JP6335793B2 - 発現方法 - Google Patents
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Description
(a)プロモーターとタンパク質をコードする核酸とを含む発現構築体を、微生物中に導入する工程;
(b)この微生物中でタンパク質を発現させる工程
を含む、微生物によるタンパク質の製造法において、微生物がバチルス・プミルス種に属していることを特徴とする方法である。
(c)微生物を培養する工程
を含む。
(a)配列番号1において示される核酸配列に対して、少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、極めて特に好ましくは100%同一である核酸配列;
(b)配列番号2において示される核酸配列に対して、少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、極めて特に好ましくは100%同一である核酸配列;
(c)配列番号3において示される核酸配列に対して、少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、極めて特に好ましくは100%同一である核酸配列;
(d)配列番号4において示される核酸配列に対して、少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、極めて特に好ましくは100%同一である核酸配列
から選択されている核酸配列を含んでいることを特徴とする。
(a)プロモーターとタンパク質をコードする核酸とを含む発現構築体を、微生物中に導入する工程;
(b)この微生物中でタンパク質を発現させる工程
を含み、その際、微生物がバチルス・プミルス種に属している方法により得られる微生物である。
(a)プロモーターが、以下:
(i)配列番号1において示される核酸配列に対して、少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも81.0%、82.0%、83.0%、84.0%、85.0%、86.0%、87.0%、88.0%、89.0%、90.0%、91.0%、92.0%、93.0%、94.0%、95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、極めて特に好ましくは100%同一である核酸配列;
(ii)配列番号2において示される核酸配列に対して、少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも81.0%、82.0%、83.0%、84.0%、85.0%、86.0%、87.0%、88.0%、89.0%、90.0%、91.0%、92.0%、93.0%、94.0%、95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、極めて特に好ましくは100%同一である核酸配列;
(iii)配列番号3において示される核酸配列に対して、少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも81.0%、82.0%、83.0%、84.0%、85.0%、86.0%、87.0%、88.0%、89.0%、90.0%、91.0%、92.0%、93.0%、94.0%、95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、極めて特に好ましくは100%同一である核酸配列;
(iv)配列番号4において示される核酸配列に対して、少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも81.0%、82.0%、83.0%、84.0%、85.0%、86.0%、87.0%、88.0%、89.0%、90.0%、91.0%、92.0%、93.0%、94.0%、95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、極めて特に好ましくは100%同一である核酸配列
から選択された核酸配列を含んでおり、
かつ/又は、
(b)タンパク質が微生物中に自然に存在するものではなく、かつ/又は、
(c)タンパク質が酵素であり、特に、酸性セルラーゼ、α−アミラーゼ、α−アセトデカルボキシラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラバナーゼ、β−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、β−マンノシダーゼ、カラゲナーゼ、カルボヒドラーゼ、カタラーゼ、セロビオースオキシダーゼ、セルラーゼ、キモシン、エンド−1,3−β−グルカナーゼ、エンド−1,3(4)−β−グルカナーゼ、エンド−1,4−β−キシラナーゼ、エンドペプチダーゼ、エステラーゼ、エキソペプチダーゼ、G4アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、グリコリパーゼ、ヘミセルラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾホスホリパーゼ、マルトース産生アミラーゼ、マンナナーゼ、中性プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクテートリアーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペントサナーゼ、ペルヒドロラーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プロテイナーゼ、プルラナーゼ、レンネット酵素、ラムノガラクツロナーゼ、スブチリシン、タンナーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ、キサンタナーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、好ましくはプロテアーゼ、又はα−アミラーゼ、又はこれからの混合物であり、
かつ/又は、
(d)微生物がバチルス・プミルスDSM 14395であり、かつ/又は、
(e)好ましくは遺伝子spoIV(yqfD)の変化により、特に遺伝子spoIV(yqfD)もしくはその一部の欠損により、微生物の胞子形成が抑制されており、かつ/又は、
(f)微生物が遺伝子改変されていることを特徴とする。
(a)プロモーターが、以下:
(i)配列番号1において示される核酸配列に対して、少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも81.0%、82.0%、83.0%、84.0%、85.0%、86.0%、87.0%、88.0%、89.0%、90.0%、91.0%、92.0%、93.0%、94.0%、95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、極めて特に好ましくは100%同一である核酸配列;
(ii)配列番号2において示される核酸配列に対して、少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも81.0%、82.0%、83.0%、84.0%、85.0%、86.0%、87.0%、88.0%、89.0%、90.0%、91.0%、92.0%、93.0%、94.0%、95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、極めて特に好ましくは100%同一である核酸配列
から選択された核酸配列を含んでおり、
かつ/又は、
(b)タンパク質が微生物中に自然に存在するものではなく、かつ/又は、
(c)タンパク質がプロテアーゼであり、好ましくはスブチリシン、又はα−アミラーゼであり、
かつ/又は、
(d)微生物がバチルス・プミルスDSM 14395であり、かつ/又は、
(e)好ましくは遺伝子spoIV(yqfD)の変化により、特に遺伝子spoIV(yqfD)もしくはその一部の欠損により、微生物の胞子形成が抑制されており、かつ/又は、
(f)微生物が遺伝子改変されていることを特徴とする。
(a)プロモーターが、以下:
(i)配列番号1において示される核酸配列に対して、少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも81.0%、82.0%、83.0%、84.0%、85.0%、86.0%、87.0%、88.0%、89.0%、90.0%、91.0%、92.0%、93.0%、94.0%、95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、極めて特に好ましくは100%同一である核酸配列;
(ii)配列番号2において示される核酸配列に対して、少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも81.0%、82.0%、83.0%、84.0%、85.0%、86.0%、87.0%、88.0%、89.0%、90.0%、91.0%、92.0%、93.0%、94.0%、95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、極めて特に好ましくは100%同一である核酸配列;
(iii)配列番号3において示される核酸配列に対して、少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも81.0%、82.0%、83.0%、84.0%、85.0%、86.0%、87.0%、88.0%、89.0%、90.0%、91.0%、92.0%、93.0%、94.0%、95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、極めて特に好ましくは100%同一である核酸配列;
(iv)配列番号4において示される核酸配列に対して、少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも81.0%、82.0%、83.0%、84.0%、85.0%、86.0%、87.0%、88.0%、89.0%、90.0%、91.0%、92.0%、93.0%、94.0%、95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、極めて特に好ましくは100%同一である核酸配列
から選択された核酸配列を含んでおり、
かつ/又は、
(b)タンパク質が微生物中に自然に存在するものではなく、かつ/又は、
(c)タンパク質がα−アミラーゼであり、
かつ/又は、
(d)微生物がバチルス・プミルスDSM 14395であり、かつ/又は、
(e)好ましくは遺伝子spoIV(yqfD)の変化により、特に遺伝子spoIV(yqfD)もしくはその一部の欠損により、微生物の胞子形成が抑制されており、かつ/又は、
(f)微生物が遺伝子改変されていることを特徴とする。
(a)プロモーターが、配列番号3において示される核酸配列に対して、少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも81.0%、82.0%、83.0%、84.0%、85.0%、86.0%、87.0%、88.0%、89.0%、90.0%、91.0%、92.0%、93.0%、94.0%、95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、極めて特に好ましくは100%同一である核酸配列を含んでおり、
かつ/又は、
(b)タンパク質が微生物中に自然に存在するものではなく、かつ/又は、
(c)タンパク質がα−アミラーゼであり、
かつ/又は、
(d)微生物がバチルス・プミルスDSM 14395であり、かつ/又は、
(e)好ましくは遺伝子spoIV(yqfD)の変化により、特に遺伝子spoIV(yqfD)もしくはその一部の欠損により、微生物の胞子形成が抑制されており、かつ/又は、
(f)微生物が遺伝子改変されていることを特徴とする。
(a)プロモーターが、配列番号1において示される核酸配列に対して、少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも81.0%、82.0%、83.0%、84.0%、85.0%、86.0%、87.0%、88.0%、89.0%、90.0%、91.0%、92.0%、93.0%、94.0%、95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、極めて特に好ましくは100%同一である核酸配列を含んでおり、
かつ/又は、
(b)タンパク質が微生物中に自然に存在するものではなく、かつ/又は、
(c)タンパク質がα−アミラーゼであり、
かつ/又は、
(d)微生物がバチルス・プミルスDSM 14395であり、かつ/又は、
(e)好ましくは遺伝子spoIV(yqfD)の変化により、特に遺伝子spoIV(yqfD)もしくはその一部の欠損により、微生物の胞子形成が抑制されており、かつ/又は、
(f)微生物が遺伝子改変されていることを特徴とする。
(a)プロモーターが、配列番号2において示される核酸配列に対して、少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも81.0%、82.0%、83.0%、84.0%、85.0%、86.0%、87.0%、88.0%、89.0%、90.0%、91.0%、92.0%、93.0%、94.0%、95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、極めて特に好ましくは100%同一である核酸配列を含んでおり、
かつ/又は、
(b)タンパク質が微生物中に自然に存在するものではなく、かつ/又は、
(c)タンパク質がα−アミラーゼであり、
かつ/又は、
(d)微生物がバチルス・プミルスDSM 14395であり、かつ/又は、
(e)好ましくは遺伝子spoIV(yqfD)の変化により、特に遺伝子spoIV(yqfD)もしくはその一部の欠損により、微生物の胞子形成が抑制されており、かつ/又は、
(f)微生物が遺伝子改変されていることを特徴とする。
バチルス・プミルスを用いた発酵によるプロテアーゼ(目的タンパク質)の産生と、バチルス・リチェニフォルミスを用いた発酵によるプロテアーゼ(目的タンパク質)の産生との比較
それぞれ、プロテアーゼ(目的タンパク質)をコードする遺伝子と機能性プロモーターとを含む、以下に示す3つの異なる発現プラスミドを、バチルス・リチェニフォルミス菌種及びバチルス・プミルス菌種に形質転換させた。形質転換されたこれらの菌種を発酵によるプロテアーゼ産生に使用した。使用したバチルス・リチェニフォルミス菌種は、国際特許出願WO91/02792号に開示されている。バチルス・プミルス菌種として、遺伝子spoIV(yqfD)を欠損により機能失活させたバチルス・プミルスDSM 14395を使用した。プロモーターとして、配列番号1及び配列番号2による核酸配列を利用した。このプロモーターは、それぞれの発現プラスミドにおいて、それぞれ、プロテアーゼをコードする核酸配列の5’側に配置されている。以下のプラスミドを使用した(第1表):
この実施例において、種々のプロモーターを含む発現構築体を用いた、バチルス・プミルスにおける発酵によるプロテアーゼ(目的タンパク質)の産生を試験した。実施例1において記載した通り、配列番号1及び配列番号2によるプロモーターを有する発現プラスミド1及び3を使用した。他の発現プラスミド(対照)として、バチルス・プミルスからのプロモーターの代わりに、国際特許出願WO91/02792号に開示されている(「ATCC 53926アルカリプロテアーゼ遺伝子のプロモーター」;WO91/02792号の実施例5、6、及び図27を参照のこと)バチルス・リチェニフォルミスプロモーターを使用するという点で発現プラスミド1及び3と相違する発現プラスミドを使用した。バチルス・プミルス菌種として、実施例1の通り、遺伝子spoIV(yqfD)を欠損により機能失活させたバチルス・プミルスDSM 14395を使用した。
それぞれ、アミラーゼ(目的タンパク質)をコードする遺伝子と機能性プロモーターとを含む、以下に示す2つの異なる発現プラスミドを、バチルス・リチェニフォルミス菌種及びバチルス・プミルス菌種に形質転換させた。形質転換されたこれらの菌種を発酵によるアミラーゼ産生に使用した。使用したバチルス・リチェニフォルミス菌種は、国際特許出願WO91/02792号に開示されている。バチルス・プミルス菌種として、遺伝子spoIV(yqfD)を欠損により機能失活させたバチルス・プミルスDSM 14395を使用した。プロモーターとして、配列番号3及び配列番号4による核酸配列を利用した(Palva,l., Pettersson,R.F., Kalkkinen,N., Lehtovaara,P., Sarvas,M., Soderlund,H., Takkinen,K. and Kaariainen,L. "Nucleotide sequence of the promoter and NH2-terminal Signal peptide region of the alpha-amylase gene from Bacillus amyloliquefaciens"; Gene 15(1), 43-51(1981)に開示されているような、バチルス・アミロリクエファシエンスからのアミラーゼプロモーター)。このプロモーターは、それぞれの発現プラスミドにおいて、それぞれアミラーゼをコードする核酸配列の5’側に配置されている。以下のプラスミドを使用した(第4表):
この実施例において、種々のプロモーターを含む発現構築体を用いた、バチルス・プミルスにおける発酵によるアミラーゼ(目的タンパク質)の産生を試験した。実施例3において記載した通り、配列番号3、1及び2によるプロモーターを有する発現プラスミド4、6及び7を使用した。バチルス・プミルス菌種として、実施例1の通り、遺伝子spoIV(yqfD)を欠損により機能失活させたバチルス・プミルスDSM 14395を使用した。この菌種を上記の発現プラスミドを用いて形質転換させた。生じた産生菌種を、標準的な発酵法で、2Lの研究室用発酵槽に入れ、得られたアミラーゼ活性を実施例3に記載した通りに測定した。
Claims (13)
- 以下の方法工程:
(a)プロモーターとタンパク質をコードする核酸とを含む発現構築体を、微生物中に導入する工程;
(b)この微生物中でタンパク質を発現させる工程
を含む、微生物によるタンパク質の製造法において、微生物がバチルス・プミルス種に属しており、
遺伝子spoIV(yqfD)もしくはその一部の欠損により微生物の胞子形成が抑制されていることを特徴とする方法。 - プロモーターが、以下:
(a)配列番号1において示される核酸配列に対して、少なくとも95%同一である核酸配列;
(b)配列番号2において示される核酸配列に対して、少なくとも95%同一である核酸配列;
(c)配列番号3において示される核酸配列に対して、少なくとも95%同一である核酸配列;
(d)配列番号4において示される核酸配列に対して、少なくとも95%同一である核酸配列
から選択された核酸配列を含んでいる、請求項1に記載の方法。 - タンパク質が微生物中に自然に存在するものではない、請求項1又は2に記載の方法。
- タンパク質が酵素である、請求項1から3までのいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質が、酸性セルラーゼ、α−アミラーゼ、α−アセトデカルボキシラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラバナーゼ、β−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、β−マンノシダーゼ、カラゲナーゼ、カルボヒドラーゼ、カタラーゼ、セロビオースオキシダーゼ、セルラーゼ、キモシン、エンド−1,3−β−グルカナーゼ、エンド−1,3(4)−β−グルカナーゼ、エンド−1,4−β−キシラナーゼ、エンドペプチダーゼ、エステラーゼ、エキソペプチダーゼ、G4アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、グリコリパーゼ、ヘミセルラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾホスホリパーゼ、マルトース産生アミラーゼ、マンナナーゼ、中性プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクテートリアーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペントサナーゼ、ペルヒドロラーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プロテイナーゼ、プルラナーゼ、レンネット酵素、ラムノガラクツロナーゼ、スブチリシン、タンナーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ、キサンタナーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、又はこれらの混合物である、請求項1から4までのいずれか1項に記載の方法。
- 微生物がバチルス・プミルスDSM 14395である、請求項1から5までのいずれか1項に記載の方法。
- 以下の方法工程:
(a)プロモーターとタンパク質をコードする核酸とを含む発現構築体を、微生物中に導入する工程;
(b)この微生物中でタンパク質を発現させる工程
を含み、その際、微生物がバチルス・プミルス種に属しており、遺伝子spoIV(yqfD)もしくはその一部の欠損により微生物の胞子形成が抑制されている方法により得られる微生物。 - プロモーターが、以下:
(i)配列番号1において示される核酸配列に対して、少なくとも95%同一である核酸配列;
(ii)配列番号2において示される核酸配列に対して、少なくとも95%同一である核酸配列;
(iii)配列番号3において示される核酸配列に対して、少なくとも95%同一である核酸配列;
(iv)配列番号4において示される核酸配列に対して、少なくとも95%同一である核酸配列
から選択された核酸配列を含んでいる、請求項7に記載の微生物。 - タンパク質が微生物中に自然に存在するものではない、請求項7又は8に記載の微生物。
- タンパク質が酵素である、請求項7から9までのいずれか1項に記載の微生物。
- タンパク質が、酸性セルラーゼ、α−アミラーゼ、α−アセトデカルボキシラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラバナーゼ、β−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、β−マンノシダーゼ、カラゲナーゼ、カルボヒドラーゼ、カタラーゼ、セロビオースオキシダーゼ、セルラーゼ、キモシン、エンド−1,3−β−グルカナーゼ、エンド−1,3(4)−β−グルカナーゼ、エンド−1,4−β−キシラナーゼ、エンドペプチダーゼ、エステラーゼ、エキソペプチダーゼ、G4アミラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、グリコリパーゼ、ヘミセルラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾホスホリパーゼ、マルトース産生アミラーゼ、マンナナーゼ、中性プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクテートリアーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペントサナーゼ、ペルヒドロラーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プロテイナーゼ、プルラナーゼ、レンネット酵素、ラムノガラクツロナーゼ、スブチリシン、タンナーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ、キサンタナーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、又はこれらの混合物である、請求項7から10までのいずれか1項に記載の微生物。
- 微生物がバチルス・プミルスDSM 14395である、請求項7から11までのいずれか1項に記載の微生物。
- タンパク質を製造するための、請求項7から12までのいずれか1項に記載の微生物の使用。
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