CN103168049B - 抗生腱蛋白-c a2抗体及使用方法 - Google Patents

抗生腱蛋白-c a2抗体及使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103168049B
CN103168049B CN201180049335.7A CN201180049335A CN103168049B CN 103168049 B CN103168049 B CN 103168049B CN 201180049335 A CN201180049335 A CN 201180049335A CN 103168049 B CN103168049 B CN 103168049B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
seq
light chain
variable region
heavy chain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201180049335.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103168049A (zh
Inventor
A.弗里莫瑟-格伦德舍伯
R.霍塞
C.克莱恩
E.莫斯纳
V.G.尼科里尼
P.尤马纳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Glycart AG
Original Assignee
Roche Glycart AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Glycart AG filed Critical Roche Glycart AG
Publication of CN103168049A publication Critical patent/CN103168049A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103168049B publication Critical patent/CN103168049B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0058—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1018—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了针对生腱蛋白-C A2结构域的抗体及其使用方法。

Description

抗生腱蛋白-C A2抗体及使用方法
发明领域
本发明涉及对生腱蛋白-C A2结构域(A2domain of tenascin-C,TNC A2)特异性的抗体。另外，本发明涉及编码此类抗体的多核苷酸，及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成该抗体的方法和在疾病的治疗中使用它们的方法。
发明背景
生腱蛋白C和抗生腱蛋白C抗体
生腱蛋白是在脊椎动物中找到的，较大多聚体细胞外基质(ECM)糖蛋白的一个高度保守的家族。已经在哺乳动物中鉴定出四种生腱蛋白旁系同源物(paralogue)，称作生腱蛋白-C、生腱蛋白-R、生腱蛋白-X和生腱蛋白-W。生腱蛋白家族蛋白质共同的一级结构，其包含N端七段重复、表皮生长因子(EGF)样重复、纤连蛋白III型结构域重复和C端纤连蛋白样球状结构域。经由N段寡聚化结构域，亚基个体装配成三聚体，或在生腱蛋白-C的情况中，装配成六聚体。
哺乳动物生腱蛋白-C单体通常具有由所有生腱蛋白-C同等型共享的14.5个EGF样重复和8个纤连蛋白III型结构域重复。然而，通过可变剪接，能独立包括或排除多至9个另外的纤连蛋白III型结构域重复（结构域A1至D），产生多种生腱蛋白-C同等型(参见例如Hsia and Schwarzbauer,J Biol Chem280,26641-26644(2005))。
生腱蛋白-C在发育的胚胎中瞬时表达，但是在成年组织中实际上缺失。然而，它在经历重塑过程的组织中再现，包括某些病理状况，诸如伤口愈合、炎症和癌症(综述Chiquet-Ehrismann&Chiquet,J Pathol200,488-499(2003))。
重要的是，生腱蛋白-C在大多数恶性实体瘤中高度表达，包括脑、***/乳腺、结肠、肺、皮肤和其它器官的肿瘤(综述Orend and Chiquet-Ehrismann,Cancer Letters244,143-163(2006))，在那里它可以由转化的上皮细胞以及肿瘤微环境中的基质细胞表达(Yoshida et al.,J Pathol182,421-428(1997),Hanamura et al.,Int J Cancer73,10-15(1997))。特别地，含有可变剪接结构域A1至D的生腱蛋白-C“较大同等型”在侵入性癌瘤中表达，而在健康成年组织中几乎检测不到(Borsi et al.,Int J Cancer52,688-692(1992),Carnemolla etal.,Eur J Biochem205,561-567(1992))。
它的表达样式使得生腱蛋白-C（特别是它的可变剪接结构域）成为肿瘤靶向应用的一种有希望抗原，而且因此开发了针对该蛋白质中数种结构域的一些抗体(参见例如Brack et al.,Clin Cancer Res12,3200-3208(2006)或EP1817345，描述针对生腱蛋白-C A1结构域的抗体；Silacci et al.,Prot Eng DesSel19,471-478(2006)或EP1173766，描述针对生腱蛋白-C C结构域的抗体；Wang et al.,Hybridoma29,13-16(2010)，描述针对生腱蛋白C D结构域的抗体；或Balza et al.,FEBS332,39-43(1993)，描述针对人生腱蛋白不同结构域的数种抗体)。
最近，还描述了一种识别人生腱蛋白-C A2结构域中特定表位的抗体(WO2009/089998)。
抗体糖基化
寡糖组分可以显著影响与治疗性糖蛋白的功效有关的特性，包括物理稳定性、对蛋白酶攻击的抗性、与免疫***的相互作用、药动学、和特定生物学活性。此类特性可以不仅取决于寡糖的存在或缺乏，而且还取决于寡糖的特定结构。可以做出寡糖结构与糖蛋白功能间的一些概括。例如，某些寡糖结构经由与特定碳水化合物结合蛋白的相互作用来介导糖蛋白自血流的快速清除，而其它寡糖结构可以被抗体结合，并且触发不想要的免疫反应。(Jenkins et al.,Nature Biotechnol14,975-81(1996))。
IgG1型抗体（即癌症免疫疗法中最常使用的抗体）是在每个CH2域中的Asn297处具有保守的N连接的糖基化位点的糖蛋白。附着于Asn297的两个复合双触角寡糖掩埋于CH2域间，与多肽主链形成广泛的接触，并且其存在对于抗体介导效应器功能诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是至关重要的(Lifely et al.,Glycobiology5,813-822(1995);Jefferis et al.,ImmunolRev163,59-76(1998);Wright and Morrison,Trends Biotechnol15,26-32(1997))。蛋白质工程研究显示了FcγR与IgG CH2结构域的下部铰链区相互作用。Lund et al.,J.Immunol.157:4963-69(1996)。然而，FcγR结合还需要CH2区中的寡糖存在。Lund et al.,J.Immunol.157:4963-69(1996);Wright andMorrison,Trends Biotech.15:26-31(1997)提示，或是寡糖和多肽二者直接促成相互作用位点，或是维持活性CH2多肽构象需要寡糖。因此可以探索寡糖结构的修饰，作为提高IgG1和FcγR之间相互作用亲和力和提高IgG1的ADCC活性的一种手段。
一种获得单克隆抗体效力大幅升高的方式是通过工程化改造它们的寡糖组分来增强其天然的、细胞介导的效应器功能，如记载于et al.,NatBiotechnol17,176-180(1999)和美国专利No.6,602,684(WO99/54342)，在此通过提及而完整收录其内容。等显示了β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)（一种催化两分型寡糖形成的糖基转移酶）在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过表达显著提高在那些细胞中生成的抗体的体外ADCC活性。生产细胞系中的GnTIII过表达产生富含两分型寡糖（通常也是非岩藻糖基化的且是杂合物类型的）的抗体。如果在GnTIII之外，生产细胞系中还过表达甘露糖苷酶II(ManII)，那么获得富含复合物类型的两分型非岩藻糖基化寡糖的抗体(Ferrara et al.,Biotechn Bioeng93,851-861(2006))。与具有未修饰聚糖的抗体相比，这两种类型的抗体显示强烈增强的ADCC，但是只有其中大部分N-聚糖属于复合物类型的抗体能够诱导显著的补体依赖性细胞毒性(Ferrara etal.,Biotechn Bioeng93,851-861(2006))。Asn297碳水化合物的组成改变或其消除也影响抗体Fc域对Fcγ受体(FcγR)和补体C1q蛋白的结合，这分别对于ADCC和CDC是重要的(et al.,Nat Biotechnol17,176-180(1999);Davies et al.,Biotechnol Bioeng74,288-294(2001);Mimura et al.,J Biol Chem276,45539-45547(2001);Radaev et al.,J Biol Chem276,16478-16483(2001);Shields et al.,J Biol Chem276,6591-6604(2001);Shields et al.,J Biol Chem277,26733-26740(2002);Simmons et al.,J Immunol Methods263,133-147(2002))。
发明概述
本发明提供了特异性结合生腱蛋白-C A2结构域、具有高亲和力和/或增强的效应器功能的抗体。
在一个方面，本发明涉及特异性结合TNC A2的抗体，其包含SEQ ID NO3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45和47所列至少一个（即一个、两个、三个、四个、五个或六个）互补决定区(CDR)。在一个实施方案中，该抗体包含选自SEQ ID NO3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45和47的三个重链CDR（即HCDR1、HCDR2、和HCDR3）和/或三个轻链CDR（即LCDR1、LCDR2、和LCDR3）。在一个更特别的实施方案中，该抗体包含选自SEQ ID NO55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89和91所列重和轻链可变区序列的抗体重链可变区和/或抗体轻链可变区，特别是重和轻链可变区二者。在一个实施方案中，该抗体包含Fc区，特别是IgG Fc区。在又一个实施方案中，该抗体是全长抗体，特别是IgG类抗体。在另一个实施方案中，该抗体包含人抗体恒定区。在一个实施方案中，该抗体是人的。在一个实施方案中，该抗体糖工程化改造成具有Fc区中经过修饰的寡糖。在一个实施方案中，与非糖工程化抗体相比，该抗体具有Fc区中比例升高的非岩藻糖基化和/或两分型寡糖(bisected oligosaccharide)。在又一个实施方案中，该抗体具有升高的效应器功能和/或升高的Fc受体结合亲和力。在一个特别的实施方案中，升高的效应器功能是升高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在另一个实施方案中，该抗体以低于约1μM、优选低于约100nM、最优选低于约1nM的KD值结合人TNC A2。在一个实施方案中，该抗体是亲和力成熟的。在一个实施方案中，该抗体结合人组织中的TNC A2。
在其它方面，本发明还涉及与该抗体有关的多肽、多核苷酸、宿主细胞、和表达载体。在又一个方面，本发明涉及制备该抗体的方法。在又一个方面，本发明涉及使用该抗体的方法，特别是用于治疗以TNC A2表达为特征的疾病（诸如癌症）。
附图简述
图1显示亲和力成熟抗TNC A2Fab片段结合人(hu)TNC A2的基于表面等离振子共振(SPR)的动力学分析。为克隆2B10_C3B6(A)、克隆2B10_6A12(B)、克隆2B10_C3A6(C)、克隆2B10_O7D8(D)、克隆2B10_O1F7(E)和克隆2B10_6H10(F)呈现了经过加工的动力学数据集。平滑线呈现数据对1:1相互作用模型的整体拟合。
图2(A)显示2B10抗TNC A2Fab片段结合人、鼠和猕猴TNC A2的基于SPR的动力学分析。小图(B)显示2B10抗TNC A2人IgG结合人、鼠和猕猴TNCA2的基于SPR的动力学分析，如实施例7所述。
图3(A)显示正常（上部小图）和肿瘤（下部小图）人子宫组织的免疫组织化学图像，100倍（左边小图）和400倍（中间小图）放大倍数，用与FLAG片段融合的Fab片段中2B10可变区(SHD2B10-FLAG)染色。右边小图：对照，100倍放大倍数。(B)显示各种人组织样品中TNC A2的表达水平，依据免疫荧光表面积%，用与FLAG片段融合的Fab片段中2B10可变区(SHD2B10-FLAG)染色。来自健康个体和癌症患者的各种人组织样品用SHD2B10-FLAG Fab片段染色，如实施例8所述。
图4(A)至(N)，显示人组织的免疫组织化学图像100倍（左边小图）和400倍（中间小图）放大倍数，用SHD2B10-小鼠IgG染色，如实施例8所述。以100倍放大倍数显示用同种型对照抗体染色（右边小图）。上部小图：正常组织，下部小图：肿瘤组织。(A)脑，(B)***/乳腺，(C)结肠，(D)肾，(E)肝，(F)肺，(G)卵巢，(H)胰（腺），(I)***，(J)骨骼肌，(K)皮肤，(L)小肠，(M)胃，(N)子宫。
图5显示2B10衍生人IgG对U87MG成胶质细胞瘤肿瘤细胞上表达的TNCA2的结合，通过流式细胞术测定（见实施例9）。显示了用不同浓度的2B10IgG处理的细胞的均值荧光强度，与未处理细胞和仅仅用二抗染色的细胞（阴性对照）比较。
图6显示野生型2B10人IgG的纯化和分析。A)蛋白A亲和层析纯化步骤。B)大小排阻层析纯化步骤。C)分析性SDS-PAGE。实验规程如实施例1所述。
图7显示糖工程化2B10人IgG的纯化和分析。A)蛋白A亲和层析纯化步骤。B)大小排阻层析纯化步骤。C)分析性SDS-PAGE。D)分析性大小排阻层析。实验规程如实施例1所述。
图8显示野生型(wt)和糖工程化(ge)形式的抗TNC A2抗体2B10对U87MG细胞上的TNC A2的结合。
发明详述
I.定义
出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
“亲和力”指分子（例如抗体）的单一结合位点与其结合配偶体（例如抗原）之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员（例如抗体和抗原）之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)来表述，它是解离和结合速率常数（分别为koff和kon）之比。如此，等同的亲和力可包含不同的速率常数，只要速率常数之比保持相同。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区（HVR）（例如CDR）中具有一处或多处改变（例如氨基酸突变）的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。典型地，亲和力成熟的抗体与亲本抗体结合相同表位。
术语“抗生腱蛋白-C A2抗体”和“结合生腱蛋白-C A2结构域的抗体”指能够以足够亲和力结合TNC A2，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向TNC A2的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)的测量，抗TNC A2抗体结合无关的、非TNC A2的蛋白质的程度小于该抗体对TNC A2的结合的约10%。在某些实施方案中，结合TNC A2的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM（例如10-8M或更少，例如10-8M到10-13M，例如10-9M到10-13M）的解离常数(KD)。在某些实施方案中，抗TNC A2抗体结合在来自不同物种的TNC A2中保守的TNC A2表位。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。还包括具有Fc区的抗体片段，和包含与免疫球蛋白Fc区等同的区域的融合蛋白。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体结合的抗原的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、单链抗体分子（例如scFv）、双抗体、和由抗体片段形成的多特异性抗体。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50%或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50%或更多。本文中提供了例示性的竞争测定法。
术语“抗原结合域”指抗原结合分子中包含特异性结合部分或整个抗原并与部分或整个抗原互补的区域的部分。在抗原较大的情况中，抗原结合分子可以仅结合抗原的特定部分，该部分称作表位。抗原结合域可以由例如一个或多个抗体可变域（也称作抗体可变区）提供。优选地，抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。对于例如嵌合抗体，非抗原结合构件可以自极其多种物种，包括灵长类诸如黑猩猩和人衍生。人源化抗体是嵌合抗体的一种特别优选的形式。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类（同种型），例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ、和μ。
在用于本文时，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于：放射性同位素（例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素）；化学治疗剂或药物（例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)（长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide)）、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂）；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞因子分泌；免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取；细胞表面受体（例如B细胞受体）下调；和B细胞活化。
药剂（例如药物配制剂）的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号***，又称作EU索引，如记载于Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。
术语“与免疫球蛋白的Fc区等同的区域”意图包括免疫球蛋白的Fc区的天然存在等位变体及具有产生替代、添加、或删除的变化，但是没有实质性降低免疫球蛋白介导效应器功能（诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性）的能力的变体。例如，可以在没有实质性生物学功能损失的情况中自免疫球蛋白Fc区的N端或C端删除一个或多个氨基酸。可以依照本领域中已知的一般规则来选择此类变体，使得对活性具有最小的影响。（见例如Bowie,J.U.等,Science247:1306-10(1990)）。
“框架”或“FR”指除高变区（HVR）（或CDR）残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1、FR2、FR3、和FR4。因而，HVR和FR序列在VH（或VL）中一般以如下的顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”、和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”、和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。在一个实施方案中，将宿主细胞工程化改造成容许生成具有经修饰寡糖的抗体。在某些实施方案中，已经对宿主细胞进一步操作以表达升高水平的一种或多种具有β(1,4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII)活性的多肽。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞，诸如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞、和植物细胞等等，而且还有转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版,NIH Publication91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR（例如，CDR）对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
在用于本文时，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环（“高变环”）的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR；三个在VH中（H1、H2、H3），且三个在VL中（L1、L2、L3）。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。除了VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。“高变区”(HVR)又称为互补决定区(CDR)，而且这些术语在本文中提及形成抗原结合区的可变区部分时可互换使用。此特定区域已经由Kabat等,美国卫生与公众服务部(U.S.Dept.of Health andHuman Services),“Sequences of Proteins of Immunological Interest”(1983)及由Chothia等,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)描述，其中定义包括在彼此比较时氨基酸残基的交叠或子集。然而，任一个定义指抗体或其变体的CDR的应用意图在该术语的范围内，如本文中定义并使用的。涵盖如由上文所引用的每篇参考文献定义的CDR的合适的氨基酸残基在下文在表I中列出作为比较。涵盖特定CDR的精确残基编号会随CDR的序列和大小而有所变化。给出抗体的可变区氨基酸序列时，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基构成特定的CDR。
表1：CDR定义1
CDR Kabat Chothia AbM2
VHCDR1 31-35 26-32 26-35
VHCDR2 50-65 52-58 50-58
VHCDR3 95-102 95-102 95-102
VLCDR1 24-34 26-32 24-34
VLCDR2 50-56 50-52 50-56
VLCDR3 89-97 91-96 89-97
1表1中的所有CDR定义的编号依照由Kabat等所列的编号约定（见下文）。
2如表1中所使用的具有小写字母“b”的“AbM”指如由Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
Kabat等还限定了可应用于任何抗体的可变区序列的编号***。本领域普通技术人员可以将“Kabat编号方式”的此***明确指派给任何可变区序列，而不依赖于超出序列自身的任何实验数据。如本文中所使用的，“Kabat编号方式”指由Kabat等,美国卫生与公众服务部,“Sequence of Proteins ofImmunological Interest”(1983)所列的编号***。除非另有规定，提及抗体可变区中的特定氨基酸残基位置的编号是依照Kabat编号***。
CDR还包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的-CDR，或a-CDR的CDR区内。一般地，给定CDR中仅五分之一至三分之一的残基参与抗原结合。可以通过例如自三维建模计算原子间接触，并依照记载于Padlan等,FASEB J.9(1):133-139(1995)的方法测定给定残基位置处的序列变异性来鉴定特定CDR中的特异性决定残基。例示性的a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58、和H3的95-102(见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基（例如，FR残基）在本文中依照Kabat等，见上文编号。
“抗体缀合物”指与细胞毒剂缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物（例如，牛、绵羊、猫、犬、和马）、灵长类（例如，人和非人灵长类诸如猴）、家兔、和啮齿类（例如，小鼠和大鼠）。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95%或99%的纯度，如通过例如电泳（例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳）或层析（例如，离子交换或反相HPLC）方法测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如Flatman等,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分离的”的多核苷酸指已经与其天然环境的组分分开的多核苷酸分子。分离的多核苷酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的多核苷酸分子，但是多核苷酸分子在染色体外或在与其天然染色***置不同的染色***置处存在。
“编码抗TNC A2抗体的分离的多核苷酸”指编码抗体重和轻链（或其片段）的一种或多种多核苷酸分子，包括单一载体或不同载体中的此类多核苷酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类多核苷酸分子。
在用于本文时，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“裸抗体”指未与异源模块（例如细胞毒性模块）或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域（CH1、CH2、和CH3），也称作重链恒定区。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域，也称作轻链恒定区。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“没有实质***叉反应性”意指分子（例如抗体）不识别或特异性结合与该分子的实际靶抗原不同的抗原（例如与靶抗原密切相关的抗原），特别地在与该靶抗原相比时。例如，抗体可以结合少于约10%至少于约5%的与实际靶抗原不同的抗原，或者可以结合选自由少于约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%、或0.1%组成的组的量的所述与实际靶抗原不同的抗原，优选地少于约2%、1%、或0.5%与实际靶抗原不同的抗原，且最优选地少于约0.2%或0.1%与实际靶抗原不同的抗原。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
术语“亲本”抗体指作为制备变体的起始点或基础使用的抗体。
关于参照多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，%氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office,Washington D.C.,20559)，其中其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech,Inc.,South San Francisco,California可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作***，包括数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性（或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A）如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的%氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的%氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
类似地，具有与本发明的参照核苷酸序列至少例如95%“相同”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同，只是多核苷酸序列可以按参照核苷酸序列的每100个核苷酸包含多至5处点突变。换言之，为了获得具有与参照核苷酸序列至少95%相同的核苷酸序列的多核苷酸，可以将参照序列中的多至5%的核苷酸删除或用另一个核苷酸替换，或者可以将占参照序列中的总核苷酸的多至5%数目的核苷酸***参照序列中。参照序列的这些变化可以在参照核苷酸序列的5’或3’端位置或者在那些末端位置间的任何地方发生，个别地在参照序列中的残基间或在参照序列内的一个或多个连续组中散布。实际上，可以使用已知的计算机程序（诸如上文所列的）来常规地测定任何特定的多核苷酸或多肽是否与本发明的核苷酸序列或多肽序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。
术语“药物配制剂”指处于如下的形式，使得容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分的制剂。
“药学可接受载体”指药物配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。
如本文中使用的，术语“生腱蛋白-C的A2结构域(TNC A2)”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类（例如人）和啮齿类（例如小鼠和大鼠）的任何天然TNC A2，除非另外指明。该术语涵盖“全长”、未加工的TNCA2以及TNC A2因细胞中的加工所致的任何形式。该术语还涵盖TNC A2的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性人TNC A2的氨基酸序列（带C端avi标签和6x His标签）显示于SEQ ID NO：97。在人生腱蛋白-C分子中，A2结构域是多至九个可变剪接纤连蛋白III型结构域中的第二个（自N端数起），可以***第五个和第六个恒定纤连蛋白III型结构域之间（生腱蛋白-C的结构域结构的示意图参见例如Orend and Chiquet-Ehrismann,CancerLetters244,143-163(2006)）。类似地，在小鼠生腱蛋白-C分子中，A2是多至六个可变剪接纤连蛋白III型结构域中的第二个(记载于例如Joestner andFaissner,J Biol Chem274,17144-17151(1999))。
在用于本文时，“治疗/处理”（及其语法变型）指试图改变所治疗个体的疾病的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域（分别为VH和VL）一般具有类似的结构，其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。（见例如Kindt等KubyImmunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)）。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如，Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993);Clarkson等,Nature352:624-628(1991)。
在用于本文时，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文中所使用的，术语“具有GnTIII活性的多肽”指能够催化将N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基以β-1-4连接添加至N连接的寡糖的三甘露糖基核心的β-连接的甘露糖苷的多肽。这包括以或不以剂量依赖性展现出与β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III（依照国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology,NC-IUBMB)，又称为β-1,4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖胺基转移酶(EC2.4.1.144)）活性相似，但不必相同的酶活性的融合多肽，如特定的生物学测定法中测量的。在剂量依赖性确实存在的情况中，它不需要与GnTIII的剂量依赖性相同，而是与GnTIII相比与给定活性的剂量依赖性基本上相似（即，相对于GnTIII，候选多肽会展现出更大的活性或小不超过约25倍且优选地，小不超过约10倍的活性，且最优选地，小不超过约3倍的活性）。
如本文中所使用的，术语“高尔基(Golgi)定位域”指高尔基驻留多肽中负责将多肽锚定至高尔基复合体内的某个位置的氨基酸序列。一般地，定位域包含酶的氨基端“尾部”。
如本文中所使用的，认为特别地具有前缀“糖”的术语“工程化”或“工程化改造”及术语“糖基化工程”包括对天然存在的或重组的多肽或其片段的糖基化样式的任何操作。糖基化工程包括细胞的糖基化机器的代谢工程，包括对寡糖合成途径的遗传操作以实现细胞中表达的糖蛋白的改变的糖基化。此外，糖基化工程包括突变和细胞环境对糖基化的影响。在一个实施方案中，糖基化工程是糖基转移酶活性的变化。在一个具体的实施方案中，工程化改造导致改变的葡糖胺基转移酶活性和/或岩藻糖基转移酶活性。
如本文中所使用的，术语“Fc介导的细胞的细胞毒性”包括抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和由含有人Fc区的可溶性Fc-融合蛋白介导的细胞的细胞毒性。它是一种导致“人免疫效应细胞”裂解“靶定细胞”的免疫机制。
如本文中所使用的，术语“人免疫效应细胞”指在其表面上展示Fc受体的白细胞群体，它们通过Fc受体结合抗体或Fc融合蛋白的Fc区并执行效应器功能。此类群体可以包括但不限于外周血单个核细胞(PBMC)和/或天然杀伤(NK)细胞。
如本文中所使用的，术语“靶定细胞”指包含Fc区的抗原结合分子（例如，抗体或其包含Fc区的片段）或Fc融合蛋白特异性结合的细胞。抗原结合分子或Fc融合蛋白经由Fc区N端的蛋白质部分结合靶细胞。
如本文中所使用的，术语“升高的Fc介导的细胞的细胞毒性”定义为通过上文限定的Fc介导的细胞的细胞毒性的机制在靶细胞周围的介质中给定浓度的抗体或Fc融合蛋白在给定时间中裂解的“靶定细胞”的数目增加和/或通过Fc介导的细胞的细胞毒性的机制在给定时间中实现给定数目的“靶定细胞”裂解需要的靶细胞周围的介质中的抗体或Fc融合蛋白的浓度降低。Fc介导的细胞的细胞毒性的升高相对于使用相同的标准生成、纯化、配制和贮存方法（其是本领域技术人员已知的），由相同类型的宿主细胞产生的，但是并非由通过本文中所描述的方法工程化改造成具有改变的糖基化样式（例如，表达糖基转移酶GnTIII、或其它糖基转移酶）的宿主细胞产生的相同抗原结合分子或Fc融合蛋白介导的细胞的细胞毒性。
“具有升高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗体”意指具有升高的ADCC的抗体（如所述术语在本文中定义的），如通过本领域普通技术人员已知的任何合适的方法测定的。一种公认的体外ADCC测定法如下：
1)该测定法使用已知表达被抗体的抗原结合区识别的靶抗原的靶细胞；
2)该测定法使用自随机选定的健康供体的血液分离的人外周血单个核细胞(PBMC)作为效应细胞；
3)依照如下的方案实施该测定法：
i)将PBMC使用标准的密度离心规程来分离，并以5x106个细胞/ml在RPMI细胞培养基中悬浮；
ii)将靶细胞通过标准的组织培养方法来培养，自具有高于90%的存活力的指数生长期收获，在RPMI细胞培养基中清洗，用100微居里的51Cr标记，用细胞培养基清洗两次，并以105个细胞/ml的密度在细胞培养基中重悬；
iii)将100微升上述最终的靶细胞悬浮液转移至96孔微量滴定板的每孔；
iv)将抗体在细胞培养基中自4000ng/ml至0.04ng/ml连续稀释，并将50微升所得抗体溶液添加至96孔微量滴定板中的靶细胞，一式三份测试覆盖上述整个浓度范围的各个抗体浓度；
v)对于最大释放(MR)对照，含有经标记的靶细胞的板中的3个额外的孔接受50微升2%(V/V)非离子型去污剂(Nonidet,Sigma,St.Louis)的水溶液，替代抗体溶液（上述的第iv点）；
vi)对于自发释放(SR)对照，含有经标记的靶细胞的板中的3个额外的孔接受50微升RPMI细胞培养基，替代抗体溶液（上述的第iv点）；
vii)然后，将96孔微量滴定板以50x g离心1分钟，并于4°C温育1小时；
viii)将50微升PBMC悬浮液（上述第i点）添加至每孔以产生效应:靶细胞比率25:1，并将平板在培养箱中在5%CO2气氛下于37°C放置4小时；
ix)收获来自每孔的无细胞上清液，并使用γ计数器来量化实验释放的放射性(ER)；
x)依照公式(ER-MR)/(MR-SR)x100对每个抗体浓度计算比裂解的百分比，其中ER是对所述抗体浓度量化（见上述第ix点）的平均放射性，MR是对MR对照（见上述第v点）量化（见上述第ix点）的平均放射性，而SR是对SR对照（见上述第vi点）量化（见上述第ix点）的平均放射性；
4)“升高的ADCC”定义为上文测试的抗体浓度范围内观察到的比裂解的最大百分比的增加和/或达到上文测试的抗体浓度范围内观察到的比裂解的最大百分比的一半所需要的抗体浓度的降低。ADCC的升高相对于用上述测定法测量的，使用本领域技术人员已知的相同的标准生成、纯化、配制和贮存方法，由相同类型的宿主细胞产生的，但是并非由工程化改造成过表达GnTIII的宿主细胞产生的相同抗体介导的ADCC。
II.组合物和方法
生腱蛋白-C（特别是A2结构域和生腱蛋白-C的其它可变剪接结构域）在某些病理状况中特异性表达，但是在健康成年组织中基本上缺失，如此，靶向这种抗原的抗体具有极大的治疗潜力。本发明提供了结合生腱蛋白-C A2结构域的抗体，特别是具有高亲和力和强效应器功能的抗体。本发明的抗体可用于例如以TNC A2表达为特征的疾病，诸如癌症的诊断和治疗。
A.例示性抗生腱蛋白-C A2抗体
本发明提供了特异性结合生腱蛋白C A2结构域(TNC A2)的抗体。特别地，本发明提供了特异性结合TNC A2的抗体，其中所述抗体糖工程化改造成具有升高的效应器功能。
在一个实施方案中，本发明的抗TNC A2抗体包含至少一种（例如一种、两种、三种、四种、五种、或六种）选自下组的重或轻链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ IDNO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，和SEQ ID NO:47，或其变异或截短形式（其至少含有特异性决定残基(SDR)），作为所述CDR。在一个实施方案中，本发明的抗TNC A2抗体包含至少一种（例如一种、两种、三种、四种、五种、或六种）选自下组的重或轻链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ IDNO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，和SEQ ID NO:47，其中该抗体不包含重链CDR1(HCDR1)选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、和SEQ ID NO:7，重链CDR2(HCDR2)选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、和SEQ ID NO:21，重链CDR3(HCDR3)为SEQ ID NO:27，轻链CDR1(LCDR1)为SEQ ID NO:29，轻链CDR2(LCDR2)为SEQ ID NO:35，和轻链CDR3(LCDR3)为SEQ ID NO:47的组合。
在一个实施方案中，所述至少一种CDR是重链CDR，特别是重链CDR3SEQ ID NO:27。在另一个实施方案中，该抗体包含至少一种重链CDR和至少一种轻链CDR，特别是重链CDR3SEQ ID NO:27和轻链CDR3SEQ ID NO:47。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含至少一种、至少两种、或所有三种重链CDR(HCDR)序列，其选自(a)包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、和SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、和SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HCDR2；和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HCDR3。在又一个实施方案中，该抗体包含重链可变区，其包含(a)选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、和SEQ IDNO:7的重链CDR1；(b)选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、和SEQ ID NO:25的重链CDR2；和(c)重链CDR3SEQ ID NO:27，或上述CDR的变异或截短形式（其至少含有SDR），作为所述CDR。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含至少一种、至少两种、或所有三种轻链CDR(LCDR)序列，其选自(a)包含选自SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、和SEQ ID NO:33的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、和SEQ IDNO:45的氨基酸序列的LCDR2；和(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的LCDR3。在又一个实施方案中，该抗体包含轻链可变区，其包含(a)选自SEQID NO:29、SEQ ID NO:31、和SEQ ID NO:33的轻链CDR1；(b)选自SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、和SEQ ID NO:45的轻链CDR2；和(c)轻链CDR3SEQ ID NO:47，或其变异或截短形式（其至少含有的SDR），作为所述CDR。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、和SEQ ID NO:7的重链CDR1；选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、和SEQ IDNO:25的重链CDR2；和重链CDR3SEQ ID NO:27，该轻链可变区包含选自SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、和SEQ ID NO:33的轻链CDR1；选自SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、和SEQ ID NO:45的轻链CDR2；和轻链CDR3SEQ ID NO:47，或上述CDR的变异或截短形式（其至少含有SDR），作为所述CDR。
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、和SEQ ID NO:7的重链CDR1；选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、和SEQ IDNO:25的重链CDR2；和重链CDR3SEQ ID NO:27，该轻链可变区包含选自SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、和SEQ ID NO:33的轻链CDR1；选自SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、和SEQ ID NO:45的轻链CDR2；和轻链CDR3SEQ ID NO:47，其中所述抗体不包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、和SEQ ID NO:7的重链CDR1(HCDR1)，选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、和SEQ ID NO:21的重链CDR2(HCDR2)，为SEQ ID NO:27的重链CDR3(HCDR3)，为SEQ ID NO:29的轻链CDR1(LCDR1)，为SEQ ID NO:35的轻链CDR2(LCDR2)，和为SEQ IDNO:47的轻链CDR3(LCDR3)的组合。
在一个具体的实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、和SEQ ID NO:7的重链CDR1；选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:23、和SEQ ID NO:25的重链CDR2；和重链CDR3SEQID NO:27，该轻链可变区包含轻链CDR1SEQ ID NO:29，轻链CDR2SEQ IDNO:35，和轻链CDR3SEQ ID NO:47。在另一个具体的实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、和SEQ ID NO:7的重链CDR1；选自SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:15、和SEQ ID NO:21的重链CDR2；和重链CDR3SEQ ID NO:27，该轻链可变区包含选自SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、和SEQ ID NO:33的轻链CDR1；选自SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、和SEQ ID NO:45的轻链CDR2；和轻链CDR3SEQ ID NO:47。在还有另一个具体的实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、和SEQ ID NO:7的重链CDR1；选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、和SEQ ID NO:21的重链CDR2；和重链CDR3SEQ ID NO:27，该轻链可变区包含轻链CDR1SEQ ID NO:29，轻链CDR2SEQ ID NO:35；和轻链CDR3SEQ ID NO:47。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区(VH)，该重链可变区(VH)包含与选自SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:67、和SEQ ID NO:63的序列具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，该抗体包含重链可变区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:67、和SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
在某些实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH序列相对于参照序列含有替代（例如保守替代）、***、或删除，但是包含该序列的抗TNC A2抗体保留结合TNC A2的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO59、63或67中替代、***和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在HVR或CDR外部的区域（即在FR中）发生替代、***、或删除。任选地，依照本发明的抗TNC A2抗体包含SEQ ID NO59、63或67中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特别的实施方案中，VH包含1、2或3个选自SEQ ID NO3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25和27所示序列的重链CDR作为HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:85、和SEQ ID NO:89的序列具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在还有另一个实施方案中，该抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含选自SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:85、和SEQ IDNO:89的氨基酸序列。
在某些实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列相对于参照序列含有替代（例如保守替代）、***、或删除，但是包含该序列的抗TNC A2抗体保留结合TNC A2的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO55、57、69、73、77、81、85或89中替代、***和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在HVR或CDR外部的区域（即在FR中）发生替代、***、或删除。任选地，本发明的抗TNC A2抗体包含SEQ ID NO55、57、69、73、77、81、85或89中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰序列。在一个特别的实施方案中，VL包含1、2或3个选自SEQ ID NO29、31、33、35、37、39、41、43、45和47所示序列的轻链CDR作为LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在另一个方面，提供了抗TNC A2抗体，其中该抗体包含如上文提供的任何实施方案中的VH和如上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含与选自SEQID NO:59、SEQ ID NO:67、和SEQ ID NO:63的序列至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列，该轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:69、SEQID NO:73、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:85、和SEQ ID NO:89的序列至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQID NO59、63或67和SEQ ID NO55、57、69、73、77、81、85或89中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:67、和SEQ ID NO:63的氨基酸序列，该轻链可变区包含选自SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:85、和SEQ IDNO:89的氨基酸序列，其中所述抗体不包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:59的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:57的轻链可变区的组合。
在一个具体的实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，该轻链可变区包含选自SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:81、SEQ IDNO:85、和SEQ ID NO:89的氨基酸序列。在另一个具体的实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:67，该轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。在还有另一个具体的实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，该轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:57。在一个特别的实施方案中，依照任何上述实施方案的抗体额外包含Fc区或与免疫球蛋白Fc区等同的区域。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含Fc区，特别是IgG Fc区，最特别地IgG1Fc区。
在一个特别的实施方案中，本发明的抗体是全长抗体，特别是IgG类抗体，最特别地IgG1同种型抗体。在另一个实施方案中，本发明的抗体是抗体片段，其选自下组：scFv片段，Fv片段，Fab片段，和F(ab’)2片段。在又一个实施方案中，本发明的抗体是具有Fc区的抗体片段，或包含与免疫球蛋白Fc区等同的区域的融合蛋白。在一个实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗体是嵌合的，最特别地人源化的。在一个特别的实施方案中，本发明的抗体是人的。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含人恒定区。在一个实施方案中，本发明的抗体包含人Fc区，优选人IgG Fc区，最优选人IgG1Fc区。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链恒定区，其中所述重链恒定区是人IgG恒定区，特别是人IgG1恒定区，其包含Fc区。在一个具体的实施方案中，该抗体包含重链恒定区，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:93。在另一个具体的实施方案中，本发明的抗体包含轻链恒定区，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:95。在还有另一个具体的实施方案中，本发明的抗体包含重链恒定区和轻链恒定区，该重链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO:93，该轻链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO:95。
在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合TNC A2的抗体，其中所述抗体包含a)重链可变区或轻链可变区，该重链可变区包含与选自SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:67、和SEQ ID NO:63的序列至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列，该轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:85、和SEQ IDNO:89的序列至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列，或其组合，和b)Fc区或与免疫球蛋白Fc区等同的区域。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含Fc区，其中所述Fc区是糖工程化的Fc区。在又一个实施方案中，本发明的抗体经过糖工程化改造成具有Fc区中修饰的寡糖。在一个具体的实施方案中，与非糖工程化抗体相比，该抗体具有Fc区中比例升高的两分型寡糖。在一个更具体的实施方案中，该抗体的Fc区中至少约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、或约100%、优选至少约50%、更优选至少约70%的N连接寡糖是两分型的。该两分型寡糖可以是杂合物或复合物类型。
在另一个具体的实施方案中，与非糖工程化抗体相比，本发明的抗体具有Fc区中比例升高的非岩藻糖基化寡糖。在一个更具体的实施方案中，该抗体的Fc区中至少约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、或约100%、优选至少约50%、更优选至少约70%的N连接寡糖是非岩藻糖基化。该非岩藻糖基化寡糖可以是杂合物或复合物类型。
在一个特别的实施方案中，与非糖工程化抗体相比，本发明的抗体具有Fc区中比例升高的两分型、非岩藻糖基化寡糖。具体地，该抗体包含Fc区，其中至少约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、或约100%、优选至少约15%、更优选至少约25%、至少约35%或至少约50%的N连接寡糖是两分型、非岩藻糖基化的。该两分型、非岩藻糖基化寡糖可以是杂合物或复合物类型。
在一个实施方案中，本发明的抗体具有升高的效应器功能和/或升高的Fc受体结合亲和力。升高的效应器功能和/或升高的Fc受体结合可源自例如抗体的糖工程和/或亲和力成熟。在一个实施方案中，升高的效应器功能和/或升高的Fc受体结合是糖工程化改造抗体Fc区的结果。在另一个实施方案中，升高的效应器功能和/或升高的Fc受体结合是升高的亲和力和糖工程组合的结果。升高的效应器功能可包括但不限于下述一项或多项：升高的Fc介导的细胞的细胞毒性（包括升高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)）、升高的抗体依赖性细胞的吞噬(ADCP)、升高的细胞因子分泌、升高的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、升高的对NK细胞的结合、升高的对巨噬细胞的结合、升高的对单核细胞的结合、升高的对多形核细胞的结合、升高的诱导凋亡的直接信号传导、升高的靶物-结合的抗体的交联、升高的树突细胞成熟、或升高的T细胞引发。在一个特别的实施方案中，升高的效应器功能是升高的ADCC。升高的Fc受体结合优选升高对Fc活化受体的结合，最优选对FcγRIIIa的结合。
在一个实施方案中，本发明的抗体在以治疗有效量对个体施用时不引起临床显著水平的毒性。
在一个实施方案中，本发明的抗体是亲和力成熟的。在又一个实施方案中，本发明的抗体以低于约1μM至约0.001nM的解离常数(KD)值，特别是低于约100nM、低于约20nM、低于约10nM、或低于约1nM的KD值结合生腱蛋白C A2结构域(TNC A2)。在一个实施方案中，本发明的抗体结合人、小鼠、或猕猴TNC A2的A2结构域。在一个实施方案中，本发明的抗体结合人和猕猴TNC A2的A2结构域。在一个更具体的实施方案中，本发明的抗体以低于约20nM、低于约10nM、或低于约1nM的KD值结合人和猕猴TNC A2的A2结构域。使用Fab或IgG，特别是IgG形式的抗体通过表面等离振子共振来测定KD值。
在一个实施方案中，本发明的抗TNC A2抗体结合人组织中的TNC A2。
在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合生腱蛋白C A2结构域(TNC A2)的抗体，其中所述抗体包含重链可变区、轻链可变区、和人IgG Fc区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:67、和SEQ ID NO:63的氨基酸序列，该轻链可变区包含选自SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:81、SEQ IDNO:85、和SEQ ID NO:89的氨基酸序列，且其中任选地所述抗体糖工程化改造成具有升高的效应器功能和/或Fc受体结合亲和力。在另一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合生腱蛋白C A2结构域(TNC A2)的抗体，其中所述抗体包含重链可变区、轻链可变区、和人IgG Fc区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:67、和SEQ ID NO:63的氨基酸序列，该轻链可变区包含选自SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:69、SEQID NO:73、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:85、和SEQ ID NO:89的氨基酸序列，且其中所述抗体具有所述Fc区中比例升高的非岩藻糖基化寡糖和/或比例升高的两分型寡糖。
在一个方面，本发明提供了特异性结合生腱蛋白C A2结构域(TNC A2)的抗体，其中所述抗体衍生自亲本抗体，该亲本抗体包含SEQ ID NO:3所示的重链CDR1、SEQ ID NO:9所示的重链CDR2、SEQ ID NO:27所示的重链CDR3、SEQ ID NO:29所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:35所示的轻链CDR2、和SEQ ID NO:47所示的轻链CDR3，且其中所述抗体在该亲本抗体的至少一种重或轻链CDR中包含至少一处氨基酸替代。例如，该抗体可以在亲本抗体的一种或多种高变区或CDR（即1、2、3、4、5、或6种高变区或CDR）中包含至少一处，例如约一处至约十处（即约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10处），特别是约两处至约五处替代。在某些实施方案中，在下述CDR位置处替代上文提供的亲本抗体的任何一个或多个氨基酸：
-重链CDR2(SEQ ID NO:9)：第1位，第6位和第8位
-轻链CDR1(SEQ ID NO:29)：第5位和第9位
-轻链CDR1(SEQ ID NO:35)：第1位，第2位和第3位
在某些实施方案中，替代是保守替代，如本文中提供的。在某些实施方案中，可以以任意组合进行下述一项或多项替代：
-重链CDR2(SEQ ID NO:9)：G1A或V，F6L，T8I
-轻链CDR1(SEQ ID NO:29)：G5S，D9V
-轻链CDR1(SEQ ID NO:35)：A1D，A2S或V，S3Y或T
另外，与亲本抗体相比，该抗体还可包含一种或多种重或轻链的框架区中的一处或多处添加、删除和/或替代。在一个实施方案中，所述至少一种CDR中的至少一处氨基酸替代促成该抗体的结合亲和力与其亲本抗体相比升高。在另一个实施方案中，所述抗体具有比亲本抗体大至少约2倍约10倍的对TNC A2的亲和力（在以相同形式，例如Fab形式比较本发明的抗体和亲本抗体）。另外，自亲本抗体衍生的抗体可单一地或组合地并入前述段落中涉及本发明抗体描述的任何特征。
本发明还提供了编码特异性结合生腱蛋白-C A2结构域的抗体的多核苷酸。在一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，编码构成依照上文所述发明的抗TNC A2抗体一部分的多肽。在一个实施方案中，该分离的多核苷酸编码构成依照上文所述发明的抗TNC A2抗体一部分的抗体重链和/或抗体轻链。
在一个实施方案中，本发明涉及一种分离的多核苷酸，其包含编码SEQID NO3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47所示一种或多种（例如一种、两种、三种、四种、五种、或六种）重或轻链互补决定区(CDR)，或其变异或截短形式（其至少含有特异性决定残基(SDR)）的序列，作为所述CDR。在另一个实施方案中，该多核苷酸包含编码选自SEQ ID NO3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47，或其变异或截短形式（其至少含有SDR）的三种重链CDR（例如HCDR1、HCDR2、和HCDR3）或三种轻链CDR（例如LCDR1、LCDR2、和LCDR3）的序列，作为所述三种互补决定区每一种。在还有另一个实施方案中，该多核苷酸包含编码选自SEQ ID NO3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47的三种重链CDR（例如HCDR1、HCDR2、和HCDR3）和三种轻链CDR（例如LCDR1、LCDR2、和LCDR3）的序列。在一个特别的实施方案中，该多核苷酸编码一种或多种CDR，包含与SEQ ID NO4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、49、50、51、52、53和54中一种或多种CDR核苷酸序列至少约90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的序列。
在又一个实施方案中，该多核苷酸包含编码选自SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:67、和SEQ ID NO:63的重链可变区的序列和/或编码选自SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:77、SEQID NO:81、SEQ ID NO:85、和SEQ ID NO:89的轻链可变区的序列。在一个特别的实施方案中，该多核苷酸编码重链和/或轻链可变区，其包含选自由SEQ ID NO56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90和92组成的可变区核苷酸序列组的序列，或其组合。
在一个具体的实施方案中，该多核苷酸包含编码选自SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:67、和SEQ ID NO:63的重链可变区的序列和编码重链恒定区，特别是人重链恒定区的序列。在一个特别的实施方案中，所述重链恒定区是包含Fc区的人IgG重链恒定区，具体是人IgG1重链恒定区。在一个具体的实施方案中，所述重链恒定区包含序列SEQ ID NO:93。在另一个具体的实施方案中，该多核苷酸包含编码选自SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:85、和SEQ ID NO:89的轻链可变区的序列和编码轻链恒定区，特别是人轻链恒定区的序列。在一个具体的实施方案中，所述轻链恒定区包含序列SEQ IDNO:95。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含第一分离的多核苷酸和第二分离的多核苷酸，该第一分离的多核苷酸编码包含与选自SEQ IDNO:59、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:63的序列至少约90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列的多肽，该第二分离的多核苷酸编码包含与选自SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:73、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:85、和SEQ ID NO:89的序列至少约90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列的多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含第一分离的多核苷酸和第二分离的多核苷酸，该第一分离的多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:68、和SEQ ID NO:64的序列至少约90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的序列，该第二分离的多核苷酸包含与选自SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:86、和SEQ ID NO:90的序列至少约90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的序列。
在又一个方面，本发明还涉及分离的多肽，其由依照上文所述发明的任何多核苷酸编码。
在又一个方面，依照任何上述实施方案的抗TNC A2抗体可单一地或组合地并入下文1-6节中描述的任何特征：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM（例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M）的解离常数(KD)。优选地，本文中提供的抗体以低于1nM的KD值（如通过表面等离振子共振(SPR)测定的）结合生腱蛋白-C A2结构域(TNC A2)，特别是人TNC A2。
依照一个实施方案，利用表面等离振子共振来测量KD。此类测定法可以例如使用-T100机器(GE Healthcare)于25°C用以～80个响应单位(RU)在链霉亲合素芯片上固定化的生物素化抗原实施。简言之，为了固定化，将抗原用10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05%Surfactant P20,pH7.4稀释至0.1μg/ml，之后以流速10μl/min注射以实现大约80个响应单位(RU)的偶联蛋白质。合适抗原构建物的蛋白质和DNA序列显示于SEQ IDNO：99-104。对于动力学测量，在10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05%Surfactant P20,pH7.4中于25°C以流速大约50μl/min注射Fab（1.56nM至100nM）或IgG（0.39nM至25nM）的两倍连续稀释液。结合和解离时间为180秒，并在各个循环之间实施60秒10mM甘氨酸pH1.5再生。使用简单一对一朗格缪尔结合模型(T100Evaluation Software version1.1.1)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以比率koff/kon计算平衡解离常数(KD)。见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、和scFv片段，及下文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)或Carter,Nat.Rev.Immunol.6:343-357(2006)。
单链Fv或scFv片段以单一多肽链包含VH域和VL域。典型地，通过接头序列来连接VH和VL域。关于scFv片段的综述，见例如Plückthun,于ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994);还可见WO93/16185;及美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基，并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，见美国专利No.5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。见例如EP404,097;WO1993/01161;Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003);及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。
微型抗体指含有恒定区，通常是免疫球蛋白，优选地IgG，更优选地IgG1的CH3区作为二聚化区的二价、同二聚体scFv衍生物。一般地，恒定区经由铰链区和/或接头区与scFv连接。微型抗体蛋白质的例子可见Hu等,CancerRes.56:3055-61(1996)。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体（Domantis,Inc.,Waltham,MA；见例如美国专利No.6,248,516B1）。
可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞（例如大肠杆菌或噬菌体）的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。
3.嵌合的和人源化的抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567;及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区（例如，自小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区）和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR（或其部分）自非人抗体衍生，而FR（或其部分）自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体（例如衍生HVR残基的抗体）的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化可以通过多种方法来实现，包括但不限于(a)将整个非人可变域嫁接至人恒定区上以生成嵌合抗体；(b)仅将非人（例如供体抗体）CDR在保留或不保留至关重要的框架残基（例如，那些对于保留良好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基）的情况中嫁接至人（例如，接受体抗体）框架和恒定区上，(c)仅将非人特异性决定区（SDR或a-CDR；对于抗体-抗原相互作用至关重要的残基）嫁接至人框架和恒定区上，或(d)移植整个非人可变域，但是通过替换表面残基用人样部分“掩盖”它们。人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann等,Nature332:323-329(1988);Queen等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86:10029-10033(1989);美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409;Jones等,Nature321:522-525(1986);Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.81:6851-6855(1984);Morrison和Oi,Adv.Immunol.44:65-92(1988);Verhoeyen等,Science239:1534-1536(1988);Padlan,Molec.Immun.31(3):169-217(1994);Kashmiri等,Methods36:25-34(2005)（描述了SDR(a-CDR)嫁接）；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)（描述了“重修表面”）；Dall’Acqua等,Methods36:43-60(2005)（描述了“FR改组”）；及Osbourn等,Methods36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer83:252-260(2000)（描述了FR改组的“引导选择”方法）。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区（见例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993)）；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区（见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);及Presta等J.Immunol.,151:2623(1993)）；人成熟的（体细胞突变的）框架区或人种系框架区（见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)）；和通过筛选FR文库衍生的框架区（见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996)）。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M技术，和美国专利申请公开文本No.US2007/0061900，其描述了技术）。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系（见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991)）。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No.7,189,826（其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体）和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)（其描述了人-人杂交瘤）的。人杂交瘤技术（Trioma技术）也记载于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等于Methods in Molecular Biology178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,2001)，并且进一步记载于例如McCafferty等,Nature348:552-554;Clackson等,Nature352:624-628(1991);Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Marks和Bradbury,于Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003);Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004);及Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以（例如自人）克隆天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373、和美国专利公开文本No.2005/0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,2007/0292936和2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对TNC A2，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合TNC A2的两个不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达TNC A2的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达（见Milstein和Cuello,Nature305:537(1983)、WO93/08829、和Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991)）、和“突起-入-空穴”工程化（见例如美国专利No.5,731,168）。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段（见例如美国专利No.4,676,980,及Brennan等,Science,229:81(1985)）；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体（见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)）；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术（见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)）；及使用单链Fv(sFv)二聚体（见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994)）；及如例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”（见例如US2006/0025576A1）。
本文中的抗体或片段还包括包含结合TNC A2及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”（见例如US2008/0069820）。
7.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或***和/或替代。可以进行删除、***、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，抗原结合。
a)替代、***、和删除变体
在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。
氨基酸替代可以导致将一个氨基酸用具有相似结构和/或化学特性的另一个氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。“保守”氨基酸替代可以基于所牵涉残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性产生。例如，非极性（疏水性）氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷的（碱性）氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；而带负电荷的（酸性）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。保守替代在表2中在“优选替代”的标题下显示。更实质的变化在表2中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。
表2
初始残基 例示性替代 优选的替代
Ala(A) Val;Leu;Ile Val
Arg(R) Lys;Gln;Asn Lys
Asn(N) Gln;His;Asp,Lys;Arg Gln
Asp(D) Glu;Asn Glu
Cys(C) Ser;Ala Ser
Gln(Q) Asn;Glu Asn
Glu(E) Asp;Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn;Gln;Lys;Arg Arg
Ile(I) Leu;Val;Met;Ala;Phe;正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸;Ile;Val;Met;Ala;Phe Ile
Lys(K) Arg;Gln;Asn Arg
Met(M) Leu;Phe;Ile Leu
Phe(F) Trp;Leu;Val;Ile;Ala;Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val;Ser Ser
Trp(W) Tyr;Phe Tyr
Tyr(Y) Trp;Phe;Thr;Ser Phe
Val(V) Ile;Leu;Met;Phe;Ala;正亮氨酸 Leu
依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；
(3)酸性的：Asp,Glu；
(4)碱性的：His,Lys,Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly,Pro；
(6)芳香族的：Trp,Tyr,Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。例如，氨基酸替代还可以导致将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一个氨基酸替换，例如将来自一组（例如，极性）的一个氨基酸用来自不同组（例如碱性）的另一个氨基酸替换。可以通过使用重组DNA技术来***性生成多肽分子中的氨基酸***、删除、或替代，并对所得的重组变体测定活性来以实验确定所容许的变异。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体（例如人源化或人抗体）的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变（例如改善）（例如升高的亲和力、降低的免疫原性）和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性（例如结合亲和力）。
可以对HVR做出变化（例如，替代），例如以改善抗体亲和力。可以对HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基（见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008)），和/或SDR(a-CDR)做出此类变化，其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom等于Methods in Molecular Biology178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法（例如，易错PCR、链改组、或寡核苷酸指导的诱变）将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的方法，其中将几个HVR残基（例如，一次4-6个残基）随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代、***、或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出保守变化（例如，保守替代，如本文中提供的），其不实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或者含有不超过1、2或3处氨基酸替代。
一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述的。在此方法中，将残基或靶残基的组（例如，带电荷的残基诸如Arg、Asp、His、Lys、和Glu）鉴定，并用中性或带负电荷的氨基酸（例如，丙氨酸或多丙氨酸）替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点可能是有益的。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列***包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它***变体包括抗体的N或C端与酶（例如对于ADEPT）或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
b)糖基化变体
在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在一方面，本发明提供了具有升高的效应器功能，包括抗体依赖性细胞的细胞毒性的抗TNC A2抗体的糖形。先前已经描述了抗体的糖基化工程。见例如美国专利No.6,602,684，通过提及而将其完整收入本文。本文中还详细描述了自具有牵涉糖基化的基因的改变的活性的宿主细胞生成抗TNC A2抗体的方法（见例如前面题目为“重组方法和组合物”的部分）。
IgG分子在其Fc区中携带两个N连接的寡糖，每个重链上一个。与任何糖蛋白一样，抗体以共享相同多肽主链，但是具有附着于糖基化位点的不同寡糖的糖形群体生成。通常在血清IgG的Fc区中找到的寡糖是复合的双触角型的(Wormald等,Biochemistry36:130-38(1997)，具有低水平的末端唾液酸和两分型N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，和可变程度的末端半乳糖基化和核心岩藻糖基化（附着于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc残基的岩藻糖）。一些研究提示了FcγR结合需要的最少碳水化合物结构位于寡糖核心内。Lund等,J.Immunol.157:4963-69(1996)。
工业和学术界中用于生成抗体的小鼠或仓鼠衍生的细胞系通常将需要的寡糖决定簇附着于Fc位点。然而，这些细胞系中表达的IgG缺乏在血清IgG中以较低的量找到的两分型GlcNAc。Lifely等,Glycobiology318:813-22(1995)。在N连接的糖基化途径中，通过GnTIII添加两分型GlcNAc。Schachter,Biochem.Cell Biol.64:163-81(1986)。
等人使用单一的抗体生成CHO细胞系，其先前工程化改造成以外部调节方式表达不同水平的克隆GnTIII酶基因(P.等,NatureBiotechnol.17:176-180(1999))。此办法第一次建立了糖基转移酶（例如GnTIII）表达与经修饰的抗体的ADCC活性之间的严格关联。如此，本发明涵盖如下的抗TNC A2抗体，其包含具有改变抗体生成宿主细胞中的糖基转移酶基因的表达水平所致改变的糖基化的Fc区或与Fc区等同的区域。在一个具体的实施方案中，基因表达水平的变化是GnTIII活性的升高。升高的GnTIII活性导致抗体的Fc区中两分型寡糖的百分比升高及岩藻糖基化寡糖的百分比降低。此抗体或其片段具有升高的Fc受体结合亲和力和升高的效应器功能。
提供了具有两分型寡糖的抗体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO2003/011878（Jean-Mairet等）；美国专利No.6,602,684（等）；及US2005/0123546（等）。
在一个实施方案中，本发明的抗TNC A2抗体由于通过本发明的方法对其寡糖的修饰而具有Fc区中比例增加的两分型寡糖。在一个实施方案中，本发明抗TNC A2抗体的Fc区中两分型N连接寡糖的百分比是总寡糖的至少约10%至约100%、特别地至少约50%、更特别地至少约60%、至少约70%、至少约80%、或至少约90-95%。两分型寡糖可以是杂合物或复合物类型。
在另一个实施方案中，本发明的抗TNC A2抗体由于通过本发明的方法对其寡糖的修饰而具有Fc区中比例增加的非岩藻糖基化寡糖。在一个实施方案中，非岩藻糖基化寡糖的百分比是至少约20%至约100%、特别地至少约50%、至少约60%至约70%、且更特别地至少约75%。非岩藻糖基化寡糖可以是杂合物或复合物类型。
通过相对于附着于Asn297的所有糖结构（例如，复合的、杂合的和高甘露糖的结构）的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位（Fc区残基的EU编号方式）的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。岩藻糖的相对量指根据MALDI-TOF MS，含有岩藻糖的结构相对于N-糖苷酶F处理的样品中鉴定的所有糖结构（例如复合、杂合和高甘露糖结构）的百分比。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。
可用于本发明抗TNC A2抗体的糖工程方法已经极为详细地记载于美国专利No.6,602,684；美国专利申请公开文本No.2004/0241817A1；美国专利申请公开文本No.2003/0175884A1；美国临时专利申请No.60/441,307及WO2004/065540，通过述及将每一篇的全部内容完整收入本文。或者，依照美国专利申请公开文本No.2003/0157108(Genentech)或EP1176195A1；WO03/084570；WO03/085119及美国专利申请公开文本No.2003/0115614；No.2004/093621；No.2004/110282；No.2004/110704；No.2004/132140；Niwa etal.,J Immunol Methods306,151/160(2006)；美国专利No.6,946,292(Kyowa)中披露的技术，本发明的抗TNC A2抗体可以糖工程化改造成具有Fc区中减少的岩藻糖残基。也可以在生成经修饰糖蛋白的表达***（诸如中美国专利申请公开文本No.60/344,169和WO03/056914(GlycoFi,Inc.)中或WO2004/057002和WO2004/024927(Greenovation)中教导的那些）中生成本发明的糖工程化抗TNC A2抗体。
涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的其它例子包括：WO2000/61739;WO2001/29246;US2002/0164328;US2004/0109865;WO2005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);美国专利申请No US2003/0157108A1,Presta,L;及WO2004/056312A1,Adams等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞（见例如Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004);Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006);及WO2003/085107）。
在一个具体的实施方案中，本发明的抗TNC A2抗体具有Fc区中比例增加的两分型、非岩藻糖基化寡糖。两分型、非岩藻糖基化寡糖可以是杂合物或复合物。具体地，本发明的方法可用于生成如下的抗TNC A2抗体，其中抗原结合分子的Fc区中至少约10%至约100%、特别地至少约15%、更特别地至少约20%至约25%、且更特别地至少约30%至约35%的寡糖是两分型、非岩藻糖基化的。本发明的抗TNC A2抗体也可以包含如下的Fc区，其中抗体的Fc区中至少约10%至约100%、特别地至少约15%、更特别地至少约20%至约25%、且更特别地至少约30%至约35%的寡糖是两分型、杂合、非岩藻糖基化的。
在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。
还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO1997/30087（Patel等）；WO1998/58964(Raju,S.)；及WO1999/22764(Raju,S.)。
也通过提高抗原结合分子对TNC A2的亲和力，例如通过亲和力成熟或其它改善亲和力的方法（见Tang等,J.Immunol.2007,179:2815-2823）或通过Fc区中的氨基酸修饰（如下文描述的）来实现本发明抗TNC A2抗体的ADCC或其它效应器功能的升高。本发明也涵盖这些办法的组合。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰（例如替代）的人Fc区序列（例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区）。
在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能（诸如补体和ADCC）是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合（因此有可能缺乏ADCC活性），但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362（见例如Hellstrom,I.等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA83:7059-7063(1986)）和Hellstrom,I等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA82:1499-1502(1985);5,821,337（见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987)）。或者，可以采用非放射性方法（见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI)）。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA95:652-656(1998)的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法（见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996);Cragg,M.S.等,Blood101:1045-1052(2003);及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004)）。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定（见例如Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)）。
具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238,265,269,270,297,327和329中的一个或多个的替代的（美国专利No.6,737,056）。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体（美国专利No.7,332,581）。
描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体（见例如美国专利No.6,737,056;WO2004/056312，及Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)）。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区的位置298、333、和/或334（残基的EU编号方式）的替代的Fc区。
在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致改变的（即，改善的或降低的）C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551、WO99/51642、及Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)的。
具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434中的一处或多处具有替代，例如，Fc区残基434的替代的（美国专利No.7,371,826）。
至于关注Fc区变体的其它例子，还可见美国专利申请No.60/439,498；60/456,041；60/514,549；或WO2004/063351（由于氨基酸修饰而具有升高的结合亲和力的变体Fc区）；或美国专利申请No.10/672,280或WO2004/099249（由于氨基酸修饰的具有改变的对FcγR的结合的Fc变体）；Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO94/29351。
d)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建抗体缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个：轻链的V205（Kabat编号方式）；重链的A118（EU编号方式）；和重链Fc区的S400（EU编号方式）。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三口恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸（均聚物或随机共聚物）、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇（例如甘油）、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
B.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物来生成抗体，例如，如记载于美国专利No.4,816,567的。在一个实施方案中，提供了编码本文中所描述的抗TNC A2抗体的分离的多核苷酸。此类多核苷酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列（例如，抗体的轻和/或重链）。在又一个实施方案中，提供了包含此类多核苷酸的一种或多种载体（例如，克隆载体或表达载体）。在又一个实施方案中，提供了包含此类多核苷酸或此类载体的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含（例如，已经用下列载体转化）：(1)包含多核苷酸的载体，所述多核苷酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列（例如多顺反子载体），或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的多核苷酸，所述第二载体包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的多核苷酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，特别是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)细胞或淋巴样细胞（例如，Y0、NS0、Sp20细胞）。在一个实施方案中，提供了生成抗TNC A2抗体的方法，其中该方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码抗体的多核苷酸的宿主细胞，如上文提供的，并且任选地，自宿主细胞（或宿主细胞培养液）回收抗体。
对于抗TNC A2抗体的重组生成，将一种或多种编码抗体的多核苷酸（例如如上文所描述的）分离，并***一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建与合适的转录/翻译控制信号一起含有抗TNC A2抗体的编码序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。见例如记载于Maniatis等,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,ColdSpring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)及Ausubel等,CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and WileyInterscience,N.Y(1989)的技术。
在一个实施方案中，可以在组成性启动子或备选地调节性表达***的控制下表达一种或几种编码抗TNC A2抗体的多核苷酸。合适的调节性表达***包括但不限于四环素调节性表达***、蜕皮激素诱导型表达***、lac转换表达***、糖皮质素诱导型表达***、温度诱导型启动子***、和金属硫蛋白金属诱导型表达***。若编码本发明抗体的几种不同多核苷酸包含在宿主细胞***内，则它们中的一些可以在组成性启动子的控制下表达，而其它在调节性启动子的控制下表达。
适合于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括本文中所描述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见例如美国专利No.5,648,237,5,789,199和5,840,523（还可见Charlton,Methods in MolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌(E.coli.)中的表达）。表达后，可以将抗体在可溶性级分中自细菌细胞团糊分离，并可以进一步纯化。
在原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是适合于抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),及Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。此类表达***还教导于美国专利申请No.60/344,169和WO03/056914（用于在非人真核宿主细胞中生成人样糖蛋白的方法）。
适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也自多细胞生物体（无脊椎动物和脊椎动物）衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429（其描述了用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术）。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适合于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系（293或293T细胞，如记载于例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)的）；幼年仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞（TM4细胞，如记载于例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)的）；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠***肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，如记载于例如Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)的；MRC5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。
一般地，稳定的表达对于瞬时表达而言是优选的，因为它通常实现更加可再现的结果，而且还更适合于大规模生产；然而，本领域技术人员技术内的是测定瞬时表达对于特定的情况是否更好。
本发明进一步涉及用于修饰由宿主细胞生成的本发明抗TNC A2抗体的糖基化概况的方法，包括在所述宿主细胞中表达一种或多种编码抗TNC A2抗体的多核苷酸和一种或多种编码具有糖基转移酶活性的多肽的多核苷酸，或包含此类多核苷酸的载体。一般地，可以使用任何类型的培养细胞系，包括上文所讨论的细胞系来生成用于生成具有改变的糖基化样式的抗TNC A2抗体的细胞系。优选的细胞系包括CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、和其它哺乳动物细胞。具有糖基转移酶活性的多肽包括β(1,4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII)、α-甘露糖苷酶II(ManII)、β(1,4)-半乳糖基转移酶(GalT)、β(1,2)-N-乙酰葡糖氨基转移酶I(GnTI)、和β(1,2)-N-乙酰葡糖氨基转移酶II(GnTII)。在一个实施方案中，在宿主细胞中表达编码具有糖基转移酶活性的多肽的多核苷酸的组合（例如，GnTIII和Man II）。同样地，该方法还涵盖在已经破坏或以其它方式灭活糖基转移酶基因的宿主细胞（例如，已经敲除编码α1,6核心岩藻糖基转移酶的基因的活性的宿主细胞）中表达一种或多种编码抗TNC A2抗体的多核苷酸。在一个具体的实施方案中，可以在进一步表达编码具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸以修饰下述抗体的糖基化样式的宿主细胞中生成本发明的抗TNC A2抗体。在一个具体的实施方案中，具有GnTIII活性的多肽是包含高尔基驻留多肽的高尔基定位域的融合多肽。在另一个具体的实施方案中，表达编码具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸的宿主细胞中本发明抗TNC A2抗体的表达生成具有升高的Fc受体结合亲和力和/或升高的效应器功能的抗TNC A2抗体。因而，在一个实施方案中，本发明涉及宿主细胞，其包含(a)一种或多种包含编码具有GnTIII活性的多肽的序列的分离的多核苷酸；和(b)一种或多种编码本发明抗TNC A2抗体的分离的多核苷酸。在一个具体的实施方案中，具有GnTIII活性的多肽是包含GnTIII的催化域和异源高尔基驻留多肽的高尔基定位域的融合多肽。特别地，所述高尔基定位域是甘露糖苷酶II的高尔基定位域。用于生成此类融合多肽及使用它们来生成具有升高的效应器功能的抗体的方法披露于WO2004/065540；美国临时专利申请No.60/495,142和美国专利申请公开文本No.2004/0241817，通过提及而将其全部内容明确收入本文。在另一个实施方案中，宿主细胞另外包含分离的多核苷酸，其包含编码具有甘露糖苷酶II(ManII)活性的多肽的序列。可以在组成性启动子或备选地调节性表达***的控制下表达编码多肽的多核苷酸，像编码抗TNC A2抗体的多核苷酸。此类***是本领域中公知的，并且包括上文所讨论的***。
可以例如通过下述方法来鉴定含有抗TNC A2抗体的编码序列和/或具有糖基转移酶活性的多肽的编码序列，并且表达生物学活性基因产物的宿主细胞：DNA-DNA或DNA-RNA杂交；“标志物”基因功能的存在或缺乏；评估转录水平，如通过宿主细胞中的各自mRNA转录物的表达测量的；和检测基因产物，如通过免疫测定法或通过其生物学活性（本领域公知的方法）测量的。GnTIII或Man II活性可以例如通过采用结合GnTIII或ManII的生物合成产物的凝集素来检测。此类凝集素的一个例子是优先结合含有两分型GlcNAc的寡糖的E4-PHA凝集素。具有GnTIII或ManII活性的多肽的生物合成产物（即具体寡糖结构）也可以通过自由表达所述多肽的细胞生成的糖蛋白释放的寡糖的质谱分析来检测。或者，可以使用如下的功能性测定法，其测量由用如下多核苷酸工程化改造的细胞生成的抗体介导的升高的效应器功能或升高的Fc受体结合，所述多核苷酸编码具有GnTIII活性的多肽。
本发明还涉及用于生成具有经修饰的寡糖的抗TNC A2抗体的方法，包括(a)在容许生成依照本发明的抗TNC A2抗体的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞工程化改造为表达编码具有糖基转移酶活性的多肽的至少一种多核苷酸，其中所述具有糖基转移酶活性的多肽以足以修饰由所述宿主细胞生成的所述抗TNC A2抗体的Fc区中的寡糖的量表达；并(b)分离所述抗TNC A2抗体。在一个实施方案中，具有糖基转移酶活性的多肽是GnTIII。在另一个实施方案中，存在两种具有糖基转移酶活性的多肽。在一个具体的实施方案中，两种具有糖基转移酶活性的肽是GnTIII和ManII。在另一个实施方案中，具有糖基转移酶活性的多肽是包含GnTIII的催化域的融合多肽。在一个更具体的实施方案中，融合多肽进一步包含高尔基驻留多肽的高尔基定位域。特别地，高尔基定位域是甘露糖苷酶II或GnTI的定位域，最特别地甘露糖苷酶II的定位域。或者，高尔基定位域选自下组：甘露糖苷酶I的定位域、GnTII的定位域、和α1,6核心岩藻糖基转移酶的定位域。
在一个具体的实施方案中，由上文所述方法或宿主细胞生成的经修饰的抗TNC A2抗体具有包含Fc区的IgG恒定区或其片段。在另一个具体的实施方案中，抗TNC A2抗体是包含Fc区的人源化或人抗体或其片段。
由上文所述方法或宿主细胞生成的具有改变的糖基化的抗TNC A2抗体通常由于宿主细胞的修饰（例如，通过表达糖基转移酶基因）而展现出升高的Fc受体结合亲和力和/或升高的效应器功能。优选地，升高的Fc受体结合亲和力是升高的对Fcγ活化受体，最优选FcγRIIIa受体的结合。优选地，升高的效应器功能是下列一项或多项的升高：升高的抗体依赖性细胞的细胞毒性、升高的抗体依赖性细胞的吞噬(ADCP)、升高的细胞因子分泌、升高的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、升高的Fc介导的细胞的细胞毒性、升高的对NK细胞的结合、升高的对巨噬细胞的结合、升高的对多形核细胞(PMNC)的结合、升高的对单核细胞的结合、靶物-结合的抗体的交联升高、升高的诱导凋亡的直接信号传导、升高的树突细胞成熟、和升高的T细胞引发。
C.测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗TNC A2抗体鉴定、筛选、或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
1.结合测定法和其它测定法
一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA、Western印迹等来进行。
另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与另一种特异性抗TNC A2抗体竞争对TNC A2的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与所述另一种特异性抗TNC A2抗体所结合表位相同的表位（例如线性或构象表位）。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法见Morris(1996)“EpitopeMapping Protocols”,Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)。
在一种例示性竞争测定法中，在包含第一经标记抗体（其结合TNC A2，例如实施例中描述的2B10抗体）和第二未标记抗体（其要测试与第一抗体竞争对TNC A2的结合的能力）的溶液中温育固定化TNC A2。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化TNC A2。在允许第一抗体结合TNC A2的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定化TNC A2联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化TNC A2联合的标记物的量与对照样品相比实质性降低，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对TNC A2的结合。参见Harlowand Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
2.活性测定法
一方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的抗TNC A2抗体的测定法。生物学活性可包括例如靶定细胞的裂解、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、或凋亡的诱导。还提供了在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。在某些实施方案中，对本发明的抗体测试此类生物学活性。
上文（见“定义”下：“具有升高的ADCC的抗体”）和实施例11中描述了“用于测试ADCC的例示性测定法。用于检测细胞裂解（例如通过测量LDH释放）或凋亡（例如使用TUNEL测定法）的测定法是本领域公知的。用于测量ADCC或CDC的测定法还记载于WO2004/065540（参见其中的实施例1），通过述及将其完整内容收入本文。
D.抗体缀合物
本发明还提供了包含与一种或多种细胞毒剂，诸如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素（例如，蛋白质毒素、细菌、真菌、植物、或动物起源的酶活性毒素、或其片段）、或放射性同位素缀合的本文中的抗TNC A2抗体的缀合物。
在一个实施方案中，在抗体-药物缀合物(ADC)中，抗体与一种或多种药物缀合，包括但不限于美登木素生物碱（见美国专利No.5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0425235B1）；auristatin诸如单甲基auristatin药物模块DE和DF（MMAE和MMAF）（见美国专利No.5,635,483和5,780,588及7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物（见美国专利No.5,712,374,5,714,586,5,739,116,5,767,285,5,770,701,5,770,710,5,773,001和5,877,296;Hinman等,Cancer Res.53:3336-3342(1993);及Lode等,CancerRes.58:2925-2928(1998)）；蒽环类抗生素诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)（见Kratz等,Current Med.Chem.13:477-523(2006);Jeffrey等,Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362(2006);Torgov等,Bioconj.Chem.16:717-721(2005);Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:829-834(2000);Dubowchik等,Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532(2002);King等,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002);及美国专利No.6,630,579）；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)诸如多西他赛(docetaxel)、帕利他塞、larotaxel、tesetaxel、和ortataxel；单端孢霉素(trichothecene)；和CC1065。
在另一个实施方案中，抗体缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文中所描述的抗体，所述酶活性毒素包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)）、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。
在另一个实施方案中，抗体缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文中所描述的抗体。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在使用放射性缀合物进行检测时，它可以包含供闪烁法研究用的放射性原子，例如tc99m或I123，或供核磁共振(NMR)成像（又称为磁共振成像，mri）用的自旋标记物，诸如再一次的碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白质偶联剂来生成抗体和细胞毒剂的缀合物，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺）、二异硫氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等,Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感性接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Res52:127-131(1992);美国专利No.5,208,020)。
本文中的缀合物明确涵盖，但不限于用交联试剂制备的此类缀合物，所述交联试剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、和sulfo-SMPB，及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们是商品化的（例如，来自PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A）。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文中提供的任何抗TNC A2抗体可用于检测生物学样品中TNC A2的存在。在用于本文时，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物学样品包含细胞或组织，诸如来自脑、乳腺/***、结肠、肾、肝、肺、卵巢、胰、***、骨骼肌、皮肤、小肠、胃或子宫的细胞或组织，也包括这些器官的细胞或组织肿瘤。
在一个实施方案中，提供了在诊断或检测方法中使用的抗TNC A2抗体。在又一方面，提供了检测生物学样品中TNC A2的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在容许抗TNC A2抗体结合TNC A2的条件下使生物学样品（任选有对照样品）与抗TNC A2抗体接触，如本文中所描述的，并检测是否在抗TNC A2抗体与TNC A2之间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗TNC A2抗体来选择适合用抗TNC A2抗体治疗的受试者，例如其中TNC A2是一种用于选择患者的生物标志。
可使用本发明的抗体来诊断的例示性病症包括与TNC A2表达有关的疾病，诸如癌症和炎性状况。
在一个方面，提供了诊断受试者中的疾病的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的诊断剂，其中所述诊断剂包含本文所述抗TNC A2抗体和标记物，通常是成像剂，其容许检测所述诊断剂和TNC A2的复合物。
在某些实施方案中，提供了经标记的抗TNC A2抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块（诸如荧光、发色、电子致密、化学发光、和放射性标记物）、及例如经由酶反应或分子相互作用间接检测的模块，诸如酶或配体。例示性的标记物包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H、和131I、荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明(rhodamine)及其衍生物、丹酰、伞形酮、萤光素酶，例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶（美国专利No.4,737,456）、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶（其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联）、乳过氧化物酶、或微过氧化物酶、生物素/亲合素、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定的自由基、等等。
F.药物配制剂
通过混合具有期望纯度的此类抗体与一种或多种任选的药学可接受载体(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))混合以冻干配制剂或水性溶液形式制备如本文中所描述的抗TNC A2抗体的药物配制剂。一般地，药学可接受载体在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚）；低分子量（少于约10个残基）多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物（例如Zn-蛋白质复合物）；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性的药学可接受载体进一步包含间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。某些例示性的sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968。在一方面，将sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性的冻干抗体配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性抗体配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的化合物。例如，如果要治疗的疾病是癌症的话，可能希望进一步提供一种或多种抗癌剂，例如化疗剂、肿瘤细胞增殖抑制剂、或肿瘤细胞动物激活剂。此类活性组分适于以有效用于所需目的的量而组合存在。
活性成分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中（例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊），在胶状药物投递***中（例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊），或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形商品形式，例如膜，或微胶囊。
用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。
本文中所描述的分子可以为多种剂量形式，其包括但不限于液体溶液或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、栓剂、聚合物微胶囊或微泡、脂质体、和可注射或可输注溶液。优选的形式取决于施用模式和治疗应用，但是通常会是可注射或可输注溶液。
G.治疗性方法和组合物
可以在治疗性方法中使用本文中提供的任何抗TNC A2抗体或包含抗TNC A2抗体的药物组合物。
本文中提供的抗TNC A2抗体可用于治疗以TNC A2表达，特别是与相同细胞类型的正常组织相比的TNC A2异常表达（例如细胞中的过表达或不同样式的表达）为特征的疾病。与相同细胞类型的非肿瘤组织相比，TNC A2在许多人肿瘤中异常表达（例如过表达）。如此，本文中提供的抗TNC A2抗体特别可用于预防肿瘤形成、根除肿瘤和抑制肿瘤生长或转移。本文中提供的抗TNC A2抗体可用于治疗任何表达TNC A2的肿瘤。可通过本文中提供的抗TNC A2抗体来治疗的具体恶性肿瘤包括例如肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌、头和颈癌、皮肤癌、肝癌、肾癌、***癌、胰腺癌、脑癌、骨骼肌癌。
本文中公开的抗TNC A2抗体可用于抑制肿瘤生长或杀死肿瘤细胞。例如，抗TNC A2抗体能结合癌性细胞（肿瘤细胞或肿瘤基质细胞）的膜或细胞表面上的TNC A2并引发例如ADCC或其它效应器介导的杀死癌性细胞。
或者，抗TNC A2抗体可用于阻断TNC A2的功能，特别是通过物理上干扰它与其它化合物的结合。例如，抗原结合分子可用于阻断TNC A2介导的细胞粘附、传播或迁移。
在一个方面，提供了作为药物使用的抗TNC A2抗体。在又一些方面，提供了在治疗以TNC A2表达为特征的疾病中使用的抗TNC A2抗体。在某些实施方案中，提供了在治疗方法中使用的抗TNC A2抗体。在某些实施方案中，本发明提供了在治疗具有以TNC A2表达为特征的疾病的个体的方法中使用的抗TNC A2抗体，所述治疗包括对个体施用有效量的抗TNC A2抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。在又一些实施方案中，本发明提供了在诱导细胞裂解中使用的抗TNC A2抗体。在某些实施方案中，本发明提供了在个体中诱导细胞裂解的方法中使用的抗TNC A2抗体，所述方法包括对个体施用有效量的抗TNC A2抗体以诱导细胞裂解。依照任何上述实施方案的“个体”优选是人。依照任何上述实施方案的“个体”优选是人。依照任何上述实施方案的“以TNC A2表达为特征的疾病”优选是癌症，最优选选自下组的癌症：肺癌，结肠癌，胃癌，乳腺癌，皮肤癌，肝癌，肾癌，***癌，胰腺癌，脑癌，骨骼肌癌。依照任何上述实施方案的“细胞”优选是肿瘤中存在的细胞，诸如肿瘤细胞或肿瘤基质细胞，最优选肿瘤细胞。依照任何上述实施方案的“TNC A2表达”优选是与相同细胞类型的正常组织相比，细胞中的异常表达，诸如过表达或不同样式的表达。
在又一方面，本发明提供了抗TNC A2抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗以TNC A2表达为特征的疾病。在又一个实施方案中，所述药物用于治疗以TNC A2表达为特征的疾病的方法，包括对具有以TNC A2表达为特征的疾病的个体施用有效量的药物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。在又一个实施方案中，药物用于诱导细胞裂解。在又一个实施方案中，药物用于在个体中诱导细胞裂解的方法，所述方法包括对个体施用有效量的药物以诱导细胞裂解。依照任何上述实施方案的“个体”优选是人。依照任何上述实施方案的“以TNC A2表达为特征的疾病”优选是癌症，最优选选自下组的癌症：肺癌，结肠癌，胃癌，乳腺癌，皮肤癌，肝癌，肾癌，***癌，胰腺癌，脑癌，骨骼肌癌。依照任何上述实施方案的“细胞”优选是肿瘤中存在的细胞，诸如肿瘤细胞或肿瘤基质细胞，最优选肿瘤细胞。依照任何上述实施方案的“TNC A2表达”优选是与相同细胞类型的正常组织相比，细胞中的异常表达，诸如过表达或不同样式的表达。
在又一方面，本发明提供了治疗以TNC A2表达为特征的疾病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对具有此类以TNC A2表达为特征的疾病的个体施用有效量的抗TNC A2抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，如下文所描述的。在又一个实施方案中，本发明提供了用于在个体中诱导细胞裂解的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对个体施用有效量的抗TNC A2抗体以诱导细胞裂解。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。依照任何上述实施方案的“以TNC A2表达为特征的疾病”优选是癌症，最优选选自下组的癌症：肺癌，结肠癌，胃癌，乳腺癌，皮肤癌，肝癌，肾癌，***癌，胰腺癌，脑癌，骨骼肌癌。依照任何上述实施方案的“细胞”优选是肿瘤中存在的细胞，诸如肿瘤细胞或肿瘤基质细胞，最优选肿瘤细胞。依照任何上述实施方案的“TNC A2表达”优选是与相同细胞类型的正常组织相比，细胞中的异常表达，诸如过表达或不同样式的表达。
在又一方面，本发明提供了药物配制剂，其包含本文中提供的任何抗TNC A2抗体，例如在任何上述治疗性方法中使用。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗TNC A2抗体和一种或多种药学可接受载体。在另一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗TNC A2抗体和至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。
可以单独或与疗法中的其它药剂组合使用本发明的抗体。例如，可以与至少一种别的治疗剂共施用本发明的抗体。在某些实施方案中，别的治疗剂是抗癌剂。合适的抗癌剂是例如化疗剂、肿瘤细胞增殖的抑制剂、或肿瘤细胞凋亡的激活剂。
上文记录的此类联合疗法涵盖联合施用（其中两种或更多种治疗剂包含在相同或不同配制剂中），和分开施用，在该情况中，可以在施用别的治疗剂和/或佐剂之前、同时、和/或之后发生本发明的抗体的施用。也可以与放射疗法组合使用本发明的抗体。
可以通过任何合适的手段，包括胃肠外、肺内、和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用本发明的抗体（和任何别的治疗剂）。胃肠外施用包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。静脉内施用通常是优选的。然而，预期腹膜内路径特别可用于例如治疗结肠直肠肿瘤。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用、推注施用、和脉冲输注。
本发明的抗体应当以一种符合良好的医学实践的方式配制、确定剂量及给药。关于这一点考虑的因素包括在治疗的特定病症、在治疗的特定哺乳动物、患者个体的临床状态、病因、药物递送部位、给药方法、服药日程以及其它为开业医生所知的因素。抗体无需但可任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所述病症的药物一起配制。上述其它药物的有效量取决于配方中所存在的抗体的量、所治疗病症的类型、以及其它上述讨论的因素。这些药物通常以相同的剂量使用并具有本文中所描述的给药途径，或以约1-99%的本文所描述的剂量使用，或以任何剂量并通过任何途径使用，所述剂量和途径是凭经验确定的/经临床测定合适的。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体(当单独或与一种或多种其它别的治疗剂联合使用时)的合适剂量应取决于所要治疗的疾病的类型、抗体的种类、疾病的严重性和病程、所给予抗体的预防或治疗目的、之前的治疗、患者的临床史和对抗体的应答、以及主治医师的斟酌决定。抗体适合于在一次或一系列的治疗中给予患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg（例如0.1mg/kg-10mg/kg）的抗体可作为首次候选用量给予患者，无论是例如通过一次或多次单独的给药或通过连续输注。取决予上述提及的因素，一个典型的日剂量可在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复给药，取决于病情，治疗应通常持续直至出现病症得到期望的抑制为止。抗体以一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此，可以对患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg（或它们的任意组合）的一剂或多剂。上述剂量可间歇给予，如每周或每三周给予一次(如使得患者得到约2-约20个，或例如约6个剂量的抗体)。可给予初始较高的负荷剂量，接着给予一个或多个较低的剂量。然而，可使用其它给药方案。通过常规技术和测定方法易于监测该治疗的进展。
应当理解，可以替换抗TNC A2抗体或在抗TNC A2抗体外使用本发明的抗体缀合物实施任何上述配制剂或治疗性方法。
H.制品
在本发明的另一方面，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上文所描述的病症的材料。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器、IV溶液袋、等等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或与另一种组合物组合有效治疗、预防和/或诊断状况的组合物，并且可以具有无菌存取口（例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋）。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外，制品可以包含(a)具有其中含有的组合物的第一容器，其中组合物包含本发明的抗体；和(b)具有其中含有的组合物的第二容器，其中组合物包含别的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。在本发明的此实施方案中的制品可以进一步包含包装插页，其指示可以使用组合物来治疗特定的状况。或者/另外，制品可以进一步包含第二（或第三）容器，其包含药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针、和注射器。
应当理解，任何上述制品可包括本发明的抗体缀合物来代替或补充抗TNC A2抗体。
III.实施例
下面是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施各种其它实施方案。
实施例1
重组DNA技术
使用标准方法来操作DNA，如记载于Sambrook,J.et al.,Molecularcloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York,1989。依照制造商的说明书使用分子生物学试剂。通过双链测序测定DNA序列。在一些情况中，由Geneart AG(Regensburg,Germany)通过自动化基因合成自合成寡核苷酸和PCR产物制备期望的基因区段。将侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆入pGA18(ampR)质粒中。自经过转化的细菌纯化质粒DNA，并通过UV光谱术测定浓度。通过DNA测序确认亚克隆基因片段的DNA序列。基因区段设计成具有合适的限制性位点以容许亚克隆入相应表达载体中。
关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息见Kabat,E.A.etal.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Ed.,NIHPublication No91-3242。为了表达，所有构建物含有编码将蛋白质靶向真核细胞中分泌的前导肽的5’端DNA序列。例示性前导肽和编码它们的多核苷酸序列见SEQ ID NO107至115。
（糖工程化）抗体的制备
通过以符合预先***相应接受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链的读码框的方式亚克隆可变区，已经获得了完整抗体重和轻链DNA序列。由MPSV启动子驱动抗体表达，而且载体在CDS的3’端携带合成polyA信号序列。另外，每一种载体均含有EBV OriP序列。
通过使用磷酸钙转染用哺乳动物抗体表达载体共转染HEK293-EBNA细胞来生成抗体。通过磷酸钙方法转染指数式生长的HEK293-EBNA细胞。或者，通过聚乙撑亚胺转染悬浮生长的HEK293细胞。为了生成未修饰的非糖工程化抗体，只用抗体重和轻链表达载体以1:1的比例转染细胞。
为了生成糖工程化抗体，用两种额外的质粒（一种用于融合GnTIII多肽表达（GnT-III表达载体），一种用于甘露糖苷酶II表达（高尔基甘露糖苷酶II表达载体））分别以4:4:1:1的比例共转染细胞。在T烧瓶中使用补充有10%FCS的DMEM培养基作为贴壁单层培养物培养细胞，并在它们介于50和80%汇合之间时转染。对于T150烧瓶转染，转染前24小时在25ml补充有FCS（最终10%V/V）的DMEM培养基中接种15x106个细胞，并将细胞在5%CO2气氛的温箱中于37°C放置过夜。对于每一个要转染的T150烧瓶，通过混合94μg总质粒载体DNA（在轻和重链表达载体之间等分）、水（至终体积469μl）和469μl1M CaCl2溶液来制备DNA、CaCl2和水的溶液。对此溶液，添加938μl50mM HEPES、280mM NaCl、1.5mM pH7.05的Na2HPO4溶液，立即混合10秒，并于室温静置20秒。用10ml补充有2%FCS的DMEM稀释悬浮液，并添加至T150替换现有的培养基。然后另外添加13ml转染培养基。将细胞于37°C、5%CO2温育约17至20小时，然后用25ml DMEM、10%FCS更换培养基。更换培养基后大约7天通过于210x g离心15分来收获条件化培养基，将溶液无菌过滤（0.22um滤器），以终浓度0.01%w/v添加叠氮化钠，并保存于4°C。
通过亲和层析使用蛋白A(HiTrap ProtA,GE Healthcare)亲和层析自细胞培养物上清液纯化分泌的野生型或糖工程化岩藻糖基化抗体。简言之，用20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5平衡柱，加载细胞上清液，接着是20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5的第一清洗和13.3mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、500mM氯化钠pH5.45的第二清洗。用20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸pH3洗脱抗体。在后续的HiLoad Superdex200柱(GEHealthcare)上的大小排阻层析步骤中，将缓冲液更换成25mM磷酸钾、125mM氯化钠、100mM甘氨酸溶液pH6.7或140mM氯化钠、20mM组氨酸pH6.0，并收集纯的单体IgG1抗体。如果需要，在两个标准纯化步骤之间包括额外的阳离子交换层析步骤。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来测定纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度。通过还原剂（5mM1,4-二硫苏糖醇）存在和缺失下的SDS-PAGE和考马斯染色(SimpleBlueTMSafeStain,Invitrogen)来分析抗体的纯度和分子量。依照制造商的说明书使用预制凝胶***(Invitrogen,USA)（4-20%Tris-甘氨酸凝胶或3-12%Bis-Tris）。使用Superdex20010/300GL分析级大小排阻柱(GE Healthcare,Sweden)在2mM MOPS、150mM NaCl、0.02%NaN3pH7.3运行缓冲液中于25°C分析抗体样品的聚集体含量。通过肽-N糖苷酶F(Roche Molecular Biochemicals)酶处理消除N-聚糖后，通过NanoElectrospray Q-TOF质谱术来验证还原的抗体轻和重链的氨基酸主链的完整性。
野生型和糖工程化2B10人IgG抗体的纯化和分析结果显示于图6和7。
通过MALDI TOF-MS来分析附着至抗体Fc区的寡糖，如下所述。通过PNGaseF消化自抗体酶促释放寡糖。所得含有释放的寡糖的消化物溶液或是直接准备进行MALDI TOF-MS分析或是进一步用EndoH糖苷酶消化之后进行MALDI TOF-MS分析的样品制备。
（糖工程化）抗体的糖结构分析
为了测定含有岩藻糖和非岩藻糖（a-岩藻糖）的寡糖结构的相对比例，通过MALDI-Tof质谱术分析纯化的抗体材料释放的聚糖。将抗体样品（约50μg）与5mU N-糖苷酶F(QAbio;PNGaseF:E-PNG01)一起在2mM Tris pH7.0中于37°C温育过夜以自蛋白质主链释放寡糖。为了测定聚糖，添加乙酸至终浓度150mM并于37°C温育1小时。对于通过MALDI TOF质谱术的分析，将2μL样品在MALDI靶上与2μL DHB基质溶液（在50%乙醇/5mM NaCl中以4mg/ml溶解的2,5-二羟基苯甲酸[Bruker Daltonics#201346]）混合并用MALDITOF质谱仪Autoflex II仪器[Bruker Daltonics]分析。例行地，记录50-300个射击，并合计为一次实验。通过flex analysis软件(Bruker Daltonics)评估获得的谱，并为检测到的每一个峰测定质量。随后，通过比较各结构的计算质量和理论预期质量，给峰定为含有岩藻糖或a-岩藻糖（非岩藻糖）的碳水化合物结构（例如分别为复合物、杂合物和寡或高甘露糖，有和无岩藻糖）。
为了测定杂合物结构的比例，相伴地用N-糖苷酶F和内切糖苷酶H[QAbio；EndoH:E-EH02]处理抗体样品。N-糖苷酶F自蛋白质主链释放所有N连接聚糖结构（复合物、杂合物和寡和高甘露糖结构），而内切糖苷酶H额外在聚糖还原末端处的两个N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)残基之间切割所有杂合物类型聚糖。随后以与上文关于N-糖苷酶F消化的样品所述相同的方式处理此消化物并通过MALDI TOF质谱术进行分析。通过比较来自N-糖苷酶F消化物和组合N-糖苷酶F/内切H消化物的样式，使用特定碳水化合物结构的信号的降低程度来估算杂合物结构的相对含量。自各结构的峰高度和检测的所有寡糖的峰高度之和的比例计算每一种碳水化合物结构的相对量。岩藻糖的量指含有岩藻糖的结构相对于N-糖苷酶F处理样品中鉴定的所有碳水化合物结构（例如分别为复合物、杂合物和寡和高甘露糖结构）的百分比。非岩藻糖基化的量指缺乏岩藻糖的结构相对于N-糖苷酶F处理样品中鉴定的所有碳水化合物结构（例如分别为复合物、杂合物和寡和高甘露糖结构）的百分比。
通过MALDI-TOF MS为2B10人IgG抗体测定的非岩藻糖基化程度，野生型形式为8.1%，糖工程化形式为83%。
实施例2
通用Fab文库的构建
使用下述V域配对在人种系基因基础上构建Fab形式的通用抗体文库：Vk3_20卡帕轻链及VH3_23重链用于DP47-3文库，和Vk1_17卡帕轻链及VH1_69重链用于DP88-3文库。见SEQ ID NO1和2。
这两个文库都在轻链CDR3(L3)和重链CDR3(H3)中随机化，而且通过交叠延伸剪接(splicing by overlapping extension,SOE)PCR每个文库自3个片段组装。片段1包含抗体基因5’端，包括随机化的L3，片段2是中央恒定片段，跨越L3至H3，而片段3包含随机化的H3和抗体基因的3’部分。
使用下述引物组合来生成DP47-3文库的文库片段：片段1(LMB3–LibL1b_new)，片段2(MS63–MS64)，片段3(Lib2H-fdseqlong)。见表3。使用下述引物组合来生成DP88-3文库的文库片段：片段1(LMB3–RJH_LIB3)，片段2(RJH31–RJH32)和片段3(LIB88_2-fdseqlong)。见表4。
表3
表4
用于生成文库片段的PCR方案包括：5分钟94°C初始变性；25个周期的1分钟94°C、1分钟58°C、和1分钟72°C；和10分钟72°C终末延伸。对于组装PCR，使用等摩尔比的3种片段作为模板。组装PCR方案包括：3分钟94°C初始变性；和5个循环的30秒94°C、1分钟58°C、和2分钟72°C。在这个阶段，添加与片段1-3外部的序列互补的引物，并再进行20个循环，之后是10分钟72°C终末延伸。
组装足够量的全长随机化Fab构建物后，将Fab构建物用NcoI/NotI（用于DP47-3文库）和用NcoI/NheI（用于DP88-3文库）消化，同时类似地处理受体噬菌粒载体。对于DP47-3文库，将22.8μg Fab文库与16.2μg噬菌粒载体连接。对于DP88-3文库，将30.6μg Fab文库与30.6μg噬菌粒载体连接。
将经过纯化的连接体系分别用于68次DP47-3文库转化和64次DP88-3文库转化以获得DP47-3最终库容量4.2x1010和DP88-3最终库容量3.3x109。挽救展示Fab文库的噬菌粒颗粒，并通过PEG/NaCl纯化来纯化，用于选择。
实施例3
抗TNC A2克隆2B10的选择（初次选择）
针对大肠杆菌表达的亚克隆在avi标签和6xhis标签5'的人TNC-A2进行选择。见SEQ ID NO:97。
在表达时在体内生物素化抗原。依照下述方案在溶液中进行选择：(i)约1012个文库DP88-3噬菌粒颗粒和100nM生物素化人TNC A2在总体积1ml中结合0.5小时；(ii)通过添加5.4x107个链霉亲合素包被磁珠10分钟来捕捉生物素化人TNC-A2和附着的噬菌体；(iii)使用5x1ml PBS/Tween20和5x1ml PBS清洗珠；(iv)通过添加1mL100mM TEA（三乙胺）10分钟来洗脱噬菌体颗粒，并通过添加500μL1M Tris/HCl pH7.4来中和；并(v)再感染对数期大肠杆菌TG1细胞，用辅助噬菌体VCSM13感染，随后PEG/NaCl沉淀噬菌粒颗粒，用于后续的选择轮次。
使用恒定抗原浓度100nM进行超过3轮选择。在第2轮中，在中性亲合素板上实施抗原:噬菌体复合物捕捉代替链霉亲合素珠。如下通过ELISA鉴定特异性结合物：在中性亲合素板的每个孔中包被100μl100nM生物素化人TNC-A2。
添加含有Fab的细菌上清液，并使用抗Flag/HRP二抗经Flag标签来检测结合的Fab。一旦鉴定，以0.5升培养体积在细菌中表达克隆2B10，亲和纯化，并使用BIACORE T100通过SPR分析进一步表征。见SEQ ID NO：56和60。
实施例4
基于克隆2B10构建抗TNC A2亲和力成熟文库
在来自初次TNC A2选择的预先选定抗体基础上构建亲和力成熟文库。更精确地说，它基于亲本克隆2B10且由两个子文库组成：1)轻链CDR1和CDR2中随机化的VL子文库(L1/L2)；和2)重链CDR1和CDR2中随机化的VH子文库(H1/H2)。在转化时合并这些子文库。通过四个扩增和组装后续步骤来构建每一个这些子文库。对于L1/L2文库：1)扩增片段1（LMB3–AM_Vk1A30_L1_ba）和片段2（RJH50(Vk1A30_L1/L2_fo)–RJH51(Vk1A30_BsiWI_ba)），2)使用外部引物LMB3和RJH51（Vk1A30_BsiWI_ba）组装片段1和2以创建模板，3)扩增片段3（LMB3–AM_Vk1A30_L2_ba）和片段4（RJH52(Vk1A30_L2/L3)–RJH51(Vk1A30_BsiWI_ba)），和4)使用与上文相同的外部引物最终组装片段3和4。对于H1/H2文库：1)扩增片段1（RJH53–AM_DP88_H1_ba_opt）和片段2（RJH54(DP88_H1/H2_fo)–MS52），2)使用外部引物RJH53和MS52组装片段1和2以创建模板，3)扩增片段3（RJH53–AM_DP88_H2_ba）和片段4（RJH55(DP88_H2H3_fo)–MS52），和4)使用与上文相同的外部引物最终组装片段3和4。最终组装产物用NcoI/BsiWI（用于VL子文库）和MunI和NheI（用于VH子文库）消化，并克隆入相似消化的受体载体。库容量产生1.16x1010个独立克隆。
表5
下划线：60%初始碱基和40%随机化成V
粗体：60%初始碱基和40%随机化成N
表6
下划线：60%初始碱基和40%随机化成V
粗体：60%初始碱基和40%随机化成N
实施例5
亲和力成熟抗TNC A2克隆的选择
针对大肠杆菌表达的克隆在avi标签和6xhis标签上游的人TNC A2进行选择（见SEQ ID NO:97）。在表达时在体内生物素化抗原。如关于初次TNCA2选择所述在溶液中进行选择，使用范围为100至2nM的渐降人TNC A2浓度。通过ELISA鉴定亲和力成熟克隆后，使用ProteOn XPR36生物传感器(Biorad)进行二次筛选，并测定动力学速率常数和亲和力，在同一仪器上分析亲和纯化Fab制备物。于25°C使用ProteOn XPR36仪器(Biorad)通过表面等离振子共振测量KD，其中在NLC传感器芯片(Biorad)上固定化抗原。简言之，将重组抗原在PBS/0.005%Tween-20，pH7.4中稀释至10μg/ml，并以30μg/min注射100至300秒以实现大约200-800个响应单位(RU)的偶联蛋白质。对于单次动力学测量，以流速100μl/min注射纯化的Fab的两倍连续稀释液（浓度范围介于约0.01nM和25nM之间）。结合时间为210秒，解离时间为600秒。通过以流速100μl/min注射50mM NaOH18秒来再生传感器芯片。通过同时拟合结合和解离传感图使用简单一对一Langmuir结合模型（ProteOn管理员软件2.1版）计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以比率koff/kon来计算平衡解离成熟(KD)。
鉴定了下述亲和力成熟克隆：2B10_O1F7（见SEQ ID NO:85和87），2B10_6H10（见SEQ ID NO:89和91），2B10_C3A6（见SEQ ID NO:69和71），2B10_D1A2（见SEQ ID NO:73和75），和2B10_O7D8（见SEQ ID NO:81和83）（这些都衍生自VL子文库），以及2B10_C3B6（见SEQ ID NO:61和63）和2B10_6A12（见SEQ ID NO:65和67）（这两个克隆衍生自VH子文库）。此外，对于克隆2B10_D1A2，生成了V32D突变体（见SEQ ID NO:77和79）（编号依照Kabat）。
图1显示选定亲和力成熟Fab结合固定化TNC A2的表面等离振子共振传感图，而表7给出推导的相应亲和力。选定Fab跨越pM范围的高亲和力范围。
表7
Fab片段形式的亲和力成熟抗TNC A2抗体的动力学平衡常数(KD)（单价结合）的汇总
抗体 对hu TNC A2的亲和力(KD)[pM]
2B10_C3B6 191
2B10_6A12 290
2B10_C3A6 497
2B10_O7D8 147
2B10_O1F7 56
2B10_6H10 810
实施例6
结合TNC A2的2B10Fab的IgG转变
将亲本2B10Fab和亲和力成熟2B10Fab衍生物转变成人IgG1形式、小鼠IgG2a形式和人IgG1形式，其中Avi Tag融合至重链C端。将亲和力成熟2B10Fab转变成小鼠IgG以容许进行免疫组织化学分析（见实施例8）。
完整抗体重和轻链DNA序列通过以符合预先***不同接受体哺乳动物表达载体中的相应重和轻链恒定区读码框的方式亚克隆可变区来获得，或通过融合与接受体载体***位点同源的短序列串来重组。依照来自Invitrogen的“In-Fusion Cloning System”实施重组。
在所有载体中由MPSV启动子驱动抗体表达，而且所有载体都在CDS3’端携带合成polyA信号序列。另外，每种载体均含有EBV OriP序列。
实施例7
2B10Fab和IgG对TNC A2的亲和力的测定
随后于25°C使用T100仪器(GE Healthcare)通过表面等离振子共振来测定并确认TNC A22B10Fab片段以及人IgG1转变TNC A22B10抗体对人、鼠和猕猴TNC A2结构域的亲和力。为此目的，在链霉亲合素芯片上固定化生物素化抗原（在大肠杆菌中表达，抗原在背景中但未糖基化），并使用构建物作为分析物。为了固定化，将抗原用HBS-EP+（GE Healthcare，10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%表面活性剂P20，pH7.4）稀释至0.1μg/ml，之后以流速10μl/min注射以实现大约80个响应单位(RU)的偶联蛋白质。在结构域A1和A3背景中表达来自人、小鼠和猕猴的TNC A2结构域。包含人TNC的第五纤连蛋白III型结构域(Fn5)、人或鼠或猕猴任一的A1和A2结构域、及人TNC的A3结构域的抗原构建物（TNC Fn5-A1-人/鼠/猕猴A2-A3）显示于SEQ ID NO99-104。
为了动力学测量，于25°C以流速50μl/min注射Fab片段（范围介于1.56nM至100nM之间）或IgG（范围介于0.39nM至25nM之间）在HBS-EP+中的两倍连续稀释液。结合和解离时间为180秒，并在各循环间用10mM甘氨酸pH1.5实施再生60秒。通过同时拟合结合和解离传感图使用简单一对一Langmuir结合模型（T100评估软件1.1.1版）计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以比率koff/kon来计算平衡解离成熟(KD)。参见例如Chen et al.,J Mol Biol293,865-881(1999)。
HEK中生成的TNC结构域1至8充当阴性对照（见SEQ ID105和106）。
表8给出结合的KD值。图2A-B显示相应的基于SPR的动力学分析。
表8
Fab片段和IgG形式的2B10抗TNC A2抗体的动力学平衡常数(KD)的汇总
实施例8
人肿瘤组织与正常组织切片上抗TNC A2抗体的结合
为了检查选定2B10Fab对人生腱蛋白A2结构域(TNC-A2)的特异性及评估它较之正常组织选择性结合肿瘤组织的能力，实施了免疫组织化学分析。简言之，将Fab片段形式的2B10可变区与FLAG片段融合(SHD2B10-FLAG)。为免疫组织化学染色制备健康和癌性人子宫组织样品。随后，将样品与SHD2B10-FLAG Fab片段一起温育。然后清洗样品并与对FLAG表位特异性的荧光抗体一起温育。癌性组织样品展现出与健康组织样品相比更高的TNCA2表达水平（图3A）。如描述的，将来自健康个体和癌症患者的各种人组织样品与SHD2B10-FLAG Fab片段一起温育。图3B给出各种人组织样品中的量化TNC A2表达水平，免疫荧光表面积%。在另一组实验中，使用小鼠IgG形式的2B10可变区。为免疫组织化学染色制备来自不同器官的健康和癌性人组织样品。随后，将样品与SHD2B10-小鼠IgG一起温育。然后清洗样品并与过氧化物酶显色***一起温育。图4A-N显示了癌性组织样品展现出与健康组织样品相比更高的TNC A2表达水平。
实施例9
抗TNC A2抗体对U87MG成胶质细胞瘤细胞上的生腱蛋白-C的结合
将2B10Fab转变成人IgG1抗体，并通过FACS测试对U87MG成胶质细胞瘤肿瘤细胞上表达的TNC A2的结合。简言之，将每孔200.000个细胞与指定浓度的抗TNC A2抗体2B10一起在圆底96孔板中于4°C温育30分钟，并用PBS/0.1%BSA清洗一次。使用FACS CantoII（Software FACS Diva）用FITC偶联的AffiniPure山羊抗人IgG Fcγ特异性F(ab’)2片段（Jackson ImmunoResearch Lab#109-096-098，工作溶液：在PBS/0.1%BSA中1:20稀释，新鲜制备）于4°C温育30分钟来检测结合的抗体。图5显示了剂量依赖方式的结合的均值荧光强度，与未处理细胞和仅仅用二抗染色的细胞比较。
使用相同的实验规程，对糖工程化2B10人IgG抗体测试对U87MG细胞上的TNC A2的结合，与野生型2B10人IgG抗体比较。图8显示野生型和糖工程化2B10抗体都结合U87MG细胞上的TNC A2。
实施例10
亲和力成熟的抗TNC A2抗体对肿瘤细胞上的生腱蛋白-C的结合
通过FACS测量自亲和力成熟的2B10Fab衍生的人IgG1抗体对U87MG成胶质细胞瘤细胞或SK-Mel5黑素瘤细胞上的人TNC A2的结合。简言之，将每孔200.000个细胞与指定浓度的2B10衍生抗TNC A2抗体一起在圆底96孔板中于4°C温育30分钟，并用PBS/0.1%BSA清洗一次。使用FACS CantoII（Software FACS Diva）用FITC偶联的AffiniPure山羊抗人IgG Fcγ特异性F(ab’)2片段（Jackson Immuno Research Lab#109-096-098，工作溶液：在PBS/0.1%BSA中1:20稀释，新鲜制备）于4°C温育30分钟来检测结合的抗体。
实施例11
由糖工程化抗TNC A2IgG1抗体介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
如实施例1所述，通过共转染编码GnTIII和ManII的质粒来糖工程化改造自2B10衍生的针对TNC A2的人IgG1抗体。随后，在ADCC测定法中对糖工程化2B10亲本和自2B10衍生的亲和力成熟的人IgG1抗体比较它们介导卓越的抗体介导的细胞的细胞毒性的潜力，与它们的非糖工程化野生型形式比较。简言之，收集作为靶细胞的U87MG成胶质细胞瘤细胞或SK-Mel5黑素瘤细胞，在培养基中清洗和重悬浮，并用新鲜制备的钙黄绿素AM(MolecularProbes)于37°C染色30分钟，清洗三次，计数，并稀释至300.000个细胞/ml。将此悬浮液转移至圆底96孔板（30.000个细胞/孔），添加相应抗体稀释液，并温育10分钟以推动测试抗体结合细胞，之后与效应细胞接触。对于PBMC，效应子对靶的比为30比1；或者，可以应用NK92细胞。共温育实施4小时。作为读出，使用受到攻击的细胞瓦解后释放入上清液的乳酸脱氢酶(LDH)。自共培养上清液收集LDH，并用LDH检测试剂盒(Roche Applied Science)分析。用ELISA吸光度阅读仪（SoftMaxPro软件，参照波长：490nm对650nm）测量LDH酶的底物转变。
***
虽然出于清楚理解的目的，前述发明已经作为例示和例子相当详细地进行了描述，但是说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提及而明确将本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容完整收录。

Claims (45)

1.一种特异性结合生腱蛋白C A2结构域的抗体，其中所述抗体包含：
(a)重链可变区和轻链可变区，重链可变区包含选自SEQ ID NO:3，SEQ IDNO:5，和SEQ ID NO:7的重链CDR1；选自SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:15，和SEQ ID NO:21的重链CDR2；和SEQ ID NO:27的重链CDR3，且轻链可变区包含：
(i)SEQ ID NO:31的轻链CDR1，SEQ ID NO:43的轻链CDR2，和SEQ IDNO:47的轻链CDR3；或
(ii)SEQ ID NO:31的轻链CDR1，SEQ ID NO:45的轻链CDR2，和SEQ IDNO:47的轻链CDR3；或
(iii)SEQ ID NO:31的轻链CDR1，SEQ ID NO:37的轻链CDR2，和SEQ IDNO:47的轻链CDR3；或
(iv)SEQ ID NO:31的轻链CDR1，SEQ ID NO:39的轻链CDR2，和SEQ IDNO:47的轻链CDR3；或
(v)SEQ ID NO:29的轻链CDR1，SEQ ID NO:39的轻链CDR2，和SEQ IDNO:47的轻链CDR3；或
(vi)SEQ ID NO:33的轻链CDR1，SEQ ID NO:41的轻链CDR2，和SEQ IDNO:47的轻链CDR3；
或
(b)重链可变区和轻链可变区，重链可变区包含选自SEQ ID NO:3，SEQ IDNO:5，和SEQ ID NO:7的重链CDR1；选自SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:17，和SEQ ID NO:23的重链CDR2；和SEQ ID NO:27的重链CDR3，且轻链可变区包含SEQ ID NO:29的轻链CDR1；SEQ ID NO:35的轻链CDR2；和SEQ IDNO:47的轻链CDR3；
或
(c)重链可变区和轻链可变区，重链可变区包含选自SEQ ID NO:3，SEQ IDNO:5，和SEQ ID NO:7的重链CDR1；选自SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:19，和SEQ ID NO:25的重链CDR2；和SEQ ID NO:27的重链CDR3，且轻链可变区包含SEQ ID NO:29的轻链CDR1；SEQ ID NO:35的轻链CDR2；和SEQ IDNO:47的轻链CDR3。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，
(a)该重链可变区组成为SEQ ID NO:59的氨基酸序列；该轻链可变区组成为选自SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:81，SEQID NO:85，和SEQ ID NO:89的氨基酸序列；或
(b)该重链可变区组成为SEQ ID NO:63或67的氨基酸序列；该轻链可变区组成为SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
3.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区组成为SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:67的氨基酸序列，该轻链可变区组成为SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
4.权利要求1或3的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区组成为SEQ ID NO:59的氨基酸序列，该轻链可变区组成为选自SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:81，SEQ IDNO:85，和SEQ ID NO:89的氨基酸序列。
5.权利要求1至4任一项的抗体，其中所述抗体包含Fc区或与免疫球蛋白Fc区等同的区域。
6.一种特异性结合生腱蛋白C A2结构域的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，和SEQ ID NO:7的重链CDR1、选自SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:15，和SEQ IDNO:21的重链CDR2、和重链CDR3SEQ ID NO:27，该轻链可变区包含轻链CDR1SEQ ID NO:29、轻链CDR2SEQ ID NO:35、和轻链CDR3SEQ ID NO:47，且其中所述抗体包含Fc区或与免疫球蛋白Fc区等同的区域。
7.权利要求6的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区组成为SEQ ID NO:59的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
8.权利要求5-7任一项的抗体，其中所述Fc区是IgG Fc区。
9.权利要求1至8任一项的抗体，其中所述抗体是全长IgG类抗体。
10.权利要求1至9任一项的抗体，其中所述抗体包含人恒定区。
11.权利要求1至10任一项的抗体，其中所述抗体是人抗体。
12.权利要求1至11任一项的抗体，其中所述抗体包含糖工程化Fc区。
13.权利要求12的抗体，其中与非糖工程化抗体相比，所述抗体具有所述Fc区中比例升高的非岩藻糖基化寡糖。
14.权利要求12或13的抗体，其中所述Fc区中20％至100％的N连接寡糖是非岩藻糖基化的。
15.权利要求12至14任一项的抗体，其中与非糖工程化抗体相比，所述抗体具有所述Fc区中比例升高的两分型寡糖。
16.权利要求12至15任一项的抗体，其中所述Fc区中20％至100％的N连接寡糖是两分型的。
17.权利要求12至16任一项的抗体，其中所述Fc区中20％至50％的N连接寡糖是两分型、非岩藻糖基化的。
18.权利要求1至17任一项的抗体，其中所述抗体具有升高的效应器功能和/或升高的Fc受体结合亲和力，所述升高的效应器功能选自以下的一种或多种：升高的Fc介导的细胞的细胞毒性、升高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、升高的抗体依赖性细胞吞噬、升高的细胞因子分泌、升高的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、升高的对NK细胞的结合、升高的对巨噬细胞的结合、升高的对单核细胞的结合、升高的对多形核细胞的结合、升高的诱导凋亡的直接信号传导、升高的靶物-结合的抗体的交联、升高的树突细胞成熟、或升高的T细胞引发。
19.权利要求18的抗体，其中所述升高的效应器功能是升高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
20.权利要求1至19任一项的抗体，其中所述抗体是亲和力成熟的。
21.权利要求1至20任一项的抗体，其中所述抗体以低于1μM的KD值结合人TNC A2。
22.权利要求1至21任一项的抗体，其中所述抗体结合人组织中的TNC A2。
23.一种分离的多核苷酸或多种多核苷酸，其编码形成依照权利要求1至22任一项的抗体。
24.一种分离的多肽，其由权利要求23的多核苷酸编码。
25.一种组合物，其包含：
(a)第一分离的多核苷酸和第二分离的多核苷酸，该第一分离的多核苷酸编码组成为SEQ ID NO:59的序列的多肽，该第二分离的多核苷酸编码组成为选自SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:81，SEQID NO:85，和SEQ ID NO:89的序列的多肽；或
(b)第一分离的多核苷酸和第二分离的多核苷酸，该第一分离的多核苷酸编码组成为选自SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:63的序列的多肽，该第二分离的多核苷酸编码组成为SEQ ID NO:57的序列的多肽。
26.一种载体，其包含权利要求23的多核苷酸。
27.一种宿主细胞，其包含权利要求23的多核苷酸、权利要求25的组合物、或权利要求26的载体。
28.权利要求27的宿主细胞，其中所述宿主细胞经过处理，表达升高水平的一种或多种具有GnTIII活性的多肽。
29.权利要求28的宿主细胞，其中所述具有GnTIII活性的多肽是融合多肽，该融合多肽包含GnTIII的催化结构域和ManII的Golgi定位结构域。
30.权利要求28或29的宿主细胞，其中所述宿主细胞经过进一步处理，表达升高水平的一种或多种具有ManII活性的多肽。
31.一种生成特异性结合生腱蛋白C A2结构域的抗体的方法，所述方法包括
a)在容许该抗体表达的条件下在培养基中培养权利要求27的宿主细胞，和
b)回收该抗体。
32.一种生成特异性结合生腱蛋白C A2结构域的抗体的方法，所述方法包括
a)在容许该抗体表达和所述具有GnTIII活性的多肽修饰所述抗体Fc区上存在的寡糖的条件下在培养基中培养权利要求28至30任一项的宿主细胞，和
b)回收该抗体。
33.一种特异性结合生腱蛋白C A2结构域的抗体，其中所述抗体通过权利要求31或32的方法来生成。
34.一种抗体偶联物，其包含权利要求1至22任一项的抗体和细胞毒剂。
35.一种药物组合物，其权利要求1至22任一项的抗体和药学可接受载体。
36.权利要求35的药物组合物，其进一步包含别的治疗剂。
37.权利要求1至22任一项的抗体在制造药物中的用途。
38.权利要求1至22任一项的抗体在制造用于治疗以生腱蛋白C A2结构域表达为特征的疾病的药物中的用途。
39.权利要求38的用途，其中所述疾病是癌症。
40.权利要求38或39的用途，其中所述治疗进一步包括施用别的治疗剂。
41.权利要求1至22任一项的抗体在制造用于诱导肿瘤细胞或肿瘤基质细胞的细胞裂解的药物中的用途。
42.权利要求41的用途，其中所述细胞裂解是通过该抗体的抗体依赖性细胞毒性诱导的。
43.权利要求1至22中任一项的抗体在一种诱导肿瘤细胞或肿瘤基质细胞的细胞裂解的体外方法中的用途，所述方法包括使所述肿瘤细胞或肿瘤基质细胞与所述抗体接触。
44.权利要求41的用途，其中所述细胞裂解是通过该抗体的抗体依赖性细胞毒性诱导的。
45.权利要求1至22任一项的抗体在制备用于诊断个体中的疾病的诊断剂中的用途，其中所述诊断剂包含权利要求1至22任一项的抗体和标记物，该标记物容许检测所述诊断剂和生腱蛋白C A2结构域的复合物。
CN201180049335.7A 2010-08-13 2011-08-10 抗生腱蛋白-c a2抗体及使用方法 Expired - Fee Related CN103168049B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10172841 2010-08-13
EP10172841.8 2010-08-13
PCT/EP2011/063734 WO2012020038A1 (en) 2010-08-13 2011-08-10 Anti-tenascin-c a2 antibodies and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103168049A CN103168049A (zh) 2013-06-19
CN103168049B true CN103168049B (zh) 2015-10-07

Family

ID=44630263

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180049335.7A Expired - Fee Related CN103168049B (zh) 2010-08-13 2011-08-10 抗生腱蛋白-c a2抗体及使用方法

Country Status (13)

Country Link
US (2) US9156913B2 (zh)
EP (1) EP2603529A1 (zh)
JP (1) JP5841149B2 (zh)
KR (1) KR101653030B1 (zh)
CN (1) CN103168049B (zh)
AR (1) AR082630A1 (zh)
BR (1) BR112013002444A2 (zh)
CA (1) CA2806640A1 (zh)
HK (1) HK1182117A1 (zh)
MX (1) MX2013001336A (zh)
RU (1) RU2584597C2 (zh)
TW (1) TW201209063A (zh)
WO (1) WO2012020038A1 (zh)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8945361B2 (en) 2005-09-20 2015-02-03 ProteinSimple Electrophoresis standards, methods and kits
JP6113404B2 (ja) * 2008-10-29 2017-04-12 アブリンクス エン．ヴェー． 単一ドメイン抗原結合分子の精製方法
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
AU2013237929B2 (en) * 2012-03-29 2017-09-14 Novimmune S.A. Anti-TLR4 antibodies and uses thereof
EP2839276B1 (en) 2012-04-19 2018-06-27 ProteinSimple Dual wavelength isoelectric focusing for determining drug load in antibody drug conjugates
NZ702241A (en) * 2012-08-07 2018-04-27 Roche Glycart Ag Composition comprising two antibodies engineered to have reduced and increased effector function
EP3211006A3 (en) * 2012-09-19 2017-11-08 AbbVie Biotherapeutics Inc. Variant antibodies to tnf alpha
WO2014122144A1 (en) 2013-02-05 2014-08-14 Engmab Ag BISPECIFIC ANTIBODIES AGAINST CD3ε AND BCMA
EP2762497A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
EP2762496A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Method for the selection of antibodies against BCMA
EP2789630A1 (en) 2013-04-09 2014-10-15 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3e and ROR1
SI2991683T1 (sl) 2013-05-02 2020-01-31 Glykos Finland Oy Konjugati glikoproteina ali glikana s toksično obremenitvijo
CA2910065C (en) * 2013-05-15 2023-09-19 Medimmune Limited Purification of recombinantly produced polypeptides
EP2982692A1 (en) 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
LU92659B1 (en) * 2015-02-23 2016-08-24 Glycotope Gmbh Glycooptimized antibody drug conjugates
JP7285076B2 (ja) * 2016-05-11 2023-06-01 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｔｎｆファミリーリガンドトリマーとテネイシン結合部分とを含む抗原結合分子
EP3455252B1 (en) 2016-05-11 2022-02-23 F. Hoffmann-La Roche AG Modified anti-tenascin antibodies and methods of use
EP3601346A1 (en) * 2017-03-29 2020-02-05 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory tnf receptor
TW201922782A (zh) 2017-10-24 2019-06-16 美商麥珍塔治療學股份有限公司 去除cd117+細胞之組合物及方法
CN111372608B (zh) 2017-10-24 2024-07-02 克里斯珀医疗股份公司 用于耗尽cd117+细胞的组合物和方法
WO2020086328A1 (en) * 2018-10-25 2020-04-30 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Targeting clptm1l for treatment and prevention of cancer

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999054342A1 (en) * 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
WO2002079255A1 (en) * 2001-04-02 2002-10-10 Idec Pharmaceuticals Corporation RECOMBINANT ANTIBODIES COEXPRESSED WITH GnTIII
WO2009089998A1 (en) * 2008-01-15 2009-07-23 Philochem Ag Binding members for tenascin-c domain a2
WO2011020783A2 (en) * 2009-08-17 2011-02-24 Roche Glycart Ag Targeted immunoconjugates

Family Cites Families (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992009690A2 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
CA2116774C (en) 1991-09-19 2003-11-11 Paul J. Carter Expression in e. coli antibody fragments having at least a cysteine present as a free thiol. use for the production of bifunctional f(ab') 2 antibodies
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DE69333807T2 (de) 1992-02-06 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
ES2091684T3 (es) 1992-11-13 1996-11-01 Idec Pharma Corp Aplicacion terapeutica de anticuerpos quimericos y radiomarcados contra el antigeno de diferenciacion restringida de los linfocitos b humanos para el tratamiento del linfoma de las celulas b.
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
PT994903E (pt) 1997-06-24 2005-10-31 Genentech Inc Metodos e composicoes para glicoproteinas galactosiladas
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
JP2001521909A (ja) 1997-10-31 2001-11-13 ジェネンテク・インコーポレイテッド 糖タンパク質グリコフォームを含む方法及び組成物
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
WO1999029888A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2532910T3 (es) 1998-04-02 2015-04-01 Genentech, Inc. Variantes de anticuerpos y fragmentos de los mismos
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
MXPA01007170A (es) 1999-01-15 2002-07-30 Genentech Inc Variantes de polipeptidos con funcion efectora alterada.
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
IT1307864B1 (it) 1999-04-20 2001-11-19 Istituto Naz Per La Ricerca Su Metodo diagnostico per il riconoscimento di neoplasie umane attraversola determinazione dell'isoforma ctn-c della tn-c, frammenti di
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
NZ517906A (en) 1999-10-04 2003-01-31 Medicago Inc Cloning of genomic sequences encoding nitrite reductase (NiR) for use in regulated expression of foreign genes in host plants
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Tatsuya Ogawa The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
AU784983B2 (en) 1999-12-15 2006-08-17 Genentech Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
WO2001049698A1 (en) 1999-12-29 2001-07-12 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
BR0110610A (pt) 2000-04-11 2003-04-29 Genentech Inc Anticorpos isolados, imunoconjugados, cadeias de polipeptìdeos, ácido nucléico isolado, vetor, célula hospedeira, processo de produção de anticorpo ou cadeia de polipeptìdeos, método de tratamento de disfunções em mamìferos, método de indução da apoptose de uma célula cancerosa, método para matar uma célula b, método para matar uma célula que expresse um receptor de erbb e usos dos anticorpos isolados
CA2785941C (en) 2000-10-06 2017-01-10 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
AU2002239422B2 (en) 2000-11-30 2006-12-07 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
IL160170A0 (en) 2001-08-03 2004-07-25 Glycart Biotechnology Ag A host cell engineered to produce a polypeptide having increased cytotoxicity
JP2005532253A (ja) 2001-10-25 2005-10-27 ジェネンテック・インコーポレーテッド 糖タンパク質組成物
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
MXPA04006357A (es) 2001-12-27 2005-03-31 Glycofi Inc Metodos para disenar estructuras de carbohidrato del tipo de mamifero.
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US20040259150A1 (en) 2002-04-09 2004-12-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to Fcgamma receptor IIIa
WO2003084570A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition d'anticorps appropriee au patient souffrant de polymorphisme fc$g(g)riiia
KR20050000380A (ko) 2002-04-09 2005-01-03 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤 게놈이 개변된 세포
ES2362419T3 (es) 2002-04-09 2011-07-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Células con depresión o deleción de la actividad de la proteína que participa en el transporte de gdp-fucosa.
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
US20040132140A1 (en) 2002-04-09 2004-07-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
AU2003239966B9 (en) 2002-06-03 2010-08-26 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
SI1539966T1 (sl) 2002-09-12 2010-10-29 Greenovation Biotech Gmbh Postopek za produkcijo proteinov
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1572744B1 (en) 2002-12-16 2010-06-09 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
CA2549932C (en) 2002-12-20 2013-08-20 Greenovation Biotech Gmbh Production of heterologous glycosylated proteins in bryophyte cells
WO2004063351A2 (en) 2003-01-09 2004-07-29 Macrogenics, Inc. IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME
CA2510003A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
SG2013005590A (en) 2003-01-22 2015-06-29 Roche Glycart Ag Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
CA2542046A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused protein composition
JPWO2005035778A1 (ja) 2003-10-09 2006-12-21 協和醗酵工業株式会社 α１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するＲＮＡを用いた抗体組成物の製造法
ES2550311T3 (es) 2003-11-05 2015-11-06 Roche Glycart Ag Moléculas de unión a antígeno con afinidad de unión a receptores Fc y función efectora incrementadas
CA3062320C (en) 2003-11-06 2022-11-15 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
EP1740615B1 (en) 2004-03-31 2014-11-05 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
EP2360186B1 (en) 2004-04-13 2017-08-30 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
PL1791565T3 (pl) 2004-09-23 2016-10-31 Modyfikowane cysteiną przeciwciała i koniugaty
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
PL1817345T3 (pl) * 2004-11-09 2009-10-30 Philogen Spa Przeciwciała przeciwko tenascynie-C
US20090208500A1 (en) * 2005-06-03 2009-08-20 Genentech, Inc. Method of producing antibodies with improved function
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
JP2009536527A (ja) 2006-05-09 2009-10-15 ジェネンテック・インコーポレーテッド 最適化されたスキャフォールドを備えた結合ポリペプチド
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
US20090098118A1 (en) 2007-10-15 2009-04-16 Thomas Friess Combination therapy of a type ii anti-cd20 antibody with an anti-bcl-2 active agent
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
US20110294985A1 (en) 2009-02-06 2011-12-01 Tokyo Universtiy of Science Educational Foundation Administrative Organization Remedy for Chronic Inflammation and Antibody to be Used Therein

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999054342A1 (en) * 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
WO2002079255A1 (en) * 2001-04-02 2002-10-10 Idec Pharmaceuticals Corporation RECOMBINANT ANTIBODIES COEXPRESSED WITH GnTIII
WO2009089998A1 (en) * 2008-01-15 2009-07-23 Philochem Ag Binding members for tenascin-c domain a2
WO2011020783A2 (en) * 2009-08-17 2011-02-24 Roche Glycart Ag Targeted immunoconjugates

Also Published As

Publication number Publication date
CN103168049A (zh) 2013-06-19
EP2603529A1 (en) 2013-06-19
BR112013002444A2 (pt) 2016-05-24
JP2013543373A (ja) 2013-12-05
WO2012020038A1 (en) 2012-02-16
US20160264651A1 (en) 2016-09-15
RU2584597C2 (ru) 2016-05-20
CA2806640A1 (en) 2012-02-16
HK1182117A1 (zh) 2013-11-22
KR101653030B1 (ko) 2016-08-31
MX2013001336A (es) 2013-03-08
RU2013108054A (ru) 2014-09-20
US20120039807A1 (en) 2012-02-16
JP5841149B2 (ja) 2016-01-13
KR20130042615A (ko) 2013-04-26
US9156913B2 (en) 2015-10-13
AR082630A1 (es) 2012-12-19
TW201209063A (en) 2012-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103168049B (zh) 抗生腱蛋白-c a2抗体及使用方法
JP7017599B2 (ja) 抗ｆａｐ抗体及び使用の方法
CN103890006A (zh) 抗mcsp抗体
JP2013542714A5 (zh)
CN107098972A (zh) 抗间皮素抗体和免疫偶联物
CN106255705A (zh) 结合HER3β‑发夹和HER2域II的HER3/HER2双特异性抗体
CN104520328B (zh) 抗锯齿蛋白抗体及使用方法
US20240043564A1 (en) Anti-brdu antibodies and methods of use
CN104755500A (zh) 结合HER3 β-发夹的HER3抗原结合蛋白
CN104755499A (zh) 结合HER3β-发夹和HER4β-发夹的抗HER3/HER4抗原结合蛋白
CN104394886B (zh) 抗茶碱抗体及使用方法
CN106459207A (zh) 结合HER3β‑发夹的抗HER3抗体
CN106459197A (zh) 结合HER1 β‑发夹的HER1抗原结合蛋白
TW201805302A (zh) 經修飾抗腱生蛋白(anti-tenascin)抗體及使用方法
CN104936987A (zh) 抗mcsp抗体

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1182117

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1182117

Country of ref document: HK

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20151007

Termination date: 20170810

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee