CN1211281A - 用于接合的细菌供体细胞 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于接合的修饰的细菌供体细胞,该细胞含有i)一个质粒,该质粒含有一个编码感兴趣的多肽的DNA构建物,以及至少一个在有反式作用转移因子的条件下通过接合转移该质粒所需要的顺式作用DNA序列,和ii)至少一个编码所述反式作用转移因子的DNA序列,其中与亲代细胞相比,所述供体细胞具有减弱的产生杀菌剂的能力,该杀菌剂可以杀伤受体细胞群或抑制其生长。

Description

用于接合的细菌供体细胞

本发明涉及将DNA导入芽孢杆菌(Bacillus spp.)细胞及通过培养这些细胞生产多肽的领域。具体地讲，本发明涉及修饰过的被用作芽孢杆菌属接合中的供体细胞的细胞。

通常有三种方法可用于将DNA导入芽孢杆菌菌株。第一种方法一般仅用于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)细胞，该方法是对感受态细胞进行转化，第二种方法是基于电穿孔原理，第三种方法是基于原生质体转化。

尤其是原生质体转化和感受态细胞转化被广泛采用。不过，尽管原生质体转化可应用于多种不同的芽孢杆菌，但它需要几天时间才能完成，这使得该方法用起来比较麻烦。而且，如上文所述，已证实感受态细胞转化通常只能在用于枯草芽孢杆菌168细胞时取得满意效果。

业已证实，某些芽孢杆菌属菌株可以通过接合方式摄入DNA，即通过由某些“转移质粒”介导的遗传材料交换摄入DNA。

更具体地讲，Koehler和Thorne(见细菌学杂志，1987年11月，pp.5771-5278)披露了一种55kb的质粒pLS20，它可以介导芽孢杆菌之间的质粒转移。已证实质粒pLS20可分别介导四环素抗性质粒pBC16和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)卡那霉素抗性质粒pUB110从一种枯草芽孢杆菌(natto)菌株转移到诸如炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、蜡状芽孢杆菌(B.cerus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、巨大芽孢杆茵(B.megaterium)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)的芽孢杆菌菌株中。已发现不能用pLS20转移其它质粒。已证实由pLS20介导的质粒转移是通过给予而不是传导进行的，即没有两种质粒间的物理缔合。

在细菌学杂志(1990年6月，pp.3290-3297)中，Selinger等在非接合质粒pUB110和pBC16上鉴定了一个开放读框β(ORF-β)区，并证实该区为通过接合质粒pLS20或其衍生物实现的质粒转移所必需。还证实位于ORF-β5′末端的pUB110和pBC16的另一个区(推测其含有oriT)是转移所必需的。ORF-β的作用方式是反式的，而另一区是顺式作用。

本发明的一个目的是提供用于将DNA导入芽孢杆菌菌株的改进***，并利用该***生产感兴趣的多肽。

业已意外地发现，可用接合方法将编码一种转运多肽的DNA导入多种不同的芽孢杆菌中，尤其是有工业价值的细胞，而且，将接合用于这一目的比上述常用方法更为简便快捷。另外，其转移频率高于常用方法的转移频率。而且可以用接合方法将DNA导入那些已证明用常规方法很难或不能导入的细胞中。接合方法包括将一种细菌细胞，优选为芽孢杆菌属细胞用作供体细胞，该细胞含有ⅰ)一种质粒，该质粒含有编码感兴趣的多肽的DNA构建物，以及至少一个在有反式作用转移因子的条件下通过接合转移该质粒所需的顺式作用DNA序列，和ⅱ)至少一个编码所述反式作用转移因子的DNA序列。在一种优选实施方案中，所述蛋白是一种转运蛋白。

虽然将上述供体细胞用于接合取得了惊人的成功，但是，在很多场合下，存活的转接合体的数量仍低于所需要的和/或所期望的。现已意外发现，受体细胞的低存活率是因为供体细胞产生了杀菌化合物。就此而言，本发明现已提供了一种新的供体细胞，该细胞除了如上文所述可用于成功地进行芽孢杆菌间的接合之外，还作了这样的修饰，以提高接合之后受体细胞的成活率。

因此，本发明的第一方面涉及一种修饰过的芽孢杆菌属供体细胞，该细胞除了含有上文所述的进行成功接合所需的元件之外，相对产生这种供体细胞的亲代细胞而言，还具有减弱的产生杀菌剂的能力，该杀菌剂可杀伤或抑制受体细胞生长。“减弱的能力”在本发明中是指在接合条件下与修饰过的供体细胞培养以后，受体细胞的存活力相对在同样的接合方法中使用其亲代细胞时的存活力而言有可检测到的增加。在一种优选实施方案中，修饰过的供体细胞的使用，可导致受体细胞的存活率与使用产生这种供体细胞的亲代细胞时的存活率相比，在相同的接合方法中至少增加大约10％。本发明还涉及一种方法，其中，将一个新的供体细胞群和芽孢杆菌受体细胞群混合，其混合条件为，使得质粒可通过接合作用从所述供体细胞群转移到所述受体细胞群。例如，所述受体细胞可以是例如工业化细胞或嗜碱性芽孢杆菌细胞，对于这些细胞而言，要么没有现有的公知DNA导入方法，要么方法十分复杂。定义

“转运多肽”一词是指待表达的多肽具有一个信号序列，这使其可以通过细胞膜转运。具体地讲，所述转运多肽可以是一种分泌性多肽或与相关的芽孢杆菌属细胞的分泌机制相关的多肽。

在本文中，“在有反式作用转移因子的条件下通过接合转移该质粒所需的顺式作用DNA序列”一词是指发生转移所需的DNA序列或DNA位点，它必须位于待导入受体细胞的质粒上。所述顺式作用DNA序列可以是oriT或其功能性类似物或部分。

“反式作用转移因子”一词是指一种蛋白，该蛋白可介导含有所述顺式作用DNA序列的DNA序列的接合转移。所述反式作用转移因子可以是一种由结合质粒，如pLS20或其一部分或衍生物编码的蛋白，或是一种由一种诸如orf-β或其功能性类似物或部分的DNA序列编码的蛋白。可以理解的是，由于所述转移因子是反式作用，它可以由存在于供体细胞的基因组上的DNA或存在于所述供体细胞中的第二种质粒，如接合质粒上的DNA编码。

Sellinger等(见所引用的书目)披露了分别含有oriT和orf-β的DNA序列。

分别用于oriT和orf-β的“功能性类似物”或“功能性部分”是指可以使用修饰的基因序列，只需由该修饰的基因赋予所述质粒的转移功能未明显受损即可。例如，理想的是oriT和orf-β部分(如Sellinger所述)可分别产生所需要的功能。可以如下方法分别鉴定oriT和orf-β的功能性部分或类似物，如通过常规DNA修饰技术缺失、***或取代一个或几个核苷酸，随后检验所得部分或类似物的质粒转移能力。

“接合质粒”一词意在包括能通过接合作用介导DNA转移的一切质粒。一种十分适合的例子是质粒pLS20(由Sellinger等在上面所引用的文献中披露)或基本上与其相同的质粒或pLS20的衍生物(其保留了pLS20的质粒转移能力)。与质粒pLS20结合在一起使用的“衍生物”一词是指作过遗传修饰的质粒，通常是尺寸变小，该质粒保留了所述质粒的接合介导的能力。

“消除质粒(curable plasmid)”是指可以通过外部作用因子从获得了所述质粒的细胞中清除所述质粒的质粒。例如，该质粒可以带有复制的条件起点，使得该质粒可以在某些(允许)条件下复制，但不能在其它(非允许)条件下复制。例如，该质粒的复制可以是温度敏感型的。

应当指出的是，在本文中“质粒”一词还表示能够起着自主复制的染色体外因子作用的噬菌体或其它DNA分子，而在本说明书和权利要求书中所提及的可转移的质粒意在包括一切可转移的遗传因子，例如染色体DNA序列或非自主复制的因子等。由特殊类型的供体细胞进行的接合

如上文所述，尽管与常规方法相比，接合是更有效而且通常是更适用的将DNA导入受体细菌细胞的方法，但业已发现某些类型供体和受体细胞之间接合的接合频率较低。

本发明现已意外地发现，造成接合频率低的部分原因是供体细胞能产生少量的杀细菌剂，该杀菌剂可杀伤所述受体细胞或抑制该受体细胞生长。因此，当所述杀菌剂的产生减少或消除时，接合频率会明显增加。为此，通过修饰亲代细胞得到了新的供体细胞，以减弱由亲代细胞产生的杀细菌剂的作用。

因此，本发明的另一个重要方面涉及一种构建芽孢杆菌细胞的方法，该细胞获得了编码感兴趣的多肽的DNA构建物，在该方法中，将一种细菌供体细胞群和一种芽孢杆菌受体细胞群混合，所述供体细胞具有ⅰ)一种质粒，它含有所述DNA构建物和至少一个在有一种反式作用转移因子的条件下通过接合转移该质粒所需的顺式作用DNA序列，和ⅱ)至少一个编码所述反式作用转移因子的DNA序列，其混合条件为，使所述质粒可以通过接合从所述供体细胞群转移到所述受体细胞群，所述供体细胞群是由修饰的细胞制备的，该细胞具有减弱的产生杀菌剂的能力，该杀菌剂可杀伤受体细胞群或抑制其生长。

在本文中，修饰的供体细胞一词还包括其所有子代，如果在接合条件下与修饰的供体细胞培养之后，受体细胞的存活力相对在相同的接合方法中使用产生所述供体细胞的亲代细胞而言，受体细胞的存活力表现出可测定的提高的话，则认为所述修饰的供体细胞具有“减弱的产生杀菌剂的能力”。在一种实施方案中，所述修饰的供体细胞相对最终产生这种供体细胞的亲代供体细胞系而言，受体细胞的存活率至少约增加1％，其前提是在相同条件下将两种供体用于接合，并使用相同的接合因子。理想的是，与亲代细胞系相比，修饰的供体细胞可使受体细胞的存活率至少约增加10％，增加20％更好，至少约增加30％最好。

“杀菌剂”一词意在包括由一种细菌细胞群所产生的任何成分，该成分可对所述受体细胞群产生生长抑制作用或影响或杀伤该受体细胞群，对于供体细胞群而言，其存在不是产生其接合介导活性所必须的。应当指出的是，所述天然供体细胞可以产生一种以上杀菌剂，根据本发明的这一方面，“降低的杀菌剂产量”一词是指由所述供体细胞群产生的不同的活性杀菌剂的总量或总数降低了。换句话说，这一术语表示供体细胞群不能产生或产生较低量的一、二或二种以上杀菌剂。

据信，根据本发明这一方面的方法适用于任何杀菌剂，即由所述供体细胞群产生的能抑制所述受体细胞群生长或对该细胞群有杀伤作用的一切成分。可以理解的是，待减少或消除的相关杀菌剂将取决于所选择的受体细胞。以下的实施例中将证实，不同的芽孢杆菌对不同的杀菌剂有敏感性，而且，通过减少或消除一种以上杀细菌剂(除了其对所选择的受体细胞生长抑制或杀伤作用之外，对其没有其它具体要求)的产生可明显提高接合频率。

“修饰的供体细胞”一词包括通过使所述供体细胞的涉及产生特殊杀菌剂的特定基因缺失或失活而产生的细胞(如就解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和迟缓芽孢杆菌(B.lentus)受体细胞而言的芽孢茵溶素)，以及已知的修饰过的以减少或消除杀菌剂的细胞，该细胞还作过其它修饰，以引入按照本文所述方法接合所需的因子。通常，更适用的方法是对亲代供体细胞进行诱变处理，并选择突变细胞，与所述亲代细胞相比该突变细胞对细菌受体细胞的杀伤或生长抑制程度较低，或无杀伤作用。通常，所述选择过程是通过将诱变的细胞集落复制到新铺板的“敏感型”受体细胞丛上，鉴定在其周围有较少或优选没有杀伤区的集落。以类似方式简单筛选未故意用诱变剂处理过的亲代供体细胞群中自然出现的对受体细胞有较弱的杀伤能力的变体；在本说明书和权利要求书中，可以理解的是“诱变”一词还包括分离“修饰”细胞的方法。

例如，所述诱变可以用适当的物理或化学诱变剂、用适当的寡核苷酸完成或通过对DNA序列进行PCR产生的诱变处理，当已知编码相关杀菌剂的DNA序列或产生所述杀菌剂的过程中涉及的DNA序列时，后一种方法特别适用。而且，所述诱变可以通过上述诱变剂的任意组合实现。

适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的例子包括紫外线(UV)辐射、羟胺、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲胲、亚硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。

当使用上述诱变剂时，诱变通常是这样进行的：在有所选择的诱变剂的条件下培养待诱变的细胞，培养是在适于诱变发生的条件下进行，以及筛选其杀菌剂产量降低了的突变细胞。在实践中，所述选择是这样进行的：将诱变细胞集落复制到新铺板的“敏感型”受体细胞丛上，鉴定在其周围具有较少的或优选无杀伤区的集落。

当编码所述杀菌剂的DNA序列或涉及该杀菌剂的生产的DNA序列已知时，所述修饰或失活可以这样实现：在编码所述杀菌剂或一种酶的DNA序列或其转录或翻译所需的调节因子中导入、取代或除去一个或几个核苷酸，例如，可将核苷酸***或清除，以引入一个终止密码子，清除起始密码子或改变开放该框。所述DNA序列或调节因子的修饰或失活可以按本领域公知方法通过定点诱变或PCR产生的诱变实现。常见方法包括基因破坏或基因置换或反义。

例如，杀菌剂可以是诸如芽孢菌溶素的抗生素，已知其是由枯草芽孢杆菌的某些菌株，如枯草芽孢杆菌168产生的。存在芽孢菌溶素缺陷型枯草芽孢杆菌细胞，并可选择其作为供体细胞用于通过本发明的接合方法导入DNA。另一种杀菌剂是枯草蛋白酶(subtilosin)，它也是由枯草芽孢杆菌168产生的。

除了杀菌剂的产量降低以外，所述供体细胞可以具有任何其它性状，这些性状有利于接合的发生。例如，所述供体细胞可以是营养缺陷型的，如在上文详细说明的。

有用受体细胞的产生

提高接合的成功率的另一种方法是使用一群受体细胞，该细胞可抗所述供体细胞的杀伤作用。不过，在很多场合下，感兴趣的受体细胞没有这种特性。为了能够使用感兴趣的受体细胞，可以通过筛选从易感群体中分离在接触供体细胞后能存活的细胞。为达此目的，将所述供体细胞与诱变的受体细胞混合，其混合时间和条件正常情况下可发生杀伤或生长抑制作用。然后分离从受体细胞群中存活下来的细胞，并培养，以提供可成功用于所述接合过程的受体细胞群，甚至使用未修饰的供体细胞。可以理解的是，当“诱变”一词与受体细胞一起使用时，它是指用上述针对供体细胞的方式有意诱变的细胞，以及可能存在于所述受体细胞群中的天然存在的突变型。

转运多肽的产生

可将所述供体细胞用于与受体细胞接合，再用接合后的受体细胞产生多肽，优选为转运多肽，是通过培养经接合作用已获得了编码相关转运多肽的DNA构建物的受体芽孢杆菌属细胞的细胞而完成的。所述接合优选通过使用一个质粒来实现，该质粒带有DNA构建物和至少一个在有至少一个转移因子的条件下通过接合转移该质粒所需的顺式作用序列，该转移因子以反式形式存在，即通过在以下说明中更详细披露的任一种接合方法实现。

特别适合于本发明的一种芽孢杆菌属菌株是嗜碱性芽孢杆菌(alkalophilic Bacilli)。嗜碱性芽孢杆菌的例子包括披露于US5,217,878(如芽孢杆菌BP92)、US3,723,250和US3,840,433中的芽孢杆菌。

另一种适用于本发明方法的芽孢杆菌属菌株是一种工业芽孢杆菌属细胞。“工业芽孢杆菌”一词是指不同于枯草芽孢杆菌168的非重组型芽孢杆菌菌株，它可以产生5g/l以上的分泌性多肽。

在EP134048中披露了工业芽孢杆菌的例子，其中包括地衣型芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和迟缓芽孢杆菌的菌株。

合适的芽孢杆菌属细胞的其它例子(可以是或不是工业用和/或嗜碱性的)可以选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆茵、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和苏云金芽孢杆菌。

为了提高待用于本发明这一方面的方法的芽孢杆菌属细胞的稳定性，理想的是将编码所述转运多肽的DNA构建物整合到芽孢杆茵属细胞基因组中。当所述质粒上带有一个或几个与受体细胞基因组的一部分有高到足以进行同源重组的同源性的DNA序列时，可实现上述目的。下面将进一步详细讨论适于实现所述DNA构建物与受体细胞基因组整合的方法。

待按照本发明第一方面的方法生产的转运多肽优选为分泌性多肽或分泌细胞的分泌途径的多肽。

所述分泌性多肽可以是一种酶，例如，选自淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白分解酶、纤维素分解酶、氧化还原酶或植物细胞壁降解酶。所述酶的例子包括AMG、淀粉酶、脂酶、角质酶、酯酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、过氧化物酶、漆酶、酚氧化酶、过氧化氢酶、葡糖氧化酶、肌醇六磷酸酶、裂合酶、果胶酶、葡糖苷酸、甘露糖苷酶、异构酶、转化酶、转移酶、核糖核酸酶、半乳糖苷酶和壳多糖酶。另外，所述分泌性多肽可以是一种激素、生长因子、或受体等。

所述分泌途径的多肽的一种优选实例为PrsA(WO 94/19471，其内容被收作本文参考)。

当所述转运多肽是一种分泌性蛋白时，本发明第一方面的方法优选还包括一个多肽回收步骤。可以用常规方法回收所述多肽，所述方法包括通过离心或过滤从培养基中分离所述细胞，在裂解所述细胞之后，如果必要的话，通过诸如硫酸铵的盐使所述上清液或滤液中的蛋白类成分沉淀，随后用各种层析方法进行纯化，例如，例子交换层析、亲合层析等。本发明通过接合导入DNA的方法使用一种工业芽孢杆菌属或嗜碱性芽孢杆菌属受体细胞

在本发明的一种优选实施方案中，将所述供体细胞用于一种将编码一种感兴趣的多肽的DNA构建物导入一种芽孢杆菌细胞的方法，在该方法中，将一种细菌供体细胞群与一种芽孢杆菌受体细胞群混合，所述细菌供体细胞具有ⅰ)一种质粒，该质粒含有所述DNA构建物和至少一个在有一种反式作用转移因子的条件下通过接合转移该质粒所需的顺式作用DNA序列，和ⅱ)至少一个编码所述反式作用转移因子的DNA序列，其混合条件为，使得所述质粒可通过接合从所述供体细胞群转移到所述受体细胞群，所述芽孢杆菌是嗜碱性芽孢杆菌和/或工业芽孢杆菌。

本发明的这一方面特别有利，因为嗜碱性和/或工业芽孢杆菌的菌株通常被证实不能通过感受态转化，并因而仅能进行原生质体转化，正如上文所披露的，该原生质体转化方法是一种十分复杂的导入DNA的方法。

上面给出了嗜碱性和/或工业芽孢杆菌的例子。使用一种营养缺陷型供体细胞

在另一种实施方案中，本发明涉及一种构建获得了编码感兴趣的多肽的DNA构建物的芽孢杆菌细胞的方法，在该方法中将一种营养缺陷型修饰的细菌供体细胞群与一种未标记过的芽孢杆菌受体细胞群混合，所述供体细胞群具有ⅰ)一种质粒，该质粒含有所述DNA构建物和至少一种在有一种反式作用的转移因子和条件下通过结合转移所述质粒所需的顺式作用DNA序列，和ⅱ)至少一个编码所述反式作用转移因子的DNA序列，混合条件为：使所述质粒可通过接合从所述营养缺陷型供体细胞群转移到所述未标记的受体细胞群，而所述供体细胞的营养缺陷型特性被用于选择受体细胞。

本发明这一方面的显著优点是无须对受体细胞进行选择，因为在利用所述供体细胞的营养缺陷型特性时所述受体细胞是唯一能存活的。

例如，所述供体细胞可以是特定氨基酸的营养缺陷型。特别优选用于本发明方法的供体是一种D-丙氨酸缺陷型供体，即该供体为dal^-。在接合处理完成之后，将dal^-供体细胞和受体细胞放在缺乏D-丙氨酸的培养基上或中培养，即在dal^-供体细胞不能在其上或其中生长的培养基里培养。因此，只有受体细胞存活。使用营养缺陷型标记的原理披露于诸如US4,920,048中。

随后，仅需选择获得了所述感兴趣的DNA构建物的受体细胞，通常是利用选择标记进行选择，例如，由所述质粒编码的抗生素抗性。使用一种消除质粒

另一方面，本发明涉及一种将一种编码感兴趣的多肽的DNA构建物导入一种芽孢杆菌细胞的方法，在该方法中，将本文所披露的一种修饰细菌供体细胞群与一种芽孢杆菌受体细胞群混合，所述供体细胞具有ⅰ)一种消除质粒，该质粒含所述DNA构建物和至少一个在有一种反式作用转移因子的条件下通过接合转移该质粒所需的顺式作用DNA序列，和ⅱ)至少一个编码所述反式作用转移因子的DNA序列，混合条件为：使所述质粒可通过接合从所述供体细胞群转移到所述受体细胞群。

消除质粒的应用特别适合于构建获得了某些质粒因子的受体细胞，该质粒已通过接合转移到所述细胞中，但该细胞没有诸如通过接合转移该质粒所需的顺式作用DNA序列的其它因子。在这种场合下，理想的是将所述编码一种感兴趣的多肽的DNA构建物整合到受体细胞基因组中，选择性地与待保留在该细胞中的其它因子一起整合，而不为该细胞所需要的因子(如顺式作用DNA序列)仍留在所述质粒上。在进行基因组整合以后，将所述细胞中带有不希望的因子的所述消除质粒消除。下面将进一步披露实现基因组整合的方法。

用于根据本发明这一方面的方法的消除质粒可以通过用本领域已知方法组合各个因子(例如，温度敏感型复制起点，顺式作用DNA序列，感兴趣的DNA构建物等)，通常是通过修饰一种消除质粒或带有所述顺式作用DNA序列的质粒而实现。本发明方法的优选实施方案

下面将披露本发明上述方法的优选实施方案。应当理解的是，本发明这些实施方案的主题普遍适用于上述每一个和任一个主要方面的方法，除非另有说明。受体细胞

理想的是，用于本发明任一种接合方法的受体细胞是一种嗜碱性芽孢杆菌细胞或工业芽孢杆菌细胞。所述受体细胞还可以是芽孢杆菌细胞，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌的细胞。而后一类受体细胞可属于工业或嗜碱性芽孢杆菌类。修饰的供体细胞

可用于本发明任一种方法的修饰的细菌供体细胞可以是诸如大肠杆菌(E.coli)的埃希氏菌细胞，但更理想的是芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌的细胞，这些细胞与其亲代细胞相比具有较弱的产生杀菌剂的能力，或不能产生这种杀菌剂，而这种杀菌剂在正常情况下是可由亲代细胞产生的，所述修饰细胞具有ⅰ)一种质粒，该质粒包括编码一种感兴趣的多肽的DNA构建物和至少一个在有一种反式作用转移因子的条件下通过接合转移该质粒所需的顺式作用DNA序列，和ⅱ)至少一个编码所述反式作用转移因子的DNA序列。

所述细胞优选为枯草芽孢杆菌细胞，如枯草芽孢杆菌168的细胞，这种细胞不产生或较少产生相关的杀菌剂。

在一种优选实施方案中，所述细胞具有减弱的或不能产生杀菌剂芽孢菌溶素或枯草蛋白酶或这两种杀菌剂的能力。

在上文的题为“由将殊类型的供体细胞进行的接合”一节中详细披露了这些细胞。另外，所述供体细胞可以是营养缺陷型的，如在上文所详细披露的。消除质粒

在一种高度优选的实施方案中，待导入所述受体细胞的DNA构建物存在于一种消除质粒上，该质粒还包括所述顺式作用序列。在上文的题为“本发明通过接合导入DNA的方法--利用消除质粒”一节中详细披露了消除质粒及其应用。感兴趣的DNA构建物的基因组整合

尽管待按本发明上述所有方面的任一方面导入受体细胞的编码感兴趣的多肽的DNA构建物可以在该受体细胞中作为染色体外因子存在(例如，由用于将所述DNA导入该细胞的质粒携带)，但通常优选的是将该DNA构建物整合到受体细胞基因组中，因为一般认为基因组整合的DNA更稳定。

所述基因组整合可以用基于分别在所述质粒和基因组上的同源序列间的重组的常见的公知方法实现。在一种实施方案中，当待转移的质粒是具有以下构建物的质粒时可实现基因组整合：

顺式-R(1)-DNA-R(2)，其中“顺式”表示接合转移所需要的顺式作用DNA序列，DNA表示待导入受体细胞中的DNA构建物，而R(1)和R(2)分别表示与所述受体细胞基因组的一部分有足够的同源性的DNA序列，以便通过双交换将位于R(1)和R(2)之间的DNA构建物整合到受体细胞的基因组中。

所述质粒通常可以是一种消除质粒，例如，这样一种质粒，在其包括R(1)-DNA-R(2)的片段的任一侧具有一个温度敏感型复制起点。使用消除质粒的另外的优点是，可以在一旦发生接合之后从所述细胞中消除进行接合所需的顺式作用DNA序列。

当使用消除质粒时，理想的是该方法还包括选择受体细胞的步骤，编码感兴趣的多肽的DNA构建物已整合到该受体细胞基因组中而带有顺式作用因子的质粒已从该细胞丧失。

就涉及利用同源区域进行的基因组整合的本发明的实施方案而言，基因组的“同源区域”一词优选是指这样的区域：对于受体细胞的存活和正常功能来说，该区域不是必需的。

而且，如上文所述，为了提高按照上述任一种方法进行整合的效率，可以使用一种消除质粒。例如，该质粒可以是一种在复制方面是温度敏感型的质粒。提高整合并在其后从细胞中消除第一子代载体的效率的另一种方法是在上述选择条件下培养宿主细胞之后，用诸如新生霉素的质粒消除剂处理用所述质粒转化过的细胞(Gadó,I.等，1987.Zbl.Bakt.Hyg.A.265,136-145)。扩增编码一种感兴趣的多肽的DNA序列

本发明的接合方法可有利地用于实现对存在于受体的基因组上的基因组DNA序列进行扩增。在WO 94/14968中披露了用于实现基因组DNA序列扩增的一种十分常见的方法，其内容并入本文作参考。待扩增的基因组DNA序列可以是编码一种感兴趣的多肽的序列，该序列是已通过本发明的接合方法导入所述受体细胞中的。本发明的受体细胞

本发明的另一方面涉及一种通过本发明的接合方法生产的芽孢杆菌细胞，该细胞获得了一种感兴趣的DNA构建物，和一个进行接合所需要的顺式作用DNA序列。所述细胞优选为在上文的题为“受体细胞”一节中所规定的任一种芽孢杆菌的细胞。生产多肽的方法

再一方面，本发明涉及一种生产感兴趣的多肽的方法，该方法包括在能诱导所述感兴趣的多肽生成的条件下培养通过上述本发明方法产生的细胞，并任选地回收所述感兴趣的多肽。

可以用常规回收或纯化方法回收所述多肽，该方法的例子在上文有进一步说明。按照本发明这一方面的方法特别适用于生产转运多肽，如分泌性多肽或在所述受体细胞的分泌途径中起作用的多肽。分泌性多肽的例子，如酶在上文中提到过。质粒和DNA构建物的构建

最后一方面，本发明涉及一种非天然存在的质粒，该质粒包括oriT或其功能性部分或类似物。该质粒还可以包括一个能赋予所述质粒温度敏感性的DNA序列和/或一个DNA构建物，所述DNA构建物编码一种感兴趣的多肽，特别是如上文所述的转运多肽。

可以理解的是，为了能在本发明方法中正常起作用，所述反式作用因子如orf-β应该可操纵地连接于调节DNA序列(如一个启动子、一个终止子、一个核糖体结合位点等)上，以确保所述基因能被转录和翻译。例如，所述基因之前应当是一种合适的启动子，例如，已证实其本身与所述基因相关的启动子，但更理想的是能确保由所述基因进行强转录的启动子。另外，将一个额外的启动子插在orf-β序列前面可以是有利的。例如，已证实将解淀粉芽孢杆菌β-淀粉酶启动子***orf-β及其天然启动子前面可明显提高转移频率。其它可作为额外或替代启动子***的强启动子的例子包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子，嗜热脂肪芽孢杆菌生麦淀粉酶基因(amyM)的启动子等。

待用于本发明方法中的DNA构建物和质粒可以一系列遗传学操作而合成，该操作使用本领域已知方法和酶。材料和方法细菌菌株和质粒供体菌株：枯草芽孢杆菌DN1280     dal(ref.2)PP289-5    DN1280(pLS20；tra⁺),(pBC16；Tc^r)MT101      DN1280(pXO503；tra⁺ MLS^r)MT107      DN1280(pXO503；tra⁺ MLS^r)(pUB110；Km^r)1A758      168 bac-1(Bacillus Stock Center,Columbus,Ohio)

       BW96 1A758 dal△

       BW97 1A758 dal△∷Cam^r(pXO503；tra+ MLS^r)BW98 1A758 dal△∷kan^r(pXO503；tra+MLS^r)BW99 1A758 dal△(pPL2541-tet；Tet^r)BW100 1A758 dal△(pXO503；tra+MLS^r),(pPL2541-tet;Tet^r)BW101 1A758 dal△(pXO503；tra+ MLS^r)BW104 1A758 dal△(pSJ2662；Kan^r)BW105 1A758 dal△(pXO503；tra+MLS^r),(pSJ2662；Kan^r)BW106 1A758 dal△∷Kan^r(pXO503；tra+ MLS^r),(pMOL913；Cam^r)受体菌株：

枯草芽孢杆茵W23             BGSC

迟缓芽孢杆菌C360           (ref.3)

地衣芽孢杆菌ATCC 102

迟缓芽孢杆菌菌株165-2

解淀粉芽孢杆菌质粒：

pUB110   Mob⁺Km^r         BGSC

pBC16    Mob+Tc^r         (ref.4)

pLS20 Tra⁺               (ref.1)

pXO503 Tra⁺MLS^r(pLS20∷Tn917,60kb)(ref.1)

pPL2541-tet Mob⁺Tet^r(pE194 ts ori)

pSJ2662 Mob⁺Km^r(pUB110，带多接头)

pMOL913 Mob⁺Cm^r(pUB110 w/cat取代neo基因)培养基和生长条件。所述接合方法是由Koehler和Thorne(ref.1)所披露方法的改进形式。所有细菌菌株都按常规方法生长于适当的话补充了D-丙氨酸(50μg/l)和抗生素的LB琼脂板上(Maniatis，T等，1982,ref5)。(为了使嗜碱性菌株能更好地生长，所述LB培养基可以用50mMNaHCO₃缓冲)。将新制备的过夜培养物用于接合。交配型。将供体菌株和受体菌株的过夜培养物(14-24小时)转移到LB+D-丙氨酸平板上，并混合含有每种菌株的5-10个茵落的接种物。在混合所述菌株之后，将所得细胞铺板于有孔板上。在30-37℃下至少培养该交配型4小时。或者将所述交配平板复制到选择平板(=含有适当抗生素，但无D-丙氨酸的LB琼脂)上，或者将所述细胞重新悬浮于LB培养基中，并以高达10⁵倍的稀释液铺板于选择平板上。在30-37℃下培养1-2天后对这些板的接合体进行记录，并在选择平板上进一步纯化。

ref.1 Koehler,T.M.,Thorne,C.B.,1987，细菌学杂志，169卷，11期，P.5271-5278。

ref.2 Diderichsen,B.,1986，见“芽孢杆菌属遗传学及生物技术应用”，P35-46。

ref. 3 Aunstrup,K.,H.Outtrup,O.Andresen和C.Dampmann,1972，源于嗜碱性芽孢杆菌的蛋白酶，P299-305。见“第四届发酵技术国际会议论文集”，发酵技术协会，Osaka，日本。

ref.4 Bernhard,K,H.Schrempf和W.Goebel.1978，蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中的细菌素和抗生素抗性质粒，细菌学杂志，133,897-903。

ref.5 Maniatis,T.等，1982，分子克隆：实验手册，Cold SpringHarbor实验室，冷泉港，纽约)。或者将所述交配平板复制到选择平板(=有适当的抗生素，但无D-丙氨酸的LB琼脂)上，或将所述细胞重悬浮于LB培养基中，并以高达10⁵倍的稀释液铺板于选择平板上。在30-37℃下培养1-2天之后，对这些平板上的接合体进行记录，并在选择平板上进一步纯化。例1A)构建一种编码Savinase的温度敏感型转座子输送载体

Savinase是获自迟缓芽孢杆菌的一种胞外碱性蛋白酶。一种表达Savinase并可用于通过转座作用输送该基因的载体是pMOL 553。该质粒是分两步构建的。步骤1

将一个BamHI位点引入cat基因上游的pHV1248转座子(Petit,M.-A.,Bruand,C.,Janniere,L.Ehrlich,S.D.(1990)，在枯草芽孢杆菌中有活性的由Tn10衍生的转座子，细菌学杂志，172:6736-6740)。是用早先披露的(Horton,RM.等(1989)Gene,pp.61-68)基于PCR的SOE技术将所述BamHI位点***。以pHV1248质粒做模板进行两个独立的PCR反应。用于第一个PCR反应的寡聚体是引物1:CCCACTGGATCCAATTTTCGTTTGTTG(序列1)和引物2:GCAAATTGATCCAAGAGAACCAAC(序列2)。引物1中划线的碱基表示BamHI位点的位置。第二个PCR反应基于引物3:CAACAAACGAAAATTGGATCCAGTGGG(序列3)和引物4:GCACATCATCATCATAAGC(序列4)。两种PCR反应均是通过标准方法完成的，变性使用96℃的温度，退火使用55℃的温度，在延伸步骤中使用72℃的温度。一共进行20轮反应。两种片段均自琼脂糖凝胶中纯化，并将500ng的每一种片段用于第二次的5轮PCR反应：96℃下2分钟，50℃下5分钟和72℃下1分钟。在96℃下加入引物2和引物4(100pmol)并开始第三次的25轮PCR反应：96℃下30秒，55℃下30秒，和72℃下90秒。用HindⅢ消化最终的1330bp的PCR片段，并重新克隆到HindⅢ消化过的pHV1248上，得到质粒pMOL610。将连接混合物转化到大肠杆菌SJ2(Diderichsen等，1990，细菌学杂志，172,4315-4321)中。通过限制性消化确定BamHI位点在pMOL610中的位置。步骤2

在这一步骤中，将整个Savinase基因克隆到pMOL610的BamHI位点。通过PCR扩增来自pSX222(WO92/11357)的整个Savinase基因和启动子区域，扩增时使用具有BamHI限制位点(划线部分)的引物5:CCGGCGGATCCAAGGGGTGA TCG(序列5)和引物6:GGGGTACTAGTAACCCGGGCCCGGCGTAGAGGATCCATACACAAA(序列6)。PCR反应是按以下方式进行的：96℃下30秒，55℃下30秒，和72℃下120秒。在经过20轮反应之后对PCR片段进行BamHI消化，纯化并克隆到pMOL610的BamHI位点。该克隆位点由限制性消化产物和在枯草芽孢杆菌中的独特蛋白酶表型(例如，在菌株DN1885(Diderichsen等，1990，细菌学杂志，172,4315-4321)，或该菌株的蛋白酶缺陷型衍生物中的表型)得以证实。由此构建的编码Savinase的载体是pMOL553。B)构建编码Savinase的可转移的转座子输送载体

已披露了由pLS20或其衍生物进行的质粒pUB110的转移，并做过一些详细分析(Koehler,T.M.和Thorne,C.B.(1987)，由枯草芽孢杆菌(natto)质粒pLS20介导的种间质粒转移，细菌学杂志，169,5271-5278；Selinger.L.B.,McGregor,N.F.,Khachatourians,G.G.和Hynes,M.F.(1990)，由芽孢杆菌属质粒pXO503进行的紧密相关的质粒pUB110和pBC16的转移需要反式作用开放读框β，细菌学杂志，172,3290-3297)。

我们已用源于上述质粒的因子转移所述表达Savinesa的转座子输送载体。

pUB110的转移取决于位于orfβ5’末端的顺式作用区域(oriT)(Selinger等，1990)。将pUB110序列上的1020位至1575位的pUB110的555bp区段用引物LWN5232和LWN5233进行PCR扩增。LWN5232：5’-GTCGGAGCTCATTATTAATCTGTTCAGCAATCGGGC-3’(序列7)LWN5233：5’-GTCGGAGCTCTGCCTTTTAGTCCAGCTGATTTCAC-3’(序列8)

用SacⅠ消化扩增的片段，并首先克隆到大肠杆菌质粒(一种pUC19衍生物)的SacⅠ位点上。随后再用SacⅠ将该片段切除，并将其克隆到上述质粒pMOL553的单一SacⅠ位点上。将连接混合物转化到大肠杆菌SJ2中，选择Amp抗性。所得质粒为pMOL553-oriT。C)构建含有一种编码Savinase的可转移转座子输送载体的接合型供体菌株

可通过接合作用将质粒pLS20和pBC16从枯草芽孢杆菌菌株PSL1UM13转移到各种枯草杆菌属受体菌株(Koehler和Thorne,1987)中。

DN1280是枯草芽孢杆菌168的衍生物，它含有一个位于dal基因上的缺失(Diderichsen,B.(1986)，用于在枯草芽孢杆菌中稳定克隆基因的遗传***，P35-46，见A.T.Ganesan和J.A.Hoch(著)，芽孢杆菌属分子遗传学和生物技术应用，学术出版社，纽约)。使DN1280成为感受态，并用质粒pHV1248转化，在30℃下选择红霉素抗性(5μg/ml)。将得到的菌株用作与PSL1 UM13接合的受体。将两种菌株混合于LB平板上，该板中添加有磷酸盐(0.01M K₃PO₄)、葡萄糖(0.4％)、淀粉(0.5％)和D-丙氨酸(100μg/ml)，并在30℃下培养5小时。然后将所述板复印到如上文所述的LB平板上，但该平板另外含有红霉素(5μg/ml)和四环素(5μg/ml)。

分析在复制平板上出现的单茵落将pBC16转入枯草芽孢杆菌DN1885中的能力。通过在如上所述LB平板上混合所述菌株并在30℃下培养5小时实现接合。复制到含有四环素(5μg/ml)，但无D-丙氨酸的LB平板上。

D-丙氨酸的取消可有效仅选择出dal^-供体菌株。少数分析过的菌落能将Tet^R标记转移到DN1885中。这表明这些茵落除了pBC16之外还获得了pLS20。在50℃下，在含有四环素(5μg/ml)和D-丙氨酸(100μg/ml)的液体TY培养基中繁殖一个这样的菌落，随后铺平板于含有四环素(5μg/ml)和D-丙氨酸(100μg/ml)的LB上，并复制到分别含有D-丙氨酸(100μg/ml)和红霉素(5μg/ml)或氯霉素(6μg/ml)的LB上。保存一种四环素抗性、红霉素和氯霉素敏感性分离体，称为PP289-5。该菌株为dal^-并含有pLS20和pBC16，它可以作为使含有pUB110oriT的质粒转入各种受体菌株的接合供体菌株。

因此，使PP289-5变成感受态，并用含有oriT的pMOL553衍生物即pMOL553-oriT进行转化。从所收集的大肠杆菌SJ2转化体中制备质粒，并将质粒混合物转化入PP289-5中，在含有D-丙氨酸(100μg/ml)的LB平板上选择对四环素(5μg/ml)、氯霉素(6μg/ml)和红霉素(5μg/ml)的抗性。再次收集转化体，并将该收集物用于通过接合作用将pMOL553-oriT转入DN1885中，使用上文所述方法。最后，通过限制作图证实转接合体中质粒的性质，并保持正确的质粒(pMOL553-oriT)。

将pMOL553-oriT重新转入PP289-5中以便进一步利用。D)碱性蛋白酶基因向嗜碱性芽孢杆菌属菌株的接合转移

将含有pMOL553-oriT的PP289-5用作接合供体菌株，将从迟缓芽孢杆菌中分离的编码Savinase的同源apr基因转入嗜碱性迟缓芽孢杆菌菌株C360中(Aunstrup,K.,Outtrup,H.,And resen,O.,Dampmann,C.(1972)，源于嗜碱性芽孢杆菌的蛋白酶，P.299-305，见第4届发酵技术国际会议论文集，发酵技术协会，Osaka，日本)。

从补充了50μg/ml D-丙氨酸、5μg/ml红霉素和5μg/ml四环素的LB平板上收集一日龄供体菌株PP289-5/pMOL553-oriT的细胞。受体菌株(C360)自LB9平板(LB9=用0.05M HNa₂CO₃/H₂NaCO₃缓冲至pH9的LB平板)上收集(1日龄细胞)。

在补充了50μg/ml D-丙氨酸的LB平板上混合所述受体菌株和供体菌株，并在30℃下培养5小时。然后将该平板复制到补充了5μg/ml红霉素的LB9平板上。在补充了5μg/ml红霉素的LB9平板上再次分离出现在复制平板上的单茵落(在30℃下培养2天之后)。(通过省略所述选择平板中的D-丙氨酸，将dal^-供体菌株杀死，仅有含可转移的pMOL553-oriT质粒的迟缓芽孢杆菌受体能够存活)。分离几种迟缓芽孢杆菌转接合体中的质粒，限制作图证实了pMOL553-oriT质粒已转移到迟缓芽孢杆菌中。例2

构建新的bac-1供体菌株

将dal基因从枯草芽孢杆菌菌株1A758(Bacillus Stock Center,Columbus,Ohio)中缺失，以便在接合之后对该菌株进行反选择。在枯草芽孢杆茵菌株1A758的“bac-1”基因座上有一个突变，该突变可消除所述细菌合成二肽抗生素芽孢菌溶素的能力。在体外构建一种缺失形式的dal基因，该基因可以置换细菌染色体上的野生型dal基因。通过PCR克隆dal基因的5′和3′部分，将寡聚体1和2用于PCR扩增该基因的5′部分(19-419号核苷酸，ATG密码子的A是+1)，并将寡聚体3和4用于PCR扩增该基因的3′部分(618-1037号核苷酸)。

寡聚体1:5’-GAGCTCACAGAGATACGTGGGC-3’(序列9)

寡聚体2:5’-GGATCCACACCAAGTCTGTTCAT-3’(序列10)

寡聚体3:5’-GGATCCGCTGGACTCCGGCTG-3’(序列11)

寡聚体4:5’-AAGCTTATCTCATCCATGGAAA-3’(序列12)

用TA克隆试剂盒(Invitrogen,Corp.San Diego,CA)将两种PCR产物克隆到pCRⅡ载体中。一旦克隆之后，在体外用两个片段共有的BamHI位点将上述两个1/2部分组合在一起，以得到一种部分dal基因(△dal)，在其中部有～200bp的缺失，该片段可以Not Ⅰ-HindⅢ片段的形式从pCRⅡ载体中方便地除去(所述NotⅠ位点是所述载体多接头的一部分)。

用两种不同方法制备dal-bac-1供体菌株。第一种方法涉及通过将一个cat基因***dal基因编码序列中来产生一个基因破坏。将一个cat表达盒克隆到pCRⅡ-△dal质粒的BamHI位点上。通过以如下方式进行双交换将该构建物导入所述细菌染色体中：用ScaⅠ将所述质粒线性化，并转化到含有接合质粒pXO503的bac-1菌株中，在含有D-丙氨酸(0.1mg/ml)和氯霉素(5μg/ml)的TBAB(胰化蛋白胨血琼脂碱)平板上选择氯霉素抗性。所述细菌细胞获得氯霉素抗性的唯一方法是在线性质粒DNA cat基因的旁侧dal序列与染色体之间进行双交换，从而导入含有所述cat表达盒的被破坏的dal基因。该方法产生了枯草芽孢杆菌菌株BW97，一种bac-1,△dal∷cat^r接合盈余型(proficient)供体菌株。

将第二种方法用于构建一种“未标记的”供体菌株(无抗生素抗性标记***所述dal基因)。在这种情况下，不是直接选择双交换过程，而是进行两次独立的单交换，以便将一种缺失的“未标记的”dal基因导入所述细菌染色体中。上述过程是以如下方式实现的：将缺失的dal基因(如上文所述)克隆到所述温度敏感型质粒pE194^ts的NotI-HindⅢ位点上，转化入所述bac-1菌株，并在34℃的允许温度下生长。为了实现所述第一次交换(将所述dal缺失质粒整合到所述染色体上的dal基因中)，将该转化菌株划线到含有D-丙氨酸(0.1mg/ml)(为细胞生长所需，因为整合到所述染色体上会破坏所述dal基因)和红霉素(5μg/ml)的TBAB平板上，并在45℃的非允许温度下生长过夜。在相同条件下对大的菌落进行再次划线，得到一种一致的细胞群，该细胞含有整合到所述染色体上的dal基因中的温度敏感型质粒。在所述非允许温度下，仅有在其染色体上含有所述质粒的细胞能在红霉素上生长，因为该质粒不能复制。为了完成所述第二次交换过程(导致所述质粒从所述染色体上切除，留下缺失形式的dal基因)，将一环细胞转移到20ml补充了D-丙氨酸(0.1mg/ml)的Luria肉汤中，并生长至后对数期，而不在34℃的允许温度下进行选择，以使其复制起点可以工作，并出现二次交换过程。再对细胞进行4次转移(每次转移稀释100倍)，以使所述质粒从染色体中切除，并从所述群体中分离。最后，将所述细胞铺平板，在34℃下在补充了D-丙氨酸(0.1mg/ml)的TBAB平板上形成单菌落，并将其复制到无D-丙氨酸(0.1mg/ml)的TBAB平板和有D-丙氨酸(0.1mg/ml)和红霉素(5μg/ml)的TBAB平板上，并记录dal^-和erm^s的菌落。在50个茵落中有2个出现这种表型。所得到的菌株被命名为枯草芽孢杆菌BW96。然后将质粒pSJ2662(基本上为pUB110，在其非必需区上***一个多接头)导入，以得到dal△bac-1,kan^r菌株BW104。用BW100作为供体菌株通过接合作用将接合质粒pXO503导入该菌株中；通过选择在TBAB+D-丙氨酸+红霉素(5μg/ml)+卡那霉素(10μg/ml)上的生长，对转接合体进行记录。由此得到“未标记的”供体菌株BW105:bac-1,dal△，该菌株含有pXO503和pSJ2662。

通过首次将ts复制子pPL2541-tet导入BW96得到dal缺失的bac-1,tet^r菌株BW99来构建供体菌株BW101(一种仅具有pXO503的dal缺失菌株)。通过用BW97作为供体菌株进行的接合，将接合质粒pXO503导入该菌株中；通过选择在TBAB+D-丙氨酸+红霉素(5μg/ml)+四环素(10μg/ml)上的生长对转接合体进行分类。由此产生含有pXO503和pPL2541-tet的供体菌株BW100:bac-1,dal△。最后在45℃的非允许温度下将该菌株繁殖过夜，并铺平板，以便在34℃的允许温度下在TBAB+D-丙氨酸平板上形成单菌落。然后将菌落影印到TBAB+D-丙氨酸+四环素(10μg/ml)平板和TBAB+D-丙氨酸+红霉素(5μg/ml)上，以鉴定erm^r和tet^s茵落；鉴定几个具有该表型的菌落，保存其中的一个，并命名为BW101。A)接合到一种解淀粉芽孢杆菌菌株中

检验菌株BW105将pSJ2662转移到解淀粉芽孢杆菌(和作为正对照的枯草芽孢杆菌168)中的能力；将该供体与相当的野生型供体菌株MT105进行比较。将供体和受体在2ml L肉汤+D-丙氨酸+葡萄糖(0.2％)中生长至中对数期。将1ml供体和受体混合，并离心，将沉淀重悬于100ul残余肉汤中；将50ul点状接种于TBAB+D-丙氨酸+葡萄糖平板上。在37℃下将其培养5小时；将所述细胞从所述平板上刮下，并转移到1ml L肉汤中，并滴定TBAB+新霉素(10μg/ml)平板上的转接合体，并在单纯TBAB平板上筛选存活的细胞。两种供体均可以相当高的效率将pUB110复制子转移到枯草芽孢杆菌(10^-3-10^-4)中。不过，bac-1供体菌株在将pUB110转入解淀粉芽孢杆菌(～10^-5)方面，比MT105供体(＜10^{- 7})更好一些(＞100倍)。B)接合到迟缓芽孢杆菌菌株165-2中

用质粒pCm∷Nm转化在其dal基因上***了cat的bac-1供体菌株BW97(bac-1,dal△∷cam^r)。该质粒获自Bacillus Genetic StockCenter，它含有其旁侧为cat基因的5′和3′部分的neo抗性基因。用该质粒转化，可以用neo基因取代dal基因中的cat基因。用该质粒转化，可以形成数以百计的neo抗性菌落。由于该质粒位于pE194复制子上，将其转化体之一生长在非允许温度下(45℃)，以便通过同源重组将该质粒整合到染色体中。在允许温度(34℃)下让该菌株生长大约20代，然后铺平板于TBAB+neo上。在30个neo抗性茵落中，有2个为氯霉素敏感型，表明neo基因取代了cat基因。然后用质粒pMOL913转化菌株BW98(bac-1,dal△∷neo^r)，该质粒基本上是用cat取代了neo基因的pUB110。选择氯霉素抗性菌落作为供体菌株(BW106)，并与bac+等同物(MT101/pMOL913)比较。按上述方法进行接合。所有接合均在pH7条件下进行。每次实验用旧供体可得到的转接合体数约为10-100个，而用新供体一共可获得大约10³-10⁴个转接合体。选择是在pH7条件下进行的，但要对所有转接合体在pH9下生长的能力进行检验，所有均生长表明其为迟缓芽孢杆菌。

在与迟缓芽孢杆菌的接合中使用含有pUB110(MT105)的旧供体菌株，在pH7下选择新霉素抗性未获得转接合体。使用相当的新供体菌株，在pH7下选择neo抗性共得到大约10³个转接合体，当仅对供体或受体进行铺平板时未获得茵落。所有菌落均生长于pH9下，证明其是正确的。C)分离具有减弱的杀伤效力的枯草芽孢杆菌突变型

尽管枯草芽孢杆菌的bac-1突变型菌株几乎能避免杀伤解淀粉芽孢杆菌受体细胞，但对诸如巨大芽孢杆菌的某些其它芽孢杆菌仍有可检测到的杀伤作用，表明形成了其它抗微生物剂。在下面的实验中证实，用传统诱变方法很容易“剔除”上述其它因子；可能将一种或几种突变与bac-1突变体组合，并得到更好的供体菌株。采取一种诱变方法，以获得额外的突变；用化学诱变剂EMS诱变野生型供体菌株MT101(也可以使用诸如NTG、UV和转座子标记的其它形式的诱变)。用0.5ml生长于Spizizen′s Ⅰ培养基+D-丙氨酸的过夜培养物MT101接种装在侧臂Klett烧瓶中的20ml相同培养基。在37℃下摇动下使细胞生长至70 Klett单位，并在室温下离心。将细胞沉淀重悬于12ml Spizizen盐+2.5ml 1M TrispH7.4中。对于t₀样品而言，将2ml等分试样转至18ml VY培养基+D-丙氨酸中，并在37℃下摇动过夜。向其余部分添加30μl EMS，并在37℃下摇动所述细胞；在t₁(1小时)、t₂(2小时)、和t₃(3小时)取2ml试样，按上述与t₀样品相同的方法转至新的培养基中。在培养过夜之后以15％的终浓度将甘油加至所述细胞中，滴定，并在-70℃下保存于Revco冷冻器中；样品t₁、t₂和t₃的存活百分率分别是38、19和0.1。

选择t₂样品进行突变体筛选。将细胞铺平板，以便在TBAB+D-丙氨酸上形成单菌落；然后将其复制铺平板于新涂布的解淀粉芽孢杆菌受体菌株丛上(任何“敏感型”菌株均可用作指示菌株)。在34℃下培养所述平板过夜，并记录MT101供体菌落周围的澄清区；有效的突变体具有显著减少的或没有澄清区。在检验过的～1500个茵落中获得了6个突变体；选择其中之一“mut1”作进一步分析。将解淀粉芽孢杆菌和mut1菌株生长至中对数期。将每一种菌株1ml合并，并通过离心沉淀，将细胞重悬于100μl肉汤中，并将50μl成斑接种于TBAB+D-丙氨酸平板上。在37℃下培养5小时后，从该平板表面刮取所述细胞，并重悬于1ml新鲜L肉汤中；通过将稀释液铺平板于缺乏D-丙氨酸的TBAB平板上滴定存活菌落。与野生型供体相比，发现其杀伤作用明显降低了(10,000倍)。

                            序列表(1)一般资料

 (ⅰ)申请人

    (A)名称：Novo Nordisk Biotech,Inc.

    (B)街道：1445 Drew Avenue

    (C)城市：Davis,California

    (D)国家：United States of America

    (E)邮编(ZIP)：95616-4880

    (F)电话：(916)757-8100

    (G)传真：(916)758-0317

(ⅱ)发明名称：用于接合的细菌供体细胞

(ⅲ)序列数：12

(ⅳ)通讯地址：

    (A)收件人：Novo Nordisk of North America

    (B)街道：405 Lexington Avenue

    (C)城市：New York

    (D)州：NY

    (E)国家：USA

    (F)邮编：10174

(ⅴ)计算机可读形式：

    (A)媒体类型：软盘

    (B)计算机：IBM兼容

    (C)操作***：DOS

    (D)软件：FastSEQ for Windows Version 2.0(ⅵ)当前申请资料：

    (A)申请号：PCT/US97/00899

    (B)申请日：1997年1月17日

    (C)分类号：(ⅷ)律师/代理人资料：

    (A)姓名：Agris,Cheryl H

    (B)注册号：34,086

    (C)文件/档案号：4666.204-WO

(ⅸ)电信信息：

    (A)电话：212-867-0123

    (B)传真：212-878-9655

    (C)电传：(2)序列1资料：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：27bp

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单

    (D)拓扑构建物：线性

  (ⅹⅰ)序列描述：序列1：

CCCACTGGAT CCAATTTTCG TTTGTTG                                      27(2)序列2资料：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：24bp

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单

    (D)拓扑构建物：线性

  (ⅹⅰ)序列描述：序列2：

GCAAATTGAT CCAAGAGAAC CAAC                                          24(2)序列3资料：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：27bp

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单

    (D)拓扑构建物：线性

(ⅹⅰ)序列描述：序列3：

CAACAAACGA AAATTGGATC CAGTGGG                                        27(2)序列4资料：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：18bp

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单

    (D)拓扑构建物：线性

(ⅹⅰ)序列描述：序列4：GCACATCATC ATCATAAG                                                  18(2)序列5资料：

  (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：23bp

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单

    (D)拓扑构建物：线性

(ⅹⅰ)序列描述：序列5：CCGGCGGATC CAAGGGGTGA TCG                                             23(2)序列6资料：

  (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：45bp

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单

    (D)拓扑构建物：线性

  (ⅹⅰ)序列描述：序列6：

GGGGTACTAG TAACCCGGGC CCGGCGTAGA GGATCCATAC ACAAA                     45(2)序列7资料：

  (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：36bp

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单

    (D)拓扑构建物：线性

(ⅹⅰ)序列描述：序列7：

GTCGGAGCTC ATTATTAATC TGTTCAGCAA TCGGGC                              36(2)序列8资料：

  (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：35bp

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单

    (D)拓扑构建物：线性

  (ⅹⅰ)序列描述：序列8：

GTCGGAGCTC TGCCTTTTAG TCCAGCTGAT TTCAC                               35(2)序列9资料：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：22bp

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单

    (D)拓扑构建物：线性(ⅹⅰ)序列描述：序列9：GAGCTCACAG AGATACGTGG GC                                     22(2)序列10资料：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：23bp

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单

    (D)拓扑构建物：线性

  (ⅹⅰ)序列描述：序列10：

GGATCCACAC CAAGTCTGTT CAT                                           23(2)序列11资料：

  (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：21bp

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单

    (D)拓扑构建物：线性

  (ⅹⅰ)序列描述：序列11：

GGATCCGCTG GACTCCGGCT G                                           21(2)序列12资料：

  (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：22bp

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单

    (D)拓扑构建物：线性

(ⅹⅰ)序列描述：序列12：AAGCTTATCT CATCCATGGA AA                                            22

Claims (24)

1．一种用于接合的修饰的细菌供体细胞，该细胞含有ⅰ)一个质粒，该质粒含有一个编码感兴趣的多肽的DNA构建物，以及至少一个在有反式作用转移因子的条件下通过接合转移该质粒所需的顺式作用DNA序列，和ⅱ)至少一个编码所述反式作用转移因子的DNA序列，其中，所述供体细胞与亲代细胞相比具有减弱的产生杀菌剂的能力，该杀菌剂能杀伤受体细胞群或抑制其生长。

2．如权利要求1的供体细胞，其中，所述供体细胞是芽孢杆菌属细胞。

3．如权利要求1的供体细胞，其中，所述供体细胞具有减弱的产生两种或两种以上不同杀菌剂的能力。

4．如权利要求1的供体细胞，其中，所述供体细胞群基本上不能产生所述杀菌剂。

5．如权利要求1的供体细胞，其中，所述杀菌剂是芽孢菌溶素或枯草蛋白酶。

6．如权利要求2的供体细胞，其中，所述芽孢杆菌属细胞选自由嗜碱性芽孢杆菌构成的一组。

7．如权利要求2的供体细胞，其中，所述芽孢杆菌属细胞是一种工业芽孢杆菌属细胞。

8．如权利要求1的供体细胞，其中，所述多肽是一种转运多肽。

9．如权利要求8的供体细胞，其中，所述转运多肽是一种分泌性多肽或一种分泌细胞的分泌途径的多肽。

10．如权利要求9的供体细胞，其中，所述分泌性多肽是一种酶，而所述分泌多肽是PrsA。

11．如权利要求1的供体细胞，该细胞还是营养缺陷型的。

12．如权利要求11的供体细胞，它是一种氨基酸营养缺陷型。

13．如权利要求1的供体细胞，其中，所述编码所述反式作用转移因子的DNA序列存在于另一种质粒上，或存在于供体细胞的基因组中。

14．如权利要求1的方法，其中，所述顺式作用因子是oriT或其功能性类似物。

15．如权利要求1的方法，其中，所述反式作用因子是orf-β或其功能性类似物。

16．如权利要求1的方法，其中，所述接合质粒是pLS20或其保留了pLS20的接合能力的衍生物。

17．如权利要求1的方法，其中，所述具有顺式作用序列的质粒是一种消除质粒。

18．一种将编码一种感兴趣的多肽的DNA构建物导入一种芽孢杆菌细胞的方法，在该方法中，将一个细菌供体细胞群与一个芽孢杆菌受体细胞群混合，所述供体细胞具有ⅰ)一种质粒，该质粒含有所述DNA构建物以及至少一个在有反式作用转移因子的条件下通过接合转移该质粒所需的顺式作用DNA序列，和ⅱ)至少一个编码所述反式作用转移因子的DNA序列，混合条件为，使所述质粒能通过接合从所述供体细胞群转移到受体细胞群，

其中，与亲代细胞相比，所述供体细胞具有减弱的产生杀菌剂的能力，该杀菌剂可杀伤一种受体细胞群或抑制其生长。

19．如权利要求18的方法，其中，所述供体细胞是芽孢杆菌属细胞。

20．如权利要求19的方法，其中，所述供体细胞是一种嗜碱性芽孢杆菌和/或一种工业芽孢杆菌。

21．一种构建芽孢杆菌细胞的方法，该细胞获得了编码一种感兴趣的多肽的DNA构建物，在该方法中，将一个营养缺陷型细菌供体细胞群与一个未标记的芽孢杆菌受体细胞群混合，所述供体细胞具有ⅰ)一种质粒，该质粒含有所述DNA构建物和至少一个在有反式作用转移因子的条件下通过接合转移该质粒所需的顺式作用DNA序列，和ⅱ)至少一个编码所述反式作用转移因子的DNA序列，其混合条件为，使所述质粒可通过接合从所述营养缺陷型供体细胞群转移到未标记的受体细胞群，并利用所述供体细胞的营养缺陷型特性选择受体细胞，

其中，与亲代细胞相比，所述供体细胞具有减弱的产生杀菌剂的能力，该杀菌剂可以杀伤一种受体细胞群或抑制其生长。

22．如权利要求21的方法，其中，所述营养缺陷型供体细菌为dal^-。

23．一种将编码一种感兴趣的多肽的DNA构建物导入一种芽孢杆菌细胞的方法，在该方法中，将一个细菌供体细胞群与一个芽孢杆菌受体细胞群混合，所述供体细胞具有ⅰ)一种消除质粒，该质粒含有所述DNA构建物和至少一种在有反式作用转移因子的条件下通过接合转移该质粒所需的顺式作用DNA序列，和ⅱ)至少一个编码所述反式作用转移因子的DNA序列，混合条件为，使所述质粒可通过接合从所述供体细胞群转移到所述受体细胞群，

其中，与亲代细胞相比，所述供体细胞具有减弱的产生杀菌剂的能力，该杀菌剂能杀伤一种受体细胞群或抑制其生长。

24．一种制备权利要求1所述供体细胞的方法，该方法包括对亲代芽孢杆菌属细胞进行诱变和筛选突变型细胞，与亲代细胞相比，该突变型细胞具有较低的杀伤感兴趣的受体细胞的能力或不能杀伤该受体细胞。