 초기 적재 투여량 후, 약 2 mg/kg 의 항체의 주당 유지 투여량"]] 을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 기타 투여량 섭생이 유용할 수 있다. 상기 요법의 진행은 통상의 기법 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.
상기 임의의 제형 또는 치료 방법은 2-특이적 항체 대신에 또는 이에 더해 본 발명의 면역접합체를 사용하여 실시될 수 있다는 것으로 이해된다.
VII. 제조품
본 발명의 또다른 양상에서, 상기 기재된 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기 및 용기 상의 또는 용기와 연관된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 용기는 조성물 그 자체 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또다른 조성물과 조합된 조성물을 담고 있으며, 멸균 접근 포트 (예를 들어, 용기는 피하 (hypodermic) 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 가진 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음) 를 가질 수 있다. 조성물 내 하나 이상의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택되는 상태를 치료하기 위해 사용되는 것을 표시한다. 게다가, 제조품은 하기 요소를 포함할 수 있다: (a) 내부에 함유된 조성물이 있는 제 1 용기, 상기 조성물은 본 발명의 항체를 포함함; 및 (b) 내부에 함유된 조성물이 있는 제 2 용기, 상기 조성물은 추가의 세포독성제 또는 그렇지 않으면 치료제를 포함함. 본 발명의 상기 구현예에서 제조품은 조성물이 특정 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있다는 것을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로는, 제조품은 약학적으로-허용가능한 완충액, 예컨대 세균발육저지 주사용수 (BWFI), 인산염-완충 식염수, 링거 (Ringer) 용액 및 덱스트로오스 용액을 포함하는 제 2 (또는 제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 기타 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 비롯해서, 판매자 및 사용자 관점으로부터 바람직한 기타 물질을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제조품에 2-특이적 항체 대신에 또는 이 외에도 본 발명의 면역접합체가 포함될 수 있는 것으로 이해된다.
서열 목록의 설명:
SEQ ID NO: 01 내지 07 및 66 내지 67 Sortase 모티프
SEQ ID NO: 08 Fc-영역 친핵체
SEQ ID NO: 09 내지 10 접합체 내 Sortase 모티프 나머지
SEQ ID NO: 11 내지 29 아미노산 서열 태그
SEQ ID NO: 30 인간 CH2 도메인
SEQ ID NO: 31 인간 CH3 도메인
SEQ ID NO: 32 내지 46 예시적 야생형 및 변이체 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드
SEQ ID NO: 47 내지 65 실시예에서 사용되는 서열.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제시된 일반적인 설명을 제시하면서 다양한 기타 구현예가 실시될 수 있다고 이해된다.
상기 발명이 이해의 명확성을 목적으로 설명과 예시에 의해 더욱 상세히 기술되고는 있지만, 설명과 예시가 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
재료 및 방법
재조합 DNA 기법
문헌 [Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)] 에 기재된 바와 같이 DNA 를 조작하기 위해 표준 방법이 사용되었다. 분자 생물학 시약은 제조자의 지침에 따라 사용되었다.
유전자 합성
원하는 유전자 분절을 Geneart GmbH (Regensburg, Germany) 에서 화학적 합성에 의해 제조했다. 합성된 유전자 단편을 증식/증폭을 위해 대장균 플라스미드 내로 클로닝했다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인했다.
단백질 측정
정제된 폴리펩티드의 단백질 농도를 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 ㎚ 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 확인했다.
실시예 1
발현 플라스미드의 생성
기본/표준 포유류 발현 플라스미드의 설명
원하는 단백질을 인간 배아 신장 세포 (HEK 293) 의 일시적 트랜스펙션에 의해 발현시켰다. 원하는 유전자/단백질 (예를 들어, 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 또는 그의 N-말단에 올리고글라이신을 함유하는 Fc-사슬) 의 발현을 위해 하기 기능적 요소들을 포함하는 전사 단위를 사용했다:
- 인트론 A 를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 조기 발현 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 영역 (5'UTR),
- 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열 (SS),
- 발현될 유전자/단백질 (예를 들어, 전장 항체 중쇄), 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH pA).
발현될 원하는 유전자를 포함하는 발현 단위/카세트 외에 기본/표준 포유류 발현 플라스미드는 하기를 함유한다:
- 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기원, 및
- 대장균에서 암피실린 저항성을 부여하는 베타-락타마제 유전자.
하기 폴리펩티드/단백질에 대해 코딩하는 발현 플라스미드를 구축했다:
- T366W 돌연변이를 함유하는 서브클래스 IgG1 의 인간 중쇄 불변 영역과 조합된 페르투주맙 중쇄 가변 도메인:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 47).
- 인간 카파 경쇄 불변 영역과 조합된 페르투주맙 경쇄 가변 도메인:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 48).
- T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 함유하는 서브클래스 IgG1 의 인간 중쇄 불변 영역과 조합된 트라스투주맙 중쇄 가변 도메인:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 49).
- 인간 카파 경쇄 불변 영역과 조합된 트라스투주맙 경쇄 가변 도메인:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 50).
- C-말단 GGGSLPETGGSGSHHHHHH 아미노산 서열을 함유하는 서브클래스 IgG1 의 인간 중쇄 불변 영역 1 (CH1) 및 페르투주맙 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 Fab 단편:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGSLPETGGSGSHHHHHH (SEQ ID NO: 51).
- C-말단 GSLPETGGSGSHHHHHH 서열을 함유하는 서브클래스 IgG1 의 인간 중쇄 불변 영역 1 (CH1) 및 페르투주맙 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 Fab 단편:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGSLPETGGSGSHHHHHH (SEQ ID NO: 52).
- C-말단 LPETGGSGSHHHHHH 서열을 함유하는 서브클래스 IgG1 의 인간 중쇄 불변 영역 1 (CH1) 및 페르투주맙 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 Fab 단편:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCLPETGGSGSHHHHHH (SEQ ID NO: 53).
- C-말단 GGGSLPETGGSGSHHHHHH 서열을 함유하는 서브클래스 IgG1 의 인간 중쇄 불변 영역 1 (CH1) 및 트라스투주맙 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 Fab 단편:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGSLPETGGSGSHHHHHH (SEQ ID NO: 54).
- C-말단 GSLPETGGSGSHHHHHH 서열을 함유하는 서브클래스 IgG1 의 인간 중쇄 불변 영역 1 (CH1) 및 트라스투주맙 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 Fab 단편:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGSLPETGGSGSHHHHHH (SEQ ID NO: 55).
- C-말단 LPETGGSGSHHHHHH 서열을 함유하는 서브클래스 IgG1 의 인간 중쇄 불변 영역 1 (CH1) 및 트라스투주맙 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 Fab 단편:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCLPETGGSGSHHHHHH (SEQ ID NO: 56).
- N-말단 GGGDKTHTCPPC 서열을 함유하는 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 갖는 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 (인간 IgG1(CH2-CH3)):
GGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 57).
- N-말단 GGHTCPPC 서열을 함유하는 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 갖는 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 (인간 IgG1(CH2-CH3)):
GGHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 58).
- N-말단 GGCPPC 서열을 함유하는 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 갖는 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 (인간 IgG1(CH2-CH3)):
GGCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 59).
- N-말단 GGGDKTHTCPPC 서열을 함유하는 T366W 돌연변이를 갖는 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 (인간 IgG1(CH2-CH3)):
GGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 60).
- N-말단 GGHTCPPC 서열을 함유하는 T366W 돌연변이를 갖는 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 (인간 IgG1(CH2-CH3)):
GGHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 61).
- N-말단 GGCPPC 서열을 함유하는 T366W 돌연변이를 갖는 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 (인간 IgG1(CH2-CH3)):
GGCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 62).
실시예 2
일시적 발현, 정제 및 분석적 특징화
F17 배지 (Invitrogen Corp.) 에서 배양된 HEK293 세포 (인간 배아 신장 세포주 293-유래됨) 의 일시적 트랜스펙션에 의해 항체 사슬을 생성했다. 트랜스펙션을 위해 "293-Fectin" 트랜스펙션 시약 (Invitrogen) 을 사용했다. 전장 중쇄 (페르투주맙-놉 (knob), 또는 트라스투주맙-홀 (hole)), 상응하는 전장 경쇄, 및 N-말단 올리고글라이신 서열 중 하나를 함유하는 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 (놉, 또는 홀 변이체로서) 에 대해 코딩하는, 3 개의 상이한 플라스미드로부터 항체 사슬을 발현시켰다. 3 가지 플라스미드를 트랜스펙션시 등몰 플라스미드 비율로 사용했다. 트랜스펙션을 제조사의 지침에 명시된 바와 같이 수행했다. 항체 Fc-영역-함유 세포 배양물 상청액을 트랜스펙션 후 7 일째에 수집했다. 상청액을 정제 전까지 동결 상태로 저장했다.
항체 Fc-영역-함유 배양물 상청액을 2 개의 크로마토그래피 단계에 의해 여과 및 정제했다. 항체 Fc-영역을 PBS (1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl), pH 7.4 로 평형시킨 HiTrap MabSelectSuRe (GE Healthcare) 를 사용하여 친화도 크로마토그래피에 의해 포획했다. 미결합 단백질을 평형 완충액으로 세정하여 제거하고, 항체 Fc-영역을 0.1 M 시트레이트 완충액, pH 3.0 으로 회수했다. 용리 직후 용액을 1 M Tris-염기, pH 9.0 로 pH 6.0 으로 중화시켰다. Superdex 200™ (GE Healthcare) 에서의 크기 배제 크로마토그래피를 제 2 정제 단계로서 사용했다. 크기 배제 크로마토그래피를 40 mM Tris-HCl 완충액, 0.15 M NaCl, pH 7.5 중에서 수행했다. 용리된 항체 Fc-영역을 Biomax-SK 멤브레인 (Millipore, Billerica, MA) 이 구비된 Ultrafree-CL 원심분리 필터 유닛으로 농축시키고, -80 ℃ 에서 저장했다.
아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 ㎚ 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 항체 Fc-영역의 단백질 농도를 확인했다. SDS-PAGE 에 의해 환원제 (5 mM 1.4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에 및 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하여 순도 및 적절한 항체 Fc-영역 형성을 분석했다.
실시예 3
C-말단 LPX1TG 모티프를 함유하는 항체 Fab 단편의 일시적 발현, 정제 및 분석적 특징화
F17 배지 (Invitrogen Corp.) 에서 배양된 HEK293 세포 (인간 배아 신장 세포주 293-유래됨) 의 일시적 트랜스펙션에 의해 항체 Fab 단편을 생성했다. 트랜스펙션을 위해 "293-Fectin" 트랜스펙션 시약 (Invitrogen) 을 사용했다. 전장 경쇄 (페르투주맙, 또는 트라스투주맙) 및 C-말단 LPX1TG 서열 중 하나를 함유하는 상응하는 절두된 중쇄에 대해 코딩하는, 2 개의 상이한 플라스미드로부터 항체 Fab 단편을 발현시켰다. 2 가지 플라스미드를 트랜스펙션시 등몰 플라스미드 비율로 사용했다. 트랜스펙션을 제조사의 지침에 명시된 바와 같이 수행했다. Fab 분절-함유 세포 배양물 상청액을 트랜스펙션 후 7 일째에 수집했다. 상청액을 정제 전까지 동결 상태로 저장했다.
Fab 단편 함유 배양물 상청액을 2 개의 크로마토그래피 단계에 의해 여과 및 정제했다. Fab 단편을 PBS 및 20mM 이미다졸 (1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 20mM 이미다졸), pH 7.4 로 평형시킨 HisTrap HP Ni-NTA 칼럼 (GE Healthcare) 을 사용하여 친화도 크로마토그래피에 의해 포획했다. 미결합 단백질을 평형 완충액으로 세정하여 제거했다. 히스티딘-태그된 단백질을 10 칼럼 부피로 PBS (1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 400 mM 이미다졸) 중 20 mM 내지 400 mM 선형 이미다졸 구배로 용리했다. Superdex 200™ (GE Healthcare) 에서의 크기 배제 크로마토그래피를 제 2 정제 단계로서 사용했다. 크기 배제 크로마토그래피를 40 mM Tris-HCl 완충액, 0.15 M NaCl, pH 7.5 중에서 수행했다. Fab 단편을 Biomax-SK 멤브레인 (Millipore, Billerica, MA) 이 구비된 Ultrafree-CL 원심분리 필터 유닛으로 농축시키고, -80 ℃ 에서 저장했다.
아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 ㎚ 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 Fab 분절의 단백질 농도를 확인했다. SDS-PAGE 에 의해 환원제 (5 mM 1.4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에 및 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하여 순도 및 적절한 항체 Fab 형성을 분석했다.
실시예 4
항체 Fc-영역 및 결합 단위 (Fab 분절) 의 소르타제 A 매개되는 라이게이션
소르타제-매개되는 펩티드전이 반응을 위해, N-말단 절두된 황색포도상구균 소르타제 A 를 사용했다 (Δ1-59). 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5 를 함유하는 완충액 (소르타제-완충액) 중에서 반응을 수행했다. 반응에서, VH-CH1 중쇄의 C-말단 (...KSC) 과 소르타제 모티프의 N-말단 (LPETGGSGSHHHHHH, SEQ ID NO: 63, GSLPETGGSGSHHHHHH, SEQ ID NO: 64, 및 GGGSLPETGGSGSHHHHHH, SEQ ID NO: 65) 사이에 2 가지 상이한 연결성 짧은 아미노산 서열을 포함하거나 포함하지 않는 VH-CH1-중쇄의 C-말단에서 소르타제 모티프 (LPETG) 를 보유하는 Fab 단편 및 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 N-말단에서 올리고글라이신 모티프 및 3 개의 상이한 힌지 서열 (GGCPPC, SEQ ID NO: 8, 식 중 X4 = P, GGHTCPPC, SEQ ID NO: 66, 및 GGGDKTHTCPPC, SEQ ID NO: 67, 각각) 을 보유하는 외-분지 항체를 연결시켜, 항체 Fc-영역 접합체를 초래했다. 반응을 수행하기 위해, 모든 시약을 소르타제 완충액 중 용액으로 만들었다. 제 1 단계에서, 항체 Fc-영역 및 항체 Fab 단편을 혼합하고, 후속적으로 소르타제 A 및 5 mM CaCl2 를 첨가하여 반응을 시작했다. 성분들을 피펫팅에 의해 혼합하고, 37 ℃ 에서 72h 동안 인큐베이션했다. 후속적으로, 반응 혼합물을 동결시켜 반응을 중단시키고, 분석 전까지 -20℃ 에서 저장했다.
몰비 Fab:외-분지 항체:소르타제 = 20:4:1
결과
각각 Fab 의 C-말단에서 및 항체의 N-말단에서 3 가지 상이한 서열을 소르타제 A 에 의해 접합시켜 항체 Fc-영역 접합체의 9 가지 상이한 조합을 수득했다. 커플링 반응의 효율을 상이한 시점에 평가했다. 이를 위해 펩티드전이 반응의 분취물을 SDS-PAGE 에 의해 분석했다. 라이게이션의 효율을 SDS PAGE 겔로부터 농도계측으로 추정했다. 72h 의 반응 후의 결과가 표 2 에 각각의 서열에 대해 나타나 있다.
표 2: Fab 분절과 외-분지 항체의 접합
Figure pct00003
<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Method for selection and production of tailor-made highly selective and multi-specific targeting entities containing at least two different binding entities and uses thereof <130> 31069 WO <150> EP12173875.1 <151> 2012-06-27 <160> 67 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sortase amino acid sequence tag <220> <221> SITE <222> (3) <223> X can be any amino acid residue <400> 1 Leu Pro Xaa Thr Gly 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sortase amino acid sequence tag 2 <220> <221> SITE <222> (1) <223> X = G or GG or GGG <220> <221> SITE <222> (5) <223> X = any amino acid residue <400> 2 Xaa Ser Leu Pro Xaa Thr Gly 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sortase amino acid sequence tag 3 <220> <221> SITE <222> (5) <223> X = any amino acid residue <400> 3 Gly Ser Leu Pro Xaa Thr Gly Gly Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial 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and knob mutation <400> 41 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 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Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Ser 210 215 220 Leu Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gly Ser His His His His His His 225 230 235 <210> 53 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody Fab fragment comprising a Pertuzumab heavy chain variable domain and a human heavy chain constant region 1 (CH1) of the subclass IgG1 containing a C-terminal LPETGGSGSHHHHHH sequence <400> 53 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 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Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly 210 215 220 Gly Gly Ser Leu Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gly Ser His His His His 225 230 235 240 His His <210> 55 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody Fab fragment comprising a Trastuzumab heavy chain variable domain and a human heavy chain constant region 1 (CH1) of the subclass IgG1 containing a C-terminal GSLPETGGSGSHHHHHH sequence <400> 55 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly 210 215 220 Ser Leu Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gly Ser His His His His His His 225 230 235 240 <210> 56 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody Fab fragment comprising a Trastuzumab heavy chain variable domain and a human heavy chain constant region 1 (CH1) of the subclass IgG1 containing a C-terminal LPETGGSGSHHHHHH sequence <400> 56 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Leu 210 215 220 Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gly Ser His His His His His His 225 230 235 <210> 57 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain Fc-region polypeptide (human IgG1(CH2-CH3)) with T366S, L368A and Y407V mutation containing a N-terminal gggdkthtcppc sequence <400> 57 Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 1 5 10 15 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 20 25 30 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 35 40 45 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 50 55 60 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 85 90 95 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 100 105 110 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 115 120 125 Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 130 135 140 Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 145 150 155 160 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 165 170 175 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 195 200 205 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 58 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain Fc-region polypeptide (human IgG1(CH2-CH3)) with T366S, L368A and Y407V mutation containing a N-terminal gghtcppc sequence <400> 58 Gly Gly His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 1 5 10 15 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 20 25 30 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 35 40 45 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 50 55 60 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 65 70 75 80 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 85 90 95 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 100 105 110 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys 115 120 125 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 145 150 155 160 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 165 170 175 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp 180 185 190 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 195 200 205 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 210 215 220 Gly Lys 225 <210> 59 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain Fc-region polypeptide (human IgG1(CH2-CH3)) with T366S, L368A and Y407V mutation containing a N-terminal ggcppc sequence <400> 59 Gly Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 1 5 10 15 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 20 25 30 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 35 40 45 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 50 55 60 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 65 70 75 80 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 85 90 95 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 100 105 110 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu 115 120 125 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys 130 135 140 Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 145 150 155 160 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 165 170 175 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 180 185 190 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 195 200 205 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 60 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain Fc-region polypeptide (human IgG1(CH2-CH3)) with T366W mutation containing a N-terminal gggdkthtcppc sequence <400> 60 Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 1 5 10 15 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 20 25 30 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 35 40 45 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 50 55 60 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 85 90 95 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 100 105 110 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 115 120 125 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 130 135 140 Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 145 150 155 160 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 165 170 175 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 195 200 205 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 61 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain Fc-region polypeptide (human IgG1(CH2-CH3)) with T366W mutations containing a N-terminal gghtcppc sequence <400> 61 Gly Gly His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 1 5 10 15 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 20 25 30 Ser Arg Thr Pro 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polypeptide (human IgG1(CH2-CH3)) with T366W mutation containing a N-terminal ggcppc sequence <400> 62 Gly Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 1 5 10 15 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 20 25 30 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 35 40 45 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 50 55 60 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 65 70 75 80 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 85 90 95 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 100 105 110 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 115 120 125 Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys 130 135 140 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 145 150 155 160 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 165 170 175 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 180 185 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Claims (8)

  1. 하기 단계를 포함하는 2-특이적 항체의 제조 방법:
    하기 (i) 내지 (iii) 을 인큐베이션하는 단계:
    (i) 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPX1TG (SEQ ID NO: 01, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 을 포함하는 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체,
    (ii) 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 및 항체 중쇄 Fc 영역 폴리펩티드를 포함하는 외-분지 (one-armed) 항체 단편,
    전장 항체 중쇄 및 전장 항체 경쇄는 서로 상보적인 동족 항체 사슬이고 이의 가변 도메인 (VH 및 VL) 의 쌍은 항원 결합 부위를 형성하고,
    전장 항체 중쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 항체 힌지 영역을 형성하는 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 서로 공유 연결되고,
    항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 그의 N-말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5) 아미노산 서열을 가짐,
    및
    (iii) 소르타제 A 효소,
    및 이에 의해 2-특이적 항체를 제조하는 단계.
  2. 하기 단계를 포함하는 2-특이적 항체의 제조 방법:
    (i) 세포 함유 샘플에 존재하는 세포 표면 마커를 결정하고 적어도 첫번째 세포 표면 마커 및 두번째 세포 표면 마커를 선별하는 단계,
    (ii) (a) 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPX1TG (SEQ ID NO: 01, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체, 상기 Fab 단편 또는 scFv 항체는 첫번째 세포 표면 마커 또는 이의 리간드에 특이적으로 결합함, (b) 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 외-분지 항체 단편, 상기 전장 항체 중쇄 및 전장 항체 경쇄는 서로 상보적인 동족 항체 사슬이고 이의 가변 도메인 (VH 및 VL) 의 쌍은 두번째 세포 표면 마커 또는 이의 리간드에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, 전장 항체 중쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 항체 힌지 영역을 형성하는 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로 공유 연결되고, 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 그의 N-말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5) 아미노산 서열을 가짐, 및 (c) 소르타제 A 효소를 인큐베이션하는 단계
    및 이에 의해 2-특이적 항체를 제조하는 단계.
  3. 하기 단계를 포함하는 항원 결합 부위의 조합의 결정 방법:
    (i) 하기 (a), (b) 및 (c) 를 조합함으로써 제조되는 다수의 2-특이적 항체의 결합 특이성 및/또는 선택성 및/또는 친화성 및/또는 효과기 기능 및/또는 생체 내 반감기를 측정하는 단계: (a) 첫번째 다수의 항체 Fab 단편 또는 scFv 항체 단편의 각각의 일원, 상기 각각의 일원은 20 개의 C-말단 아미노산 잔기 내에 아미노산 서열 LPX1TG (SEQ ID NO: 01, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하고, Fab 단편 또는 scFv 항체는 첫번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합함, (b) 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 다수의 외-분지 항체 단편의 각각의 일원, 상기 전장 항체 중쇄 및 전장 항체 경쇄는 서로 상보적인 동족 항체 사슬이고, 이의 가변 도메인 (VH 및 VL) 의 쌍은 두번째 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, 전장 항체 중쇄 및 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 항체 힌지 영역을 형성하는 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 서로 공유 연결되고, 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 그의 N-말단에 올리고글라이신 Gm (m = 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5) 아미노산 서열을 가짐, 및 (c) 소르타제 A 효소
    및
    (ii) 적합한 결합 특이성 및/또는 선택성 및/또는 친화성 및/또는 효과기 기능 및/또는 생체 내 반감기를 가진 2-특이적 항체를 선택하고, 항원 결합 부위의 조합을 결정하는 단계.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 방법에 의해 수득되는 2-특이적 항체.
  5. 중쇄 중 하나에 아미노산 서열 LPX1TG (SEQ ID NO: 01, 식 중 X1 은 임의의 아미노산 잔기일 수 있음) 를 포함하는 2-특이적 항체.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항, 또는 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, Fc-영역이 위치 329 에서의 자연 발생적 아미노산 잔기의 돌연변이 및 위치 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322 및 331 에서의 아미노산 잔기를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기의 상이한 잔기로의 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함하고, Fc-영역 내의 잔기는 Kabat 의 EU 인덱스에 따라 넘버링되고, 상기 특이적 아미노산 잔기의 변화가 비-개질된 (야생형) Fc-영역과 비교하여 Fc-영역의 효과기 기능의 변경을 야기하는 것을 특징으로 하는 방법 또는 항체.
  7. 제 4 항 또는 제 5 항에 따른 2-특이적 항체를 포함하는 약학 제형.
  8. 의약의 제조에서의 제 4 항 또는 제 5 항에 따른 2-특이적 항체의 용도.
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Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2015153109A (ru) 2009-09-16 2019-01-15 Дженентек, Инк. Содержащие суперспираль и/или привязку белковые комплексы и их применения
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
SG191153A1 (en) 2010-12-23 2013-07-31 Hoffmann La Roche Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
KR20140127854A (ko) 2012-02-10 2014-11-04 제넨테크, 인크. 단일-쇄 항체 및 다른 이종다량체
WO2014001324A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Hoffmann-La Roche Ag Method for selection and production of tailor-made highly selective and multi-specific targeting entities containing at least two different binding entities and uses thereof
RU2015100656A (ru) 2012-06-27 2016-08-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ получения конъюгатов fc-фрагмента антитела, включающих по меньшей мере одну связывающую группировку, которая специфически связывается с мишенью, и их применения
WO2014041072A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the production and selection of molecules comprising at least two different entities and uses thereof
EP3227332B1 (en) 2014-12-03 2019-11-06 F.Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
MX2017007503A (es) * 2014-12-17 2017-10-04 Hoffmann La Roche Metodos novedosos para conjugacion de polipeptido mediada por enzimas usando sortasa.
CA2966289A1 (en) 2014-12-17 2016-06-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Enzymatic one-pot reaction for double polypeptide conjugation in a single step using sortase
WO2016096740A1 (en) 2014-12-17 2016-06-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Activity assay for bond forming enzymes
CN107849126B (zh) * 2015-07-29 2022-04-08 阿勒根公司 仅有重链的抗ang-2抗体
DE102016103562A1 (de) * 2015-09-17 2017-03-23 Topos Nomos Ltd. Pharmazeutische Wirkstoffe zur Verwendung in der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS) und Diagnoseverfahren
JP6895953B2 (ja) 2015-09-25 2021-06-30 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ソルターゼａを利用してチオエステルを作製するための方法
CN108026560A (zh) 2015-09-25 2018-05-11 豪夫迈·罗氏有限公司 在低共熔溶剂中使用分选酶的转酰胺反应
EP3353291B1 (en) 2015-09-25 2021-06-09 F. Hoffmann-La Roche AG Novel soluble sortase a
JP6861702B2 (ja) 2015-09-25 2021-04-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ソルターゼ・コンジュゲート化ループを含む組換え免疫グロブリン重鎖およびそのコンジュゲート
JP7014725B2 (ja) * 2016-02-05 2022-02-01 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー チオールベースの深共融溶媒
JP7258556B2 (ja) 2016-04-28 2023-04-17 ビオミューネクス・ファルマシューティカル Ｅｇｆｒ及びｈｅｒ２をターゲティングする二重特異性抗体
US10738338B2 (en) 2016-10-18 2020-08-11 The Research Foundation for the State University Method and composition for biocatalytic protein-oligonucleotide conjugation and protein-oligonucleotide conjugate
MX2019007984A (es) * 2017-02-02 2019-10-15 Merck Patent Gmbh Apareamiento preferido de dominios de anticuerpos.
EP3579848A4 (en) 2017-02-08 2021-03-03 Dragonfly Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC BINDING PROTEINS FOR ACTIVATING NATURAL KILLER CELLS AND THEIR THERAPEUTIC USES FOR TREATING CANCER
JP7257323B2 (ja) * 2017-02-10 2023-04-13 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｂｃｍａ、ｎｋｇ２ｄ及びｃｄ１６と結合するタンパク質
AU2018220736A1 (en) 2017-02-20 2019-09-05 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding HER2, NKG2D and CD16
US11191845B2 (en) * 2017-06-20 2021-12-07 Sorrento Therapeutics, Inc. CD38 antibody drug conjugate
TWI789399B (zh) * 2017-06-22 2023-01-11 財團法人生物技術開發中心 不對稱異二聚fc-scfv融合抗globo h及抗cd3雙特異性抗體及其於癌症治療上之用途
CN107602702A (zh) * 2017-09-22 2018-01-19 生标（上海）医疗器械科技有限公司 一种同时靶向人p185和血管内皮生长因子的抗体及其应用
CN112368012A (zh) 2018-02-08 2021-02-12 蜻蜓疗法股份有限公司 靶向nkg2d受体的抗体可变结构域
WO2020013126A1 (ja) 2018-07-09 2020-01-16 国立大学法人 熊本大学 環状一本鎖抗体
WO2020200941A1 (en) * 2019-03-29 2020-10-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Spr-based binding assay for the functional analysis of multivalent molecules
KR20220005568A (ko) * 2019-05-09 2022-01-13 제넨테크, 인크. 항체의 제조 방법
KR20220160598A (ko) * 2020-03-30 2022-12-06 고쿠리츠다이가쿠호진 미에다이가쿠 이중 특이적 항체
CN117295760A (zh) * 2021-05-07 2023-12-26 信达生物制药(苏州)有限公司 与Fc受体结合改变的Fc突变体

Family Cites Families (370)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
IL47062A (en) 1975-04-10 1979-07-25 Yeda Res & Dev Process for diminishing antigenicity of tissues to be usedas transplants by treatment with glutaraldehyde
US4150149A (en) 1976-11-29 1979-04-17 Professional Staff Association Of The Los Angeles County Harbor General Hospital Method and means for the early detection and diagnosis of certain types of cancers
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
US4665077A (en) 1979-03-19 1987-05-12 The Upjohn Company Method for treating rejection of organ or skin grafts with 6-aryl pyrimidine compounds
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
US4361544A (en) 1980-03-03 1982-11-30 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibodies specific to intracellular tumor-associated markers
US4444744A (en) 1980-03-03 1984-04-24 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibodies to cell surface antigens
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4868105A (en) 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
SE8505922D0 (sv) 1985-12-13 1985-12-13 Kabigen Ab Construction of an igg binding protein to facilitate downstream processing using protein engineering
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
IL86164A0 (en) 1987-04-28 1988-11-15 Tamir Biotechnology Ltd Improved dna probes
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
PT88550A (pt) 1987-09-21 1989-07-31 Ml Tecnology Ventures Lp Processo para a preparacao de reagentes de ligacao nao nucleotidicos para sondas nucleotidicas
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US4914210A (en) 1987-10-02 1990-04-03 Cetus Corporation Oligonucleotide functionalizing reagents
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
IL85746A (en) 1988-03-15 1994-05-30 Yeda Res & Dev Preparations comprising t-lymphocyte cells treated with 8-methoxypsoralen or cell membranes separated therefrom for preventing or treating autoimmune diseases
ES2064374T3 (es) 1988-04-01 1995-02-01 Carter Wallace Escision especifica de enlaces peptidicos mediante fosfinas organicas que tienen cadenas laterales nucleofilas.
FI891226A (fi) 1988-04-28 1989-10-29 Univ Leland Stanford Junior Reseptordeterminanter i anti-t-celler foer behandling av autoimmunsjukdom.
FR2632955B1 (fr) 1988-06-20 1991-12-27 Oris Ind Derives de nucleosides utilisables pour la synthese d'oligonucleotides marques, oligonucleotides obtenus a partir de ces derives et leur synthese
DE68925971T2 (de) 1988-09-23 1996-09-05 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
WO1990008187A1 (en) 1989-01-19 1990-07-26 Dana Farber Cancer Institute Soluble two domain cd2 protein
FR2642074B1 (fr) 1989-01-20 1994-04-29 Oris Ind Derives de molecules polyhydroxylees permettant l'introduction d'au moins une ramification dans un oligonucleotide
DE69006018T3 (de) 1989-03-21 2004-01-15 Immune Response Corp Inc Impfung und methoden gegen krankheiten, die von pathologischen reaktionen der spezifischen t-zellen abstammen.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
DK0552142T3 (da) 1989-07-19 1998-09-07 Connetics Corp T-cellereceptorpeptider og terapeutika til autoimmune og maligne sygdomme
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
WO1991006305A1 (en) 1989-11-07 1991-05-16 Bristol-Myers Squibb Company Oligomeric immunoglobulins
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1992004053A1 (en) 1990-08-31 1992-03-19 Bristol-Myers Sqibb Company Homoconjugated immunoglobulins
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
US5290925A (en) 1990-12-20 1994-03-01 Abbott Laboratories Methods, kits, and reactive supports for 3' labeling of oligonucleotides
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US6511663B1 (en) 1991-06-11 2003-01-28 Celltech R&D Limited Tri- and tetra-valent monospecific antigen-binding proteins
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
CA2071137A1 (en) 1991-07-10 1993-01-11 Clarence C. Lee Composition and method for revitalizing scar tissue
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
WO1993002093A1 (en) 1991-07-15 1993-02-04 La Jolla Pharmaceutical Company Modified phosphorous intermediates for providing functional groups on the 5' end of oligonucleotides
DE59209203D1 (de) 1991-08-28 1998-03-26 Boehringer Mannheim Gmbh Primer für matrizenabhängige enzymatische nukleinsäuresynthesen
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
DK1024191T3 (da) 1991-12-02 2008-12-08 Medical Res Council Fremstilling af autoantistoffer fremvist på fag-overflader ud fra antistofsegmentbiblioteker
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
WO1994004550A1 (en) 1992-08-21 1994-03-03 Triplex Pharmaceutical Corporation Cholesteryl-modified triple-helix forming oligonucleotides and uses thereof
GB9221657D0 (en) 1992-10-15 1992-11-25 Scotgen Ltd Recombinant bispecific antibodies
AU678787B2 (en) 1992-10-23 1997-06-12 Immunex Corporation Methods of preparing soluble, oligomeric proteins
CA2145985C (en) 1992-10-28 2003-09-16 Napoleone Ferrara Vascular endothelial cell growth factor antagonists
CA2149329C (en) 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5532142A (en) 1993-02-12 1996-07-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Method of isolation and purification of fusion polypeptides
DE4310141A1 (de) 1993-03-29 1994-10-06 Boehringer Mannheim Gmbh Homobidentale trifunktionelle Linker
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
US6476198B1 (en) 1993-07-13 2002-11-05 The Scripps Research Institute Multispecific and multivalent antigen-binding polypeptide molecules
UA40577C2 (uk) 1993-08-02 2001-08-15 Мерк Патент Гмбх Біспецифічна молекула, що використовується для лізису пухлинних клітин, спосіб її одержання, моноклональне антитіло (варіанти), фармацевтичний препарат, фармацевтичний набір (варіанти), спосіб видалення пухлинних клітин
US5635602A (en) 1993-08-13 1997-06-03 The Regents Of The University Of California Design and synthesis of bispecific DNA-antibody conjugates
WO1995009917A1 (en) 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
AU1444095A (en) 1993-12-27 1995-07-17 Baxter International Inc. Water soluble non-immunogenic polyamide cross-linking agents
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US5824483A (en) 1994-05-18 1998-10-20 Pence Inc. Conformationally-restricted combinatiorial library composition and method
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5814464A (en) 1994-10-07 1998-09-29 Regeneron Pharma Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5849879A (en) 1994-11-03 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis of glaucoma
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
GB9504344D0 (en) 1995-03-03 1995-04-19 Unilever Plc Antibody fragment production
JPH08245698A (ja) 1995-03-14 1996-09-24 Soosei:Kk ヒト１型イノシトールトリスホスフェート受容体
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
AU6163196A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Smithkline Beecham Corporation Method for obtaining receptor agonist antibodies
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
SE504798C2 (sv) 1995-06-16 1997-04-28 Ulf Landegren Immunanalys och testkit med två reagens som kan tvärbindas om de adsorberats till analyten
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
WO1997005156A1 (en) 1995-07-27 1997-02-13 Carsten Behrens A new achiral linker reagent for the incorporation of multiple amino groups into oligonucleotides
JPH0987296A (ja) 1995-09-25 1997-03-31 Akira Matsuda サイクリックａｄｐ−リボース類縁体
WO1997014719A1 (en) 1995-10-16 1997-04-24 Unilever N.V. A bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
CA2237296C (en) 1995-11-16 2008-10-07 Boehringer Mannheim Gmbh Process for the preparation of peptides by way of streptavidin fusion proteins
US5736626A (en) 1996-01-29 1998-04-07 The Perkin-Elmer Corporation Solid support reagents for the direct synthesis of 3'-labeled polynucleotides
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
JP2000508892A (ja) 1996-04-04 2000-07-18 ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシャープ 多価および多特異的抗原結合タンパク
AU2660397A (en) 1996-04-05 1997-10-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells
ATE252158T1 (de) 1996-05-15 2003-11-15 Biogenex Lab Nicht-nukleotid verknüpfende reagentien
EP3260468A1 (en) 1997-04-07 2017-12-27 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
EP0973804B1 (en) 1997-04-07 2006-12-27 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
WO1998048032A2 (en) 1997-04-21 1998-10-29 Donlar Corporation POLY-(α-L-ASPARTIC ACID), POLY-(α-L-GLUTAMIC ACID) AND COPOLYMERS OF L-ASP AND L-GLU, METHOD FOR THEIR PRODUCTION AND THEIR USE
DE69830901T2 (de) 1997-05-02 2006-05-24 Genentech Inc., San Francisco ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
US6083715A (en) 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
CA2297070A1 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Morphosys Ag Novel method and phage for the identification of nucleic acid sequences encoding members of a multimeric (poly)peptide complex
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
EP1015480A2 (en) 1997-08-18 2000-07-05 Innogenetics N.V. Interferon-gamma-binding molecules for treating septic shock, cachexia, immune diseases and skin disorders
EP1049787B1 (en) 1998-01-23 2004-11-24 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie Multipurpose antibody derivatives
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
US6117986A (en) 1998-06-10 2000-09-12 Intergen Company, L.P. Pyrimidines linked to a quencher
ATE460946T1 (de) 1998-06-22 2010-04-15 Immunomedics Inc Gebrauch von bispezifischen antikörpern in diagnose und therapie
US7138103B2 (en) 1998-06-22 2006-11-21 Immunomedics, Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US6465211B1 (en) 1998-08-27 2002-10-15 Riken Nucleic acids, vectors and transformed cells for making and using high affinity IP-3 binding polypeptides
JP3538611B2 (ja) 1998-08-27 2004-06-14 独立行政法人理化学研究所 高親和性ｉｐ３結合ポリペプチド
US6573043B1 (en) 1998-10-07 2003-06-03 Genentech, Inc. Tissue analysis and kits therefor
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
CN1810832B (zh) 1998-10-23 2012-12-12 麒麟-安姆根有限公司 与MPl受体结合并具有血小板生成活性的模拟二聚体血小板生成素肽
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
US20030035798A1 (en) 2000-08-16 2003-02-20 Fang Fang Humanized antibodies
AU1687500A (en) 1998-12-16 2000-07-03 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Antihuman vegf monoclonal antibody
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
CN1232039A (zh) 1999-04-02 1999-10-20 中国人民解放军海军总医院 一种基因工程双特异抗体及其应用
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6872806B1 (en) 1999-06-25 2005-03-29 The Governors Of The University Of Alberta Polypeptide compositions formed using a coiled-coil template and methods of use
EP1074563A1 (en) 1999-08-02 2001-02-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Chimeric polypeptides enhancing dimer formation through electrostatic interactions and disulfide bond, method for production and uses thereof
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
AU782626B2 (en) 1999-10-04 2005-08-18 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
US6727356B1 (en) 1999-12-08 2004-04-27 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Fluorescent quenching detection reagents and methods
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
US7449443B2 (en) 2000-03-23 2008-11-11 California Institute Of Technology Method for stabilization of proteins using non-natural amino acids
JP2004500108A (ja) 2000-03-24 2004-01-08 マイクロメット　アーゲー Ｎｋｇ２ｄレセプター複合体のエピトープへの結合部位を含む多機能ポリペプチド
ES2528794T3 (es) 2000-04-11 2015-02-12 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
EP1299419A2 (en) 2000-05-24 2003-04-09 Imclone Systems, Inc. Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production
US6586207B2 (en) 2000-05-26 2003-07-01 California Institute Of Technology Overexpression of aminoacyl-tRNA synthetases for efficient production of engineered proteins containing amino acid analogues
US6511809B2 (en) 2000-06-13 2003-01-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the detection of an analyte by means of a nucleic acid reporter
AU2001270609A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Heterodimeric fusion proteins
JP2002025018A (ja) 2000-07-10 2002-01-25 Tdk Corp 磁気抵抗効果型薄膜磁気ヘッド及びその製造方法
DE10044373A1 (de) 2000-09-08 2002-03-21 Roche Diagnostics Gmbh Neues Reagenz zur Markierung von Nukleinsäuren
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6610472B1 (en) 2000-10-31 2003-08-26 Genetastix Corporation Assembly and screening of highly complex and fully human antibody repertoire in yeast
CA2447832C (en) 2000-12-22 2012-09-25 Jamshid Tanha Phage display libraries of human vh fragments
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
WO2002072141A2 (en) 2001-03-09 2002-09-19 William Herman Targeted ligands
US20030027751A1 (en) 2001-04-10 2003-02-06 Genvec, Inc. VEGF fusion proteins
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
ES2527471T3 (es) 2001-05-11 2015-01-26 Amgen Inc. Péptidos y moléculas relacionadas que se unen a TALL-1
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
US20030082547A1 (en) 2001-08-27 2003-05-01 Ewing Gregory J. Non-fluorescent quencher compounds and biomolecular assays
ES2276735T3 (es) 2001-09-14 2007-07-01 Affimed Therapeutics Ag Anticuerpos fv multimericos de cadena sencilla en tandem.
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7521053B2 (en) 2001-10-11 2009-04-21 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7205275B2 (en) 2001-10-11 2007-04-17 Amgen Inc. Methods of treatment using specific binding agents of human angiopoietin-2
US7332474B2 (en) 2001-10-11 2008-02-19 Amgen Inc. Peptides and related compounds having thrombopoietic activity
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
US7053202B2 (en) 2001-10-19 2006-05-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin DNA cassette molecules, monobody constructs, methods of production, and methods of use therefor
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US20030170230A1 (en) 2002-02-05 2003-09-11 Caterer Nigel Robert Compositions and methods for assembly and stabilization of antibody Fv fragments via antiparallel heterogeneous coiled-coil peptide regions and uses thereof
EA007041B1 (ru) 2002-02-25 2006-06-30 Паблик Уэрхаузинг Компани Кск Система таможенного осмотра и обработки данных и способ её работы для доступной через сеть обработки таможенной информации
AU2003248370A1 (en) 2002-02-27 2003-09-09 California Institute Of Technology Computational method for designing enzymes for incorporation of amino acid analogs into proteins
US20040018557A1 (en) 2002-03-01 2004-01-29 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
US7332585B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The California University Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
CA2484182A1 (en) 2002-04-29 2003-11-13 Genpat77 Pharmacogenetics Ag Novel antibody binding tcr and tirc7 and its use in therapy and diagnosis
US7081443B2 (en) 2002-05-21 2006-07-25 Korea Advanced Institutes Of Science And Technology (Kaist) Chimeric comp-ang1 molecule
KR100527334B1 (ko) 2002-06-07 2005-11-09 (주)넥스젠 올리고뉴클레오타이드의 신규한 링커
PT1517921E (pt) 2002-06-28 2006-09-29 Domantis Ltd Ligandos duplamente especificos com semi-vida no soro aumentada
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US6919426B2 (en) 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
EP1549345A1 (en) 2002-10-10 2005-07-06 MERCK PATENT GmbH Bispecific anti-erb-b antibodies and their use in tumor therapy
ATE319699T1 (de) 2002-12-20 2006-03-15 Hoffmann La Roche Mannitol- und glucitolderivate
US7534427B2 (en) 2002-12-31 2009-05-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B cell malignancies and autoimmune diseases using unconjugated antibodies and conjugated antibodies and antibody combinations and fusion proteins
AU2004204763A1 (en) 2003-01-09 2004-07-29 Arizeke Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for targeted biological delivery of molecular carriers
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
ES2574993T3 (es) 2003-01-22 2016-06-23 Roche Glycart Ag Construcciones de fusión y uso de las mismas para producir anticuerpos con mayor afinidad de unión al receptor de Fc y función efectora
CA2513113A1 (en) 2003-01-23 2004-08-05 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
BRPI0407446A (pt) 2003-02-13 2006-01-31 Pharmacia Corp Anticorpos para c-met para o tratamento de cânceres
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
GB0305702D0 (en) 2003-03-12 2003-04-16 Univ Birmingham Bispecific antibodies
US7238792B2 (en) 2003-03-18 2007-07-03 Washington State University Research Foundation Foldable polymers as probes
CA2520254A1 (en) 2003-03-26 2004-10-07 Apogenix Gmbh Treatment of viral infections
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
CA2527694C (en) 2003-05-30 2015-07-14 Hendricus Renerus Jacobus Mattheus Hoogenboom Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
MXPA05012723A (es) 2003-05-30 2006-02-08 Genentech Inc Tratamiento con anticuerpos anti-vgf.
US7700097B2 (en) 2003-06-27 2010-04-20 Biogen Idec Ma Inc. Purification and preferential synthesis of binding molecules
PT1639011E (pt) 2003-06-30 2009-01-20 Domantis Ltd Anticorpos (dab) de domínio único peguilados
JP5026072B2 (ja) 2003-07-01 2012-09-12 イミューノメディクス、インコーポレイテッド 二重特異性抗体の多価キャリヤー
AR046071A1 (es) 2003-07-10 2005-11-23 Hoffmann La Roche Anticuerpos contra el receptor i del factor de crecimiento de tipo insulinico y los usos de los mismos
US20060188515A1 (en) 2003-07-24 2006-08-24 Anderson Annaliesa S Polypeptides for inducing a protective immune response against staphylococcus aureus
US20060177462A1 (en) * 2003-07-24 2006-08-10 Anderson Annaliesa S Polypeptides for inducing a protective immune response against staphylococcus aureus
CA2534077A1 (en) 2003-07-29 2005-02-10 Morphotek Inc. Antibodies and methods for generating genetically altered antibodies with enhanced effector function
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
CN1871259A (zh) 2003-08-22 2006-11-29 比奥根艾迪克Ma公司 具有改变的效应物功能的经改进的抗体和制备它的方法
WO2005074417A2 (en) 2003-09-03 2005-08-18 Salk Institute For Biological Studies Multiple antigen detection assays and reagents
AU2004273791A1 (en) 2003-09-05 2005-03-31 Genentech, Inc. Antibodies with altered effector functions
US20050064509A1 (en) 2003-09-23 2005-03-24 The Regents Of The University Of California Use of templated self assembly to create novel multifunctional species
CN1326881C (zh) 2003-09-29 2007-07-18 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种三价双特异性抗体，其制备方法及用途
SG143252A1 (en) 2003-10-09 2008-06-27 Ambrx Inc Polymer derivatives
EA036531B1 (ru) 2003-11-05 2020-11-19 Роше Гликарт Аг Гуманизированное антитело типа ii к cd20 (варианты), фармацевтическая композиция, содержащая эти варианты антитела, и их применение
KR101520209B1 (ko) 2003-11-06 2015-05-13 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
EP1682584B1 (en) 2003-11-13 2013-04-17 Hanmi Science Co., Ltd. A pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin fc region as a carrier
WO2005051976A2 (en) * 2003-11-20 2005-06-09 Ansata Therapeutics, Inc. Protein and peptide ligation processes and one-step purification processes
CA2494571C (en) 2003-12-02 2010-02-09 F.Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides containing molecular rods
PT1718677E (pt) 2003-12-19 2012-07-18 Genentech Inc Fragmentos de anticorpo monovalentes úteis como agentes terapêuticos
AU2005211362B2 (en) 2004-02-02 2008-03-13 Ambrx, Inc. Modified human interferon polypeptides and their uses
US7705150B2 (en) 2004-02-04 2010-04-27 Biosearch Technologies, Inc. Cyanine dyes
WO2005075514A2 (en) 2004-03-10 2005-08-18 Lonza Ltd. Method for producing antibodies
BRPI0510716A (pt) 2004-05-05 2007-11-20 Merrimack Pharmaceuticals Inc uso de um agente de ligação bi-especìfico, agente de ligação bi-especìfico, composição de um agente de ligação bi-especìfico, e, kit
JP2008512352A (ja) 2004-07-17 2008-04-24 イムクローン システムズ インコーポレイティド 新規な四価の二重特異性抗体
CA2577133A1 (en) 2004-08-19 2006-03-23 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
JP2008515780A (ja) 2004-09-02 2008-05-15 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ＦｃγＲＩＩＢレセプター抗体およびその使用
ES2347340T3 (es) 2004-09-13 2010-10-28 Genzyme Corporation Construcciones multimericas.
EP1791565B1 (en) 2004-09-23 2016-04-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP1842226B2 (en) 2004-11-03 2014-07-02 Iris International, Inc. Homogeneous analyte detection
US7632497B2 (en) 2004-11-10 2009-12-15 Macrogenics, Inc. Engineering Fc Antibody regions to confer effector function
AU2005319382B2 (en) 2004-12-21 2011-04-07 Astrazeneca Ab Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
NZ556286A (en) 2005-02-07 2010-11-26 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules that bind EGFR, vectors encoding same, and uses thereof
WO2006091209A2 (en) 2005-02-23 2006-08-31 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific binding agents for modulating biological activity
WO2006089364A1 (en) 2005-02-24 2006-08-31 The University Of Queensland Peptide networks
EP1863844A1 (en) 2005-02-28 2007-12-12 Centocor, Inc. Heterodimeric protein binding compositions
US10011858B2 (en) 2005-03-31 2018-07-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
TW200720289A (en) 2005-04-01 2007-06-01 Hoffmann La Roche Antibodies against CCR5 and uses thereof
CA2605024C (en) 2005-04-15 2018-05-22 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
CA2606102C (en) 2005-04-26 2014-09-30 Medimmune, Inc. Modulation of antibody effector function by hinge domain engineering
US20090215639A1 (en) 2005-04-26 2009-08-27 Bioren, Inc. Method of Producing Human IgG Antibodies with Enhanced Effector Functions
US7795009B2 (en) 2005-06-15 2010-09-14 Saint Louis University Three-component biosensors for detecting macromolecules and other analytes
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
RU2515108C2 (ru) 2005-08-19 2014-05-10 Эббви Инк Иммуноглобулин с двойными вариабельными доменами и его применения
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US20070071745A1 (en) 2005-08-26 2007-03-29 Pablo Umana Modified antigen binding molecules with altered cell signaling activity
CN101312748A (zh) 2005-09-26 2008-11-26 梅达莱克斯公司 抗体-药物轭合物和使用方法
WO2007044887A2 (en) 2005-10-11 2007-04-19 Transtarget, Inc. Method for producing a population of homogenous tetravalent bispecific antibodies
US7666622B2 (en) 2005-10-19 2010-02-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Monomeric self-associating fusion polypeptides and therapeutic uses thereof
TW200732350A (en) 2005-10-21 2007-09-01 Amgen Inc Methods for generating monovalent IgG
ES2332139T3 (es) 2005-11-23 2010-01-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Polinucleotidos con mimetico de fosfato.
ES2435420T3 (es) 2005-12-15 2013-12-19 Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs Oligonucleótidos catiónicos, procedimientos automáticos para preparar los mismos y sus usos
WO2007068895A1 (en) 2005-12-15 2007-06-21 Astrazeneca Ab Combination of angiopoietin-2 antagonist and of vegf-a, kdr and/or flt1 antagonist for treating cancer
FR2894959B1 (fr) 2005-12-15 2008-02-29 Galderma Res & Dev Derives biphenyliques agonistes selectifs du recepteur rar-gamma
WO2007084692A2 (en) 2006-01-20 2007-07-26 Welson Pharmaceuticals, Inc. Immunoconjugates for treatment of infectious diseases
AR059066A1 (es) 2006-01-27 2008-03-12 Amgen Inc Combinaciones del inhibidor de la angiopoyetina -2 (ang2) y el inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf)
JP2009526857A (ja) 2006-02-15 2009-07-23 イムクローン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 機能性抗体
CA2646508A1 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
WO2007108013A2 (en) * 2006-03-22 2007-09-27 National Institute Of Immunology Novel bioconjugates as therapeutic agent and synthesis thereof
AU2007229698B9 (en) 2006-03-24 2012-11-08 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
JP5164971B2 (ja) 2006-04-21 2013-03-21 ピープルバイオ，アイ エヌ シー 三次元的相互作用を用いてマルチマー形成ポリペプチドのモノマーからマルチマーを分別検出する方法
US20070274985A1 (en) 2006-05-26 2007-11-29 Stefan Dubel Antibody
WO2008005828A2 (en) 2006-06-30 2008-01-10 Novo Nordisk A/S PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE COMPOSITIONS COMPRISING ANTIBODY MOLECULES SPECIFIC TO LAMININ-5 α3 CHAIN DOMAINS G1G2 AND USE THEREOF
AR062223A1 (es) 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
EP2061901A2 (en) 2006-10-31 2009-05-27 Noxxon Pharma AG Methods for detection of a single- or double-stranded nucleic acid molecule
CN101205255A (zh) 2006-12-14 2008-06-25 上海中信国健药业有限公司 抗cd20四价抗体、其制备方法和应用
SG10201503407WA (en) 2006-12-19 2015-06-29 Genentech Inc Vegf-specific antagonists for adjuvant and neoadjuvant therapy and the treatment of early stage tumors
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN101037671B (zh) 2007-02-14 2010-07-07 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 杂交瘤细胞株及其产生的抗人红细胞表面h抗原的单克隆抗体
PL2716301T3 (pl) 2007-02-16 2017-10-31 Merrimack Pharmaceuticals Inc Przeciwciała przeciw ERBB3 i ich zastosowania
US10259860B2 (en) 2007-02-27 2019-04-16 Aprogen Inc. Fusion proteins binding to VEGF and angiopoietin
CA2686039A1 (en) 2007-05-03 2008-11-13 Tethys Bioscience, Inc. Binding reagents that contain small epitope binding molecules
NZ581395A (en) 2007-05-14 2012-08-31 Biogen Idec Inc Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
DK2170959T3 (da) 2007-06-18 2014-01-13 Merck Sharp & Dohme Antistoffer mod human programmeret dødsreceptor pd-1
EP2014680A1 (en) 2007-07-10 2009-01-14 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Recombinant, single-chain, trivalent tri-specific or bi-specific antibody derivatives
JP2010535032A (ja) 2007-07-31 2010-11-18 メディミューン，エルエルシー 多重特異性エピトープ結合性タンパク質およびその用途
EP2201051A1 (en) 2007-08-15 2010-06-30 Isp Investments Inc. Polyvinylamide polymers containing polymerizable functionalities
WO2009021754A2 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Monospecific and multispecific antibodies and method of use
DE102007038753A1 (de) 2007-08-16 2009-02-19 Giesecke & Devrient Gmbh Vorrichtung und Verfahren für die Kalibrierung eines Sensorsystems
KR20100052545A (ko) 2007-08-28 2010-05-19 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｉｇｆ―１ｒ의 다중 에피토프에 결합하는 조성물
ATE538129T1 (de) 2007-09-07 2012-01-15 Complix N V Nicht natürliches proteinöses gerüst aus drei nicht kovalent assoziierten peptiden
US8709727B2 (en) 2007-09-17 2014-04-29 Mattias Strömberg Magnetic detection of small entities
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
US20090117105A1 (en) 2007-11-01 2009-05-07 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of National Defence Humanized anti-venezuelan equine encephalitis virus recombinant antibody
EP2214700A4 (en) 2007-11-02 2012-08-22 Janssen Biotech Inc HALF-SYNTHETIC GLP-1 PEPTIDE FUSION CONSTRUCTS, METHOD AND USES
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
JP2009181819A (ja) 2008-01-31 2009-08-13 Hitachi High-Technologies Corp 荷電粒子線装置
US11260133B2 (en) 2008-02-21 2022-03-01 Sanford-Burnham Medical Research Institute Methods and compositions related to peptides and proteins with C-terminal elements
JP4438875B2 (ja) 2008-02-27 2010-03-24 三菱自動車工業株式会社 車両の貯蔵燃料量推定装置
ES2368700T3 (es) 2008-04-11 2011-11-21 Emergent Product Development Seattle, Llc Agente inmunoterapéutico para cd37 y combinación con un agente quimioterapéutico bifuncional del mismo.
KR20110047255A (ko) 2008-09-26 2011-05-06 로슈 글리카트 아게 이중특이적 항-ｅｇｆｒ／항-ｉｇｆ-１ｒ 항체
HUE033438T2 (en) 2008-09-26 2017-11-28 Ucb Biopharma Sprl Biological products
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
KR20190025057A (ko) 2008-10-14 2019-03-08 제넨테크, 인크. 이뮤노글로불린 변이체 및 그의 용도
BRPI0922807A2 (pt) 2008-12-04 2015-12-22 Abbott Lab imonuglobulinas de domínio variável duplo e usos dos mesmos
US8133979B2 (en) 2008-12-16 2012-03-13 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human angiopoietin 2
WO2010087994A2 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof
EP2403530B1 (en) 2009-02-27 2016-05-11 Massachusetts Institute of Technology Engineered proteins with high affinity for dota chelates
CA2756244A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
WO2010112194A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen-binding polypeptides and multispecific antibodies comprising them
EP2417156B1 (en) 2009-04-07 2015-02-11 Roche Glycart AG Trivalent, bispecific antibodies
MX2011010166A (es) 2009-04-07 2011-10-11 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-erbb-3/anti-c-met.
MX2011010169A (es) 2009-04-07 2011-10-11 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-erbb-1/anti-c-met.
US20120076728A1 (en) 2009-04-08 2012-03-29 The Regents Of The University Of California Human protein scaffold with controlled serum pharmacokinetics
WO2010136172A1 (en) 2009-05-27 2010-12-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
RU2015153109A (ru) 2009-09-16 2019-01-15 Дженентек, Инк. Содержащие суперспираль и/или привязку белковые комплексы и их применения
CN102574921B (zh) 2009-09-29 2016-05-04 罗切格利卡特公司 双特异性死亡受体激动型抗体
WO2011112983A2 (en) * 2010-03-12 2011-09-15 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Psrp is a protective antigen against pneumococcal infection
ES2617777T5 (es) 2010-04-23 2022-10-13 Hoffmann La Roche Producción de proteínas heteromultiméricas
MX2013000301A (es) 2010-07-09 2013-05-09 Biogen Idec Hemophilia Inc Factores quimericos de coagulacion.
WO2012025530A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized - fv fragment
RU2013110876A (ru) 2010-08-24 2014-09-27 Рош Гликарт Аг Активируемые биспецифические антитела
AR084053A1 (es) 2010-11-30 2013-04-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente terapeutico que induce citotoxicidad
EP2659269B1 (en) 2010-12-23 2016-10-26 Roche Diagniostics GmbH Detection of a posttranslationally modified polypeptide by a bi-valent binding agent
CN103384831B (zh) 2010-12-23 2016-02-10 霍夫曼-拉罗奇有限公司 通过二价结合剂来检测多肽二聚体
SG191153A1 (en) 2010-12-23 2013-07-31 Hoffmann La Roche Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
CN103384681B (zh) 2010-12-23 2018-05-18 霍夫曼-拉罗奇有限公司 结合剂
ES2549638T3 (es) 2011-02-28 2015-10-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Proteínas de unión a antígeno
CN103403025B (zh) 2011-02-28 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单价抗原结合蛋白
CN103764665A (zh) * 2011-06-28 2014-04-30 怀特黑德生物医学研究所 使用分选酶安装用于蛋白质连接的点击化学柄
EP2729488A4 (en) 2011-07-06 2015-01-14 Medimmune Llc PROCESS FOR PREPARING MULTIMANT POLYPEPTIDES
RU2617970C2 (ru) 2011-08-23 2017-04-28 Рош Гликарт Аг Антитела, не содержащие fc-фрагмента, включающие два fab-фрагмента, и способы их применения
CN103748114B (zh) 2011-08-23 2017-07-21 罗切格利卡特公司 T细胞活化性双特异性抗原结合分子
SI2748202T1 (sl) 2011-08-23 2018-10-30 Roche Glycart Ag Bispecifične molekule, ki se vežejo na antigen
CA2854243A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 Simone HOEGE Rapid method for cloning and expression of cognate antibody variable region gene segments
KR20140127854A (ko) 2012-02-10 2014-11-04 제넨테크, 인크. 단일-쇄 항체 및 다른 이종다량체
MX2014014162A (es) 2012-05-24 2015-02-04 Hoffmann La Roche Anticuerpos multiespecificos.
BR112014029888A2 (pt) 2012-06-27 2020-05-12 Hoffmann La Roche Métodos de produção de um anticorpo, de determinação de uma combinação de sítios de ligação e de tratamento de um indivíduo com câncer, formulação farmacêutica, anticorpo e uso de um anticorpo
WO2014001324A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Hoffmann-La Roche Ag Method for selection and production of tailor-made highly selective and multi-specific targeting entities containing at least two different binding entities and uses thereof
RU2015100656A (ru) * 2012-06-27 2016-08-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ получения конъюгатов fc-фрагмента антитела, включающих по меньшей мере одну связывающую группировку, которая специфически связывается с мишенью, и их применения
WO2014041072A1 (en) * 2012-09-14 2014-03-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the production and selection of molecules comprising at least two different entities and uses thereof
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
US9195896B2 (en) 2013-07-10 2015-11-24 Tencent Technology (Shenzhen) Company Limited Methods and systems for image recognition
MX2017004526A (es) 2014-10-08 2017-06-07 Hoffmann La Roche Terapia combinada de anticuerpos biespecificos especificos para fap y dr5 y agentes quimioterapeuticos.

Also Published As

Publication number Publication date
RU2639287C2 (ru) 2017-12-20
MX354862B (es) 2018-03-23
WO2014001324A1 (en) 2014-01-03
CN104395339A (zh) 2015-03-04
US20190002570A1 (en) 2019-01-03
RU2015100230A (ru) 2016-08-10
HK1207864A1 (en) 2016-02-12
ES2597228T3 (es) 2017-01-17
US20150232561A1 (en) 2015-08-20
CA2871880A1 (en) 2014-01-03
EP2867253B1 (en) 2016-09-14
EP2867253A1 (en) 2015-05-06
US20230220110A1 (en) 2023-07-13
JP6203838B2 (ja) 2017-09-27
MX2014014801A (es) 2015-02-12
WO2014001324A9 (en) 2014-06-19
BR112014032193A2 (pt) 2017-06-27
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