CN107602702A - 一种同时靶向人p185和血管内皮生长因子的抗体及其应用 - Google Patents

一种同时靶向人p185和血管内皮生长因子的抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时靶向人源化p185和VEGF的双特异性抗体及其应用。其由以下四条肽链组成：(1)两条完全相同的抗体轻链，和，(2)两条完全相同的重组抗体重链；其中，所述的抗体轻链是识别p185抗原表位或抗原的抗体的轻链；所述的重组抗体重链的氨基酸序列从N端至C端依次为：①识别p185抗原表位或抗原的抗体的轻链序列，②抗体重链恒定区序列，③柔性短肽序列，和，④以下(a)、(b)两种序列中的任何一种：(a)具有识别VEGF抗原表位或抗原的抗VEGF抗体的单链可变区序列(ScFv)，或，(b)具有结合VEGF能力的受体结构域序列。其具有同时结合p185和VEGF的能力，并能够抑制肿瘤细胞的增殖，在T淋巴细胞中会显著促进IFN‑γ表达，是优良的抗肿瘤的抗体药物。

Description

一种同时靶向人p185和血管内皮生长因子的抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种同时靶向人p185和血管内皮生长因子的抗体及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物。 2015年中国新发肿瘤病例数达4,292,000例，严重危险人类健康。
肿瘤分子生物学研究证实人表皮生长因子受体2(human epidermal growthfactor receptor,HER2)基因和Myc基因等癌基因异常活化引起细胞信号传导通路失调，进而导致细胞无限增殖是肿瘤发生的分子机制。HER2是表皮生长因子受体(epidermalgrowth factor receptor,EGFR)家族成员，位于人染色体17q21。HER2编码由1255个氨基酸组成的，具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白p185。P185由胞外的配体结合区、单链跨膜区及胞内的蛋白酪氨酸激酶区(720-987位氨基酸)三部分组成，过度活化的p185蛋白通过激活膜受体酪氨酸蛋白激酶信号传导通路(Ras/Raf/MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K/AKT)信号传导通路及转录激活(STAT)信号传导通路发挥促进细胞增殖的作用。
肿瘤细胞的无限增殖消耗大量的营养成分。在肿瘤生长的初始阶段，周围组织的渗透作用负责提供维持其生长的营养成分。当肿瘤生长到2.0mm3时，即有新生血管长入，否则其中心部分将因缺乏营养供应出现缺血坏死，肿瘤组织也很难继续生长。肿瘤细胞分泌的血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是重要的促血管生长因素，它是诱导肿瘤血管生成作用最强、特异性最高的生长因子。VEGF基因位于染色体6p21.3，由8个外显子和7个内含子组成，其编码产物是二聚体糖蛋白。VEGF不仅能提高内皮细胞胞浆内钙离子的浓度，还能增加微血管对大分子物质的通透性。
上述肿瘤分子生物学的研究进展为抗肿瘤药物研发理念的更新提供了坚实的科学依据。目前，抗肿瘤药物研发的焦点已从传统的研发细胞毒药物转移到研发针对肿瘤细胞内细胞信号传导通路失调关键靶点的特异性新一代抗肿瘤药物。靶点特异性抗肿瘤药物，特别是抗体药物，以正常细胞和肿瘤细胞之间基因表达差异为依据，发挥高特异性和低毒性的治疗效果。
发明内容
本发明想要解决的技术问题是，针对缺乏肿瘤药物的缺陷，提供一种同时靶向p185和VEGF双特异性抗体及其应用，其具有同时结合p185和VEGF 的能力，并能够抑制肿瘤细胞的增殖。
本发明人利用分子生物学技术分别合成多条靶向p185和VEGF的抗体序列，体外鉴定抗体亲和力和封闭效率后，利用DNA重组技术制备成不同形式的重组DNA，然后转染哺乳动物细胞表达并纯化双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb)。经纯化并鉴定后筛选获得同时靶向人源化p185和VEGF 的抗体且具有同时靶向人源化p185和VEGF的生物学效应，从而完成了本发明。
本发明为解决上述技术问题，提供了一种同时靶向p185和VEGF双特异性抗体，其由以下四条肽链组成：
(1)两条完全相同的抗体轻链，和，
(2)两条完全相同的重组抗体重链；
其中，所述的抗体轻链是识别p185抗原表位或抗原的抗体的轻链；
所述的重组抗体重链的氨基酸序列从N端至C端依次为：
①识别p185抗原表位或抗原的抗体的轻链序列，
②抗体重链恒定区序列，
③柔性短肽序列，和，
④以下(a)、(b)两种序列中的任何一种：
(a)具有识别VEGF抗原表位或抗原的抗VEGF抗体的单链可变区序列 (ScFv)，或，
(b)具有结合VEGF能力的受体结构域序列。
本发明中，所述的识别p185抗原表位或抗原的抗体的轻链是常规的。较佳的，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
本发明中，所述的抗体重链恒定区是常规的。较佳的，其氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.2的第1位-第449位。
本发明中，所述的柔性短肽是常规的。较佳的，其氨基酸序列是 GGGGSGGGGSGGGGS。
本发明中，所述的具有识别VEGF抗原表位或抗原的抗VEGF抗体的单链可变区是常规的。较佳的，其氨基酸序列是较佳的，其氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.2的第465位-第710位，或者是序列表中SEQ ID NO.3第465 位-第710位。
本发明中，所述的具有结合VEGF能力的受体结构域是常规的。较佳的，其氨基酸序列是较佳的，其氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.4的第417位 -第605位，或者是序列表中SEQ ID NO.5的第465位-第676位。
较佳的，所述的重组抗体重链的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.4所示。
本发明提供的同时靶向人源化p185和VEGF的双特异性抗体，具有特异性识别p185和特异性识别VEGF的生物学功能。
本发明提供同时靶向人源化p185和VEGF的双特异性抗体，其中，序列的融合不影响蛋白的分泌表达，在空间结构和功能上保留了各自特异性地识别VEGF和p185的能力。
本发明还提供一种核酸，其编码所述的同时靶向p185和VEGF双特异性抗体。
本发明还提供一种包含所述的核酸的重组表达载体。
本发明还提供一种包含所述的重组表达载体的重组表达转化体。
本发明还提供一种双特异性抗体的制备方法，其包括如下步骤：培养所述的重组表达转化体，从培养物中获得双特异性抗体。
本发明还提供所述的双特异性抗体在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。
其中，用药剂量和途径可以是常规的，所述的肿瘤可以是常规，较佳的是肺癌、乳腺癌或胃癌。
本发明提供的同时靶向人源化p185和VEGF的双特异性抗体，能够特异性结合人p185和VEGF蛋白，具有高度亲和力，并能够在蛋白水平有效封闭 p185和VEGF蛋白，既能够有效分别结合p185和VEGF蛋白，又能够在结合一种蛋白之后并不影响另一种蛋白的结合，即具有同时结合p185和VEGF的能力，填补目前没有同时靶向p185和VEGF双特异性抗体的空白。该双特异性抗体抑制血管内皮细胞、人肺癌细胞、人乳腺癌细胞和人胃癌细胞的增殖。T细胞刺激实验证明，具有良好的生物活性，在T淋巴细胞中会显著促进 IFN-γ表达。
附图说明
图1是本发明同时靶向人p185和血管内皮生长因子的双特异性抗体的结构示意图。
图2显示本发明同时靶向人p185和血管内皮生长因子的双特异性抗体 (轻链序列是No.1，重组重链序列是NO.2)与人p185和VEGF蛋白具有高度亲和力。
图3显示本发明同时靶向人p185和血管内皮生长因子的双特异性抗体 (轻链序列是No.1，重组重链序列是NO.2)可以有效识别人p185和VEGF 蛋白。
图4显示本发明同时靶向人p185和VEGF的双特异性抗体(轻链序列是 No.1，重组重链序列是NO.2)抑制血管内皮细胞、人肺癌细胞、人乳腺癌细胞和人胃癌细胞的增殖(检测时间：用药后96小时)。
图5显示本发明同时靶向人p185和VEGF的双特异性抗体(轻链序列是 No.1，重组重链序列是NO.2)促进人T淋巴细胞分泌IFN-γ。
具体实施方式
本发明提供一种同时靶向人p185和血管内皮生长因子的双特异性抗体。本双特异性抗体由两条完全相同的轻链和两条完全相同的重组重链组成。其中，一条轻链和一条重组重链的结构是：轻链是识别p185抗原表位或抗原的抗体的轻链(氨基酸序列见表1)；重组重链的序列(氨基酸序列见表1) 为：N端首先是识别p185抗原表位抗体的轻链序列，然后是重链恒定区序列； C端是具有识别VEGF抗原表位或抗原的抗VEGF抗体的单链可变区序列(ScFv) 或具有结合VEGF能力的受体结构域序列；重组重链的N端和C端由柔性短肽相连(结构示意图参见图1)。
表1 同时靶向人p185和血管内皮生长因子的双特异性抗体的氨基酸序列
本发明分别合成编码抗p185抗体，抗VEGF抗体或结合VEGF的结构域序列的DNA片段，然后利用重组DNA，如重叠PCR技术将抗体轻链序列以及重组重链序列分别克隆到真核表达载体pcDNA中，然后共转染293F或CHO 细胞，转染后5-7天收集细胞上清液，然后通过亲和层析凝胶柱纯化获得双特异性抗体。
下面结合实施例对本发明做进一步说明，并不是对本发明的限定。
实施例1
分别合成编码抗p185抗体，抗VEGF抗体或结合VEGF的结构域序列的DNA片段，然后利用重组DNA，如重叠PCR技术将抗体轻链序列(氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1)以及重组重链序列(氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.2、NO.3、NO.4、或No.5)分别克隆到真核表达载体pcDNA 中，然后将轻链和重组重链DNA按质量比2:1的比例混匀，总量为4-10μg 稀释至灭菌水中，然加入40μL 2M CaCl2至总体积250μL，然后加入等体积的2×HBS(NaCl16.3g,KCl 0.74g,Na2HPO4 0.214g，Glucose 2.4g和 HEPES 10g，调pH至7.05，定容至1L，0.22μm滤膜过滤)，混匀形成磷酸钙-DNA悬液，逐滴加入处于对数生长期的293F或CHO细胞，转染后 5-7天收集细胞上清液，经0.45μm滤膜过滤后，将上清液加入经结合缓冲液(12.15gTris加适量灭菌水溶解，调pH7.5，加8.78g NaCl,定容至1L) 冲洗过的亲和层析凝胶柱(Protein A)后用洗脱液(7.5g甘氨酸加入适量双蒸水溶解，调pH3.5，加8.78g NaCl，定容至1L)洗脱，洗脱组分用1M Tris-HCl pH9.0进行中和后得到如图1所示双特异性抗体。
实施例2 酶联免疫吸附检测
将人源p185和VEGF蛋白4℃条件下包被于96孔板16小时；37℃条件下在含有1％bovine serum albumin(BSA)的PBS缓冲液中封闭2小时； PBST缓冲液洗涤；缓慢加入市售p185抗体、市售VEGF抗体和本发明的抗体37℃条件下孵育2小时；PBST缓冲液洗涤；以抗人IgG Fab抗体37℃条件下孵育1小时；PBST缓冲液洗涤；加入四甲基联苯胺孵育5分钟后加入硫酸终止反应，检测450nm吸光度值。
酶联免疫吸附检测结果见图2，结果表明，所述的同时靶向人p185和 VEGF的双特异性抗体，与人p185(图2中A)、VEGF(图2中B)、p185-VEGF (图2中C)和VEGF-p185(图2中D)蛋白具有高度亲和力。
实施例3 蛋白印迹检测
(1)检测本发明抗体识别VEGF的能力：
收集细胞形态健康、融合率达80％的血管内皮细胞(HUVEC细胞)，离心后，弃上清，加入细胞裂解液，95℃变性10分钟，以聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞蛋白，利用半干转法将蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜)，以5％脱脂牛奶室温下封闭1小时，加入本发明的抗体或市售VEGF抗体或市售β-actin抗体，室温下孵育1小时，PBST洗涤后，加入带辣根过氧化物酶标签的二抗，室温下孵育1小时，PBST洗涤后，利用化学发光试剂显色，暗室显影。
(2)检测本发明抗体识别p185的能力：
收集细胞形态健康、融合率达80％的乳腺癌细胞(MDA-MB-453细胞)，离心后，弃上清，加入细胞裂解液，95℃变性10分钟，以聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞蛋白，利用半干转法将蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜)，以5％脱脂牛奶室温下封闭1小时，加入本发明的抗体或市售p185抗体或市售β-actin抗体，室温下孵育1小时，PBST洗涤后，加入带辣根过氧化物酶标签的二抗，室温下孵育1小时，PBST洗涤后，利用化学发光试剂显色，暗室显影。
蛋白印迹检测结果见图3，结果表明，所述的同时靶向人p185和VEGF 的双特异性抗体，能够在蛋白水平有效识别p185(图3中A)和VEGF(图 3中B)蛋白。
实施例4 细胞增殖检测
接种形态健康的血管内皮细胞、人肺癌细胞、人乳腺癌细胞和人胃癌细胞于96孔板，含0.5％胎牛血清培养基饥饿过夜后，每种细胞分为五组(每组包含三个孔)，分别加入培养基、市售p185抗体、市售VEGF抗体、市售p185和VEGF抗体以及本发明的抗体，继续在细胞培养箱中培养72小时，以市售细胞增殖检测试剂盒(CCK8试剂盒)检测细胞增殖情况。
细胞增殖检测结果见图4，结果表明，所述的同时靶向人p185和VEGF 的双特异性抗体，可以有效抑制血管内皮细胞、人肺癌细胞、人乳腺癌细胞和人胃癌细胞的增殖。
实施例5 T细胞刺激检测
将T淋巴细胞悬液加入96孔板，实验分为两组(每组包含三个孔)，分别加入培养基和本发明的抗体，继续在细胞培养箱中培养72小时，以市售酶联免疫吸附检测试剂盒(ELISA试剂盒)检测IFN-γ浓度。
T细胞刺激检测结果见图5，结果表明，所述的同时靶向人p185和VEGF 的双特异性抗体具有良好的生物活性，在T淋巴细胞中会显著促进IFN-γ表达。
对比例1
将常规的p185抗体和常规的VEGF抗体，按照本发明所述的接头进行连接，所得的连接产物，并不能够同时靶向p185和VEGF，有的连接产物的表达效率很低，有的甚至因为空间结构的问题而不能表达。有的能够表达，但结合p185和/或VEGF的能力明显减弱。
序列表
<110> 生标（上海）医疗器械科技有限公司
<120> 一种同时靶向人p185和血管内皮生长因子的抗体及其应用
<130> SHZ232I
<141> 2017-09-22
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> 轻链
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 2
<211> 710
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> 重组重链
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
465 470 475 480
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
485 490 495
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500 505 510
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
515 520 525
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
580 585 590
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
595 600 605
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
610 615 620
Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln
625 630 635 640
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser
645 650 655
Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
660 665 670
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675 680 685
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<210> 3
<211> 710
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> 重组重链
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
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260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
465 470 475 480
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
485 490 495
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
500 505 510
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
515 520 525
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
530 535 540
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
545 550 555 560
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
565 570 575
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
580 585 590
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His
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Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
690 695 700
Leu Val Thr Val Ser Ser
705 710
<210> 4
<211> 653
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> 重组重链
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Cys
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
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275 280 285
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
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355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
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385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
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420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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645 650
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<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> 重组重链
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
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145 150 155 160
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe Ile Thr Val
660 665 670
Lys His Arg Lys
675

Claims (10)

1.一种同时靶向人源化p185和VEGF的双特异性抗体，其特征在于，其由以下四条肽链组成：
(1)两条完全相同的抗体轻链，和，
(2)两条完全相同的重组抗体重链；
其中，所述的抗体轻链是识别p185抗原表位或抗原的抗体的轻链；
所述的重组抗体重链的氨基酸序列从N端至C端依次为：
①识别p185抗原表位或抗原的抗体的轻链序列，
②抗体重链恒定区序列，
③柔性短肽序列，和，
④以下(a)、(b)两种序列中的任何一种：
(a)具有识别VEGF抗原表位或抗原的抗VEGF抗体的单链可变区序列(ScFv)，或，
(b)具有结合VEGF能力的受体结构域序列。
2.如权利要求1所述的同时靶向人源化p185和VEGF的双特异性抗体，其特征在于，所述的识别p185抗原表位或抗原的抗体的轻链的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
3.如权利要求1所述的同时靶向人源化p185和VEGF的双特异性抗体，其特征在于，所述的柔性短肽序列为GGGGSGGGGSGGGGS，或者，所述的抗体重链恒定区的氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.2的第1位-第449位。
4.如权利要求1所述的同时靶向人源化p185和VEGF的双特异性抗体，其特征在于，所述的具有识别VEGF抗原表位或抗原的抗VEGF抗体的单链可变区的氨基酸序列是序列表中SEQID NO.2的第465位-第710位，或者是序列表中SEQ ID NO.3第465位-第710位；
所述的具有结合VEGF能力的受体结构域的氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.4的第417位-第605位，或者是序列表中SEQ ID NO.5的第465位-第676位。
5.一种核酸，其特征在于，其编码如权利要求1-4任一项所述的同时靶向p185和VEGF双特异性抗体。
6.一种包含如权利要求5所述的核酸的重组表达载体。
7.一种包含如权利要求6所述的重组表达载体的重组表达转化体。
8.一种双特异性抗体的制备方法，其包括如下步骤：培养如权利要求7所述的重组表达转化体，从培养物中获得双特异性抗体。
9.如权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤是肺癌、乳腺癌或胃癌。
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