CN1049866A - 高效率生产突变型蛋白酶 - Google Patents
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Abstract
提供了能有效地生产突变Bacillus蛋白酶,并且
不能表达野生型蛋白酶的嗜碱Bacillus菌株。还公
开了获得该Bacillus菌株的方法。
Description
本发明涉及一种利用重组DNA技术生产突变型蛋白质的方法。更具体地说,本发明涉及利用同源芽孢杆菌属(Bacillus)寄主菌株高效率生产用于构造Bacillus蛋白酶的旦白质,该菌株生产相应未修饰蛋白酶的能力已被消除。
在工业上,普遍利用杆菌(Bacilli)生产重要酶类,如α-淀粉酶,中性蛋白酶和碱性(或丝氨酸)蛋白酶。参见,如Debabov:“The industrial use of Bacilli”in:The Molecular Biology of Bacilli,Acad.Press,New York,1982。
使用杆菌(Bacilli)的主要优点是能大量分泌蛋白质,而不产生危害物质和工业应用安全历史长。因此,Bacilli的一些种已被允许用于生产食品用的旦白质。
Palva等人,Gene 19(1982)81-87,通过将来自溶淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)的α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中进行表达。证实了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)能作为异源蛋白质的表达寄主。其它描述异源基因在枯草杆菌(B.subtilis)中表达的参考文献是如Fahnestock和Fisher,在J.Bacteriol.165(1986)796-804,描述的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)旦白质A基因的表达。Schein等人,在Biotechnology 4(1986)719-725,公开的人干扰素-α2的表达;以及Wang等人,在Gene 69(1988)39-47,显示的人心房钠尿α-因子的表达和分 泌。为保证这些异源蛋白的正常分泌,前两篇参考文献使用α-淀粉酶信号序列,而后一篇文献则采用与表达的基因融合的枯草杆菌(B.subtilis)枯草溶菌素基因(aprE)的信号序列。
芽孢杆菌作为生产重组蛋白质寄主的主要问题是它们能产生并分泌出倾向于降解所产生的异源旦白质的各种旦白酶。参见,如Old和Primorse,“Principles of Gene Manipulation”,3rd ed.(1985)289,Blackwell,Oxford。
国际专利申请(PCT)WO89/04866指出胞外旦白酶的重要作用,大约90%的旦白质水解活性被认为是由中性金属旦白酶(npr)和丝氨酸旦白酶(碱性蛋白酶=apr)产生的。
已提出克服该降解问题的各种解决方案。
Kawamura和Doi,J.Bacteriol,160(1984)442-444,公开了缺失胞外中性和碱性旦白酶的枯草杆菌(B.subtilis)双重缺陷突变型。首先,通过转移nprR2和来自枯草杆菌(B.subtilis)NT 18的nprE 18突变,获得了中性蛋白酶阴性的B.subtilis DB100。其次,通过基因转换方法而使含有部分apr基因的178bp片段缺失。
Fahnestock和Fisher,Appl.Environ.Microbiol.53(1987)379-384,描述了由npr阴性菌株构建一个apr阴性枯草杆菌(B.subtilis)菌株。他们使用含apr基因的质粒载体并引入既作为失活因子又作为选择标记的cat基因(具有氯霉素抗体)。其次,染色体apr基因被该构建物取代。
Sloma等人,J.Bacteriol.170(1988)5557-5563,检测到产自枯草杆菌(B.subtilis)的第三种胞外旦白酶基因,并对此进行了序列分析。该基因的部分缺失表明它仅具有有限的蛋白酶活性。
严格检查所产生的菌株,发现没有一种参照枯草杆菌(B.Subtilis)菌株是完全没有胞外蛋白质水解活性的。因此,仍有必要对蛋白酶缺失的芽孢杆菌(Bacillus)菌株进行改良,以便能用于生产异源蛋白质。当以表达发生突变的蛋白酶为目的时,这种需求尤其强烈。
在一些出版物中,描述了采用不能表达野生型蛋白酶基因的Bacillus subtilis(枯草杆菌)寄主菌株,生产突变旦白质,从而避免产生突变和野生型旦白酶的混合物。
在EP-A-0246678(该申请的内容与EP-A-0130756一致)中,公开了一种枯草杆菌(B.Subtilis)菌株,它不能分泌具酶促活性的枯草杆菌蛋白酶或中性蛋白酶,然而能表达从B.amyloliquefaciens分离或衍生的异源旦白酶基因。位点一特异性饱和诱变是在B.amyloliquefaciens基因上完成的,而且表达该突变体。枯草杆菌(B.subtilis)寄主菌株阴性背景菌株是通过两个原始蛋白酶基因或其中之一的部分缺失。或通过N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)诱变获得的。
应进一步强调所描述的枯草杆菌(B.subtilis)寄主通率是能形成孢子的,而且不产孢子突变体用于生产(重组)蛋白是令人不能满意的。
在WO86/01825(Fahnestock和Fisher,上文已引证)中,描述了具有低含量胞外蛋白酶的芽孢杆菌(Bacillus)菌株,尤其是枯草杆菌(B.subtilis)。碱性蛋白酶基因的失活是通过体外***一个编码赋予微生物某一表型特征的蛋白质的基因。含有***性失活蛋白酶基因的质粒载体被转化到枯草杆菌(B.subtilis)通过同源重组使失活的基因取代天然的染色体基因。
WO88/08033公开了枯草杆菌蛋白酶Carlsberg,枯草杆菌蛋白酶DY,枯草杆菌蛋白酶BPN′,枯草杆菌(B.Subtilis)产生的apr枯草杆菌蛋白酶和B.mesentericus(肠膜芽孢杆菌)产生的枯草杆菌蛋白酶的类似物,这些突变体是通过用带负电荷的氨基酸(例如Asp或Glu)置换钙结合位点处或其附近的一个或多个氨基酸而获得的。所述突变体在枯草杆菌(B.Subtilis)中表达。
WO89/04866公开了一种分泌蛋白酶活性很低的枯草杆菌(B.Subtilis)菌株。它是通过在apr-npr-双重突变体中引入SPOOH突变形成的,从而使菌株不产生孢子。得到的三重突变体apr-npr-spooH-显示出很低分泌旦白酶活性。
上述参考文献描述同源和异源基因在枯草杆菌(B.subtilis)中的表达以及旦白酶阴性枯草杆菌(B.subtilis)菌株的构建。已发现由旦白酶基因的部分缺失或在蛋白酶基因中***另外的基因而产生的旦白酶阴性菌株显示出一些缺点,如:
一原始基因可被重新激活。假若与失活的染色体基因同源的一个基因被引入细胞(例如在质粒上),通过同源重组能导致基因的复活。
一原始基因,虽然失活,但由于启动区仍然具活性,仍可能导致产生部分表达产物。就代谢效率来说,这是不利的。
一质粒不稳定性,是由于基因组序列和质粒的一部分区域具同源性引起的。
由此希望利用染色体和质粒间可能具有的同源性而使所有序列缺失。
用B.subtilis生产碱性蛋白酶或其它旦白酶时还存在着其它缺点。尽管Wells等人,NuCl.Acids Res.11(1983)7911-7925证明利用其自己的转录信号在枯草杆菌(B.subtilis)中表达B.amyloli quefaciens枯草杆菌旦白酶BPN′是可能的,Jacobs等人Nucl.Acids Res.13(1985)8913-8926证明这种方案不是普遍适用的。已证明来源于B.Licheniformis(地衣芽孢杆菌)的枯草杆菌旦白酶Carlsberg基因的5′区不含能在枯草杆菌(B.subtilis)中转录时有功能的信号。为了能进行大批量生产必须在所讨论基因的前侧***枯草杆菌(B.subtilis)的启动子。由此也暗示由于Shine Dalgarno序列不完整,甚至基因产物与异源寄主不相适应因而不仅转录,而且转译、分泌或成熟过程,在异源寄主中的效能都是很低的。
当产物合成是在一种已被证明具高生产性能的同源芽孢杆菌菌株中进行时,由于它的高效能产生高含量的产物,从而避免上面描述的表达问题。
本发明提供一种蛋白酶生产方法,该旦白酶至少有一个氨基酸与野生型旦白酶不同。所述方法包括使用同源嗜碱芽孢杆菌(alkalophinlic Bacillus)菌株作为表达寄主,所述菌株不产生野生型蛋白酶。
本发明的一个方面是使染色体上的强碱性蛋白酶基因缺失,得到的旦白酶阴性株能用作表达同源或异源旦白酶的寄主。
本发明的另一方面是染色体强碱性旦白酶基因被该基因的突变拷贝所置换。
另外还提供构建新转化菌株和为此使用的载体的方法以及生产突变蛋白酶的方法。
在一优选实施例中,所产生的突变旦白酶显示出与相应菌株原先产生的旦白酶具有紧密的同源性。
优选菌株是Bacillus novo种PB92,及其衍生物,以及由突变旦白酶编码基因转化的最相关菌株。所述基因与Bacillus PB92的编码丝氨基酸蛋白酶的野生型基因显示出至少有30%,优选的是至少50%,最佳的是至少80%的同源性。优选的该基因是来自于嗜碱芽孢杆菌(alkalophilic Bacillus)菌株的野生型基因。尤其优选的菌株是不产孢子的嗜碱芽孢杆菌(alkalophilic Bacillus)。
图1显示含有Bacillus novo sp.PB92的碱性旦白酶基因5′和3′侧面部分区域的质粒PM58△的构建。
图2表示在质粒pEM58△中引入质粒pE194-neo-1的温度敏感性复制原点,得到质粒pEM58△
图3显示通过同源重组将质粒pEM58△引入芽孢杆菌(Bacillus)菌株PBT110的旦白酶基因5′侧面区域。
图4表明异常重组后缺失旦白酶基因周围区域的放大限制性图谱。获得的两菌株PBT125和PBT126。
图5表示PBT125(A)和PBT126(B)的HINDⅢ片段的核苷酸顺序。
图6表示将所述旦白酶基因引入M13mp18中。
图7表示质粒pBHA-1的核苷酸顺序。
图8表明将芽孢杆菌(Bacillus)菌株PBT110的旦白酶基因引入质粒pBHA1
图9表明含PBHA1-MXL的BamHI片段的F1ori再定位,得到质粒PBHAR-MXL
图10表明强碱性旦白酶的3′序列亚克隆到质粒PBHAR-MXL得到 质粒PBHARB-MXL。
图11表明质粒pBHARB-MXL M216Q的E.Coli序列缺失,得到质粒pBHB-MXLM216Q。
图12表明新霉素抗性基因在质粒pE194neo-1中再定位,得到质粒pE194neo-3。
图13示意将质粒pE194neo-3的温度敏感型复制原点引入质粒pBHB-MXL M216Q,得到质粒PEN3Q
图14图解表示构建菌株BacillusPEP111。
图15图解说明构建菌株Bacillus PEP211。
由芽孢杆菌属(Bacillus)菌株生产的丝氨酸蛋白酶通常称为碱性旦白酶。用于本发明的该蛋白酶来源于嗜碱芽孢杆菌(alkalophilic Bacillus),因此称之为强碱性蛋白酶。
为了生产强碱性旦白酶,最好使用嗜碱芽孢杆菌(alkalophilic Bacillus)菌株作为寄主细胞,对于大规模生产时工业化菌株是必要的。它们来源于土壤中分离到的微生物,或从保藏处得到或其它来源。也可通过对所述芽孢杆菌(Bacillus)菌株的遗传修饰得到。工业用芽孢杆菌(Bacillus)菌株在EP-A-0134048中有说明。它们的特征是对遗传交换有抗性,例如噬菌体的感染或转化。这些菌株是稳定的,并且能或不能形成孢子。通常它们是原养型的而且是修饰过的,能提供高产率的内源性蛋白产物,例如酶类的α-淀粉酶和各种蛋白酶。由工业生产方法所获得的内源性蛋白产物的产率至少可达到5g/l(0.5%W/V)。工业菌株也能分泌DNase,从而引起培养基中的DNA降解,保证免于遗传交换。
利用最初分离出该旦白酶基因的菌株作为寄主菌株是有利的, 因为只有在那种情况下才能确信表达所需要的全部信号都是有功能的。
采用嗜碱芽孢杆菌作为生产菌株的另一优点是受其它微生物污染的危险小,因为发酵过程PH值呈碱性。
按照本发明,公开了从基因组中使一种芽孢杆菌(Bacillus)蛋白酶编码基因缺失的方法。根据这种方法产生的突变的回复突变是不可能的。所述缺失可能是部分缺失(只要留在染色体内的序列是短的,不能与编码旦白酶的质粒基因发生同源重组),然而最好该基因全部缺失。由该方法获得的蛋白酶阴性菌株,在引入携带编码突变蛋白酶的基因的表达载体后,能用于生产同源突变型蛋白酶。然而,应当理解到这种蛋白酶阴性菌株用于表达另外的同源和异源旦白也是有利的。从这个角度考虑,利用能分离出野生型基因的细胞作为寄主细胞表达突变旦白酶是同源性表达。
现已发现通过使用生产旦白酶的工业化Bacillus菌株作为生产该突变旦白酶的寄主时,该菌株生产原始旦白酶的高效性能转移到产生突变型旦白酶,从而产生了与实验菌株相比具有令人惊奇的优越生产性能。一个染色体突变基因拷贝在工业菌株中表达和分泌时,得到的产率高于含该突变基因的50个质粒拷贝在一个实验菌株内表达和分泌所得产率。
本发明一方面是利用同源性芽孢杆菌(Bacillus)菌株有效地生产突变旦白酶,采用的方法是用相应的突变基因交换染色体基因或该基因的一部分,通过这种方法,生产野生型蛋白酶的能力消失,同时引入生产突变旦白酶的能力。
作为表达编码经修饰或所谓的工程旦白的旦白质的突变基因的 寄主细胞,最好使用能在结构上高水平表达该基因的细胞。
本发明的另一方面是令人惊奇地发现利用不产孢子的芽孢杆菌(Bacillus)能用于高水平地表达旦白酶基因。
本发明还描述(见表1)用枯草杆菌(B.Subtilis)能生产高产量的起源于芽孢杆菌(Bacillus)PB92的强碱性旦白酶。最好将在枯草杆菌(B.Subtilis)中有活性的启动子***到所述基因的前面。假若要使来源于其它Bacillus的酶在B.subtilis中产生,必须在B.subtilis中***活性启动子或其它表达信号,这就需要额外的步骤。
生产强碱性旦白酶的Bacillus没有用分类学方法对其进行分类,通常被称为嗜碱芽孢杆菌(alkalophilic Bacillus)菌株。在本发明中将嗜碱芽孢杆菌(alkalophilic bacillus)定义为在碱性条件PH 9-11下生长的Bacillus菌株(Horikoshi,K.and T.Akiba,1982,Alkalophilic microorganisms,Springer Verlag,New York)。由这种杆菌产生的碱性旦白酶也被称作强碱性旦白酶。能生长在碱性PH下的Bacillus菌株的例子描述于如美国专利No.3,723,250,Re 30,602和4,480,037中。Alkalo philic Bacillus寄主菌株的一个例子是inter alia美国专利号Re.30602公开的Bacillus novo sp.PB92。经优化选择到的生产旦白酶的这些嗜碱Bacillus菌株的衍生物,被用于工业规模生产旦白酶(见EP-A-0284126)。产品适用于某些工业应用方面,例如用作洗衣用洗涤剂中的添加剂。这种产物的例子是MaxacalR(Gist-brocades/IBIS)。SavinaseR(Novo),EsperaseR(NoVo)。这些突变型产物已描述于WO89/06279中,文中已说明它们产自Bacillus Lentus菌株,并且记载于未公开的欧洲专利申请No.EP-A-0328229中。
本发明的一个优选实施例中提供了能产生EP-A-0328229和WO89/06279中所述突变体的被转化的Bacillus菌株,是用于工业规模上生产的优选菌株。
根据本发明,适于使用的是Bacillus菌株尤其是嗜碱的Bacillus,优选的是Bacillus novo sp.PB92。其它优选的芽孢杆菌属菌株是不产孢子的突变体,其中最优选的是PBT110及其衍生物。转化嗜碱芽孢杆菌属(alkalophilic Bacillus)菌株时,优选使用该菌株的原生质体。然而,如chang,S.和S.M.Cohen,Molec.Gen.Genet.168(1979)111-115,所述的常规原生质体转化方案,对于嗜碱芽孢杆菌属(alkalophilic Bacillus)菌株是没有效果的。这些菌株所必需的方案在EP-A-0283075中已有描述,该申请作为本文的参考文献。
突变旦白酶基因在同源寄主中的表达是以野生型基因的置换和/或失活为条件。可采用几种方案。
A)一种方法是克隆该基因或其部分,通过位点一定向诱变修饰和将该(部分的)基因置于一个质粒后重新引入到细胞。通过同源重组技术,所述基因可被引入染色体内。结果引起野生型和突变型基因串联地定位于一个位点上。第二次重组后,经过修饰的序列留在染色体内,因此突变被有效地引入该染色体基因(如图14所说明的)。
B)在另一方法中,该染色体基因拷贝由于缺失突变而失活,如果选择基因缺失作为方案,该缺失的染色体基因片段最好是整个编码区域。失活之后,失活的突变型基因拷贝被安置在一个克隆载体上引入细胞内。
C)另一方法是诱变该染色体基因拷贝。原则上用诱变的低聚核 苷酸转化细菌之后,能得到(特异性的)体内突变。这种方法按Moerschell等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85(1988)524-528所述已成功地在酵母中应用,假如该法在同源菌株,优选的是同源嗜碱Bacillus菌株上进行,则为本发明实施例。
本发明涉及已知是有效的蛋白酶生产者的Bacillus菌株。在一个优选方法中,染色体上完整的强碱性旦白酶编码区域缺失。在该实施例中,所使用的载体含有包含其5′和3′区域的碱性旦白酶基因。体外缺失该载体上旦白酶基因,留下5′和3′侧面序列,该载体被引入嗜碱(alkalophilic)Bacillus菌株。通过在侧面区域上同源重组,将载体整合到染色体。异型重组和分解使Bacillus菌株的旦白酶基因缺失。使用的载体最好是质粒。为了能够进行筛选,将一个选择性标记引入质粒。优选的是抗生素抗性,如:新霉素抗性。优选的载体是能选择性地整合到染色体上。完成这一点是靠引入可诱导的复制原点,例如类似来源于PE194的一种温度敏感性原点。将所述质粒引入一个同源性寄主细胞。在高温条件下,该质粒是不能复制的,以致于能选择出染色体整合子(integrant)。在高温且有相关抗生素(如新霉素)存在条件下筛选整合体(integrant)。寄主染色体上质粒分解而将侧面区域留在染色体上,同时去掉编码区域。最后,筛选到的突变体已失去选择性标记基因(对新霉素敏感)。所述突变体是旦白酶阴性的。最终染色体构型是用限制性分析法和Southern影印法测定。WO88/06623广泛地阐述了可能整合的机制。经位点一定向诱变修饰的旦白酶基因借助适当的表达载体引入旦白酶阴性细胞,注意,该质粒携带短的或最好是没有与染色体同源的序列,以避免质粒不稳定性。
如果不是由载体表达已发生突变的旦白酶基因,就可能使该突变的旦白酶基因整合到旦白酶阴性菌株的染色体上。这一点是通过在质粒上保留旦白酶基因的侧面区域作为突变旦白酶基因的两边界来完成。这样的质粒引入后导致侧面区域的同源重组,从而将突变旦白酶基因引入到旦白酶阴性菌株的染色体内。假如该质粒证明是不稳定的,这一点尤其有利。本发明还说明将该基因的一个拷贝整合到基因组内所产生的重组突变旦白酶的量可与将位于一个质粒上的该基因的多个拷贝引入基因组产生的量相比或甚至更高。
在另一个实施例中,在没有预先分离旦白酶阴性菌株的情况下,通过同源重组,用突变型基因置换染色体强碱性蛋白酶基因。
表达旦白酶,且可从细胞或当该旦白酶被分泌时可从培养基中分离该旦白酶。回收旦白酶后,经过纯化,配制成去污剂组合物。由于在所述生产体系中野生型基因完全缺失,所以突变型旦白酶制剂完全不含野生型旦白酶。
按EP-A-0284126所述构建的质粒PM58含有强碱性旦白酶基因。为了得到失活的质粒,通过BalI/HpaI双消化而使该蛋白酶基因编码区域缺失。随后将来源于pE194neo-1的温度敏感性复制原点引入。构建成的pEM58△引入Bacillus菌株PBT110。
按所谓Campbell型机制,在旦白酶基因的5′侧面区域内发生整合,结果产生在染色体的旦白酶位点上带有完整质粒载体的旦白酶阳性菌株(如图3所描绘的)。
接着筛选该菌株的蛋白酶阴性衍生物,得到两个菌株PBT125和PBT126,它们已失去旦白酶基因和新霉素抗性标记。进一步分析表明在所述第二步骤中出现了异常重组。
由于所获得的芽孢杆菌(Bacillus)菌株没有表现出可检测的蛋白酶活性,因此它们能被用来表达经改变的旦白酶基因。必须明白的是PBT125和PBT126只是举例子。由于异常重组会得到不同的结果,因此对于测定是否整个基因已缺失是必不可少的。为了得到更加特异的菌株,必须进行同源重组。
本文所举例子主要说明本发明的两个特定实施例。一个例子是由旦白酶阴性菌株生产编码突变型旦白酶的质粒。另一个是生产突变型蛋白酶,该方法中通过基因交换将所述突变基因引入基因组中。本领域内技术人员十分清楚,其它实施例也是可能的。例如,在蛋白酶阴性菌株中的染色体整合,一个突变基因拷贝在质粒上,以及整合到染色体上,该突变基因的一个以上的拷贝串联地定位于染色体上或在染色体的不同位置上。提供下列实例予以说明但不受此限制。
实施例1
构建失活的质粒pEM58△
质粒PM58(见EP-A-0284126)用限制性酶BalI和HpaI消化。纯化出含有部分旦白酶基因侧面序列的大片段(Maniatis,Molecular Clonings.A laboratory Manual,Cold Spring Harbor 1982)后进行连接。连接混合物转化(Spizizen et al.,J.Bacteriol.81(1961)741-746)枯草杆菌(Bacillus subtilis)DB104(Kawamur a and Doi,J.Bacteriol.160(1984)442-444),再在含0.4%酪旦白和20μg/ml新霉素的基本培养基平板上筛选具新霉素抗药性 和旦白酶阴性的转化体。
分离出质粒PM58△,用限制性酶分析法分析其特性。如图1所述,质粒PM58△含强碱性旦白酶基因的侧面序列,新霉素抗性编码基因和一个Bacillus的复制原点。
为了构建含有温度敏感性复制原点的整合质粒,用限制性酶XbaⅠ和BglⅡ消化PM85△。纯化出含强碱性旦白酶(基因)侧面序列的片段,将它连接到按前面所述方法纯化的含温度敏感性复制原点的PE194neo-1的(纯化的)XbaⅠ/BglⅡ片段上(EP-A-0284126),该复制原点来源于PE194(Jordanescu et al.,Plasmid 1(1978)468-479)。用连接混合物转化枯草杆菌(B.Subtilis)DB104后,再筛选具新霉素抗药性的转化体(见上文)。质粒pEM58△分离后进行定性(图2),它含有新霉素抗性基因,来源于pE194的温度敏感性复制原点和碱性蛋白酶基因的侧面序列。
所述质粒pEM58△用于转化芽孢杆菌(Bacillus)菌株PBT110。
实施例2
构建蛋白酶阴性嗜碱Bacillus菌株
A.质粒pEM58△转化Bacillus PBT 110的原生质体
Bacillus菌株PBT110是Bacillus novo sp.PB92的一个不产孢子突变体(美国再版专利30,602),通过经典(UV)突变方法可得到该菌株。用类似于EP-A-0284126中描述的方法,用质粒pEM58△转化该菌株。在整合实验之前,采用限制性酶分析法检验转化体是 否含有相关的质粒。
B.pEM58△在芽孢杆菌属(Bacillus)PBT110染色体内的整合
pEM58△在芽孢杆菌属(Bacillus)菌株PBT110染色体内的整合按EP-A-0284126所述方法进行。选择新霉素浓度为1μg/ml时出现的整合体(integrant)采用限制性酶分析法,再用Southern影印法和杂交分析法测定整合体的遗传结构,表示于图3。发现pEM58△的整合是通过所谓Campbell型机理借助同源重组发生在碱性旦白酶基因的5′侧面区域内,结果得到芽孢杆菌属(Bacillus)菌株PBT110-INT5。
C.选择蛋白酶阴性菌株
将芽孢杆菌(Bacillus)菌株PBT110-INT5接种于含1μg/ml新霉素的100ml胰蛋白酶大豆肉汤内(TSB)并且于50℃下培养24小时。
24小时后,将得到的培养物取0.1ml接种于含100mlPBT基本培养基的500ml摇瓶内,所述培养基为:K2HPO417.42g/l;谷氨酸13.36g/l;水合柠檬酸钠2g/l;FeSO4·7H2O 0.05g/l;ZnSO4·7H2O 1mg/l;MnSO4·H2O 1mg/l;CaCl2·2H2O 10mg/l;MgSO4·7H2O 0.2g/l;CuSO4·5H2O 0.5mg/l;H3BO30.5mg/l;Na2MoO4·2H2O 0.5mg/l;CoCl2·6H2O 0.5mg/l;Biotine 0.5mg/l;蔗糖20g/l(PH8.0于120℃下灭菌20分钟)。灭菌之后添加1mg/l的维生素B1。
所述培养物在37℃下培养4天。4天后,1ml的培养物稀释于100ml同样培养基中再培养4天。4天后,培养物置于含另外0.4%酪蛋白和15g/l琼脂的PBT基本培养基平板上培养。没有可检测的蛋白酶晕圈(halo)的菌落被看作是旦白酶阴性的,并且检验该菌落中编码PBT110碱性蛋白酶基因的消失。
D.旦白酶阴性菌株的特性
前面所述的在酪旦白培养平板上未显示可检测的酶的菌株首先用于测试新霉素的敏感性和不产孢子表型的存在。按美国专利号Re.30,602所述,在含100ml旦白酶生产培养基的500ml摇瓶中检验具有旦白酶阴性和不产孢子表型的两种菌株,BacillusPBT125和PBT126的旦白酶产生情况。没有一种菌株产生可检测量的旦白酶。
采用限制性酶分析法和染色体影印法测定两个菌株的遗传结构,显示于图4。其中发生了异常重组而不是同源重组,结果产生两种完全缺失蛋白酶和新霉素抗性基因的菌株。但旦白酶基因缺失后,一个小的质粒片段仍留在染色体上。所述片段的顺序按下述方法测定。含有质粒/染色体连接点的菌株PBT125和PBT126的染色体HindⅢ片段连接到噬菌体载体M13mp18中(Messing et al.,NuCl.Acids Res.9(1981)303-321),并且按照Cohen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA69(1972)2110-2114所述的方法转染E.Coli JM101。噬菌体在E.coli JM101中繁殖后,分离SSDNA(Heidecker et al.,Gene 10(1980)69-73)。
按Sanger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA74(1977)6463所述方法对***物进行序列分析,结果分别示于图5A和5B。
实施例3
构建旦白酶生产和突变载体
A.在噬菌体M13mp18中亚克隆PB92旦白酶基因
用HpaI和BalI消化质粒pM58。含旦白酶基因的DNA片段纯化之后(Maniatis,1982)将该片段连接到用SmaI消化的噬菌体M13mp18。连接混合物用于转染E.coli JM101(Cohen et al.,Supra)。噬菌体在E.coli JM101中繁殖以后,按Birnboim和Doly所述的方法分离dsDNA(Nucl.Acids Res.7(1979)1513-1523)。采用限制性酶分析法检验***物及其定向。载体mp18MXL用于进行再次亚克隆实验,并示于图6。
B.在质粒PBHA1中亚克隆PB92旦白酶基因
图7显示质粒PBHAL的核苷酸序列。按Stanssens等人(Nucl.Acids Res.17(1989)4441-4454)的描述,该质粒是由双生载体体系PMa/c5-8得到的,在该质粒中***了一个额外的启动子。质粒BHA1由下列片段组成:
POS11-105:噬菌体FD,终止密码子;
POS121-215:噬菌体FD,终止密码子;
POS221-307:质粒PBR322的一部分(即位点2069-2153);
POS313-768:噬菌体F1,复制原点(即位点5482-5943);
POS772-2571:质粒PBR322的一部分,即复制原点和
β-内酰胺酶(Lactamase)基因;
POS2572-2685:转座子Tn903,完整基因组;
POS2719-2772:包氨酸终止密码子(双);
POS2773-3729:转座子Tn9,氯霉素-乙酰基-转移酶(=cat)基因,在POS3005(A),3038(C),3302(A)和3409(A)上的核苷酸不同于野生型cat编码序列,将该突变体引入以消除NcoⅠ,BalⅠ,EcoRⅠ和PVUⅡ位点。
POS3730-3804:多克隆位点;
POS3807-7264:质粒PUB110的一部分(即复制功能和卡那霉素抗性基因,EcoRⅠ-PvuⅡ片段)(Mckenzie et al.,Plasmid 15(1986)93-103 and plasmid 17(1987)83-85);
POS7267-7331:多克隆位点。
使用已知的克隆技术将上述片段连接,例如在粘性末端填充Klenow,克隆接合体等。所有的材料都取自GenbankRNational Nucleic Acid sequence Data Bank′NIH,U.S.A。PMc5-8质粒寄存号DSM4566。
为了获得双生载体体系PBHARB-MXL/PBHcRB-MXL,在突变操作之前要对双生载体体系:PBHA/C-1进行修饰,步骤如下:
1、用KpnⅠ和HincⅡ消化载体mp18MXL。含旦白酶基因的DNA片段纯化后连接到已用EcoRⅤ和KpnⅠ消化的PBHA1。连接混合物用于转化E.Coli JM101(Maniatis,1982),并放在LC+平板培养基上培养,该培养基含有10g/l胰化旦白胨,5g/l酵母抽提物(DIfco),8g/l NaCl,25mg/l胸腺嘧啶,1g/lMgSO4·7H2O,100μg/ml,α-氨苄青霉素和20μg/ml新霉素PH7.0。转化体质粒DNA分离后(Birnboim,supra)用限制性酶分析法表达特性。分离PBHAMXL(见图8)。
2、为了对引入旦白酶基因中的具有一套有效的寡聚核苷酸的突变体进行序列分析,必须将F1原点定位于旦白酶基因的相反方向。这一点可采用下列方法完成:将质粒PBHA1-MXL用BamHI消化后,重新连接。连接混合物用于转化E.coli WK6(Maniatis,Supra),并且在含10g/l胰旦白胨,5g/l酵母抽提物(Difco)、8g/lNaCl,25mg /l胸腺嘧啶、1g/lMgSO4·7H2O100μg/mlα-氨苄青霉素和20μg/ml新霉素PH7.0的LC+平板培养基上选择对新霉素或α-氨苄青霉素有抗性的转化体。分离转化体质粒DNA(Birnboim,supra),用限制性酶分析法表征其特性。由此方法可分离PBHAR-MXL,它与PBHA-MXL是不同的其中的E·Coli序列的定向是与PBHA-MXL相反的。
3、为了在质粒PBHAR-MXL中引入其它的侧面序列,进行下列消化。质粒PM58用SphⅠ和HindⅢ消化。质粒PBHAR-MXL(图10)用SphⅠ和HindⅢ消化。纯化出较大片段。两种质粒的消化产物连接后,转化枯草杆菌(B.subtilis)DB104,并在含有10μg/ml新霉素和0.4%酪旦白的基本培养基平板上选择具新霉素抗性和旦白酶活性的转化体。转化体用限制性酶分析法表征特性。其中之一是PBHARB-MXL(图10)用于进一步的实验。
C.质粒PBHARB-MXL中PB92基因的诱变
诱变是采用双生载体体系PBHARB-MXL/PBHCRB-MXL进行的(stanssens,supra)。
利用一种基于缺口一双近似法(Kramer et al.,Nucl.Acids Res.12(1984)9441)的方法和一个质粒(噬菌体/质粒杂交物)。实质上该方法建立在一个缺口一双链DNA中间体上,该中间体由含一个野生型抗生素抗性标记的缺口单链(一链)和一个含有在具抗生素抗性的基因中携带有琥珀型突变的模板链(十链)组成。退火之后,通过体外缺口一填充和密封过程,将诱变的低聚核苷酸整合到缺口单链中。所得到的分子用于转化失配修复缺陷(Muts)寄主,该寄主中保存了予期突变和抗生素抗性标记间的连接。从该菌株分离出的混合质粒群体,可以在一个抑制基因阴性寄主菌株中分泌。转化体放 在含抗生素的平板培养基上,迫使选择出由缺口单链产生的子代。
在pMa型载体中3409位核苷酸从G变成A,然而在pMc型载体中2238位核苷酸从G变成C分别在氯霉素一乙酰基转移酸基因和β-内酰胺酶基因内产生琥珀型终止密码子(stopcodons)使所述基因失活。
为了进行诱变,靶DNA片段被克隆到pMa5-8的多克隆位点或其衍生物,这样构建成含靶DNA的pMa5-8和pMc5-8间的缺口双链。利用化学的或核苷酸的酶促误掺入(misincorporation)法,使含靶DNA的单链缺口易于用诱变的寡聚核苷酸进行诱变。该诱变寡聚核苷酸是具有低含量误掺入核苷酸的合成的长寡聚核苷酸。详细描述参见Ausubel等人,1987.Current protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons Inc.New York;或B.perbal,1988,Apractical Guide to Molecular Cloning,2nd ed.John wiley & Sons Inc;New York。
D.构建工业生产旦白酶的载体
在向质粒PBHARB-MXL中引入所需要的突变之后,按上述方法,使质粒上的不需要的E.Coli序列缺失:含有相应突变的质粒PBHARB-MXL用BamHⅠ消化,并在稀释状况下再连接。连接混合物转化枯草杆菌(B.Subtilis)DB104后在含20μg/ml新霉素和0.4%酪旦白的基本培养基平板上,筛选具新霉素抗性和蛋白酶活性的转化体,分离出转化体的DNA,用限制性酶分析法表征特性。由此分离出缺失E.Coli DNA的载体,适用于旦白酶的商业化生产。
前述步骤已于图11中说明,其中以M216Q突变作为例子,结果产生质粒PBHB-MXL M216Q。M216Q,以及下文所述的M216S,S160D和N212D,是EP-A-0328229所述的芽孢杆菌(Bacillus)PB92的突变蛋白酶。
实施例4
由质粒pBHB-MXL衍生物对芽孢杆菌(Bacillus)PBT125
的原生质体的转化
用质粒PBHB-MXL或其衍生的含突变型旦白酶基因的质粒转化芽孢杆菌(Bacillus)菌株PBT125,下列转化方法见EP-A-0284126所述。在生产实验分析之前,转化体要经过限制性酶分析以检验其是否含有相应的质粒。
实施例5
构建旦白酶整合载体
A.整合载体PEN3Q
质粒pE194neo-1(EP-A-0284126)用SalⅠ消化并再连接。连接混合物转化枯草杆菌(B.Subtilis)DB104,再于含20μg/ml新霉素的基本培养基平板上选择具新霉素抗性的转化体。分离出质粒PE194neo-3后,检验逆向定位新霉素抗性基因的存在(见图12)。质粒pE194neo-3用HpaⅠ和BglⅡ消化。纯化含温度敏感性复制原点的片段(Maniatis,上文)。
质粒pBHB-MXL M216Q(见例3和图11)用BegⅡ和BalⅠ消化。纯化含旦白酶基因的片段。将两种片段连接。连接混合物转化枯草杆菌(B.Subtilis)DB104,并按上面描述选择具旦白酶活性和新霉素 抗性的转化体。转化体用限制性酶消化后表征特性。选择出其中含质粒pEN3Q的一种(图13)。这种质粒含有新霉素抗性的基因、来源于质粒pE194neo-3的t.s复制原点以及在PB92旦白酶基因中的M216Q突变。
B.整合载体pEN3S
按整合载体pEN3Q相同的构建方法,采用PBHARB-MXL M216S作为起始载体构建pEN3S。
实施例6
构建Bacillus菌株PEP111和PEP112
A.由质粒pEN3Q转化芽孢杆菌(Bacillus)PBT110原生质体
按EP-A-0284126所述方法,用质粒PEN3Q转化芽孢杆菌(Bacillus)菌株PBT110。整合实验前,要通过限制性酶分析检验转化体是否含相应质粒。
B.pEN3Q在芽孢杆菌(Bacillus)PBT110染色体内的整合
质粒pEN3Q在芽孢杆菌(Bacillus)菌株PBT110染色体内的整合实验是按EP-A-0284126所述完成的。在质粒复制的非允许温度(50℃)下,选择新霉素浓度为1μg/ml时出现的整合体(integrant)。为了检验PEN3Q在所述染色体内的整合,分离出可能的整合体的染色体DNA,用HINDⅢ或ClaⅠ消化,然后在0.8%DNA琼脂糖凝胶上电泳,再影印到硝化纤维膜上(Southern,J.Mol.Biol.98(1975)503-517)并与32P标记的缺口一转译pEN3QDNA杂交(Maniatis,1982)。
已经证明通过同源重组能产生PEN3Q整合,结果得到含有串联 地定位于染色体上的两个旦白酶基因(一个是野生型,另一个是突变型M216Q)的菌株(PBT110M/Q)。因此,按图14描绘的所谓Campbell型机理(也见EP-A-0284126)能使PEN3Q整合。
C.新霉素敏感重组体的选择
选择出新霉素敏感的重组体,在其染色体中既含野生型的也含突变型蛋白酶基因(下文称“异型重组体”)。选择步骤类似于上文例2C中所述。
菌株PBT110M/Q被用作起始菌株。菌株PBT110M/Q在PBT基本培养基上培养后,培养物放在含0.4%酪旦白和15g/l琼脂的PBT基本培养基平板上。这些培养皿于37℃下培养48小时,再通过平板影印法分别培养于含1μg/ml新霉素和不含新霉素的心浸液(HI)平板培养基上。新霉素敏感菌落被定为异型重组体。
D.新霉素敏感重组体的特征
分离出可能的异型重组体的染色体DNA,用ClaⅠ或HindⅢ消化,接着在0.5%琼脂糖凝胶上电泳,影印到硝基纤维膜上(Southern,1975)再与32P标记的切口转译PEN3Q杂交(Maniatis,1982)。由于突变M216Q引起ClaⅠ位点的去除,所以含野生型蛋白酶或突变蛋白酶基因的菌株和中间产物菌株PBT110M/Q很易区分,见图14。
分离含PB92的M216Q突变型蛋白酶基因的异型重组体。已发现PB92野生型旦白酶基因被PB92突变旦白酶基因置换,按EP-A-0328229所述,对菌株产物的生化参数(Kcat′Km)、氧化抗性、比活性和洗涤性特征进行表征。所有结果与对照蛋白酶M216Q相同,表明转化菌株产物确实是含突变M216Q的PB92旦白酶。这种转化菌株被称谓芽孢杆菌(Bacillus)PEP111。
用载体PEN3Q进行类似的实验以构建芽孢杆菌(Bacillus)菌株PEP112,所述菌株含具有突变M216S的PB92旦白酶。
实施例7
构建芽孢杆菌(Bacillus)菌株PEP211和PEP212
由质粒PEN3Q转化芽孢杆菌(Bacillus)菌株PEP111,下列方法按照EP-A-0284126描述。整合过程前,要通过限制性酶分析检验转化株是否含有相应的质粒。整合步骤和选择整合体(integrant)[在20μg/ml新霉素浓度下,质粒复制的非允许温度(50℃)]是按EP-A-0284126所述进行的。
为了检验质粒PEN3Q在染色体内的整合,先分离可能的整合体的染色体DNA,后用HindⅢ消化,然后在0.8%琼脂糖凝胶上电泳,影印到硝化纤维膜(southern et al.,1979)再与32P标记的缺口转译PEN3Q杂交。现已证明能分离含有分别定位于染色体的两个突变(M216Q)PB92蛋白酶基因的菌株。该菌株称谓PEP211。其染色体结构示于图15。
为获得含有两个具M216S突变的蛋白酶基因的类似菌株,野生型基因被置换后的含突变基因(M216S)的菌株PEP112用质粒PEN3S转化,方法如前所述。实验产生的菌株PEP212含有两个分别定位于染色体的PB92突变M216Q旦白酶基因。
实施例8
生产突变型蛋白酶
突变型蛋白酶的生产是用转化的芽孢杆菌(Bacillus)菌株进行的,该菌株中突变型旦白酶编码基因既可定位于质粒,也可定位于染色体。
对于由质粒编码产物生产时,使用两种类型菌株,如上所述的嗜碱(alkalophilic)菌株芽孢杆菌(Bacillus)PBT125和枯草杆菌(B.Subtilis)DS12367,该菌株是由枯草杆菌(B.Subtilis)DB104衍生到的不产孢子菌株(Kawamura et al.,J.Bacteriol.(1984)160,442-444)。这些菌株用pBHB-MXL衍生的质粒转化。芽孢杆菌(Bacillus)PBT125和枯草杆菌(B.Subtilis)DS12367,都不含旦白酶编码质粒,被用作对照菌株。
对于用含染色体上整合的旦白酶突变基因的菌株生产时,如本文所述,使用芽孢杆菌(Bacillus)PEP菌株。含有野生型旦白酶基因芽孢杆菌(Bacillus)PBT菌株108和110被用作对照菌株。PBT108是一种含两个分别定位于染色体上的野生型基因的菌株,见EP-A-0284126。对于PBT110,见例2A。
为了检验PB92旦白酶基因原始启动子在枯草杆菌(B.Subtilis)中的活性,而构建pBHB-MXLR,其中旦白酶基因以HpaⅡ启动子(ZyDrian et al.,DNA 5(1986)219-225)的相反方向定位,以致于旦白酶基因的表达仅由原始启动子指导。
生产是在含100ml蛋白酶产生培养基的500ml摇瓶中进行的。
当采用嗜碱芽孢杆菌(Bacillus)菌株时,接种之后,按美国专利号Re 30,602所述在生产培养基中37℃时将培养物培养40小时。在含质粒菌株情况时,要加新霉素(20μg/ml)。
当使用枯草杆菌(B.Subtilis)DS12367菌株时,使用类似的培 养基,它含有12.5g/l酵母抽提物(Difco),0.97g/l CaCl2·6H2O,2.25g/l MgCl2·6H2O 20mg/l MnSO4·4H2O,1mg/lCoCl2·6H2O,0.5g/l柠檬酸盐,0.5ml消沫剂5693,6%W/W麦芽糖、0.2M磷酸盐缓冲液PH6.8,在含质粒的菌株情况时,加入新霉素(20μg/ml)。
含枯草杆菌(B.Subtilis)菌株的培养物在37℃下培养65小时,所有情况,都是用0.1ml含20μg/ml新霉素和相关菌株的Tryptic Soya Broth培养物接种于摇瓶,然后在37℃下培养24小时。
按Lin等人,J.Biol.Chem.244(1969)789-793所述,使用二甲基酪旦白作底物测定旦白酶活性。突变型旦白酶的比活性是根据测定mg底物的产物得到的(EP-A-0328229)。
发酵实验的结果概括于下列表1中。
表1
菌株 相关旦白酶总产量 突变
PBT110 100% WT
PBT125 0% -
PBT108 120% WT
PEP111 100% M216S
PEP112 100% M216Q
PBT125 pBHB-MXL 95-100% WT
PBT125 pBHB-MXL M216Q 95-100% M216Q
PBT125 pBHB-MXL M216S 95-100% M216S
PBT125 pBHB-MXL S160D 95-100% S160D
PBT125 pBHB-MXL N212D 95-100% N212D
PEP211 120% M216Q
PEP212 120% M216S
DS12367 0-1% -
DS12367 pBHB-MXLR 4% WT
DS12367 pBHB-MXL 40% WT
DS12367 pBHB-MXL M216Q 40% M216Q
DS12367 pBHB-MXL M216S 40% M216S
DS12367 pBHB-MXL S160D 40% S160D
DS12367 pBHB-MXL N212D 40% N212D
本说明书指出的所有出版物(包括专利说明书)对与本发明有关的现有技术的水平作了陈述。作为参考文献引入本文的全部出版物按其内容如同每篇出版物一样特定地和单独地作为参考文献引入。
虽然为了使人们更清楚地理解,已借助说明书和实施例对上述说明作了一些详细说明,但对所属技术领域的技术人员来说很清楚,对此作些变动和修改将不脱离所附权利要求书的原理和范围。
Claims (21)
1、至少有一个氨基酸不同于野生型旦白酶的一种旦白酶生产方法,所述方法包括使用同源嗜碱(alkalophilic)Bacillus菌株作为表达寄主,所述菌株不能产生野生型旦白酶。
2、按照权利要求1的方法,采用一种旦白酶阴性嗜碱(alkalophilic)Bacillus菌株作为表达寄主。
3、按照权利要求2的方法,采用一种蛋白酶阴性嗜碱(alkalophilic)Bacillus菌株作为表达寄主,该菌株的基因组中缺失野生型旦白酶基因。
4、按照权利要求1-3中的任一次的方法,使用Bacillus novo sp.PB92的旦白酶阴性衍生物。
5、按照权利要求1-4中的任一项的方法,使用不产孢子的嗜碱(alkalophilic)芽孢杆菌(Bacillus)菌株。
6、按照权利要求1-5中的任一项的方法,使用的不产孢子的芽孢杆菌(Bacillus)菌株的野生型旦白酶基因已用同源或异型重组方法缺失。
7、按照权利要求1-6中的任一项方法,其特征是突变型强碱性旦白酶是由质粒编码的。
8、按照权利要求1、2或3的方法,其特征在于野生型强碱性旦白酶基本上具有Bacillus novo sp.PB92旦白酶的氨基酸序列。
9、按照权利要求1-6的方法,其特征在于野生型高碱性旦白酶基因从染色体上缺失,并且至少有一种突变强碱性蛋白酶基因的一个拷贝被***该基因组。
10、按照权利要求1-6的方法,其特征在于野生型强碱性旦白酶基因至少被该突变强碱性旦白酶基因的一个拷贝所置换。
11、按照权利要求9或10的方法,其特征在于至少有一种突变强碱性旦白酶基因的一个拷贝被***基因组,而另一个拷贝是由质粒编码的。
12、一种获得具有低含量胞外强碱性旦白酶的嗜碱(alkalphilic)芽孢杆菌(Bacillus)菌株的方法,包括:
-将基因***一个克隆载体,
-从克隆载体上缺失该基因编码区
-用克隆载体转化Bacillus菌株
-转化体在载体复制功能失活的条件下生长
-选择含有已失去编码碱性旦白酶DNA序列的转化体
13、按照权利要求12的方法,其特征在于所述的嗜碱(alkalophilic)Bacillus菌株是Bacillus novo sp.PB92或其衍生物。
14、一种按照权利要求12所获得的嗜碱(alkalophilic)Bacillus菌株,用一种含突变强碱性旦白酶基因的质粒表达载体转化。
15、一种按照权利要求14所述的Bacillus菌株,其特征在于嗜碱(alkalophilic)Bacillus菌株是Bacillus novo sp.PB92的衍生物,是通过同源或异型重组获得的。
16、一种强碱性旦白酶,基本上不含有野生型强碱性旦白酶污染物,至少有一种氨基酸不同于Bacillus菌株产生的野生型旦白酶,所述菌株至少有一种已发生突变的基因拷贝和没有能产生活性旦白酶的野生型基因拷贝。
17、一种按照权利要求16的强碱性旦白酶,是由嗜碱Bacillus菌株产生的。
18、一种按照权利要求16或17的强碱性旦白酶,其特征在于在质粒和/或基因组中提供突变基因。
19、含有一种或多种权利要求16-18中任一项的强碱性旦白酶作为活性成份的洗涤剂组合物。
20、权利要求16-18中任一项所述的一种或多种强碱性旦白酶的应用,用作为一种洗涤剂组合物。
21、权利要求16-18中任一项所述的一种或多种强碱性旦白酶突变体的应用,用于一个洗涤过程中。
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